nghiên cứu quy trình tách chiết eurycomanone từ dịch chiết rễ cây bách bệnh eurycoma longifolia jack

Từ ngàn đời nay, công dụng của cây bách bệnh được biết đến là loài thực vật chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với tác dụng trị bệnh, tăng cường sức khoẻ, do đó có thể sử dụng chi

BÁO CÁO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH EURYCOMANONE TỪ DỊCH CHIẾT RỄ CÂY BÁCH BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y - DƯỢC

CBHD 1: TS.Phùng Văn Trung CBHD 2: ThS Nguyễn Minh Hoàng SVTH: Phạm Minh Sang

MSSV: 1553010166 Khoá: 2015 – 2019

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2019

BÁO CÁO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT EURYCOMANONE TỪ DỊCH CHIẾT RỄ CÂY BÁCH BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y - DƯỢC

Chữ ký CBHD 1 Chữ ký CBHD 2

CBHD 1: ThS Nguyễn Minh Hoàng CBHD 2: TS Phùng Văn Trung SVTH: Phạm Minh Sang MSSV: 1553010166 ThS Nguyễn Minh Hoàng TS Phùng Văn Trung Khoá: 2015 – 2019

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2019

Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong những năm tháng trên giảng đường đại học Chính những kiến thức mà Thầy Cô giảng dạy là nên tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của em đến thầy Nguyễn Minh Hoàng, người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dạy bảo và truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành đề tài khoá luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Phùng Văn Trung và mọi người tại phòng thí nghiệm trọng điểm Hoá dược (Trung tâm nghiên cứu và chuyển giao công nghệ − Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã hướng dẫn, tạo điều kiện làm việc tốt nhất và dành cho em sự quan tâm, giúp đỡ to lớn trong thời gian em thực hiện đề tài tại đây

Ngoài ra không thể thiếu sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể các bạn sinh viên đang làm khoá luận và học việc trong phòng thí nghiệm Hoá − Môi trường Mọi người đã luôn động viên, chia sẻ những khó khăn vui buồn trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian học việc tại phòng

Quan trọng nhất trong cuộc đời con, con kính gửi đến Bố Mẹ tình cảm sâu sắc tận đáy lòng con Nhờ có sự dạy dỗ, động viên, dìu dắt và tạo mọi điều kiện cho con có thể phát huy được những khả năng tiếp tục thực hiện niềm yêu thích của mình Con sẽ cố gắng và nỗ lực bước đi hết con đường tốt đẹp mà Bố Mẹ đã dành cho con Gửi lời chúc sức khoẻ đến tất cả mọi người và chúc các bạn của tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp của mình cũng như thành công trong cuộc sống

Xin cảm ơn tất cả mọi người!

Hồ Chí minh, ngày 02 tháng 06 năm 2019 Sinh viên

Bảng II.1: Chương trình dung môi phân tích eurycomanone trong

mẫu 26

Bảng II.2: Chương trình ổn định cột 28

Bảng II.3: Chương trình dung môi thứ nhất 30

Bảng II.4: Chương trình dung môi thứ hai 31

Bảng II.5: Chương trình dung môi thứ ba 31

Bảng II.6: Chương trình dung môi thứ tư 32

Bảng II.7: Chương trình dung môi thứ năm 32

Bảng II.8: Thể tích hứng chương trình dung môi thứ năm 32

Bảng II.9: Chương trình rửa cột 33

Bảng II.10: Chương trình dung môi chạy khối phổ LC – MS 34

Bảng II.11: Chương trình dung môi kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC 34

Bảng II.12: Chương trình dung môi ổn định cột 35

Bảng II.13: Chương trình dung môi chạy prep - HPLC thứ nhất 36

Bảng II.14: Thể tích hứng chương trình dung môi chạy prep - HPLC thứ nhất 37

Bảng II.15: Chương trình dung môi chạy semi prep thứ hai 37

Bảng II.16: Thể tích hứng chương trình dung môi chạy prep - HPLC thứ hai 37

Bảng II.17: Chương trình rửa cột 38

Bảng III.18: Kết quả khảo sát điều kiện chiết xuất eurycomanone 39

Hình II.1: Bông thấm chứa dịch chiết được sấy khô 29

Hình II.2: Vật chứa mẫu sử dụng cho quá trình chạy MPLC 29

Hình II.3: Vật chứa mẫu được gắn lên cột pha đảo C18 30

Hình II.4: Hệ thống máy HPLC điều chế Gilson PLC 2250 36

Hình III.1: Sắc ký đồ chương trình dung môi thứ nhất 39

Hình III.2: Sắc ký đồ chương trình dung môi thứ hai 40

Hình III.3: Sắc ký đồ chương trình dung môi thứ ba 40

Hình III.4: Sắc ký đồ chương trình dung môi thứ tư 41

Hình III.5: So sánh phân đoan 14 đến 20 với chuẩn eurycomanone bằng phổ UV 41

Hình III.6: Bảng thể hiện thời gian lưu của chuẩn eurycomanone 42

Hình III.7: Bảng thể hiện thời gian lưu của phân đoạn 14 đến 20 42

Hình III.8: Sắc ký đồ chương trình dung môi thứ năm 42

Hình III.9: Kết quả HPLC kiểm tra độ tinh khiết 43

Hình III.10: Sắc ký đồ chương trình dung môi chạy prep – HPLC thứ nhất 44

Hình III.11: Sắc ký đồ chương trình dung môi chạy prep – HPLC thứ hai 44

Hình III.12: Kết quả HPLC kiểm tra độ tinh khiết của HPLC điều chế 45

Phụ lục 1: Kết quả đánh giá độ tinh khiết sau khi chạy MPLC viii Phụ lục 2: Kết quả chạy LC – MS sau khi chạy MPLC ix Phụ lục 3: Kết quả chạy LC – MS chuẩn eurycomanone x Phụ lục 4: Kết quả so sánh phổ UV của phân đoạn 14 đến 20 với chuẩn eurycomanone xii Phụ lục 5: Kết quả đánh giá độ tinh khiết sau khi chạy HPLC

điều chế xiii

I.1.3 Phân bố thu hái và chế biến 3

I.2 Công dụng của cây bách bệnh I.2.1 Tác dụng dược lý 3

I.2.2 Một số kinh nghiệm chữa bệnh bằng cây bách bệnh 4

I.3 Thành phần hoá học I.3.1 Một số công trình nghiên cứu trong nước 5

I.3.2 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước 9

I.4 Hoạt tính sinh học của cây I.4.1 Hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét và gây độc tế bào 19

I.4.2 Hoạt tính kích thích tình dục 19

I.5 Phương pháp chiết xuất, cô lập và tinh chế hợp chất tự nhiên I.5.1 Phương pháp ngâm dầm 21

I.5.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng 21

I.5.3 HPLC điều chế (High Performance Liquid Chromatography) 22

I.5.4 Sắc ký trung áp (Medium Pressure Liquid Chromatography) 22

I.5.5 Phương pháp xác định cấu trúc 23

I.5.6 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 23

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Vật liệu 25

II.1.1 Đối tượng, phạm vi thí nghiệm 25

II.1.2 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 25

II.2 Phương pháp nghiên cứu II.2.1 Phân tích eurycomanone trong mẫu 26

II.2.2 Phương pháp phân tích bằng LC – MS 26

II.2.3 Khảo sát các điều kiện chiết xuất Eurycomanone 27

II.2.4 Khảo sát các điều kiện tinh chế eurycomanone 27

Chương III PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 Kết quả khảo sát các điều kiện chiết xuất eurycomanone 39

III.2 Kết quả khảo sát các điều kiện tinh chế eurycomanone 39

III.2.1 Kết quả khảo sát chương trình dung môi chạy MPLC 39

III.2.2 Kết quả khảo sát chương trình dung môi chạy sắc ký điều chế (Prep – HPLC) 44

Chương IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ IV.1 Kết luận 46

IV.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC viii

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hoá học các hợp chất thiên nhiên, một bộ phận của chuyên ngành hoá hữu cơ, đang có xu hướng phát triển mạnh mẽ Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ vượt bậc của y học Các hợp chất tự nhiên có dược tính sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu Nhằm tạo ra các sản phẩm chiết xuất từ thiên nhiên để đáp ứng nhu cầu đa dạng của con người

Các loại thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối ưu với các quốc gia đang phát triển như Việt Nam, vì khi sử dụng những loại thuốc có nguồn gốc tổng hợp hoặc nhập khẩu để điều trị sẽ gây tốn kém, bên cạnh đó còn có những phản ứng phụ không mong muốn làm ảnh hưởng đến sức khoẻ Để giải quyết những vấn đề trên thì việc lựa chọn các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược thiên nhiên đang là vấn đề được các nhà khoa học, bác sĩ quan tâm vì chúng mang lại nhiều ưu điểm như dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ Chính vì thế, những nghiên cứu gắn liền với các hợp chất tự nhiên ngày càng được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi

Bách bệnh hay còn gọi là mật nhân thuộc họ thanh thất (Simaroubaceae) phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á Ở Việt Nam, bách bệnh phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi thấp và trung du Các tỉnh Tây Nguyên và miền Trung gặp nhiều hơn ở các tỉnh phía Bắc

Từ ngàn đời nay, công dụng của cây bách bệnh được biết đến là loài thực vật chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học với tác dụng trị bệnh, tăng cường sức khoẻ, do đó có thể sử dụng chiết xuất từ loại thảo dược này để làm thực phẩm chức năng Hầu hết các bộ phận của cây đề có tác dụng chữa bệnh Các chiết xuất từ bách bệnh đã được y học cổ truyền sử dụng để điều trị bệnh sốt rét, làm thuốc tăng trưởng hoocmon sinh dục, tăng cường chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, làm thuốc hạ nhiệt, bổ sung năng lượng cho cơ thể, giúp giảm stress, tăng cường miễn dịch ngăn ngừa khối u và phòng lão hoá, hoạt tính chống oxy hoá,… Rễ bách bệnh được cho là thành phần có giá trị nhất, được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như đau nhức, sốt dai dẳng, sốt rét, suy dương, kiết lỵ, sưng tuyến và có thể dùng làm thuốc tăng cường

sức khoẻ cộng đồng và bảo vệ hạnh phúc gia đình hiệu quả Từ rễ đã phân lập được các quassinoid: eurycomanol, eurycomanone, eurycomanol 2 − O − β − D glucopyranosid và 13β, 18 − dehydroeurycomanol Trong đó, eurycomanol và eurycomanone được các nhà khoa học đi trước báo cáo rằng có chứa các hợp chất có hoạt tính điều tiết các con đường truyền tín hiệu, chống khối u, chống ký sinh trùng, có khả năng gây độc tế bào đối với tế bào gây ung thư ở người như ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đại tràng và chống loét, chống viêm,… Một hoạt tính rất nổi bật của loại cây này đó là hoạt tính tăng nội tiết tố testosterone ở nam giới, đã có rất nhiều nghiên cứu báo cáo về hoạt tính sinh học này trên chuột cũng như trên cơ thể người

Hiện nay trên thế giới, công nghệ chiết xuất và ứng dụng các chiết xuất từ bách bệnh đã được sử dụng rộng rãi trong cả dược phẩm và thực phẩm chức năng Riêng ở nước ta, bách bệnh mới chỉ được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, chưa có nhiều công trình công bố về vấn đề khai thác và ứng dụng của nó Bên cạnh đó, các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược được chiết xuất từ các loại thảo dược quí như sâm alipas và còn nhiều sản phẩm khác không có những sản phẩm chất lượng làm nền móng để đánh giá và so sánh nên đa phần không thể kiểm tra được hàm lượng chất bên trong đó có là bao nhiêu và độ tinh sạch như thế nào Với những tác dụng to lớn của loại thảo dược này, đồng thời nhằm tạo ra những sản phẩm có hàm lượng eurycomanone cao và tinh sạch để đánh giá các sản phẩm khác trên thị trường nâng cao giá trị sử dụng của rễ cây bách bệnh chúng tôi đã quyết định chọn đề tài “Nghiên

cứu quy trình tách chiết eurycomanone từ dịch chiết rễ cây bách bệnh

(Eurycoma longifolia Jack)”

Mục tiêu của đề tài:

− Nghiên cứu quy trình phân lập eurycomanone tinh khiết từ rễ cây bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) bằng phương pháp HPLC điều chế

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Tổng quan về cây bách bệnh

I.1.1 Giới thiệu về cây bách bệnh

Cây bách bệnh hay còn gọi là mật nhân, hậu phác, tho nan (Lào), antoung sar (campuchia), Tongkat ali (Mã Lai) Tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack

(Crassula pinnata Lour.), thuộc họ thanh thất (Simaroubaceae)

I.1.2 Mô tả thực vật

Cây nhỏ có cành, lá kép lông chim lẻ gồm 10 đến 36 đôi lá chét, hầu như không có cuống, hình trứng dài, dày, nhẵn hoặc có lông ở mặt dưới Cây bách bệnh là loài đơn tính khác gốc (dioecious) nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái Hoa màu đỏ nâu mọc thành chùm, nở vào tháng 3 – 4 Mỗi hoa có 5 – 6 cánh rất nhỏ Cây kết quả vào tháng 5 – 6 Quả non màu xanh, khi chín đổi sang màu đỏ sẫm, nhẵn, hơi thuôn dài, đầu tù và cong, mặt trong có lông thưa và ngắn, dài từ 1 – 2 cm, ngang 0,5 – 1 cm Một hạt có nhiều lông ngắn

I.1.3 Phân bố thu hái và chế biến

Eurycoma Jack là chi nhỏ gồm những đại diện là cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á Vùng Đông Nam Á có ba loài và một vài dưới loài, trong đó đáng chú ý nhất là loài bách bệnh phân bố rộng rãi từ Myanmar đến các nước Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, đảo Sumatra Ở Việt Nam cây mọc phổ biến ở khắp nước ta nhưng phổ biến nhất ở miền Trung, Tây Nguyên, Tây Ninh, đặc biệt quanh vùng Biên Hoà, Trảng Bom và Định Quán − Đồng Nai Người ta dùng quả, vỏ thân và vỏ rễ phơi hay sấy khô làm thuốc (Đỗ Tất Lợi, 1999)

I.2 Công dụng của cây bách bệnh

I.2.1 Tác dụng dược lý

Theo Đông y, cây có vị đắng, tính ấm, dung chữa nhiều bệnh nên có tên là bách bệnh như: ăn không tiêu, tiêu chảy, nôn mửa, kiết lỵ,… Nước sắc lá cây trị ghẻ lở mụn nhọt Các quassinoid từ rễ cây có tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét Plasmodium (Chan và cs, 1989)

Sách những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của GS – TS Đỗ Tất Lợi có ghi như sau: trong vỏ cây mật nhân có chứa một chất đắng gọi là quassin Vỏ cây dùng chữa những trường hợp ăn uống không tiêu, đau mỏi lưng Quả của cây này dùng để chữa lỵ (Đỗ Tất Lợi, 1999) Theo từ điển cây thuốc Việt Nam của TS Võ Văn Chi, người ta dùng rễ cây mật nhân thái nhỏ, tẩm rượu sao để làm thuốc, có vị đắng, tính mát Thường dùng chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu, tức ngực, gân xương yếu, tay chân tê đau, tả lỵ, nôn mửa Còn dùng chữa tứ thời cảm mạo (Võ Văn Chi, 2003)

Tại Việt Nam rễ, vỏ và quả cây được dùng sắc thuốc, vị rất đắng Thuốc được dùng trị xổ giun, sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc, đầy bụng, và cả say rượu Khi dùng ngoài da thuốc có thể trị ghẻ lở Có lẽ vì đa dụng nên cây này được đặt tên là “mật nhân” Ngoài ra cây mật nhân có khả năng tăng kích thích tố testosterone nên trong giới lực sĩ, cây dùng như vị thuốc bổ để thêm năng lượng cơ thể giúp tăng cường chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa khối u và phòng chống lão hoá, giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể (Lương y Lê Trần Đức, 1997)

I.2.2 Một số kinh nghiệm chữa bệnh bằng cây bách bệnh

I.2.2.1 Điều trị các triệu chứng về rối loạn tiêu hoá, đường ruột, đau nhức xương khớp, tê thấp

Dùng 2 lít rượu với 0,2 kg rễ mật nhân Cây rửa sạch rồi chẻ nhỏ ra đủ kích cỡ lọt bình ngâm là được (bằng ngón tay), phơi khô, rượu ngâm sau một thời gian chuyển sang màu vàng tuỳ đậm đặc mà màu rượu vàng mức độ nào, tuỳ độ đặc mà người uống khi rót rượu từ bình ra khi uống có thể pha thêm rượu ở ngoài (Lương y Lê Trần Đức, 1997 và Võ Văn Chi, 2003)

I.2.2.2 Công thức trị đau gan, nước da vàng, ngứa, suyễn

Mật nhân tán cho nhuyễn, để bột uống hoặc làm hoàn, mỗi ngày uống 2 lần, mỗi lần 1 muỗng cà phê đầy Trong khoảng 1 – 2 tuần sẽ hết

I.3 Thành phần hoá học

Qua kết quả thu nhận từ các công trình nghiên cứu đã được công bố, đã phân lập hơn 65 hợp chất các loại từ rễ cây bách bệnh (Kuo và cs, 2004), thành phần hoá học của cây bách bệnh vô cùng phong phú và đa dạng, bao gồm nhiều hợp chất như các diterpenoids, triterpen với 3 khung sườn cơ bản như: quassinoid, squallan và tirucallan Ngoài ra, còn có các alkaloid, steroid, flavonoid Trong đó, quassinoid, alkaloid đóng vai trò quan trọng nhất và hoạt lực chủ yếu của cây bách bệnh (Zjengming Guo và cs, 2009)

I.3.1 Một số công trình nghiên cứu trong nước

Hiện nay trong nước chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học cây bách bệnh

Năm 1968 từ cao ete dầu hoả của vỏ và lá cây mật nhân, nhóm tác giả Nguyễn Ngọc Sương, trường Đại học Khoa học Sài Gòn đã phân lập được 7 hợp chất là β- sistosterol (1), campesterol (2), 2,6-dimethoxybezoquinone (3), eurycomalactone (4), dihydroeurycomalactone (5), laurycolatone A (6), laurycolactone B (7)

(3) 2,6-dimethoxybezoquinone

(4) Eurycomalactone

Năm 2006, GS.TS Trần Quán Anh, trung tâm nam học của bệnh viện Việt Đức - Hà Nội, đã nghiên cứu tính hiệu quả và an toàn của sản phẩm Khang Dược trong điều trị mãn dục nam Kết quả nghiên cứu trên 30 bệnh nhân sau thời gian sử dụng bước đầu cho thấy: 100% nam giới bị mãn dục nam có sử dụng mật nhân đều tăng nồng độ testosterone trong máu sau 3 tháng sử dụng Thuốc có tác dụng cải thiện sức khoẻ toàn diện, nâng cao chất lượng đời sống tình dục một cách tự nhiên, gia tăng ham muốn, tăng trương lực cơ, chống mệt mỏi, hồi phục nhanh sinh lực sau khi quan hệ tình dục Đối với những người bị rối loạn cương dương, xuất tinh sớm, thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị cùng với nhóm thuốc đặc hiệu, làm tăng khoái cảm, tăng khả năng cương cứng, kéo dài thời gian xuất tinh

(5) Dihydroeurycomalactone (6) Laurycolacton A

(7) Laurycolacton B

Năm 2006 nhóm tác giả Phạm Thị Như Hồng, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM đã phân lập 3 hợp chất triterpen là 25-O-methylpiscidinol A (8), tirucallan-7,24-diene-3-one (9) và epi-sapeline (10) cùng với hai hợp chất quassinoid là quassin (11) và 18-hydroxyquassin (12)

(8) 25-O-methylpiscidinol A (9) Tirucallan-7,24-diene-3-one

(12) 18-hydroxyquassin

Năm 2007, nhóm tác giả Trần Anh Tuấn, Trần Thị Thu Hương, Trần Hồng Quang, Nguyễn Tiến Hùng, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh, đã nghiên cứu thành phần hoá học cây bách bệnh và đã cô lập được 6 hợp chất là: 9-hydroxycanthin-6-one (13), 13,18-dihydroeurycomanone (14), kaempferol-3-0-α-rhamnpyrannoisid (15), eurycomanone (16), eurylene (17), 9-methoxylcanthin-6-one (18)

(17) Eurylene

(16) Eurycomanone (18) 9-methoxylcanthin-6-one

(13) 9-hydroxycanthin-6-one (14) 13,18-dihydroeurycomanone

I.3.2 Một số công trình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1982, nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Y dược Hiroshima, Nhật, từ rễ cây có nguồn gốc từ Indonesia đã cô lập được hai hợp chất quassinoid có số oxy hoá cao có tên là eurycomanone (19) và eurycomanol (20)

(19) Eurycomanone (20) Eurycomanol

Năm 1982, bằng phương pháp sắc kí, phương pháp nhiễu xạ tia X để xác định cấu trúc, Nguyễn Ngọc Sương, S.Bhatnagar, J Plonsky, M Vuihorgene, T Drange và C Pascal đã cô lập được hai hợp chất thuộc nhóm quassinoid 20 carbons, có tên gọi là laurycolacton A (21) và laurycolacton B (22)

(21) Laurycolactone A (22) Laurycolactone B

Năm 1986, nhóm tác giả gồm: K L Chan, M J O’Neil, T D Phillupson, D C Warhurst, từ cao eter dầu trích từ rễ cây, không những tìm thấy những hợp chất mới thuộc nhóm quassinoid như 3,4-dihydroeurycomalacton (23), 5,6- dehydroeurycomalactone (24), 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalacton (25), mà còn phát hiện thêm sự hiện diện của các alkaloid khác như 10-hydroxycanthin-6-one (26), là tinh thể màu vàng Đồng thời từ cao chloroform trích từ rễ cây bách bệnh nhóm tác giả đã phân lập được một hợp chất coumarin có tên gọi là scopoletin (27)

(23) 3,4-dihydroeurycomalactone (24) 5,6-dihydroeurycomalactone

(27) Scopoletin (25) 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalactone

(26) 10-hydroxycanthin-6-one

Năm 1989, nhóm tác giả K L Chan, S P Lee, T W Sam, B H Han, từ cao n-butanol trích từ rễ cây bách bệnh, nhóm tác giả đã cô lập được một quassinoid có tên gọi là eurycomanol-2-O-β-D-glucopyranoid (28)

(28) Eurycomanol-2-O-β-D-glucopyranosid

Năm 1991, nhóm tác giả H Taga, F Yasuda, K O Tani, M Doteuchi, Y I Shihara, M Shir, trong quá trình thử nghiệm hoạt tính sinh học của cây pasakbumi (bách bệnh), bên cạnh việc phân lập hợp chất paskbumin A (eurycomanone (29)) còn phân lập được hai hợp chất mới cũng có khung sường quassinoid là paskbumin B (30) và paskbumin C (31) từ cao methanol trích từ rễ cây bách bệnh

Eurycomanone

(30) R = β – epoxide (pasakbumin – B) (31) R = α – epoxide (pasakbumin – C)

Cùng thời điểm trên, nghiên cứu từ cao n-butanol trích ly từ rễ cây bách bệnh thu hái ở Indonesia, nhóm tác giả thuộc trường đại học y dược Hiroshima - Nhật đã cô lập được hợp chất longilactone (32) và ba hợp chất quassinoid có 19 carbons là 13,21-dihydroeurycomanone (33), 13β,21-dihydroxyeurrycomanone (34) và

14,15β- dihydroklaineanone (35)

(32) Longilactone (33) 13,21-dihydroeurycomanone

(34) 13β,21-dihydroeurycomanone (35) 14,15β-dihydroklaineanone Năm 1993, nhóm còn tiếp tục cô lập thêm 1 hợp chất quassinoid mới từ cao n-butanol có tên 1,2-seco-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasau-2,5-olide

Ngoài ra, khi tiến hành khảo sát dịch chiết từ lá cây bách bệnh bằng dung môi CH2Cl2 thu được hai hợp chất mới là 6-dehydrolongilactone (36) và 7α-hydroeurycomalactone (37)

1,2-seco-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasau-2,5-olide

(37) 7α -hydroxyeurycomalactone (36) 6-dehydrolongilactone Năm 1991, nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học y dược Tokyo - Nhật, trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây bách bệnh đã phân lập được hai hợp chất mới khung squallan Đây là hai đồng phân lập thể của nhau, gồm có eurylene (38) và teurylene (39), cả hai đều có dạng tinh thể không màu, có chung công thức phân tử là C34H58O8

(38) Eurylene

(39) Teurylene

Ngoài ra, từ dịch trích từ rễ cây bách bệnh với ete dầu, K L Chan, S P Lee, T W Sam, S C Tan, H Noguchi và U Sankawa đã cô lập được hợp chất 13β,18-dihydroeurycomanol (40) bằng cách kết tinh trong methanol

(40) 13β,18-dihydroeurycomanol

Năm 1990, nhóm đã phát hiện ra hợp chất longilacton (41), với cao methanol, H Itokawa, E Kishi, H Morita, K Takeya và Y Iitaka, thuộc trường đại học dược Tokyo - Nhật, đã cô lập được một hợp chất có mang khung squallan, tên là longilen peroxide (42) Đây là một hợp chấ không màu, có công thức phân tử là C30H52O8

(42) Longilen peroxid

Bên cạnh những hợp chất thuộc nhóm triterpen với khung chính là quassinoid, khi nghiên cứu hoạt tính sinh học của các cao trích từ rễ cây bách bệnh thu hái ở Kalimantan-Indonesia, nhóm nghiên cứu của trường đại học dược Illinois-Chicago, đã chứng tỏ trong cây còn chứa các alkaloid như canthin-6-one và β-carbolin Cụ thể là đã cô lập được sáu chất mới, trong đó có 4 chất thuộc canthin-6-one: 9-

metoxycanthin-6-one (43), 9-metoxycanthin-6-one-N-oxid (44), 6-one (45), 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxid (46), hai chất còn lại thuộc nhóm β-carbolin: β-carbolin-1-propinoic acid (47), 7-metoxy-β-carbolin-1-propinoic acid (48)

9-hydroxycanthin-(43) 9-metoxycanthin-6-one (44) 9-metoxycanthin-6-one-N-oxid

(45) 9-hydroxycanthin-6-one (46) 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxid

(47) Β-carbolin-1-propinoic acid (48) 7-metoxy-β-carbolin-1-propionic acid Năm 1992, tại trường đại học Y Dược Tokyo-Nhật, đã phân lập được hai hợp chất 6α-hydroxyeurycomalactone (49) và 11-dehydroklaineanone (50)

(49) 6α-hydroxyeurycomalactone (50) 11-dehydroklaineanone Đồng thời, tại đây H Itokawa, E Kishi, H Morita, K Takeya còn phát hiện thêm một số hợp chất thuộc nhóm triterpen với khung tirucallan gồm: niloticine (51), hydroniloticine (52), piscidinol A (53), bourjtinolon A (54), 3-episapelin A (55), melianone (56), hispidone (57), các hợp chất này được công bố có độc tính đối với một số loại tế bào ung thư

(51) Niloticin R = O

(52) Hydroniloticin R = OH

(53) Piscidinol A

(56) Melianone (54) Bourjtinolone A R = O

58A & 58B

Một đồng phân có nhiệt độ nóng chảy 56-580C, [α]D = +1.30, chất kia có nhiệt độ nóng chảy cao hơn 60 – 620C, [α]D = -2.50 là 2-hydroxy-3,2’,6’-trimetoxy-4’-(2,3-epoxy-1-hydropropyl)-5-(3-hydroxy-1-propenyl) biphenyl (59), có màu vàng và 2-hydroxy-3,2’-dimetoxy-4’-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5-(3-hydroxy-1-propenyl) biphenyl (60), có màu vàng

(59) R = OMe (60) R = H

Năm 1933, từ cao n-butanol, ngoài 2,5-olide (61), nhóm nghiên cứu tại đại học y dược Tokyo-Nhật, còn cô lập thêm một chất mới là 14-deacetyl eurylen (62)

1,2-seco-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasau-(61) 1,2-seco-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasau-2,5-olide

(62) 14-deacetyl eurylene

I.4 Hoạt tính sinh học của cây

I.4.1 Hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét và gây độc tế bào

Chan et al (1989) đã thử nghiệm dịch chiết của E.longifolia cho thấy có hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét P.falciparum trong điều kiện in vitro Các hợp chất phân lập trong cây mật nhân là: 10-hydroxycanthin-6-one, eurycomalactone, eurycomanone và eurycomanol cho tác dụng chống sốt rét (Chan và cs, 1989)

Kardono et al (1991) đã phân lập năm thành phần gây độc tế bào từ rễ của E.longifolia từ Kalimantan, Indonesia Có bốn alkaloid thuộc nhóm canthin-6-one, là 9-methoxycanthin-6-one, 9-methoxycanthin-6-one-N-oxide, 9-hydroxycanthin-6-one, và 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxide và một quassinoid là eurycomanone có tác dụng gây độc tế bào chống một số dòng tế bào ung thư như: (vú, đại tràng, phổi, da, các dòng tế bào kháng thuốc KB, và KB-V1 và bệnh bạch cầu (P-388) Ngoài ra các hợp chất eurycomanone và 7-methoxy-P-carboline-1-propionic acid cho thấy chống lại kí sinh trùng sốt rét P.falciparum (Kardono và cs, 1991)

Kuo et al phân lập và xác định được gần 65 hợp chất từ rễ cây của E.longifolia Trong đó tám hợp chất đã chứng minh khả năng gây độc mạnh đối với dòng tế bào ung thư phổi (A-549), bảy hợp chất tác dụng chống lại dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Hai trong số các hợp chất có tác dụng mạnh với ký sinh trùng sốt rét P.falciparum (Kuo và cs, 2003)

I.4.2 Hoạt tính kích thích tình dục

Tác dụng vượt trội của cây bách bệnh đã được chứng nhận và công bố rộng rãi với nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trên thế giới là khả năng tăng cường sức khoẻ tình dục cho nam giới, kích thích cơ thể tăng tiết hormon giới tính nam (testosterone) một cách tự nhiên Viện nghiên cứu rừng Malaysia (FRIM) trong chương trình hợp tác công nghệ sinh học với viện Công nghệ MIT Mỹ chứng minh lợi ích của cây bách bệnh trong chữa rối loạn cương dương do làm tăng testosterone Gần đây, các nhà khoa học Mỹ, Malaysia và Thái Lan đã nghiên cứu và kết luận: dịch chiết cây bách bệnh kích thích tiết testosterone tự nhiên ở nam giới lên 4,4 lần, do đó cơ thể nhanh chóng “hồi xuân”, cường tráng tràn đầy sinh lực như thời trai trẻ Các thí nghiệm mới nhất cũng xác định dịch chiết cây mật nhân làm tăng sinh

oxid nitric trong cơ thể, do đó có thể làm cương cứng cơ quan sinh dục nam Cây bách bệnh được đánh giá là thảo dược có hoạt tính cao và an toàn để tăng cường sinh lực tình dục cho nam giới Đó chính là chìa khoá duy trì sự hưng phấn và phong độ tình dục ở nam giới, ngăn chặn các dấu hiệu suy giảm khi bước vào độ tuổi trung niên, như giảm sự ham muốn, chất lượng sinh hoạt tình dục, xuất tinh sớm, thường gọi chung là yếu sinh lý hay chứng bất lực

Nhiều tạp chí về sức khoẻ cũng đã chứng minh rằng những chất có trong cây bách bệnh giúp hưng phấn tình dục, gia tăng tần suất hoạt động tình dục Có nơi còn xem cây bách bệnh như một Viagra thảo dược với tên thương mại là Via Plus hoặc Long Jack Tuy nhiên, những nghiên cứu độc tính trên thực nghiệm cho thấy rằng LD50 (liều giết chết 50 % động vật thử nghiệm) là 1,5-2 g/kg dạng dịch chiết cồn và 3 g/kg dạng nước Độc tính cấp xảy ra với liều 0,6 g/kg Độc tính bán trường diễn được khảo sát với liều 0,4 g/kg có thể gây suy gan, thận, lách và tinh hoàn Liều tối đa cho người lớn trong ngày không quá 1g (Zjengming Guo và cs, 2009)

I.5 Phương pháp chiết xuất, cô lập và tinh chế hợp chất tự nhiên

Chiết xuất là sử dụng một loại dung môi hữu cơ thích hợp có khả năng hoà tan chất cần tách, tinh chế và cô lập hợp chất mong muốn Các dung môi sau đây có thể được sử dụng trong quá trình chiết và tinh chế eurycomanone hiệu quả: methanol, ethanol, nước, ethyl acetate và carbon dioxide siêu tới hạn (supercritical fluid method) cũng có thể được sử dụng trong quá trình chiết

Các dược liệu khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp) Có nhiều phương pháp để tách chiết hợp chất hữu cơ ra khỏi cây dược liệu Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng - lỏng và chiêt rắn - lỏng Trong thực nghiệm việc chiết rắn - lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn - lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết Soxhlet, chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra, còn có chiết với phương pháp lôi cuốn bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method),…

I.5.1 Phương pháp ngâm dầm

Phương pháp ngâm dầm là phương pháp đơn giản và được sử dụng phổ biến để tách chiết hợp chất tự nhiên Đây là phương pháp chiết xuất rắn - lỏng bằng cách cho dung môi (pha lỏng) xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật (pha rắn) và hoà tan các hợp chất tự nhiên (Sarker và cs., 2006)

Nguyên liệu sau khi xây thành bột sẽ được ngâm trong bình chứa thuỷ tinh hoặc thép không gỉ có nắp đậy Tránh sử dụng bình nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hoà tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn hợp chất có chứa trong cây Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột dược liệu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hoà tan các hợp chất tự nhiên

Sau đó dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ được cao chiết Tiếp tục rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục chiết thêm vài lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý tránh nắp bình bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hoà tan dung môi đến đạt mức bão hoà, không thể hoà tan thêm được nhiều hơn, có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Phương pháp làm ở nhiệt độ phòng nên giữ hoạt tính của các hoạt chất chiết được

Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thi công, chiết nhiều lần tốn dung môi và thời gian chiết (Từ Minh Koóng, 2007)

I.5.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hoà tan vào nước hoặc loại có thể hỗn hợp vào nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi) Tuỳ vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở phân lớp trên hoặc dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: ether dầu hoả và n-hexan, ether ethyl, chloroform, ethyl acetate, n-butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hoà tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,…, đuổi dung môi, thu cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

I.5.3 HPLC điều chế (High Performance Liquid Chromatograph –HPLC)

Là phương pháp dùng để cô lập một lượng lớn mẫu chất dùng cho nhiều mục tiêu khác nhau như để phân tích phổ NMR, thử hoạt tính của chất cần tách… Thực hiện bằng cách mỗi lần tiêm vào máy một lượng mẫu nhất định; dùng cột phân tích có đường kính phù hợp lượng mẫu tiêm vào máy; lặp lại nhiều lần đến khi thu được lượng mẫu mong muốn

Ưu điểm: tách được những chất có lượng mẫu nhỏ; các hợp chất mà không thể tách bằng sắc ký cột thông thường hay sắc ký cột trung áp, vì toàn bộ quá trình tách đều được kiểm soát qua hệ thống máy tính

Nguyên tắc: mẫu được tiêm vào cột nhờ hệ thống tiêm mẫu, dung môi được bơm qua cột theo chu trình đã được cài đặt trước Chất tách ra khỏi cột sẽ được đầu dò UV phát hiện và truyền tín hiệu về hệ thống máy tính, dễ kiểm soát và lấy được mẫu theo ý muốn

I.5.4 Sắc ký trung áp (Medium Pressure Liquid Chromatography – MPLC)

Phương pháp dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều chất thành từng loại đơn chất riêng biệt, dựa vào độ phân cực khác nhau của các chất đối với hệ thống pha tĩnh (chất và silica gel) và pha động (một hoặc hệ nhiều dung môi) Dung môi được đẩy qua cột nhờ áp lực của bơm trung áp (áp suất P < 50 Bar)

Ưu điểm: thay thế phương pháp sắc ký cột thông thường để tách hợp chất, do sẽ rút ngắn thời gian tách; giảm thiểu thao tác cho người chạy cột (hứng mẫu, thêm dung môi); có thể điều chỉnh thời gian, lưu lượng mẫu; có thể thay đổi tốc độ dòng theo ý muốn

Cột sắc ký: sử dụng sắc ký pha thường và sắc ký cột pha đảo

Sắc ký cột pha thường: cột được nhồi silica gel pha thường; khi chạy chất phân cực mạnh được giữ lại trong cột, chạy dung môi từ hệ phân cực thấp đến phân cực cao

Sắc ký cột pha đảo: chất nhồi cột pha đảo thông thường là silica gel C18; khi chạy chất phân cực yếu sẽ được giữ lại trong cột, chạy dung môi từ phân cực mạnh đến phân cực yếu

I.5.5 Phương pháp xác định cấu trúc

Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy – MS)

Phương pháp khối (MS) là một kỹ thuật phân tích hoá học giúp xác định khối lượng các ion phân tử, các mảnh ion

Nguyên lý máy khối phổ: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí (bay hơi mẫu ở nhiệt độ và áp suất thích hợp); phân tích các ion, ghi tín hiệu theo khối lượng ion (m/z)

Máy MS hoạt động trong điều kiện: áp suất thấp, nhiệt độ cao, lượng mẫu phân tích rất nhỏ, chất khảo sát phải được chuyển sang thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ

Ưu điểm: có độ nhạt rất cao, thời gian đo ngắn và rất dễ dàng kết nối với cac thiết bị sắc ký; khối phổ cung cấp nhiều thông tin hữu ích cho các nhà khoa học, sinh học, vật lý, môi trường, phi hành gia để định danh các hợp chất

Nhược điểm: thiết bị đắt tiền, mẫu bị phá huỷ sau khi đo (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

I.5.6 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC)

Năm 1967, Horvath C G là người đầu tiên chế tạo máy HPLC để nghiên cứu về nucleotic Ngày nay, HPLC là một kỹ thuật dùng trong hoá phân tích để tách, định tính và định lượng từng thành phần trong hỗn hợp; HPLC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu như: dược phẩm, các dung dịch sinh ký, polymer thiên nhiên và tổng hợp, các dư lượng trong môi trường, các nguyên tố hiện diện trong mẫu phân tích ở dạng vết