nghiên cứu hệ vận chuyển thuốc trên cơ sở hạt micro nano chitosan và vật liệu hydrogel y sinh nhạy nhiệt độ nhạy ph

ii TÓM TẮT LUẬN ÁN Luận án này nghiên cứu chế tạo hệ vật liệu bao gồm hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH từ Poly Ethylene Glycol PEG, D,L-Lactide và hạt micro-nano chitosan để áp dụng làm hệ d

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ THANH HIỀN

NGHIÊN CỨU HỆ VẬN CHUYỂN THUỐC TRÊN CƠ SỞ HẠT MICRO-NANO CHITOSAN VÀ VẬT LIỆU HYDROGEL Y

SINH NHẠY NHIỆT ĐỘ, NHẠY PH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2023

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY HO CHI MINH CITY

HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

NGUYEN THI THANH HIEN

STUDY OF DRUG DELIVERY SYSTEM

BASED ON CHITOSAN MICRO-NANO PARTICLES AND TEMPERATURE, PH-SENSITIVE

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ THANH HIỀN

NGHIÊN CỨU HỆ VẬN CHUYỂN THUỐC TRÊN CƠ SỞ HẠT MICRO-NANO CHITOSAN VÀ VẬT LIỆU HYDROGEL Y

SINH NHẠY NHIỆT ĐỘ, NHẠY PH

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số chuyên ngành: 9520301

Phản biện độc lập: PGS TS Đỗ Thị Mỹ Liên Phản biện độc lập: PGS TS Nguyễn Đại Hải

Phản biện: PGS TS Nguyễn Đình Thành

Phản biện: PGS TS Hoàng Thị Đông Quỳ

Phản biện: TS Huỳnh Lê Huy Cường

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1 PGS.TS Huỳnh Đại Phú 2 TS Hà Cẩm Anh

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, một ít nhiệm vụ nghiên cứu là thành quả tập thể và được sự cho phép của đồng sự sử dụng Các kết quả nghiên cứu, các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Tác giả luận án

Chữ ký

Nguyễn Thị Thanh Hiền

ii

TÓM TẮT LUẬN ÁN

Luận án này nghiên cứu chế tạo hệ vật liệu bao gồm hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH từ Poly Ethylene Glycol (PEG), D,L-Lactide và hạt micro-nano chitosan để áp dụng làm hệ dẫn truyền thuốc dạng tiêm Các đặc tính, yêu cầu cần thiết cho một vật liệu y sinh như tính tương thích sinh học, tính phân hủy sinh học, khả năng chuyển pha sol-gel, kích thước, hình dáng hạt được kiểm tra bằng các phương pháp khoa học hiện đại Những kết quả chính của luận án cho thấy đã tạo được hạt micro-nano chitosan tròn, đều với kích thước trung bình 367 nm bằng phương pháp electrospraying Bên cạnh đó, hệ hydrogel nhạy nhiệt copolymer PLA1750-PEG1750-PLA1750 (T-2.6 25%) và các pentablock copolymer nhạy nhiệt và nhạy pH OS-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OS (P-2.6 25%) hay OSA-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OSA (P-2.6A 35%) được tổng hợp thể hiện các ưu điểm tạo gel tốt trong điều kiện 37°C, pH 7,4 và có đặc điểm của micelle Tất cả các vật liệu đều đạt yêu cầu về tính tương thích sinh học và phân hủy sinh học Hydrogel

nhạy nhiệt cho kết quả thử nghiệm in vitro nhả thuốc kị nước (ibuprofen) có mối quan

hệ với quy luật phân hủy: nhả chậm ban đầu và nhanh sau 3 tuần Đối với thuốc ưa nước như paracetamol, hệ hydrogel nhả khá nhanh là do thuốc được giữ bởi PEG nằm ở vỏ của micelle nên dễ dàng khuếch tán vào môi trường Riêng hạt micro-nano chitosan có giá trị tải thuốc LC, bao gói EE thấp và khó kiểm soát nhả thuốc cả ưa nước và kị nước do không có sự tương tác giữa thuốc và chitosan Từ đó, các giải pháp kết hợp 2 hệ vật liệu hydrogel và hạt micro-nano chitosan để cải thiện đặc tính bao thuốc, kéo dài nhả thuốc ưa nước được đưa ra Giải pháp thứ nhất là tạo hạt micro-nano bao thuốc ưa nước paracetamol từ chitosan và hydrogel nhạy nhiệt đã làm tăng LC (3,94%) và EE (60,25%) cao bởi tương tác hydro giữa các nhóm chức của chitosan và PLA, nhưng việc kiểm soát nhả thuốc khó khăn Giải pháp thứ hai là tạo hạt micro-nano chitosan bao thuốc ưa nước exendin-4 phân tán trong hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH để kéo dài thời gian nhả thuốc Việc thử nghiệm này cho kết quả hệ kết hợp đạt tốc độ nhả thuốc chậm hơn so với từng hệ riêng hydrogel P-2.6 và hạt trơn chitosan qua so sánh lượng đường huyết của chuột bị tiểu đường tuýp 2 sau khi tiêm Đây là kết quả rất khả quan tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu hơn hệ dẫn truyền thuốc exendin-4, một loại thuốc điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2, rất cấp thiết trong thực tế hiện tại

iii

ABSTRACT

This thesis studied the synthesis of biomaterial materials, including thermosensitive, pH-sensitive hydrogels from Poly Ethylene Glycol (PEG), D, L - Lactide, and micro-nano chitosan particles to apply as the injectable drug delivery system The required properties for a biomedical material, such as biocompatibility, biodegradability, sol-gel phase transition, morphology, and size, were evaluated by scientific analytical methods The main results of the thesis show that the micro-nano chitosan particles formed by the electrospraying method obtained round shapes, uniform, with an average diameter of 367 nm In addition, the synthesized thermosensitive PLA1750-PEG1750-PLA1750 (T-2.6 25%) hydrogel and the temperature, pH-sensitive OS-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OS (P-2.6 25%), OSA-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OSA (P-2.6A 35%) hydrogels showed a good gel state in 37°C, pH 7,4, and owning micelles feature These materials exhibited degradation and good biocompatibility in vitro and in vivo testing The hydrophobic drugs (ibuprofen) release process results of the T-2.6 hydrogels were related to the rule of in vitro degradation: initial slow and fast after three weeks For paracetamol as a hydrophilic drug, the release of hydrogels was quick because it was encapsulated by hydrophilic PEG located at the shell of the micelle Remarkably, the micro-nano chitosan particles had small drug loading (LC), low efficient encapsulation EE and difficult drug release control of hydrophilic and hydrophobic drugs because of no interaction between the drugs and chitosan Therefore, solutions that combine hydrogel materials and chitosan micro-nano particles were proposed to improve hydrophilic drug delivery The first solution is to create micro-nano particles from a solution of chitosan and thermosensitive hydrogel containing paracetamol As a result, there is a dramatically increasing in the LC (3,94%) and EE (60,25%) because of hydrogen interaction between functional groups of chitosan and PLA, but drug release control is difficult The second solution is to generate micro-nano chitosan particles coating an exendin-4 hydrophilic drug and disperse them in temperature and pH-sensitive hydrogels The results displayed that the drug release rate of the combined system was slower than that of the P-2.6 hydrogel and bare chitosan particles The positive outcome creates primes for further research into the exendin-4 drug delivery system to treat type 2 diabetes, an urgent problem now

Tôi gửi lời cảm ơn đến bộ môn đào tạo Kỹ thuật Hóa hữu cơ và các phòng thí nghiệm cho phép tôi thực hiện luận án này

Tôi trân trọng cám ơn PGS.TS Huỳnh Đại Phú và TS Hà Cẩm Anh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Cuối cùng, tôi cám ơn rất nhiều gia đình, các cộng sự, đồng nghiệp, các sinh viên đã hỗ trợ, động viên và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án này

v

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU xii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiii

TỔNG QUAN 1

Giới thiệu 1

Tính cấp thiết của đề tài 1

Mục đích, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 2

Ý nghĩa của đề tài 3

Tổng quan về nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 4

Tổng quan hạt micro-nano chitosan 4

Tổng quan về hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH 6

Cơ sở khoa học của đề tài 10

Tình hình nghiên cứu 12

Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 12

Tình hình nghiên cứu trong nước 25

Nội dung nghiên cứu 28

THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

Nguyên liệu, hóa chất và động vật 29

Thực nghiệm 32

Tổng hợp copolymer nhạy nhiệt, nhạy pH 32

Quy trình tạo hạt micro-nano 43

Quy trình phân hủy vật liệu trong điều kiện in vitro, in vivo 45

Quy trình đánh giá khả năng tải thuốc, bao gói thuốc của hạt micro-nano chitosan 46

Quy trình đánh giá hàm lượng acid acetic trong hạt micro-nano chitosan……… 47

Quy trình đánh giá tương thích sinh học của hệ dẫn hydrogel và hạt micro-nano chitosan trong điều kiện in vivo 47

Quy trình nhả thuốc từ hệ hydrogel, hạt micro-nano chitosan và hệ kết hợp hydrogel với hạt micro-nano chitosan 47

Mô hình tạo chuột tiểu đường tuýp 2 48

vi

Các phương pháp phân tích 49

Phương pháp phân tích cấu trúc polymer 49

Phương pháp phân tích các đặc tính của copolymer 50

Phương pháp xác định đặc tính của chitosan 52

Phương pháp nhuộm HE (hematoxylin và eosin) 54

Phương pháp phân tích HPLC (high performance liquid chromatography)……… 54

Tóm tắt sơ đồ quy trình tổng hợp, nghiên cứu 54

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 58

Tổng hợp và đánh giá đặc tính hydrogel nhạy nhiệt độ PLA-PEG-PLA 58

Tổng hợp triblock copolymer nhạy nhiệt độ PLA-PEG-PLA 58

Phân tích chuyển pha sol-gel của triblock copolymer PLA-PEG-PLA 61

Tổng hợp oligomer nhạy pH 63

Oligomer nhạy pH từ mserine (OS) 63

Oligomer nhạy pH từ acid suberic và ethylenediamine (OSA) 66

Tổng hợp hydrogel nhạy nhiệt độ, nhạy pH 71

Pentablock copolymer nhạy nhiệt, nhạy pH OS-PLA-PEG-PLA-OS từ PLA-PEG-PLA và OS 71

Pentablock copolymer nhạy nhiệt, nhạy pH OSA- PLA-PEG-PLA-OSA từ PLA-PEG-PLA và OSA 74

So sánh hydrogel nhạy nhiệt và hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH 77

Đánh giá khả năng phân hủy và tương thích của hydrogel 79

Phân hủy, tương thích sinh học của hydrogel PLA1750-PEG1750-PLA1750 (T-2.6) ……… 79

Phân hủy, tương thích sinh học của hydrogel nhạy nhiệt độ, nhạy pH 83

So sánh khả năng phân hủy và tương thích của T-2.6, P-2.6 và P-2.6A 90

Tổng hợp hạt micro-nano chitosan 92

Đánh giá đặc tính của nguyên liệu chitosan 92

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt micro-nano chitosan bằng phương pháp electrospraying 94

Đánh giá khả năng tương thích sinh học và phân hủy in vitro, in vivo của hạt micro-nano chitosan 100

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 123

TÀI LIỆU THAM KHẢO 125

PHỤ LỤC 138

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo hóa học của chitosan 5

Hình 1.2 Mô phỏng sự trương nở của polymer hydrogel 6

Hình 1.3 Các tác nhân tác động đến khả năng đáp ứng của polymer thông minh [33] 7

Hình 1.4 Cơ chế hình thành gel của copolymer lưỡng tính theo nhiệt độ [34] 7

Hình 1.5 Sự thay đổi hình thái của polymer nhạy pH khi pH thay đổi 9

Hình 1.6 Giản đồ sol-gel của copolymer PDLLA-PEG-PDLLA theo nồng độ và nhiệt độ với phân tử lượng khác nhau S1, S2, S3 [55] 13

Hình 1.7 Giản đồ sol-gel của pentablock PA-PCL-PEG-PCL-PA theo pH và nhiệt độ với tỉ lệ PCL/PEG và khối lượng oligomer PA nhạy pH khác nhau [51] 14

Hình 1.8 Sự hình thành micelle từ PLLA và PEG [11] 14

Hình 1.9 Phổ 1H NMR của copolymer PLA-PEG: 1) trong D2O; 2) trong CDCl3 [11] 15

Hình 1.10 Phân hủy in vitro hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA theo thời gian [51] 16

Hình 1.11 PDLLA-PEG-PDLLA: a) phân hủy in vitro (GPC), b) phân hủy in vivo [55] 16

Hình 1.12 Phân hủy in vivo của pentablock nhạy pH/nhiệt độ OSM: a) 3 giờ, b) 1 tuần, c) 2 tuần, d) 3 tuần và e) Độ giảm khối lượng gel [54] 17

OSM-PCL-PEG-PCL-Hình 1.13 Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào L929 và HUVEC [55] 17

Hình 1.14 Mô tế bào xung quanh vết tiêm copolymer bằng kỹ thuật nhuộm HE [55] 18Hình 1.15 Sự nhả thuốc của copolymer từ PLA và PEG: a) paclitaxel [6], b) DOX [17] 19

Hình 1.16 Thử nghiệm in vivo nhả thuốc insulin hệ PAE-PCL-PEG-PCL-PAE [59] 19

Hình 1.17 Ảnh SEM hạt micro-nano chitosan: a) không có thuốc và b) có thuốc [63] 21Hình 1.18 a) Ảnh SEM hạt chitosan mang thuốc sau 9 ngày được ngâm trong dung dịch PBS 7,4 [54], b) Sự nhả in vitro thuốc indomethacin của hạt chitosan [63] 22

Hình 1.19 Sự nhả thuốc của các hệ dẫn truyền micro-nano chitosan, hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH và hệ kết hợp hydrogel và micro-nano chitosan [58] 24

Hình 1.20 Ảnh SEM hạt PLA với khối lượng phân tử khác nhau: a) 80 kDa, b) 180 kDa [73], c) Ảnh TEM hạt chitosan bao thuốc dạng lõi-vỏ [74] 25

Hình 1.21 Đồ thị chuyển trạng thái sol-gel của pH OS-PCL-PEG-PCL-OS [13] 26

Hình 1.22 Sơ đồ PAMAM G3.5-mPEG bao thuốc CTP [75] 26

Hình 1.23 Sự nhả thuốc của G3.5-mPEG/CPT [77] 27

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tổng hợp triblock copolymer PLA-PEG-PLA 33

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tổng hợp mserine 35

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tổng hợp oligomer nhạy pH từ mserine 37

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình tổng hợp oligomer OSA 39

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình phản ứng tổng hợp pentablock copolymer nhạy nhiệt độ và nhạy pH 42

ix

Hình 2.6 Máy electrospraying tạo hạt micro-nano chitosan [15] 43

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình tạo hạt micro-nano chitosan bằng electrospraying 44

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình tạo hạt micro-nano chitosan chứa thuốc 45

Hình 2.9 Quy trình tạo chuột tiểu đường tuýp 2 49

Hình 2.10 Đồ thị biểu diễn cách xác định pKa và bước nhạy pH 52

Hình 2.11 Sơ đồ tổng hợp và đánh giá hệ vật liệu hydrogel 55

Hình 2.12 Sơ đồ quy trình tạo hạt micro-nano chitosan và hạt micro-nano chitosan chứa thuốc 56

Hình 2.13 Sơ đồ quy trình kết hợp tạo hạt micro-nano chitosan/hydrogel 57

Hình 2.14 Sơ đồ kết hợp hạt micro-nano chitosan bao thuốc exendin-4 phân tán trong hydrogel 57

Hình 3.1 Mẫu triblock copolymer PLA-PEG-PLA tổng hợp 58

Hình 3.2 Phổ 1H NMR triblock copolymer T-2.3 59

Hình 3.3 Phân phối khối lượng mẫu triblock T-2.3 theo GPC 59

Hình 3.4 Kết quả TEM của PLA1750-PEG1750-PLA1750 (T-2.6) 61

Hình 3.5 Phổ 1H NMR T-2.6 đo trong dung môi D2O 61

Hình 3.6 Đồ thị chuyển pha sol-gel triblock copolymer PLA-PEG-PLA 62

Hình 3.7 Mẫu tổng hợp: a) mserine, b) OS 63

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của mserine trong dung môi DMSO 64

Hình 3.9 Phổ 1H NMR của OS trong dung môi DMSO 65

Hình 3.10 Đồ thị chuẩn độ xác định độ nhạy pH của OS 65

Hình 3.11 Phổ 1H NMR của: a) suberic acid, b) ethylenediamine và c) OSA 67

Hình 3.12 Phổ FTIR của suberic acid, OSA và ethylenediamine 68

Hình 3.13 OSA tan trong nước: a) pH> 10, b) pH<4 69

Hình 3.14 Đường cong chuẩn độ xác định độ nhạy pH của các OSA-2,3,4,5 70

Hình 3.15 a) Giản đồ phân phối PI của OSA-2; b) Giá trị PI các OSA 70

Hình 3.16 Thế Zeta của OSA-2 71

Hình 3.17 Phổ 1H NMR của pentablock OS-PLA-PEG-PLA-OS 72

Hình 3.18 Đồ thị chuyển pha sol-gel của pentablock copolymer ở nồng độ 20% 73

Hình 3.19 Đồ thị chuyển pha sol-gel của T-2.6 (25%) và P-2.6 ở nồng độ khác nhau 74Hình 3.20 Phổ 1H NMR của pentablock OSA-PLA-PEG-PLA-OSA 75

Hình 3.21 Đồ thị chuyển pha sol-gel của pentablock P-2.6A và P-2.8A 76

Hình 3.22 Phân hủy in vitro hydrogel T-2.6 (25%) trong 4 tuần 79

Hình 3.23 Sự thay đổi pH theo thời gian phân hủy in vitro của T-2.6 80

Hình 3.24 Phân hủy in vivo gel T-2.6 (25%) theo thời gian 81

Hình 3.25 Sự thay đổi cân nặng chuột theo thời gian sau khi tiêm T-2.6 82

Hình 3.26 Mô xung quanh vùng tiêm T-2.6 (nhuộm HE): a) sau 1 tuần, b) sau 4 tuần 82Hình 3.27 Phân hủy in vitro của T-2.6 (25%), P-2.6 (25% và 30%) theo thời gian (bắt đầu tuần 0 đến tuần số 4) 83

Hình 3.28 Phổ 1H NMR của P-2.6 sau khi phân hủy in vitro 1 tháng 84

PLA1750-Hình 3.33 Phân hủy in vivo P-2.6 (25%): a) gel sau 1 ngày, b) gel sau 1 tuần 87

Hình 3.34 Sự thay đổi khối lượng chuột khi tiêm P-2.6 (25%) theo thời gian 87

Hình 3.35 Mô xung quanh chổ tiêm P-2.6 sau khi tiêm: a) 1 tuần, b) 2 tuần, c) 3 tuần và d) 4 tuần 88

Hình 3.36 Phân hủy in vitro OSA-PLA1750-PEG1750-PLA1750-OSA (35%) theo thời gian 89

Hình 3.37 Phân hủy in vivo P-2.6A 35%: a) 2 tuần, b) 4 tuần 90

Hình 3.38 Mô xung quanh vết tiêm P-2.6A sau 4 tuần: a) độ khuếch đại nhỏ, b) độ khuếch đại lớn 90

Hình 3.39 Kết quả XRD của chitosan 93

Hình 3.40 Phổ FTIR của chitosan 94

Hình 3.41 Góc tiếp xúc của dung dịch chitosan 1,0% trong acid acetic 90% 95

Hình 3.42 Ảnh SEM hạt chitosan ở hiệu điện thế U= 18 kV, L= 12 cm với nồng độ chitosan1,0% trong các nồng độ acid acetic: a) 90%, b) 80%, c) 70% 95

Hình 3.43 Kết quả SEM và phân phối cỡ hạt: a) chitosan nồng độ 1,0% trong acid acetic 80% ở U= 18 kV, L= 12 cm; b) chitosan nồng độ 1,0% trong acid acetic 90% ở U= 18 kV, L= 12 cm; c) chitosan nồng độ 0,8% trong acid acetic 80% ở U= 15 kV, L= 10 cm và d) chitosan nồng độ 0,8% trong acid acetic 90% ở U= 18 kV, L= 12 cm 97

Hình 3.44 Sự phụ thuộc giữa nồng độ chitosan và độ nhớt dung dịch 98

Hình 3.45 Ảnh SEM hạt chitosan được phun ở các chế độ khác nhau: a) chitosan nồng độ 0,5% trong acid acetic nồng độ 90% ở U= 9 kV, L= 10 cm; b) chitosan nồng độ 0,2% trong acid acetic nồng độ 90% ở U= 9 kV, L= 10 cm; và c) chitosan nồng độ 0,2% trong acid acetic nồng độ 90% ở U= 12 kV, L= 10 cm 98

Hình 3.46 Giọt dung dịch chitosan ở đầu kim tại các hiệu điện thế khác nhau 99

Hình 3.47 Ảnh SEM và phân phối cỡ hạt chitosan nồng độ 0,2%: a) trong acid acetic 90% ở L = 10 cm, U = 9 kV, b) trong acid acetic 80% ở L = 12 cm, U = 12 kV 100

Hình 3.48 Phân hủy in vitro hạt micro-nano chitosan sau 1 tháng 100

Hình 3.49 Cân nặng chuột theo thời gian sau khi tiêm hạt micro-nano chitosan 101

Hình 3.50 Phân hủy in vivo hạt micro-nano chitosan: a) 1 tuần, b) 2 tuần và c) 4 tuần 101

Hình 3.51 Mô xung quanh vị trí tiêm chitosan (HE) sau 4 tuần 102

Hình 3.52 Sự nhả thuốc ibuprofen của T-2.6 theo thời gian 104

Hình 3.53 Phân hủy in vitro T-2.6 (25%) có chứa thuốc IBU 105

Hình 3.54 Sự nhả thuốc IBU của hydrogel 106

xi

Hình 3.55 Kết quả SEM của hạt micro-nano chitosan/CEF 107

Hình 3.56 Sự nhả thuốc CEF của hạt micro-nano chitosan 107

Hình 3.57 Sự nhả thuốc paracetamol của các hydrogel 108

Hình 3.58 Ảnh SEM của hạt micro-nano chitosan/T-2.7 theo tỉ lệ: a) 7:3, b) 8:2 và c) 9:1 110

Hình 3.59 Phân phối hạt micro-nano chitosan/T-2.7 (7:3) 110

Hình 3.60 Phổ FTIR của chitosan và chitosan/copolymer 111

Hình 3.61 Liên kết hydro giữa chitosan và PLA 111

Hình 3.62 Phổ XRD chitosan và chitosan/copolymer 112

Hình 3.63 Phổ XRD của chitosan/copolymer/paracetamol 113

Hình 3.64 Ảnh SEM và phân phối cỡ hạt micro-nano chitosan/copolymer/thuốc paracetamol 113

Hình 3.65 Sự thay đổi cân nặng của chuột sau khi tiêm STZ liều thấp 116

Hình 3.66 Sự thay đổi đường huyết của chuột sau khi tiêm STZ liều thấp 116

Hình 3.67 Mô thận và gan (HE) chuột: a) thận, b) gan 117

Hình 3.68 Sự thay đổi cân nặng của chuột sau khi tiêm STZ liều cao 117

Hình 3.69 Sự thay đổi lượng đường huyết chuột sau khi tiêm STZ liều cao 118

Hình 3.70 Mô (nhuộm HE) chuột tiểu đường: a) gan, b) thận và c) tim 118

Hình 3.71 Ảnh SEM và phân phối cỡ hạt của hạt chitosan chứa thuốc exendin-4 119

Hình 3.72 Sự thay đổi lượng đường huyết của chuột trong thử nghiệm nhả thuốc exendin-4 của các hệ vật liệu 119

Hình 3.73 Sự phân hủy in vivo của hệ kết hợp hạt micro-nano chitosan và hydrogel 2.6 trường hợp: a) 1 tuần, b) 6 tuần 120

P-xii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng 29

Bảng 3.1 Khối lượng copolymer PLA-PEG-PLA và độ đa phân tán PDI tương ứng 60

Bảng 3.2 Khoảng nhạy pH của OSA 69

Bảng 3.3 Tính chất triblock copolymer PLA-PEG-PLA và pentablock PLA-OS, OSA-PLA-PEG-PLA-OSA được tổng hợp 77

OS-PLA-PEG-Bảng 3.4 Tỉ lệ LA/EO của T-2.6 theo thời gian phân hủy in vitro 80

Bảng 3.5 Tỉ lệ LA/EO của P-2.6 phân hủy in vitro theo thời gian 85

Bảng 3.6 Kết quả giá trị pH của mẫu P-2.6A theo thời gian 89

Bảng 3.7 Đặc điểm phân hủy và tương thích sinh học của vật liệu 91

Bảng 3.8 Đặc điểm hạt micro-nano chitosan được tổng hợp bằng phương pháp electrospraying 102

Bảng 3.9 Kết quả LC và EE thuốc CEF trong hạt micro-nano chitosan 106

Bảng 3.10 LC, EE và hàm lượng thuốc paracetamol nhả ra theo thời gian của hạt micro-nano chitosan 109

Bảng 3.11 LC, EE và hàm lượng thuốc paracetamol nhả ra theo thời gian của hạt micro-nano chitosan/copolymer 113

Bảng 3.12 Đặc điểm chuột sau khi tiêm STZ 115

xiii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CDCl3 Deuterated chloroform CEF Ceftiofur hydrochloride

CMC Critical micelle concentration – Nồng độ micelle tới hạn CGpH Critical gel pH – pH gel tới hạn

CPT Carboplatin

DCC N N- Dicyclohexylcarbodiimide DCM Dicloromethane

DNA Deoxyribonucleic acid – vật liệu di truyền và gen DMAP Dimethylaminopyridine

DMF Dimethylformamide DMSO Dimethyl sulfoxide DOX Doxorubicin

DP Degree of polymerizaion – Độ trùng hợp D2O Deuterium oxide

EE Encapsulation effciency – Hiệu quả bao gói EO Ethylene oxide

EPR Enhanced permeability and retention – Tăng cường tính thấm và lưu giữ

FDA Food and Drug Administration – Cục quản lý Thực phẩm và Dược FTIR Fourier-transform infrared spectroscopy – Quang phổ hồng ngoại biến

đổi Fourier

GPC Gel permeation chromatography – Sắc ký thẩm thấu gel HBL Hydrophilic-lipophilic balance – Cân bằng ưa nước - kị nước HE Haematoxylin and Eosin stain – Nhuộm HE

HEK Human embryonic kidney – Phôi thận người

H1NMR Nuclear magnetic resosnance – Cộng hưởng từ hạt nhân HPLC High performance liquid chromatography – Sắc kí lỏng cao áp

HUVEC Human umbilical vein endothelial cells – Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người

IBU Ibuprofen

IDF International Diabetes Federation – Hiệp hội Đái tháo đường thế giới mPEG Poly (ethylene glycol) methyl ether

LA Lactic acid

LC Loading capacity – Khả năng tải

LCGT Low critical gel temperature – Nhiệt độ gel tới hạn dưới

LCST Lower critical solution temperature – Nhiệt độ dung dịch tới hạn dưới

xiv OS Oligomer serine

OSM Oligomer sulfamethazine PA Polyamide

PAA Poly acrylic

PAE Poly β-amino ester PAMAA Poly amidoamine

PAEU Poly amino(ester)urethane

PBS Phosphate Buffered Saline – Dung dịch đệm PCL Poly caprolactone

PCGA Poly glycolide-co-ε-caprolactone PCLA Poly (ε-capronlactone-co-lactide) PDEAEM N,N’-diethylaminoethyl methacrylate PDLA Poly D-Lactic acid

PDLLA Poly D,L-Lactic acid PEG Poly (ethylene glycol) PEO Poly ethylene oxide PLA Poly lactide

PLGA Poly D,L-Lactide acid-co-glycolic acid PLLA Poly L-Lactic acid

PTX Paclitaxel

SEM Scanning electron microscope – Kính hiển vi điện tử quét STZ Streptozotocin

TEM Transmission electron microscope – Kính hiển vi điện tử truyền qua

TGA Acid thioglycolic THF Tetrahydrofuran

Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh

UCGT Up critical gel temperature – Nhiệt độ gel tới hạn trên

UCST Upper critical solution temperature – Nhiệt độ dung dịch tới hạn trên XRD X-Ray diffraction – Phổ XRD

1

TỔNG QUAN

Giới thiệu

Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, sự phát triển nhanh chóng các căn bệnh ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng như ung thư, bệnh đái tháo đường đang trở thành mối lo ngại lớn Theo thống kê hiệp hội đái tháo đường thế giới IDF (International Diabetes Federation), bệnh tiểu đường được xem như là một trong những trường hợp khẩn cấp về sức khỏe toàn cầu có tốc độ phát triển nhanh nhất ở thế kỷ 21 Năm 2021, bệnh nhân tiểu đường (20-79 tuổi) trên toàn thế giới gần 537 triệu người, dự kiến gia tăng lên đến 643 triệu vào năm 2030, và 783 triệu vào năm 2045 Ở Việt Nam, khoảng 6,1 % dân số bị bệnh tiểu đường, và dự đoán đến năm 2045 tỉ lệ bệnh này tăng lên 7,7 % Chi phí y tế trực tiếp cho bệnh tiểu đường đã gần một nghìn tỷ USD [1] Song song đó, khoa học y khoa cũng đang tăng trưởng mạnh mẽ Các loại thuốc mới, các phương pháp điều trị liên tục được nghiên cứu và phát triển [2], [3] Do đó, việc tìm kiếm một phương thức điều trị các căn bệnh có ảnh hưởng đến sức khỏe toàn cầu như bệnh tiểu đường nằm trong xu thế phát triển của xã hội Trong đó, nghiên cứu chất dẫn truyền thuốc bằng polymer y sinh thông minh là chủ đề được quan tâm và phát triển mạnh trong thập kỷ gần đây

Polymer y sinh thông minh là loại polymer được áp dụng trong điều trị y học trực tiếp, tương tác được với hệ thống sinh học của cơ thể và có thể đáp ứng với sự thay đổi của các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, ánh sáng, từ trường Những đáp ứng này được thể hiện bởi sự thay đổi các tính chất hóa lí của polymer như hình dáng, đặc tính bề mặt, chuyển pha sol-gel, độ hòa tan, cấu trúc [4]-[6] Trên thực tế, tùy theo đặc điểm, cấu tạo, tính chất mà polymer y sinh thông minh được phân loại rất nhiều dạng khác nhau với các tên gọi riêng rẽ như: micelle, liposome, hạt nano hay hydrogel Ưu điểm nổi bật của polymer y sinh thông minh dẫn truyền thuốc là: khả năng tương thích cao, giảm thiểu các độc tính, kiểm soát được tốc độ và vị trí nhả thuốc, duy trì sự ổn định của thuốc và ngưỡng thuốc thích hợp để điều trị, kéo dài thời gian nhả thuốc nên giảm tần

Với các lý do đã phân tích trên, đề tài “Nghiên cứu hệ vận chuyển thuốc trên cơ sở hạt micro-nano chitosan và vật liệu hydrogel y sinh nhạy nhiệt độ, nhạy pH” được lựa chọn cho nghiên cứu trong luận án này

Mục đích, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

Mục đích: Đánh giá đặc tính hệ vật liệu hạt micro-nano và hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH để áp dụng làm hệ dẫn truyền thuốc dạng tiêm, định hướng tăng khả năng tải thuốc và kéo dài thời gian nhả thuốc, đặc biệt là thuốc exendin-4 là thuốc trị tiểu đường

tuýp 2

Đối tượng nghiên cứu:

- Hạt micro-nano chitosan được tạo thành bằng phương pháp electrospraying - Hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH OS-PLA-PEG-PLA-OS và OSA-PLA-PEG-PLA-OSA được tổng hợp từ các tiền chất chính là PEG và D,L- Lactide bằng phản ứng trùng ngưng

Phạm vi nghiên cứu:

Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm của cơ sở đào tạo và nơi công tác trong thời gian 36 tháng Giới hạn nghiên cứu đề tài trong phạm vi:

3

- Tổng hợp hệ vật liệu y sinh bao gồm hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH, hạt nano chitosan

micro Phân tích, đánh giá các tính chất đặc trưng của hệ vật liệu như hình thái, kích

thước, cấu trúc, đặc điểm hóa lý, tính tương thích, phân hủy in vitro, in vivo

- Đánh giá thử nghiệm nhả thuốc in vitro, in vivo (ibuprofen, paracetamol,

ceftiofur hydrochloride, exendin-4)

Ý nghĩa của đề tài

Đề tài mang ý nghĩa xã hội sâu sắc bởi tính thiết thực, cấp thiết Việc nghiên cứu thành công sẽ góp phần tăng hiệu quả điều trị Bên cạnh đó, đề tài cũng thể hiện ý nghĩa tiếp cận và kế thừa các thành tựu khoa học, kỹ thuật hiện đại qua việc lựa chọn nguyên liệu và phương pháp thực hiện Các nguyên liệu chitosan, polylactide (PLA) và polyethylene glycol (PEG) là những polymer có tính tương thích sinh học, rẻ tiền, dễ sản xuất [10]-[12] Trong khi đó, phương pháp tổng hợp hydrogel bằng phản ứng trùng ngưng có hiệu suất cao, riêng phương pháp electrospraying tạo hạt nano có ưu điểm rất nổi bật là vận hành đơn giản, ít sử dụng dung môi nên không ảnh hưởng đến tính chất vật liệu và thuốc [13]-[15]

Mặt khác, đề tài tham gia giải quyết một trong những vấn đề đang được quan tâm hiện tại trong hệ dẫn truyền thuốc Đó là tạo ra hệ truyền dẫn thuốc/protein mới với những đặc tính vượt trội, hạn chế những nhược điểm của phương pháp truyền thống như tiêm nhiều lần, khó kiểm soát được ngưỡng thuốc nên có thể gây độc [9], [16] Trong tình hình Việt Nam hiện nay chưa phát triển mạnh về khoa học công nghệ của ngành dược liệu và y tế, hầu hết các bệnh viện đều dùng dược phẩm nhập ngoại và dùng những phương pháp cũ để chữa bệnh Nhiệm vụ khoa học này nếu được thực hiện sẽ tạo ra tín hiệu tích cực cho sự phát triển khoa học nước nhà trong nhiều lĩnh vực như vật liệu polyme, dược phẩm, y tế Điều này sẽ góp phần cho việc phát triển công nghệ mới và áp dụng công nghệ trong việc chữa bệnh phục vụ đời sống

4

Tổng quan về nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu

Tổng quan hạt micro-nano chitosan

1.2.1.1 Hạt micro-nano ứng dụng dẫn truyền thuốc

Ngày nay, sự phát triển của công nghệ micro-nano tạo ra nhiều bước tiến vượt bậc trong tất cả các lĩnh vực khoa học công nghệ Hàng loạt vật liệu mới, kích thước từ vài nano mét tới vài trăm nano mét đã được tổng hợp và ứng dụng trong thực tế [17] Đặc điểm nổi bật của vật liệu này so với vật liệu có kích thước lớn là: diện tích bề mặt lớn, độ tan tăng, hấp thụ tăng, độ phân tán trong chất lỏng lớn [18] Trong lĩnh vực y, dược phẩm, hệ dẫn thuốc bằng hạt micro-nano đang được phát triển mạnh mẽ Số lượng nghiên cứu công bố và sản phẩm ngày càng tăng, góp phần nâng cao hiệu lực chữa trị của các loại thuốc [19], [20] Các yêu cầu quan trọng của hệ dẫn truyền hạt micro-nano cần kiểm soát ban đầu này là: kích thước, hình thái và khả năng phân hủy sinh học của vật liệu [21] Theo S.Rajesh [21], hạt vật liệu ở kích thước micro-nano có khả năng lưu thông trong hệ tuần hoàn mà không có sự cản trở bởi những đại thực bào tồn tại trong hệ lưới nội mô của cơ thể Thêm vào đó, hệ dẫn thuốc micro-nano có thể thoát khỏi quá trình đào thải thuốc, kéo dài thời gian tuần hoàn do đó sẽ đưa thuốc vào đúng vị trí Tác giả D Jinwei [22] công bốhạt có kích thước nhỏ, tốc độ đào thải sẽ chậm Mặt khác, với kích thước hạt nhỏ nên tỉ lệ diện tích cao tính trên một đơn vị thể tích làm tăng khả năng tải thuốc Điều này sẽ giảm thiểu lượng vật liệu tải thuốc mà tính năng vẫn đạt mong muốn Tuy nhiên, nhược điểm của hạt micro-nano là làm tăng khả năng giải phóng thuốc gây giảm khả dụng sinh học [21] Vì vậy, tùy thuộc vào phương thức dẫn truyền khác nhau sẽ có mức độ yêu cầu kích thước phù hợp khác nhau Về phương diện hình thái học của hạt micro-nano ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tải thuốc và nhả thuốc Hạt dạng hình cầu, độ đồng đều cao thường dễ dàng kiểm soát hơn các hạt bị khuyết tật [21] Trong khi đó, yếu tố phân hủy sinh học của vật liệu liên quan đến độ bền cơ, tốc độ nhả thuốc, và độc tính nên vật liệu được lựa chọn phải được kiểm tra cẩn thận tính năng này [19], [21]

Từ đây có thể nói, để sử dụng hạt micro-nano làm hệ dẫn truyền thuốc thì yêu cầu đầu tiên cần phải đạt được hình thái đồng đều, kích thước phù hợp hệ dẫn truyền và vật liệu có khả năng phân hủy sinh học tốt trong thời gian mong muốn

5

1.2.1.2 Hạt mirco-nano chitosan ứng dụng làm chất dẫn truyền thuốc

Trong các loại polymer y sinh thì chitosan là một polymer tự nhiên (có cấu trúc polysaccharide) được ứng dụng nhiều trong dẫn truyền thuốc Chitosan (CS) là dạng dẫn xuất deacetyl hóa từ chitin, có nguồn gốc chủ yếu trong vỏ của các loài giáp xác như tôm, cua, bọ cánh cứng Đơn phân chủ yếu của chitosan là D-glucosamine hay 2-amino-2-deoxy-β-D-glucose với công thức cấu tạo như hình 1.1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo hóa học của chitosan

Những đặc tính ưu việt của chitosan được sử dụng làm vật liệu dẫn truyền thuốc là có tính tương thích sinh học, ít độc hại, có khả năng phân hủy sinh học Sản phẩm phân hủy của chitosan là các chất không độc hại và các chất này được cơ thể hấp thụ hoàn toàn hay chuyển hóa Thêm vào đó, trong cấu trúc của phân tử chitosan (hình 1.1) có các nhóm chức năng dễ dàng biến tính hóa học như nhóm chức -OH bậc 1, -OH bậc 2 và nhóm –NH2 nên có thể điều chỉnh được tính năng Với lượng lớn nhóm amine, hydroxyl tự do nên chitosan có thể tạo liên kết ngang làm tăng độ bền cơ, đặc biệt liên kết ion do ion dương của chitosan kết hợp được với các chất mang ion âm Hơn nữa, chitosan có thể được xem như là polymer thông minh nhạy pH do khả năng hòa tan của chitosan thay đổi theo pH môi trường Đặc biệt, hạt micro-nano chitosan làm chất dẫn truyền thuốc dạng tiêm có ưu điểm nổi bật là khả năng xuyên qua mao quản vào hệ tuần hoàn, cơ tính tốt nên không biến dạng trên đường vận chuyển [23]-[26]

Bên cạnh các ưu điểm, hạt micro-nano chitosan làm hệ thống dẫn truyền thuốc có các nhược điểm như: có hiện tượng tập hợp, giảm độ ổn định, nhả thuốc nhanh nếu thuốc chỉ phủ trên bề mặt hạt, hay không kiểm soát tốc độ nhả thuốc khi hình thái hạt không đồng đều [10], [21] Do đó, để kiểm soát được quá trình nhả thuốc thì thường biến tính chitosan bằng các nhóm chức năng nhằm tạo liên kết với tác nhân điều trị hoặc cải tiến

6

hệ dẫn truyền này bằng cách kết hợp hạt nano chitosan với thành phần polymer y sinh khác [24]-[26] Đây cũng là ý tưởng của luận án này khi nghiên cứu hạt micro-nano chitosan để áp dụng bao gói và dẫn truyền thuốc dạng tiêm Các hạt micro-nano chitosan tạo thành được biến tính với hydrogel y sinh nhằm tạo hệ dẫn truyền thuốc ưu việt hơn Việc lựa chọn hydrogel trong các polymer y sinh thông minh do các ưu điểm nổi bật của hệ vật liệu này như: khả năng bao gói thuốc cả ưa nước và kị nước, phân tán dễ dàng các hạt micro-nano chitosan do độ nhớt thuận lợi, các nhóm chức trên cấu trúc có thể biến tính tăng tính năng, phẫu thuật xâm lấn thấp, đơn giản hóa trong việc gắn kết tác nhân điều trị và quan trọng là có thể kiểm soát thời gian nhả thuốc do thuốc được bao gói qua nhiều hệ vật liệu mới khuếch tán ra môi trường [27]-[30]

Tổng quan về hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH

1.2.2.1 Hydrogel

Hydrogel là vật liệu polymer có cấu trúc không gian ba chiều, có khả năng trương nở trong dung môi (nước) Hydrogel có thể hấp thụ lượng dung môi (nước) gấp hàng nghìn lần khối lượng khô của chúng nên hydrogel có độ xốp lớn, mềm như mô được mô phỏng hình 1.2 [31], [32]

Hình 1.2 Mô phỏng sự trương nở của polymer hydrogel

Hydrogel được phân loại bởi nhiều cách khác nhau, có thể dựa vào: kích thước, điện tích, phương thức liên kết, khả năng phân hủy hay khả năng đáp ứng với tác nhân của môi trường Trong đó, cách phân loại dựa vào khả năng đáp ứng hydrogel dưới các kích thích của môi trường như pH, nhiệt độ, ánh sáng, điện trường… mà hydrogel còn gọi là polymer thông minh và tên gọi tương ứng với các tác nhân đó (hình 1.3) [33] Trong đó, hydrogel nhạy nhiệt độ và hydrogel nhạy pH là đối tượng được nghiên cứu khả thi nhất hiện nay do dễ kiểm soát [34], [35]

7

Hình 1.3 Các tác nhân tác động đến khả năng đáp ứng của polymer thông minh [33]

1.2.2.2 Hydrogel nhạy nhiệt độ

• Hydrogel nhạy nhiệt độ

Hydrogel nhạy nhiệt độ là polymer hay copolymer có khả năng chuyển pha gel khi nhiệt độ thay đổi [34] Hydrogel nhạy nhiệt độ có cấu tạo chủ yếu là một phân tử lưỡng tính, bao gồm các nhóm ưa nước và kị nước Nhiệt độ chuyển pha sol-gel của hydrogel phụ thuộc rất lớn vào: tỉ lệ kị nước/ưa nước trong cấu trúc, nồng độ và chiều dài phần kị nước [35], [36]

sol-Hình 1.4 Cơ chế hình thành gel của copolymer lưỡng tính theo nhiệt độ [34] Hình 1.4 thể hiện cơ chế tạo gel của copolymer lưỡng tính Ở nhiệt độ thấp, copolymer lưỡng tính tan được trong nước như dạng các micelle tan trong nước Khi nhiệt độ tăng lên, các micelle sắp xếp tạo liên kết để hình thành gel Copolymer lưỡng tính khối dạng B-A-B là một trong những hydrogel nhạy nhiệt đặc trưng, bao gồm khối (block) A ưa nước ở giữa và các khối (block) kị nước B ở cuối cấu trúc Khối kị nước B này đóng vai trò là thành phần nhạy nhiệt Thông thường hydrogel này có trạng thái phân tán (sol) ở nhiệt độ thấp hơn LCGT (low critical gel temperature) và gel ở nhiệt độ

8

trong khoảng giữa LCGT và UCGT (up critical gel temperature), nhiệt độ trên UCGL thì copolymer bị tách lớp được gọi là kết tụ (precipitation) [33] Các hydrogel nhạy nhiệt thường gặp như poly (ethylene oxide)-b-poly(L-lactide-co-glycolide) (PEO-poly(LLA-co-GA)), poly (ethylene oxide)-b-poly(D,L-Lactide-co-glycolide) (PEO-poly(DLLA-co-GA)), PEG-g-chitosan, poly(ethylene glycol)-poly(lactide-glycolide)-poly(ethylene glycol) (PEG-PLGA-PEG) và PEG-poly(L-Lactide)-PEG (PEG-PLLA-PEG) [5], [34]

Hydrogel nhạy nhiệt độ được nghiên cứu và ứng dụng vào hệ dẫn truyền thuốc dạng tiêm rất lớn trong thập kỉ qua bởi đặc tính nổi bật như: mềm như mô, tương thích sinh học tốt, tải thuốc lớn, và đặc biệt kéo dài thời gian nhả thuốc, kiểm soát hàm lượng thuốc nhả ra [33]-[35] Tính chất quan trọng của hydrogel nhạy nhiệt là thuốc có thể phân tán dễ dàng vào hệ ở trạng thái sol tại nhiệt độ môi trường (dưới LCGT), trong khi tiêm vào cơ thể ở 37°C (trên LCGT), hệ chuyển sang trạng thái gel, bao gói thuốc, sau đó phân hủy từ từ để nhả thuốc Trong đề tài này, copolymer PLA-PEG-PLA (Poly Lactide-Poly Ethylene glycol- Poly Lactide) được lựa chọn làm hệ vật liệu hydrogel nhạy nhiệt độ Trong đó, PLA đóng vai trò là khối kị nước và PEG là khối ưa nước Việc lựa chọn này dựa trên đặc điểm của PLA, PEG và tiếp nhận các thành quả nghiên cứu trước [7], [11], [12], [37]

• Hydrogel nhạy nhiệt độ PLA-PEG-PLA

PLA là một trong những loại polymer sinh học được sử dụng phổ biến do có khả năng phân hủy sinh học, độ bền kéo cao, khả năng tương hợp sinh học cao và giá thành thấp [38], [39] Tuy nhiên, PLA có tính kị nước cao nên khả năng tương hợp tế bào sẽ thấp, độ bền cơ không cao do phân hủy, tốc độ phân hủy phụ thuộc vào sự thủy phân liên kết ester trong cấu trúc Trong khi đó, PEG là một polymer ưa nước, hòa tan rất tốt trong nước, ít độc và khả năng tương thích sinh học tuyệt vời, có khả năng chống lại sự hấp phụ protein và sự kết dính tế bào Điều này làm giảm thiểu sự phát hiện của hệ thống miễn dịch và do đó làm tăng tuần hoàn trong máu, thời gian bán hủy trong huyết tương, tăng cường hiệu ứng thấm và lưu giữ EPR (enhanced permeability and retention) và tránh đại thực bào [37], [40], [41] Sự kết hợp của PLA và PEG để tạo copolymer PLA-PEG-PLA vừa bổ sung tính năng cho nhau vừa làm tăng thêm các đặc tính tuyệt vời của một hydrogel làm hệ dẫn truyền thuốc Bên cạnh đó, copolymer PLA-PEG-PLA còn có

9

cấu trúc của micelle với tâm là PLA và vỏ là PEG Điều này làm cho hydrogel PEG-PLA có thể tải thuốc cả ưu nước và kị nước [42] Tuy nhiên, độ ổn định của copolymer micelle bao thuốc phụ thuộc vào nồng độ Khi nồng độ xuống thấp (thấp hơn CMC (critical micelle concentration) - nồng độ giới hạn tạo micelle), cấu trúc copolymer dễ vỡ và như vậy sẽ không kiểm soát tốt sự nhả thuốc [41] Hơn nữa, tính nhạy nhiệt tốt của hydrogel PLA-PEG-PLA làm cho việc tiêm thuốc sẽ gặp khó khăn do gây nghẽn kim tiêm nên kết hợp thêm tính năng nhạy cảm khác lên mạch copolymer PLA-PEG-PLA để khắc phục nhược điểm này là rất cần thiết Trong luận án này, độ bền gel của các hydrogel được kiểm tra cẩn thận, đồng thời các nhóm chức nhạy pH được lựa chọn để gắn lên hydrogel nhạy nhiệt tạo hydrogel nhạy nhiệt độ và nhạy pH

PLA-1.2.2.3 Hydrogel nhạy pH

Hydrogel nhạy pH là loại polymer (oligomer) có khả năng đáp ứng với pH của môi trường xung quanh bởi thay đổi cấu trúc được biểu hiện sự co lại (làm co khối polymer- gel) hay giãn ra (làm trương khối polymer-sol) của mạch polymer [43]-[45] Lí do là các polymer nhạy pH có chứa những nhóm chức có khả năng ion hóa và đề ion hóa để cho hay nhận proton tùy theo pH của môi trường dẫn đến thay đổi trạng thái, được minh họa theo hình 1.5

Hình 1.5 Sự thay đổi hình thái của polymer nhạy pH khi pH thay đổi

Các polymer nhạy pH được chia làm hai loại là polymer nhạy anion và polymer nhạy cation [5], [45], [46]

Polymer nhạy anion là loại polymer có chứa các nhóm chức acid yếu (như COOH, -SO3H, -SH…), có thể gọi chung là polyacid Loại polymer này có khả năng ion hóa (biểu hiện trương) trong môi trường pH có tính base (lớn hơn giá trị pKa)

-10

- Polymer nhạy cation là loại polymer có chứa các nhóm chức amine (như -NH2, -NH-), có thể gọi chung là polybase Loại polymer này có khả năng ion hóa (biểu hiện trương) trong môi trường pH có tính acid (bé hơn giá trị pKb)

Cơ chế nhạy pH của hydrogel làm thay đổi trạng thái sol-gel diễn ra chủ yếu bởi sự thay đổi tính phân cực sang không phân cực của polymer Khi pH môi trường làm cho nhóm chức trên polymer bị ion hóa tạo các điện tích trên mạch cùng dấu, lực đẩy tĩnh điện làm cho mạch polymer giãn ra gây hiện tượng trương, phân cực và tan trong nước Ngược lại, khi pH thay đổi đến giá trị các nhóm chức không còn bị ion hóa (đề ion hóa), mạch polymer không còn điện tích nên không phân cực, không còn lực tĩnh điện dẫn đến mạch co lại, không tan trong nước [47], [48]

Đề tài này sẽ tổng hợp oligomer nhạy pH có nhóm sulfonamide và carbonxamide để ghép vào mạch PLA-PEG-PLA tạo hydrogel nhạy nhiệt độ và nhạy pH nhằm tăng thêm tính năng cho hydrogel, giúp hệ vận chuyển thuốc hiệu quả hơn

Cơ sở khoa học của đề tài

Luận án này tập trung tổng hợp và đánh giá đặc tính của hệ vật liệu, tìm mối quan hệ giữa các thông số tính chất để đưa ra các giải pháp hiệu quả khi định hướng làm hệ dẫn truyền thuốc dạng tiêm Từ đó, hệ vật liệu được áp dụng vào dẫn truyền thuốc trị bệnh tiểu đường exendin-4 Do đó, luận án cần làm sáng tỏ các vấn đề sau:

Thứ nhất là sự biến tính hydrogel nhạy nhiệt PLA-PEG-PLA Như đề cập phần trước, hydrogel nhạy nhiệt từ copolymer PLA-PEG-PLA có nhược điểm: độ bền cơ, độ ổn định thấp, đặc biệt khi áp dụng dẫn truyền dạng tiêm gây nghẽn kim tiêm bởi sự gel hóa khi nhiệt độ thay đổi đột ngột từ nhiệt độ môi trường lên nhiệt độ cơ thể Do đó, giải pháp kết hợp thêm nhóm chức amide nhạy pH như sulfonamide và carboxamide lên cấu trúc copolymer PLA-PEG-PLA nhằm biến tính thành hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH là cần thiết để khắc phục các nhược điểm này Các nhóm chức amide nhạy pH này dạng polyacid nên ion hóa trong môi trường pH cao và đề ion hóa trong môi trường pH thấp [5], [49] Điều này có nghĩa, copolymer nhạy nhiệt, nhạy pH hình thành đáp ứng yêu cầu là ion hóa ở pH cao hơn 7,4 (dạng sol) giúp tiêm dễ dàng và đề ion hóa ở giá trị pH của máu (7,15-7,40) (dạng gel) để có thể bao bọc phần thuốc bên trong khi được tiêm

11

vào cơ thể Bên cạnh đó, sự có mặt của các thành phần nhạy pH này giúp hydrogel PEG-PLA ổn định, tránh giảm pH môi trường đột ngột khi bị phân hủy tạo ra acid lacide dẫn đến khó kiểm soát nhả thuốc [49], [50] Hơn nữa, nhóm chức amide có tính tương hợp tốt với cơ thể nên đạt yêu cầu như polymer y sinh [51] Do đó, trong luận án này sẽ tổng hợp pentablock copolymer nhạy nhiệt, nhạy pH OS-PLA-PEG-PLA-OS và OSA-PLA-PEG-PLA-OSA để nghiên cứu làm một hệ dẫn truyền thuốc dạng tiêm

PLA-Thứ hai, làm rõ mối quan hệ giữa đặc tính nguyên liệu chitosan phù hợp với thông số vận hành máy electrospraying Hạt micro-nano chitosan được tạo thành bằng phương pháp electrospraying định hướng làm hệ dẫn truyền thuốc phải đảm bảo về hình thái học (hình cầu, kích thước micro-nano, đồng đều) [21], [22] Trên thực tế, mỗi loại chitosan sẽ có đặc điểm khác biệt về khối lượng phân tử, độ hòa tan, mức độ deacetyl hóa nên sẽ thích hợp với dung môi hòa tan và chế độ làm việc của máy electrospraying khác nhau [52]-[54] Trong luận án này, mối quan hệ giữa đặc tính của chitosan với các chế độ vận hành của máy electropsraying tạo hạt micro-nano được nghiên cứu cẩn thận Hơn nữa, việc hiểu rõ các đặc tính của chitosan và dung dịch chitosan cũng góp phần đánh giá khả năng tải thuốc, bao thuốc và nhả thuốc của hạt micro-nano chitosan hình thành [54]

Thứ ba, cơ sở khoa học để luận án đề cập đến là mức độ ảnh hưởng đặc tính phân hủy của hệ vật liệu y sinh lên khả năng nhả thuốc do phân hủy là một trong những cơ chế nhả thuốc chính của polymer y sinh [7], [31]-[34] Hạt micro-nano chitosan có độ bền cơ tốt nhưng rất khó kiểm soát quá trình nhả thuốc [21], [31] Trong khi hydrogel có độ bền cơ thấp và kiểm soát thuốc phụ thuộc vào đặc tính hydrogel và thuốc [50] Do đó, luận án này sẽ làm rõ cơ chế phân hủy hệ vật liệu tác động đến sự nhả thuốc, cũng như sự phù hợp của dạng thuốc đối với từng hệ vật liệu Các hydrogel và hạt chitosan

được thử nghiệm phân hủy in vivo kết hợp với phân hủy in vitro để phân tích cơ chế

phân hủy nhằm dự đoán quá trình nhả thuốc

Cuối cùng, luận án này đề cập các giải pháp cải thiện hay khắc phục nhược điểm của từng hệ vật liệu khi làm hệ dẫn truyền thuốc, đặc biệt định hướng áp dụng dẫn truyền thuốc ưa nước exendin-4, chữa bệnh tiểu đường tuýp 2 Copolymer lưỡng tính PLA-PEG-PLA ngoài tính chất một hydrogel còn là một micelle với vỏ là thành phần ưu nước PEG, lõi là PLA kị nước nên dự đoán gặp khó khăn khi làm chất dẫn truyền thuốc ưa

12

nước [55]-[57] Thuốc ưa nước được giữ ở vỏ PEG, không bao gói tốt nên dễ bị rò rỉ trên đường đến đích, hay gây hiện tượng nhả nhanh Do đó, ý tưởng dẫn truyền thuốc ưu nước bằng kết hợp hạt micro-nano chitosan và hydrogel nhằm tận dụng hai rào cản quá trình phân tán thuốc vào môi trường Rào cản thứ nhất là sự khuếch tán thuốc ra khỏi hạt chitosan để phân tán vào cấu trúc hydrogel Rào cản thứ hai là thuốc khuếch tán ra khỏi hydrogel Điều này sẽ làm cho hệ ổn định, tránh nhả thuốc nhanh ban đầu, dễ kiểm soát tốc độ và kéo dài thời gian nhả thuốc

Tình hình nghiên cứu

Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.4.1.1 Các nghiên cứu về hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH

Các đề tài nghiên cứu polymer y sinh được phát triển khá mạnh khoảng 30 năm gần đây Đặc biệt, các công bố hydrogel nhạy nhiệt từ các copolymer lưỡng tính được tổng hợp từ PLA, PCL, PLGA và PEG rất nhiều Trong khi đó, hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH còn hạn chế Tuy nhiên, nhìn chung các nghiên cứu về hydrogel tập trung nhiều vào các vấn đề sau:

- Thứ nhất là phương pháp tổng hợp hydrogel có cấu tạo copolymer lưỡng tính Theo các tác giả K.Jelonek [11], A Basu [12], K.Shi [55], và Q Breche và cộng sự [56], phương pháp tổng hợp copolymer nhạy nhiệt từ PLA và PEG chủ yếu dựa vào phản ứng mở vòng D, L-Lactide với sự có mặt của xúc tác stannous octoate hay tin (II) 2-ethyl hexanoate (Sn(Oct)2) theo phản ứng (1.1):

(1.1)

Sự có mặt của Tin (II) 2- ethyl hexanoate (Sn(Oct)2) làm tăng hoạt các điện tử ở các vị trí liên kết có chênh lệch độ âm điện lớn, chẳng hạn như -CO-O-C-, làm đứt liên kết carbonyl-oxyl dẫn tới mở vòng D,L-Lactide Các phân tử này khi mở vòng sẽ phản

13

ứng với nhau ở điều kiện thích hợp tạo liên kết ester, đây là cơ sở cho sự polymer hóa diễn ra Sản phẩm copolymer tạo thành có khối lượng phân tử khác nhau tùy theo nguyên liệu, điều kiện phản ứng, tỉ lệ thành phần, xúc tác và được chứng minh qua phân tích phổ 1H NMR, GPC Quan trọng là, quy trình phản ứng không phức tạp, hiệu suất phản ứng cao Trong khi đó, một số ít công bố hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH được tạo thành bằng cách phản ứng giữa chất có nhóm nhạy pH như nhóm amide (OS), poly(β-amino ester) PAE với copolymer nhạy nhiệt PCL-PEG-PCL [13], [49], [58], [59] Phản ứng được thực hiện thường sử dụng nhiều xúc tác và dung môi

- Thứ hai là khả năng tạo sol-gel của hydrogel Đây là tính chất tiên quyết chứng tỏ hydrogel là một polymer thông minh Trên giản đồ sol-gel của hydrogel có ba trạng thái vật lí bao gồm: trạng thái sol (chảy lỏng), trạng thái gel (không chảy) và trạng thái kết tụ (precipitation - co gel, đùn nước) Khả năng chuyển đổi pha của hydrogel nhạy nhiệt phụ thuộc chủ yếu vào phân tử lượng, tỉ lệ thành phần kị nước/ưu nước, nồng độ copolymer, và nhiệt độ [37], [49], [51], [55] Hình 1.6 cho thấy khả năng tạo gel của các copolymer lưỡng tính từ PDLLA và PEG phụ thuộc vào nồng độ, nhiệt độ và tỉ lệ PDLLA/PEG [55] Hydrogel S1 (PDLLA1000-PEG1000-PDLLA1000) gần như không gel được ở 37°C tại nồng độ khảo sát 10% - 25% do khối lượng phân tử PEG, PDLLA thấp, trong khi đó S3 (PDLLA1500-PEG1500-PDLLA1500) có cùng tỉ lệ PDLLA/PEG giống S1 nhưng lại cho vùng gel rất rộng tại nhiệt độ 37°C S2 (PDLLA1300-PEG1500-PDLLA1300) có cùng phân tử lượng PEG giống S3 nhưng tỉ lệ PDLLA/PEG nhỏ hơn thì vùng gel lại hẹp hơn Tuy nhiên, các hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA S1,S2, S3 gần như có quy luật giảm LCGT và tăng UCGT khi nồng độ tăng

Hình 1.6 Giản đồ sol-gel của copolymer PDLLA-PEG-PDLLA theo nồng độ và nhiệt độ với phân tử lượng khác nhau S1, S2, S3 [55]

14

Trong khi đó, khả năng chuyển pha sol-gel của copolymer nhạy nhiệt, nhạy pH thể hiện rõ phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và khối lượng Theo Ho và cộng sự [51], giá trị pH tới hạn của gel CGpH (critical gel pH) phụ thuộc vào khối lượng oligomer PA (polyamide) nhạy pH Với cùng tỉ lệ PCL/PEG, PA có phân tử lượng nhỏ (Mn=1757) sẽ có giá trị CGpH là 7,8, trong khi phân tử lượng PA tăng lên (Mn=3182) thì CGpH tăng lên 8.2 (hình 1.7)

Hình 1.7 Giản đồ sol-gel của pentablock PA-PCL-PEG-PCL-PA theo pH và nhiệt độ với tỉ lệ PCL/PEG và khối lượng oligomer PA nhạy pH khác nhau [51]

Oligomer PA có khối lượng lớn đáp ứng mạnh với pH được giải thích là do các chuỗi PA không ion hóa trở nên kỵ nước hơn nên làm gia tăng tính kỵ nước của copolymer, dẫn đến việc tăng mạng lưới đan xen kỵ nước và đóng gói chặt hơn trong cấu trúc

- Thứ ba là copolymer lưỡng tính có thể có cấu trúc micelles Hydrogel nhạy nhiệt PLA-PEG-PLA là dạng micelles có PLA nằm ở lõi của micelle và PEG nằm ở vỏ (hình 1.8) [11], [12], [55]

Hình 1.8 Sự hình thành micelle từ PLLA và PEG [11]

15

Cấu trúc copolymer lưỡng tính là micelle rất quan trọng khi làm hệ dẫn truyền thuốc Bởi vì, hydrogel đơn thuần theo bản chất tự nhiên sẽ giữ thuốc ưa nước tốt, nhưng nếu copolymer được xem như micelle thì sự tương thích của thuốc và micelle sẽ quyết định khả năng tải thuốc Lõi micelle (PLA) sẽ giữ thuốc kị nước và ngược lại thuốc ưa nước được giữ vỏ (PEG) Độ bền cơ học của micelle ảnh hưởng đến khả năng tải thuốc và nhả thuốc Thông số này phụ thuộc vào nồng độ micelle, do đó để đạt độ bền cơ thì nồng độ phải cao hơn CMC (critical micelle concentration) Phổ 1H NMR trên hình 1.9 làm rõ đặc điểm copolymer PLA-PEG có cấu trúc micelle Trong dung môi CDCl3 các đỉnh proton nhóm –CH và –CH3 của PLA và –CH2 của PEG đều thể hiện rõ ở 1,5 ppm; 5,2 ppm và 3,6 ppm tương ứng Tuy nhiên, trong dung môi D2O, đỉnh proton nhóm –CH của PLA gần như không xuất hiện Điều này có thể nói rằng PLA nằm trong lõi của copolymer

Hình 1.9 Phổ 1H NMR của copolymer PLA-PEG: 1) trong D2O; 2) trong CDCl3 [11] - Thứ tư là vấn đề phân hủy của copolymer Phương thức nhả thuốc của hydrogel thường theo 3 cách chính bao gồm khuếch tán thuốc từ polymer vào môi trường hoặc trương nở polymer từ từ nhả thuốc hay phân hủy polymer sẽ gây nhả thuốc [4], [7] Do đó, sự phân hủy vật liệu ảnh hưởng đến tốc độ nhả thuốc Các quá trình phân hủy của

hydrogel được thể hiện qua thử nghiệm in vitro và in vivo [11], [12], [37], [55] Trong đó, phân hủy in vitro được xem như thí nghiệm giảm khối lượng trong ống nghiệm (bên ngoài cơ thể sống) và ngược lại phân hủy in vivo được thí nghiệm trên cơ thể sống

Kết quả phân hủy in vivo hình 1.11b cũng phù hợp quy luật với phân hủy in vitro Từ

tuần 6 thì gel tăng nhanh tốc độ tiêu biến và biến mất hoàn toàn sau 10 tuần

Hình 1.11 PDLLA-PEG-PDLLA: a) phân hủy in vitro (GPC), b) phân hủy in vivo [55]

Đối với pentablock copolymer nhạy nhiệt, nhạy pH OSM-PCL-PEG-PCL-OSM,

thử nghiệm phân hủy in vivo thể hiện hình 1.12 [58] Tương tự hydrogel nhạy nhiệt, theo

thời gian, gel giảm kích thước, khối lượng Tốc độ giảm kích thước của khối gel ở những ngày đầu tương đối chậm, sau 7 ngày đầu tiên ~ 83% gel còn lại, 3 tuần tiếp theo, hơn 70% hydrogel đã bị biến mất Qua đó cho thấy, khi thời gian tăng lên, tốc độ giảm cấp phân tử polymer tăng lên do khuếch tán chất lỏng sinh học vào trong khối gel làm cho hydrogel xuống cấp nhanh chóng

17

Hình 1.12 Phân hủy in vivo của pentablock nhạy pH/nhiệt độ

OSM-PCL-PEG-PCL-OSM: a) 3 giờ, b) 1 tuần, c) 2 tuần, d) 3 tuần và e) Độ giảm khối lượng gel [54] - Thứ năm là vấn đề tương thích và độc tính của một hydrogel làm chất dẫn truyền

thuốc Đối với thử nghiệm in vitro, độc tính hydrogel chủ yếu đánh giá khả năng kháng khuẩn hay thử nghiệm sống của tế bào khi tiếp xúc với hệ Trong khi đó, thử nghiệm in

vivo tương thích hệ vật liệu được thực hiện với cơ thể sống của chuột cho thấy chuột

không phản vệ, chết và khối lượng cân nặng của chuột ổn định theo thời gian Tác giả K.Shi [55], thử nghiệm độc tính tế bào trên hệ PDLLA-PEG-PDLLA thông qua khả năng sống của tế bào L929 và HUVEC Theo hình 1.13, khả năng sống sót của cả tế bào L929 và HUVEC đều giảm từ từ khi tăng nồng độ PDLLA-PEG-PDLLA Tuy nhiên, ở nồng độ rất cao 2,5 mg/mL, tỉ lệ sống của tế bào vẫn cao hơn 85% Kết quả này chỉ ra rằng copolymer PDLLA-PEG-PDLLA là vật liệu an toàn

Hình 1.13 Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào L929 và HUVEC [55]

18

Hình 1.14 Mô tế bào xung quanh vết tiêm copolymer bằng kỹ thuật nhuộm HE [55] Hình 1.14 là kết quả thử nghiệm soi mô tế bào xung quanh chổ tiêm copolymer bằng kỹ thuật nhuộm HE (Haematoxylin and Eosin stain) Tuần đầu tiên, vị trí xung quanh vết tiêm có vùng thâm nhiễm lớn, đặc trưng cho viêm cấp tính với mật độ dày bạch cầu, tế bào lympho và đại thực bào Sau đó, theo thời gian, từ tuần 2 đến tuần 6, số lượng bạch cầu, tế bào lympho và đại thực bào giảm dần 10 tuần sau, mẫu mô gần như được trở lại bình thường, không bị tổn thương Điều này cho thấy, hydrogel PDLLA-PEG-PDLLA có thể có khả năng tương thích sinh học và được chấp nhận cho các ứng dụng y sinh

- Cuối cùng là đánh giá nhả thuốc của hydrogel Các kết quả công bố cho thấy tín hiệu tích cực như kéo dài thời gian nhả thuốc, ít có hiện tượng nhả thuốc ồ ạt [6], [11], [17], [37] Theo K.Jelone [11], H.Mao và cộng sự [37], một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhả thuốc như: pH, độ dài, cấu trúc của hệ vật liệu copolymer được thể hiện hình 1.15 Hydrogel từ PLA-PEG nhả thuốc paclitaxel ở pH 7,4 có chậm hơn so với pH 5,5 và pH 3,0 Điều này là do PLA phân hủy sẽ tạo acid lactic làm giảm pH dẫn đến sự nhả thuốc sẽ tăng lên Chiều dài và cấu trúc trạng thái của PLA (L, D, LD) ảnh hưởng đến khả năng nhả thuốc doxorubicin [37] Hình 1.15 cũng cho thấy, trong các triblock copolymer (3L, 3DL hay 3L/D) với PLA có độ trùng hợp DP (degree of polymerizaion) là 30 thì copolymer 3L/D có kết quả nhả thuốc chậm nhất Đối với các pentablock copolymer mạch dài (5 LD), PLA với DP 15 cho kết quả tốt nhất Việc giải thích liên quan đến dạng đồng phân đối quang (enantiomer)của PLA Sự trộn lẫn giữa đồng phân L và D của PLA làm cho cấu trúc có sự đóng gói nhỏ gọn nên quá trình phân hủy chậm hơn, sự nhả thuốc được kéo dài

19

Hình 1.15 Sự nhả thuốc của copolymer từ PLA và PEG: a) paclitaxel [6], b) DOX [17] Kết quả nhả thuốc insulin của hydrogel nhạy nhiệt, nhạy pH PAE-PCL-PEG-PCL-PAE hình 1.16 kéo dài thời gian hơn hydrogel nhạy nhiệt PCL-PEG-PCL [59] Cụ thể, hệ pentablock kéo dài đến 30 ngày so với hệ triblock chỉ trong 24 giờ Tương tự hệ hydrogel OSM-PCLA-PEG-PCLA-OSM nhả thuốc PTX cho kết quả khả quan [60]

Hình 1.16 Thử nghiệm in vivo nhả thuốc insulin hệ PAE-PCL-PEG-PCL-PAE [59]

Qua các nghiên cứu đã công bố về hydrogel thông minh cho thấy để hydrogel làm chất dẫn truyền thuốc tốt phải được đánh giá các tiêu chí bao gồm: cấu trúc, trạng thái tạo sol-gel, tính phân hủy, tương thích sinh học Trong đó, các yếu tố như tỉ lệ thành phần kị nước/ưa nước, nồng độ, nhiệt độ, pH quyết định đến đặc tính hydrogel và khả năng chứa thuốc và nhả thuốc Tuy nhiên, mỗi hệ copolymer lưỡng tính (hydrogel) có đặc điểm khác nhau và luôn luôn được phân tích rõ Đề tài này cũng theo xu hướng

20

nghiên cứu trên, ban đầu cũng lựa chọn thành phần nguyên liệu phù hợp với mục tiêu Với mong muốn hydrogel có khả năng tương thích sinh học, có độ bền cơ, kéo dài thời gian nhả thuốc tương ứng lượng gel tiêu biến dần nên luận án này lựa chọn PEG có khối lượng Mn=1750 để làm nguyên liệu tổng hợp copolymer PLA-PEG-PLA Nếu lựa chọn thành phần ưa nước (PEG) có khối lượng phân tử nhỏ thì khó kiểm soát vùng gel ở 37C do CMC thấp, gel cơ tính thấp Ngược lại khối lượng phân tử ưa nước lớn thì CMC cao, copolymer hình thành có khối lượng lớn nên ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy hydrogel [55] Bên cạnh đó, mặc dù tài liệu công bố về hydrogel nhạy cả nhiệt độ và pH rất ít nhưng các hydrogel này lại cho những kết quả tích cực như bền cơ tốt, tiêm dễ dàng, tăng thời gian nhả thuốc so với hydrogel nhạy nhiệt độ Do đó, đây cũng là hướng nghiên cứu mới mà luận án này hướng đến là tổng hợp pentablock nhạy nhiệt độ và nhạy pH định hướng làm tăng thời gian nhả thuốc

1.4.1.2 Các nghiên cứu về hạt micro-nano chitosan được tạo ra bằng phương pháp electrospraying để ứng dụng dẫn truyền thuốc

• Hạt micro-nano chitosan ứng dụng dẫn truyền thuốc được tạo bằng phương pháp electrospraying

Đối với lĩnh vực hạt micro-nano chitosan ứng dụng dẫn truyền thuốc bằng phương pháp electrospraying, các công bố tập trung các vấn đề:

- Tối ưu các yếu tố quá trình electrospraying để thu được hạt chitosan hình cầu, có kích thước mong muốn, đạt độ đồng nhất cao Hai yếu tố chính là thông số máy (hiệu điện thế, kích thước kim, khoảng cách điện cực, tốc độ phun) và thông số dung dịch (nồng độ polymer, độ nhớt, độ dẫn, sức căng bề mặt) được khảo sát để tối ưu Các hạt micro-nano tạo thành được kiểm tra hình thái bằng SEM, TEM [61]-[63] Theo N.Tram [53], D Thien và đồng nghiệp [63], để thu hạt micro-nano chitosan có hình dạng đẹp thì giọt dung dịch chitosan ở đầu kim thường dạng côn Các tác giả đã công bố sự ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan, hiệu điện thế, tốc độ phun, nồng độ chitosan, nồng độ dung môi acid acetic đến hình thái hạt chitosan và hạt chiosan bao thuốc indomethacin Với khối lượng phân tử 150 kDa, hiệu điện thế 20 kV, nồng độ chitosan 30 g/L trong nồng độ acid acetic 90%, kích thước đạt thu được khoảng 340 nm và không thay đổi nhiều so với hạt có tải thuốc (hình 1.17) [63]

21

Hình 1.17 Ảnh SEM hạt micro-nano chitosan: a) không có thuốc và b) có thuốc [63] - Đánh giá hiệu quả bao thuốc EE (encapsulation effciency) và khả năng tải thuốc LC (loading capacity) của hạt micro-nano chitosan Ưu điểm của phương pháp electrospraying là tạo hạt có EE khá cao Cụ thể, hạt micro-nano chitosan bao thuốc indomethacin đạt gần 80%, bao thuốc doxorubicin đến 67,9% [62], [63] Điều quan trọng là khả năng tương tác của thuốc và chitosan sẽ ảnh hưởng đến LC và EE Ví dụ, chitosan mang điện dương có thể kết hợp với thuốc mang điện âm như insulin bằng tương tác tĩnh điện thì EE càng cao, có thể đạt hơn 90% [58]

- Cuối cùng, đánh giá sự nhả thuốc và phân hủy của hạt micro-nano chitosan Theo

D Nguyen và cộng sự [58], sự phân hủy in vitro của hạt chitosan mang 10% insulin sau

9 ngày trong PBS 7,4 ở hình 1.18a cho thấy hạt cầu bị biến dạng nhiều, lớp bề mặt ngoài của hạt cầu trương lên và giảm cấp nhanh chóng Sự phân hủy này có liên quan đến sự nhả thuốc Tuy nhiên, tác giả cho biết nhờ sự tương tác tĩnh điện giữa nhóm (-NH2) bị ion hóa thành -NH3 của chitosan với các acid amino mang điện tích âm trên phân tử insulin, hình thành đơn vị ion phức nên có thể ức chế insulin giải phóng đột ngột ở thời điểm đầu Hình 1.18b cho thấy hạt chitosan có kích thước 340 nm nhả thuốc indomethacin trong 10 giờ khoảng 50% Theo tác giả D Thien [63], việc kéo dài thời gian nhả thuốc phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chitosan Chitosan có khối lượng phân tử lớn hơn (300 kDa) thì tốc độ chậm hơn so với chitosan có khối lượng phân tử thấp hơn (150 kDa) do sự hình thành lớp gel dày để bao thuốc Nhìn chung, hạt micro-nano chitosan thường khó kiểm soát nhả thuốc nhanh ở thời điểm ban đầu

22

Hình 1.18 a) Ảnh SEM hạt chitosan mang thuốc sau 9 ngày được ngâm trong dung

dịch PBS 7,4 [54], b) Sự nhả in vitro thuốc indomethacin của hạt chitosan [63]

• Biến tính hạt micro-nano chitosan

Để khắc phục một trong những nhược điểm của hạt micro-nano chitosan nhả thuốc nhanh, biện pháp thường đề cập đến là biến tính chitosan bằng các tác nhân khác nhau để cải thiện độ bền cơ hay gia tăng sự liên kết với thuốc Dưới đây là các cách biến tính được sử dụng:

- Quá trình ghép (grafted) chitosan: Yu và cộng sự [64] đã ghép được chất poly (Llysine) với chitosan và so sánh hiệu quả khi bao bọc DNA của plasmid cũng như hiệu ứng chuyển gen trong tế bào HEK 293T Trong cả hai trường hợp, vật liệu mới này cho thấy hiệu quả hơn so với chitosan trơn Hay một nghiên cứu ghép PEG lên chitosan một cách chọn lọc hóa học ở vị trí C6 của đơn vị lặp lại Hạt nano chitosan biến tính này mang lại hiệu quả chuyển gen mà không có gây độc tính khi thử nghiệm trong tế bào thần kinh [64] Trong khi đó, hạt nano chitosan được ghép try-polyphosphat có khả năng liên kết tuyệt vời với insulin Nghiên cứu các hạt nano của phức hợp polyelectrolyte chitosan và alginate tải insulin cho thấy sự tăng cường đáng kể trong hấp thu insulin ở ruột sau khi uống [65]

- Quá trình thiolated chitosan: Martien và cộng sự [66] đã biến tính chitosan bởi quá trình thiol hóa bằng cách đưa acid thioglycolic (TGA) vào chitosan thông qua sự hình thành liên kết amide Sản phẩm được áp dụng việc phân phối gen trị liệu qua đường miệng Vật liệu thể hiện hiệu quả trong việc chuyển gen trong tế bào Caco-2 với sự ổn định cao, và độc tính tế bào thấp

23

- Quá trình carboxymethylation: Chitosan được gắn thêm nhóm carboxymethy vào sườn cấu trúc để tăng cường thêm tính năng Chen và cộng sự [67] đã sử dụng dẫn xuất chitosan này để điều chế hydrogel nhạy pH phân phối protein Tan và cộng sự [68]

biến tính carboxymethyl chitosan bằng axit linoleic để đánh giá các nghiên cứu in vitro

Kết quả cho thấy sự nhả thuốc adriamycin được kéo dài và mức độ thay thế acid linoleic ảnh hưởng đến tốc độ giải phóng thuốc Hoạt tính chống tế bào HeLa khối u của các hạt nano biến tính rất khả quan Sodium acrylate được ghép vào carboxymethyl chitosan để tăng các nhóm carboxylic trong polymer bằng cách hình thành gắn kết Ca2+ trên liên kết các micelle- hydrogel Dẫn xuất này đã được đánh giá thành công trong việc phân phối thuốc kị nước [69] Jeong và cộng sự [70] sử dụng polyethylene bao thuốc kị nước

doxorubicin ghép với dẫn xuất carboxymethyl chitosan trong thử nghiệm in vitro đối

với tế bào u thần kinh đệm và cho thấy hoạt tính chống khối u của hệ vật liệu cho kết quả khả thi

Qua đó cho thấy, trên thế giới các nghiên cứu hạt micro-nano chitosan dẫn truyền thuốc khá nhiều Đặc biệt với phương pháp tạo hạt micro-nano bằng electrospraying, khảo sát tối ưu giữa thông số máy và thông số dung dịch polymer là cần thiết Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đầy đủ sự liên quan giữa tính chất hóa lí ban đầu của chitosan với điều kiện vận hành máy nhằm thu được hạt chitosan đạt yêu cầu về hình thái Đây là hướng mà đề tài này làm rõ nhằm làm giảm thời gian khảo sát do có thể dự đoán được sự phù hợp của vật liệu với điều kiện làm việc của máy Bên cạnh đó, các công bố cho thấy khả năng bao gói thuốc hạt micro-nano chitosan phụ thuộc vào sự tương tác giữa chitosan và thuốc Hạt nano chitosan có nhược điểm nhả thuốc nhanh ban đầu nếu không tương tác với thuốc Vì vậy, nhiều giải pháp biến tính chitosan để cải thiện đặc tính được sử dụng nhưng chủ yếu là phương pháp hóa học phức tạp, chưa kể có thể gây biến tính cho thuốc Trong khi đó, phương pháp biến tính vật lí chitosan hay kết hợp hạt micro-nano chitosan với hệ dẫn truyền khác chưa đề cập nhiều Do đó, hướng nghiên cứu của luận án này sẽ biến tính chitosan bằng phương pháp vật lí đơn thuần nhằm cải tiến đặc tính chitosan, đồng thời không biến tính thuốc