xây dựng dữ liệu dna barcode vùng gen nrlsu its atp6 ở một số mẫu nấm thuộc chi cordyceps s l thu nhận tại vùng núi langbian lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -X0X -

XÂY DỰNG DỮ LIỆU DNA BARCODE VÙNG GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -^0^ -

XÂY DỰNG DỮ LIỆU DNA BARCODE VÙNG GEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Võ Thanh Nhàn

Ngày sinh:09/12/1999 Nơi sinh: An Giang

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã học viên : 1753010176 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ỷ KIÊN CHO PHÉP BAO VẼ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP CÙA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DÃN

Giảngviênhướngdẫn: , Tl kkC Ỉ.ỈÍ< T£llíiíì

Họcviên thực hiện: \k£ JX&íẠ Mk<Jj Lóp: nHÀ3 D.LJ

Ngày sinh: C.3 LÀLl A99ã Noisinh: AQ fo£jXUj

Tênđề tài: kÓ^ cÌÌ£l^ ẤÌ£ Jík<. Jỉ^K BùlCad^ A3Ũrifỵ.X^Q ỮxL^^

~ XIS “ A±p.G .d ũừ kạ mộ í£m :ửwL L^

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Công nghệ Sinhhọc trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt các kiếnthức cơ bản và rất cần thiết cho con đường học tập của sinh viên nói chung và củabản thân em nói riêng Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin được gửiđến giảng viên – TS Lao Đức Thuận đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em giúpem nhận ra con đường học tập em yêu thích là Sinh học phân tử và đã nhận em vàolàm việc trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thầy đã tận tình hướng dẫn,truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi đểem được học tập và nghiên cứu Bên cạnh đó em xin được cảm ơn các bạn sinh viênvà các anh chị phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã luôn quan tâm giúp đỡ, hỗ trợem trong quá trình thực hiện đề tài này Trên tất cả, con xin gửi lời cảm ơn đến cha,mẹ và chị em trong gia đình đã luôn tin tưởng, ủng hộ và động viên con mỗi khi convấp ngã Mọi người đã tạo điều kiện cho con học tập, tạo động lực cho con vững tinvà trưởng thành hơn trong cuộc sống này Cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô, cácanh chị, các bạn, gia đình và tất cả mọi người sức khoẻ dồi dào, hạnh phúc và gặthái được nhiều thành công trong cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn!

Bình Dương, ngày 22 tháng 6 năm 2021SINH VIÊN THỰC HIỆN

Võ Thanh Nhàn

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Nấm Ophiocordyceps ngoài tự nhiên 5

Hình 1.2: Cấu trúc và cặp mồi khuếch đại gen ITS 11

Hình 1.3: Cấu trúc gen và vị trí mồi LR0R/LR5 khuếch đại vùng gen nrLSU 12Hình 3.1: Kết quả kiểm tra mồi ITS1/ITS4 bằng công cụ trực tuyến BLASTtrên NCBI 31

Hình 3.2: Sử dụng Annhyb để kiểm tra vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩmvới Cordyceps militaris 32

Hình 3.3: Kết quả kiểm tra cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A trên công cụBLAST 33

Hình 3.4: Kết quả Annhyb cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A với trình tự genAtp6 33

Hình 3.5: Kết quả kiểm tra mồi LR0R/LR5 bằng công cụ BLAST 34

Hình 3.6: Kết quả Annhyb cặp mồi LR0R/LR5 trên trình tự gen nrLSU 35

Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU 37

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen ITS 37

Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen Atp6 37

Hình 3.10: Tín hiệu giải trình tự gen nrLSU ở mạch F và mạch R ở mẫuDL0036 38

Hình 3.11: Kết quả BLAST trình tự gen nrLSU mạch xuôi đã hiệu chỉnh 39

Hình 3.12: Kết quả dot plot trình tự gen nrLSU của mẫu DL0036 với trình tựtham chiếu 39

Hình 3.13:Tín hiệu giải trình tự gen nrLSU ở mạch F và mạch R ở mẫu

tham chiếu 44

Hình 3.22: Tín hiệu giải trình tự gen Atp6 ở mạch F và mạch R ở mẫu DL0036.45Hình 3.23: Kết quả BLAST trình tự gen Atp6 mạch xuôi đã hiệu chỉnh 45Hình 3.24: Kết quả dot plot trình tự gen Atp6 của mẫu DL0036 với trình tự

tham chiếu 46

Hình 3.25: Tín hiệu giải trình tự gen Atp6 ở mạch F và mạch R ở mẫu DL0099.46Hình 3.26: Kết quả BLAST trình tự gen Atp6 mạch xuôi đã hiệu chỉnh 47Hình 3.27: Kết quả dot plot trình tự gen Atp6 của mẫu DL0099 với trình tự

tham chiếu 47

Hình 3.28: Tín hiệu giải trình tự gen ITS ở mạch F và mạch R 48Hình 3.29: Kết quả BLAST trình tự gen ITS mạch xuôi đã hiệu chỉnh 48Hình 3.30: Kết quả dot plot trình tự gen ITS của mẫu DL0099 với trình tự

tham chiếu 49

Hình 3.31: Tín hiệu giải trình tự gen ITS ở mạch F và mạch R 50Hình 3.32: Kết quả BLAST trình tự gen ITS mạch xuôi đã hiệu chỉnh 50Hình 3.33: Kết quả dot plot trình tự gen ITS của mẫu DL0036 với trình tự

pháp lần lượt được biểu diễn là NJ/ML/MP trên vùng gen nrLSU-ITS-Atp6

(các con số hiển thị trên cây đều được giá trị bootstrap >= 50, mỗi phânnhánh được ủng hộ thông qua giá trị bootstrap với nhau.) 66Hình 3.38: Cây phả hệ phân tử được xây dựng trên loài khảo sát bằng phương

pháp lần lượt được biểu diễn là NJ/ML/MP trên vùng gen nrLSU-ITS (các

con số hiển thị trên cây đều được giá trị bootstrap >= 50, mỗi phân nhánhđược ủng hộ thông qua giá trị bootstrap với nhau.) 67

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thông tin cặp mồi khuếch đại các gen ITS, nrLSU, Atp6 sử dụng

trong nghiên cứu 25

Bảng 3.1: Các thông số vật lý của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 6 mẫu nấmký sinh côn trùng được tách chiết theo phương pháp phenol/chloreform 36Bảng 3.3: Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng.52Bảng 3.4: Kết quả chiều dài các trình tự trước và sau hiệu chỉnh 53

Bảng 3.5: Thông tin trình tự các vùng gen nrLSU, Atp6, ITS sử dụng cho xâydựng cây phát sinh loài đơn gen 55

Bảng 3.6: Kết quả dò tìm mô hình tiến hóa của các gen nrLSU, Atp6, ITS và đagen 61

Bảng 3.7: Kết quả định danh phân tử đơn gen dựa vào trình tự gen nrLSU 62

Bảng 3.8: Kết quả định danh phân tử đơn gen dựa vào trình tự gen Atp6 63

Bảng 3.9: Kết quả định danh phân tử đơn gen dựa vào trình tự gen ITS 64

Bảng 3.10: Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử đơngen và đa gen 70

Bảng 3.11: Thông tin các trình tự DNA barcode thu nhận được trong nghiêncứu 73

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

ITSInternal Transcribed Spacer

nrLSUnuclear ribosomal large subunit

Atp6Mitochondrially encoded ATP synthase 6

1.1.1 Phân loại khoa học 6

1.2 Tiềm năng ứng dụng trong y dược: 6

1.6.2 Nhóm gen giữ nhà (House keeping gene) 10

1.6.3 Những bước chính trong nghiên cứu cây phả hệ phân tử 14

1.7 Tình hình nghiên cứu: 18

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Vật liệu nghiên cứu 21

2.2.1 Mẫu nấm ký sinh côn trùng 21

2.2.2 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất 21

2.3 Các phần mềm sử dụng: 22

2.4 Tiến trình nghiên cứu: 22

2.4.1 Nghiên cứu in silico 23

2.4.2 Thực nghiệm 24

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả khảo sát mồi 29

3.1.1 Kết quả kiểm tra thông số vật lý của mồi bằng công cụ trực tuyếnIDT 29

3.1.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi ITS1/ITS4 bằng công cụ trực tuyến BLASTtrên NCBI 31

3.1.3 Kết quả kiểm tra cặp mồi ATP6-C1A/ATP6-C2A bằng công cụ trựctuyến BLAST trên NCBI 32

3.1.4 Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 bằng công cụ trực tuyến BLASTtrên NCBI 34

3.3.1 Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA 54

3.3.2 Xây dựng cây phát sinh loài phân tử 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cordyceps là một chi nấm ký sinh côn trùng (Kobayashi, 1982; Spatafora

& Blackwell, 1993), thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp

Pyrenomycetes, ngành nấm túi Ascomycota Thường được biết đến với tên

“Đông trùng hạ thảo”, một loại dược liệu quý đã được khoa học hiện đại chứngminh Nhóm này bao gồm những loại nấm ký sinh trên ấu trùng và cả các cá thểtrưởng thành của nhiều loại côn trùng khác nhau Sau khi xâm nhập vào cơ thểcôn trùng, bào tử nấm sẽ nảy mầm và phát triển thành hệ sợi nấm Hệ sợi nấm sẽxâm chiếm toàn bộ cơ thể côn trùng rồi hình thành quả thể khi gặp điều kiệnthuận lợi (Liu và cộng sự, 1998) Ghi chép khoa học đáng tin cậy đầu tiên đượcviết bởi tác giả Wu-Yiluo trong quyển Ben Cao Congxin (“New Compilation ofMateria Medica”) trong thời nhà Thanh (Holliday J và cộng sự, 2005) Nổi bật

trong chi Cordyceps là loài Ophiocordyceps sinensis được biết đến sớm nhất vàđược chứng minh có nhiều dược tính quý Ophiocordyceps sinensis có dạng nấm,

quả thể mọc trên xác sâu bướm ở độ cao trên 3.800 m ở Tây Tạng, các tỉnh ở

phía nam Trung Quốc, Nepal (Đào Duy Bái, Đông trùng hạ thảo, Nhà xuất bản

Y học, tr 3-5) Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps bao gồm 3 giai đoạn:

Xâm nhiễm vật chủ vào mùa hè, sinh trưởng và phát triển vào mùa thu và giếtchết vật chủ, qua mùa đông hệ sợi nấm sẽ phát triển cấu trúc thể bó chứa bào tửsinh sản (stroma), phát triển trên mặt đất vào mùa hè năm tiếp theo (Rizzo J vàcộng sự, 2007) Ngoài ra cũng có nghiên cứu ghi nhận một số loài trong chi

Cordyceps có khả năng tác động đến hành vi của côn trùng Ví dụ nhưCordyceps unilateralis đã tác động đến hệ thần kinh của kiến khiến nó phải leo

lên cây và bám trên cây trước khi chết, giúp các bào tử nấm được phát tán vàphát triển trên diện tích rộng (Cleaver và cộng sự, 2008).

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về các hợp chất

tự nhiên có trong nấm Cordyceps Đặc biệt là Ophiocordyceps sinensis, cácnghiên cứu cho thấy sinh khối của nấm Ophiocordyceps sinensis có đến hơn 20

công dụng chữa bệnh khác nhau như: có tác dụng hiệu quả trong điều trị các

bệnh về gan, thận, tim mạch, miễn dịch, thần kinh (Wang và Shiao, 2000), khảnăng điều hòa đáp ứng miễn dịch (Kuo và cộng sự, 1996), ức chế phát triển củatế bào khối u (Bok và cộng sự, 1999; Wang và Shiao, 2000), giảm huyết áp vàsự căng cơ (Chiou và cộng sự, 2000), Ngoài các công trình nghiên cứu hiệnđại, từ xa xưa ở Trung Quốc đã ghi nhận khả năng chữa các bệnh về phổi, hô hấp,yếu sinh lý, rối loạn miễn dịch và chống ung thư từ Đông trùng hạ thảo (Zhouvà cộng sự, 1998).

Trong lịch sử và cách sử dụng chung, thuật ngữ “Đông trùng hạ thảo”

thường dùng để chỉ loài Ophiocordyceps sinensis, tuy nhiên trong vài năm gần

đây thuật ngữ trên đã được dùng cho một số loài có quan hệ gần gũi, được đánh

giá là dễ nuôi trồng hơn Mặc dù Ophiocordyceps sinensis gần như là loài được

biết đến nhiều nhất, tuy nhiên khoa học hiện đại cũng đã phát hiện ra tiềm năng

dược liệu quý hiếm của nhiều loài thuộc chi Cordyceps (Cleaver và cộng sự,

2008) Ví dụ như Cordycepin là chất kháng ung thư hiệu quả (Itol và cộng sự,

1994) Cordycepin phân lập từ C Militaris cũng có chức năng kháng ung thư,

thú vị rằng loài nấm này còn được biết đến là Đông trùng hạ thảo cam với đặc

tính dễ nuôi cấy (Zhang J và cộng sự 2019) C cicadae có chức năng điều hòamiễn dịch (Weng và cộng sự, 2002), C phiogossoides có khả năng kháng ung

thư nhờ vào chất alkali-soluble polysaccharide có trong sinh khối (Yanada, 1984).Chính vì có những giá trị to lớn trong y dược nên việc xác định rõ các loài nấm

thuộc chi Cordyceps là một việc vô cùng quan trọng nhằm nhận định chính xác

giá trị của loài nấm đang sở hữu Tuy nhiên hiện nay việc định danh loài nấmnày thường dựa trên kỹ thuật phân tích hình thái theo Kobayashi (1982) Kỹthuật này được xem là chìa khóa vàng trong việc định danh tuy nhiên vẫn còngặp nhiều khó khăn do các đặc điểm, cấu trúc của các loài nấm có thể thay đổi đểthích nghi với môi trường Ngoài ra, với các mẫu nấm được thu nhận khi khôngcòn nguyên vẹn hoặc sau khi thu hái quá lâu cũng bị biến đổi về đặc điểm bênngoài khiến cho việc định danh bằng hình thái không còn hiệu quả Một pháthiện quan trọng trong nấm học vào thế kỷ XIX là nhiều loại nấm có khả năngthay đổi hình dạng hoặc kích thước để đáp ứng với sự thay đổi điều kiện môi

trường và có hai trạng thái sinh sản là vô tính (anamorph) và sinh sản hữu tính

(teleomorph) (Cummings và cộng sự, 2009) Tiêu biểu như Cordyceps

takaomontana có đặc điểm hình thái sinh sản hữu tính (telemorph) có bình và

quả thể, theo khóa phân loại của Sung và cộng sự (2007) đã đề cập đến thể vô

tính (anamorph) của nấm này lại là Isaria tenuipes Chính những vấn đề trên đòi

hỏi cần phải có một kỹ thuật định danh khác có thể khắc phục được những yếuđiểm của định danh hình thái.

Từ những năm 1980 trở lại đây phương pháp định danh phân tử được ứngdụng để nghiên cứu sự phát sinh loài được gia tăng (Hillis, 1987; Patterson, 1987;Doolittle, 1990; Hillisand Moritz, 1990) Do đó, hiện nay các nghiên cứu ngoàisử dụng định danh hình thái, phần lớn đều ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tửvào công tác định danh (Bok và cộng sự, 1999).

Điển hình như công trình nghiên cứu của Sung và cộng sự (2007) đã sắp xếp

lại hệ thống nhóm nấm cordyceps cũng như họ Clavicipitaceae dựa trên việc phân

tích các dữ liệu từ 5-7 gen thuộc nhóm gen giữ nhà (House keeping gene) gồm có:

nrSSU (nuclear ribosomal small subunit - tiểu đơn vị nhỏ ribosome), nrLSU (nuclear

ribosomal large subunit tiểu đơn vị lớn ribosome), Tef1 (elongation factor 1ɑ nhân tố kéo dài 1ɑ), Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớnnhất của RNA polymearse II), Rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II -tiểu đơn vị lớn thứ hai của RNA polymerase II), Tub (β tubulin) và Atp6

-(mitochondrial ATP6) của 162 taxon Kết quả nghiên cứu phù hợp với các phân tíchhình thái giải phẫu Qua công trình, các tác giả đã khẳng định các loài thuộc nhóm

nấm này nên được chia thành 3 họ là họ Clavicipitaceae với các chi Metacordyceps,

Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi Cordyceps; họOphiocordycipitaceae với hai chi Ophiocordyceps và Elaphocordyceps Ngoài ra,

nhóm tác giả Tang và cộng sự (2007) đã sử dụng gen nrSSU, nrLSU, Rpb2, Tub (β

tubulin) để xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen nhằm phân loại các chi

trong họ Sordariomycetes - thuộc ngành nấm túi Ascomycota Nhóm tác giả đã dựngcây đơn gen với bốn gen trên và nối gen nrLSU+nrSSU và nrLSU+nrSSU+Rpb2 và đưa ra một vài nhận xét như sau: cây phát sinh loài đơn gen nrSSU thể hiện mức

độ tin cậy cao hơn, mối quan hệ giữa các chi thể hiện rõ ràng hơn so với cây phát

sinh loài đơn gen của nrLSU và Rpb2 Cây phát sinh loài dựa vào gen nrSSU là câyđáng tin cậy tuy nhiên khi kết hợp cả gen nrSSU với nrLSU hoặc nrLSU với Rpb2

thì các nhánh trong cây có mức ý nghĩa của cây khá cao (dựa vào giá trị bootstrap và

bayesian), gen Tub kết hợp với gen nrLSU và Rpb2 cũng có kết quả khả quan Khi

kết hợp các gen thì làm tăng số lượng nucleotide kết hợp trong dữ liệu cục bộ, mộthướng giải quyết cho cây phát sinh loài.

Qua những nghiên cứu về cây phát sinh loài đa gen đã đề cập ở trên cho thấy việcphân tích dữ liệu các gen giữ nhà là cần thiết để hỗ trợ trong việc định danh cácloài nấm ký sinh côn trùng Việc kết hợp đa gen giúp làm tăng độ tin cậy của câyphát sinh loài Vì vậy, nhóm tiến hành nghiên cứu đề tài: “XÂY DỰNG DỮ LIỆU

DNA BARCODE VÙNG GEN nrLSU-ITS-Atp6 Ở MỘT SỐ MẪU NẤM

THUỘC CHI CORDYCEPS S.L THU NHẬN TẠI VÙNG NÚI LANGBIAN

-LÂM ĐỒNG”

TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN

1.1 Chi nấm Cordyceps s.l:

Hình 1.1: Nấm Ophiocordyceps ngoài tự nhiên (ảnh chụp bởi Daniel Winkler vào

tháng 6 năm 2008).

Chi nấm Cordyceps ước tính bao gồm hơn 400 loài (Kobayasi, 1982),

chúng phân bố rộng khắp thế giới gồm tất cả các vùng trên cạn ở độ cao từ 0 đếndưới 2000m, ngoại trừ Nam Cực Chúng thường phân bố ở nơi có khí hậu nhiệtđới và cận nhiệt đới, đặt biệt ở các vùng Đông Á và Đông Nam Á (Kobayasi,1941, 1982, Samson và cộng sự 1988) Chúng là một loại thảo dược rất quý ởTrung Quốc từ thời xa xưa với tên gọi “DongChongXiaCao”, còn ở Nhật bảnchúng được gọi là “Tockukaso” có nghĩa là “mùa đông là côn trùng, mùa hè là

thực vật” Chi nấm Cordyceps có tên như vậy là do đặc điểm quá trình phát triển

của chúng: đầu tiên nấm ký sinh vào ấu trùng của một số loài sâu bướm tạothành một tổ hợp ký sinh bao gồm phần xác của ấu trùng và chất nền của nấm.Do ấu trùng bị nấm xâm nhập vào mùa hè hoặc mùa thu, và bị tơ nấm biến thành“sâu cứng” vào mùa đông nên được gọi là “Đông trùng” (DongChong) Vào mùaxuân và mùa hè năm sau, phần nấm trồi lên khỏi mặt đất, chúng phát triển từ

phần đầu của ấu trùng và được gọi là “Hạ thảo” (XiaCao) (Zhang và cộng sự2019).

Theo y học cổ truyền, các loài nấm thuộc chi Cordyceps như

Ophiocordyceps sinensis, Cordyceps militaris có giá trị dược tính rất cao Theo

Dược điển Trung Quốc (2005) ghi nhận rằng các chức năng chính của O.

senensis là bổ thận, làm dịu phổi, tan đờm… Nó cũng có thể được sử dụng để

điều trị ho kéo dài do lao lực, hen suyễn, ho ra máu, liệt dương, di tinh,… Các

nghiên cứu về dược lý cũng đã chỉ ra C militaris có tác động đáng kể trên nhiều

loại bệnh và triệu chứng như các bệnh về hô hấp, thận, gan, thần kinh và timmạch cũng như khối u, lão hóa,…(G Yue và cộng sự 2008, S Das và cộng sự

2010) Chính vì lợi ích to lớn đối với sức khỏe mà sản lượng C militaris trong tự

nhiên ngày càng hiếm và không thể đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn của ngườitiêu dùng Do đó công nghệ nuôi cấy bắt đầu được sử dụng rộng rãi để sản xuất

hàng loạt sợi nấm C militaris và nhiều thành phần hữu ích khác (J Park và cộng

sự, 2001) Một số nghiên cứu chỉ ra rằng sợi nấm nuôi cấy của một số chủngnấm có tác dụng dược phẩm tương tự như các loại nấm nguyên liệu và được sửdụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe khác nhau (Wang và cộngsự 2012, Yu và cộng sự 2006).

1.1.1 Phân loại khoa học

Theo Kepler và cộng sự 2017, chi nấm Cordyceps được phân loại như sau:Giới: Fungi

Phân giới: Dikarya

Ngành: Ascomycota

Phân ngành: PezizomycotinaLớp: Sordairyomycetes

Phân lớp: HypocreomycetidaeBộ: Hypocreales

Họ: Clavicipitaceae

Chi: Cordyceps

1.2 Tiềm năng ứng dụng trong y dược:

a Điều trị ung thư:

Nhiều loài nấm trong chi Cordyceps có tác dụng kiềm chế sự phát triển

của khối u, tăng cường hệ miễn dịch và và tăng thể lực giúp ích cho các bệnhnhân ung thư Một số nghiên cứu đã chứng minh khả năng của chi nấm

Cordyceps như ức chế sự phát triển của tế bào khối u (Book và cộng sự, 1999),

khả năng kháng ung thư của alkali-soluble polysaccharide thu từ C.

phioglossoides (Yanada, 1984).

b Hỗ trợ hệ miễn dịch:

Chi nấm Cordyceps có chứa những hợp chất có khả năng điều hòa miễndịch cơ thể và phòng chống bệnh tật Cordyceps có hai chức năng là tăng hoặcgiảm miễn dịch Cordyceps có khả năng làm giảm miễn dịch thông qua kiểm

soát các rối loạn tự miễn dịch và viêm khi xảy ra tổn thương mô, ngăn chặn quátrình thải ghép sau khi cấy ghép nội tạng (Taylor và công sự, 2005), điều khiểnhệ miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch (Li và Tsim, 2004).

1.3 DNA barcode:

Mã vạch DNA (DNA barcode) là một phương pháp mới nhằm xác địnhbất kỳ loài nào dựa trên đoạn trình tự DNA được tách chiết từ một mẫu mô nhỏthuộc bất kỳ cơ quan nào của loài đó (Kress và cộng sự, 2012) Bằng cách ứngdụng những tiến bộ trong di truyền học phân tử, công nghệ giải trình tự và tinsinh học, mã vạch DNA cho phép chúng ta nhận dạng nhanh chóng và chính xáccác loài đã biết và truy xuất thông tin của chúng (Kress và cộng sự, 2012) Mãvạch DNA đã trở thành một công cụ quan trọng đối với các nhà phân loại học,những người chịu trách nhiệm kiểm kê và quản lý Đa dạng sinh học rộng lớn vàđang thay đổi của Trái Đất.

Mã vạch DNA, theo định nghĩa đơn giản nhất là một hoặc nhiều trình tựgen ngắn được lấy từ một phần của bộ gen được sử dụng để xác định loài Việcsử dụng các chuỗi DNA ngắn như vậy để nhận dạng sinh học lần đầu tiên đượcđề xuất bởi Paul Hebert và các cộng sự (Hebert và cộng sự, 2003) với mục đíchlà nhận dạng ở mức độ loài một cách nhanh chóng và đáng tin cậy trên tất cả cácdạng sống bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật, nấm Khái niệm về một

đoạn DNA có tính bao quát phổ biến có thể được sử dụng như một dấu hiệu nhậnbiết giữa các loài ban đầu được áp dụng cho động vật (Hebert và cộng sự, 2004).Tuy nhiên, sáu năm sau khi Hebert công bố bài báo đầu tiên về mã vạch DNAcho động vật thì một locus mã vạch DNA chuẩn cho thực vật mới được các nhàthực vật học chấp nhận Sau nhiều lần sàng lọc rộng rãi các vùng gen trong bộ

gen thực vật, ba gen ty thể (rbcL, matK, và trnH-psbA) và một vùng gen trongnhân (ITS) đã trở thành mã vạch DNA tiêu chuẩn được lựa chọn nhiều nhất để

ứng dụng cho thực vật và nấm (Plant working group, 2009).

1.4 Tách chiết và thu nhận DNA ở nấm.

Cấu tạo thành tế bào nấm bao gồm 80% polysaccharides góp phần giúpcho tế bào vững chắc (Bennett và cộng sự) Ngoài ra vách tế bào còn chứaprotein Các thành phần chính của polysaccharides gồm ɑ, β-glucan, chitin,chitosan (Vliegenthart và cộng sự, 2008) Các sợi ɑ, β-glucan được sắp xếpchồng chéo lên nhau chúng kết hợp với protein màng tạo nên mạng lưới thành tếbào chắc chắn (Bennett và cộng sự) Protein hoặc glycoprotein tham gia mộtphần nhỏ tạo nên thành tế bào Thành phần và cấu trúc của các tế bào có thể thayđổi theo tuổi tác và điều kiện sống (Bennett và cộng sự).

Ngành nấm túi Ascomycota có thành phần chính của vách tế bào là chitin

(Vliegenthart và cộng sự, 2008) Chitin có cấu trúc gần giống với cenllulose, sựkhác biệt duy nhất là trong chitin có các nhóm phụ aminoacetyl thay thế nhómhydroxyl gắn vào các nguyên tử carbon thứ hai của cenllulose Chitin nằm phântán xung quanh đan xen với β-(1-3) và β-(1-6) glucan trong vách tế bào (Klis vàcộng sự, 2002), ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình tách chiết và thu nhận DNA

của ngành nấm túi Ascomycota trong đó có chi nấm Cordyceps (Melo và cộng

sự, 2006).

Kuo và cộng sự đã nghiên cứu và bổ sung các chất bổ trợ cho việc táchchiết như là: (1) β-mecaptoethanol có vai trò loại bỏ protein do có khả năng cắtđứt liên kết disulfide làm cho cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của protein bị phá vỡ dẫnđến quá trình tủa protein dễ dàng hơn, (2) CTAB (Cetyltrimethyl ammonium

bromide) (Kuo và cộng sự, 2007) giúp thu nhận DNA đạt độ tinh sạch cao, nângcao hiệu quả tách chiết (Anderson và cộng sự, 2003).

1.5 Phương pháp PCR và giải trình tự

1.5.1 PCR (Polymerase chain reaction).

Năm 1983, Kary Mulllis người phát minh ra kỹ thuật PCR (4) PCR sửdụng những thành phần cơ bản của hệ thống sao chép phức tạp trong tự nhiên đểsao chép một đoạn ngắn DNA trong ống nghiệm Quá trình sao chép DNA gồmcó các thành phần: DNA khuôn, dNTP, mồi, enzyme polymerase, MgCl2 vàdung dịch đệm Phản ứng này được thực hiện trong máy luân nhiệt.

Một phản ứng bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm các bước: biến tính(DNA biến tính ở nhiệt độ cao 94oC-95oC và tách thành hai mạch đơn), bắt cặpmồi (nhiệt độ bắt cặp của mồi với mạch khuôn là Ta, Ta<Tm khoảng 5oC, TM lànhiệt độ nóng chảy của mồi, nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào trình tự mồi, ), kéodài (nhiệt độ được tăng lên 72oC để enzyme polymerase hoạt động, nối dài mạchmới) Sau n chu kỳ tạo được một số lượng 2nphân tử DNA mới từ 1 phân tửDNA gốc.

1.5.2 Giải trình tự

Phương pháp giải trình tự DNA là kỹ thuật xác định tất cả nhữngnucleotide cấu thành nên phân tử DNA Maxam và Gilbert (1997), Sanger vàcộng sự (1997) là những người đầu tiên công bố phương pháp giải trình tự.

Phương pháp giải trình tự dựa vào sự biến đổi hóa học của DNA được môtả bởi Maxam và Gilbert (1997) Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặctrưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học Nguyên tắccủa phương pháp này là:

(1): Đánh dấu một đầu của phân tử DNA cần giải trình tự bằng một gốc phosphođồng vị phóng xạ (32P).

(2): Xử lý đoạn DNA đã đánh dấu với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệumột hoặc hai loại base của nuleotide trên DNA.

(3): Nạp DNA đã xử lý vào 4 giếng trên gel polyacrylamide biến tính và tiếnhành điện di.

(4): Chiếu trên một phim nhạy tia X, những vị trí dừng lại của DNA trên gel điệndi tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều đánh dấu phóng xạ 32P Từđó có thể đọc được trình tự nuleotide của đoạn DNA.

1.6 Nghiên cứu phát sinh loài

1.6.1 Định danh phân tử

Định danh phân tử là phương pháp nghiên cứu về mối quan hệ giữa cácsinh vật ở mức độ phân tử dựa trên sự sai khác giữa các trình tự nuleotide và acidamin trong di truyền phân tử DNA, RNA, protein Trong nghiên cứu định danhphân tử, việc lựa chọn vùng trình tự DNA, RNA, protein để khảo sát giữa cácloài là rất quan trọng, các trình tự này cần có tính bảo tồn cao trong cùng mộtloài nhưng lại có sai khác lớn giữa các loài khác nhau Kết quả của định danhphân tử là một cây phả hệ phân tử Các nhà nghiên cứu có thể phân tích dựa trêncác tiêu chí như giá trị bootstrap, sự phân nhóm để lý giải mối tương quan giữacác đối tượng trên cây Ngoài ra việc kết hợp với các dữ kiện hình thái, giải phẫuhọc nhằm định danh chính xác các đối tượng quan tâm Hiện nay định danh phântử đang trở thành chủ đề nghiên cứu được chú trọng trong phân loại học, bổ sungcho định danh truyền thống Hỗ trợ định danh các loài mà định danh hình tháicòn hạn chế.

1.6.2 Nhóm gen giữ nhà (House keeping gene).

Nhóm gen giữ nhà là các gen được biểu hiện thường xuyên với mức độtương đối ổn định trong bất kỳ điều kiện nào, mã hóa cho các protein quan trọngtrong tế bào Các protein đó thường liên quan đến những chức năng cần thiết chosự sống như quá trình nuôi dưỡng và duy trì tế bào Do đó trong định danh phântử nấm, nhóm gen giữ nhà đã được sử dụng nhiều vì chúng là nhóm gen có tínhbảo tồn cao giúp ích cho việc so sánh và phân tích mối quan hệ giữa các loài.

Đối với nhóm nấm Cordyceps các gen nrSSU, nrLSU đã được sử dụng phổ biến

để nghiên cứu phát sinh loài.

1.6.2.1 Vùng gen ITS (internal transcribed spacers).

Hình 1.2: Cấu trúc và cặp mồi khuếch đại gen ITS (Brasilerio và cộng sự,

Các trình tự DNA trở thành cơ sở dữ liệu dùng cho hệ thống định danh

sinh học phân tử Các vùng gen phổ biến được sử dụng là gen ITS (internaltranscibed spacer), gen RNA ribosome (Capote và cộng sự,2012) Gen ITS phổ

biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở tất cả các loài sinh vật nhân chuẩn(Capote và cộng sự, 2012) Đặc điểm của các gen này là hiện diện hầu hết ở tấtcả các tế bào, chúng thường xuyên biểu hiện ở mức độ cao và có mức độ bảo tồncao.

Ribosome là một bào quan nhỏ có trong tất cả các tế bào của vi sinh vậtnhân sơ và nhân chuẩn Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổnghợp protein Các ribosome có cấu tạo từ rRNA và ribosome protein Mộtribosome gồm tiểu phần nhỏ và tiểu phần lớn Hai tiểu đơn vị này sẽ kết hợp vớinhau tạo ra một bào quan ribosome thực hiện quá trình dịch mã ở tế bào Ở sinhvật nhân chuẩn, tiểu phần nhỏ của ribosome (40S) chứa 18S RNA, tiểu phần lớnchứa 28S, 5.8S, và 5S RNA ribosome được phiên mã từ DNA ribosome DNA

ribosome bao gồm nhiều đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp lại bao gồm vùng LSU

(ribosome large subunit-25-28S), vùng 18S, ITS, 5.8S, 5S RNA và vùng IGS(intergenic spacer) Vùng IGS bao gồm phần ETS (external transcrible spacer) vàphần không phiên mã NTS (non-transcrible spacer).

Vùng ITS là locus phổ biến nhất được dùng trong nhiều nghiên cứu về

mức độ phân giới để xác định loài (Horton và Bruns (2001); Bridge và cộng sự,

2005) Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS rất thích hợp trong việc so

sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so sánh ở mức độ dưới loài.Chính vì vậy ở những nghiên cứu nhằm mục đích định danh trên loài (tiến hóa

lớn) người ta không chú trọng vào vùng gen ITS này Ribosomal DNA (rDNA)

trong hệ gen của sinh vật nhân chuẩn được cấu trúc thành 2 bộ đơn vị lặp lại(repeated units) trong đó gồm các vùng đệm mã hóa tách nhau 18S, 5.8S, và 28S

ribosomal RNA Chính sự biến đổi trong các vùng đệm (spacer) của vùng ITS đã

được chứng minh giúp phân biệt sự đa dạng của taxa khó xác định một cách rộng

rãi Vùng ITS gần như là vùng được giải trình tự DNA phổ rộng nhất hiện nay

trong giới Nấm, và cũng là vùng đặc trưng thuận lợi nhất cho hệ thống phân tử ởcấp độ loài Bruns và cộng sự (1993) đã thiết kế hai mồi ITS1-F và ITS4-B đượcdự đoán là đặc hiệu cho hai phân nhóm taxa nấm và basidiomycetes.

1.6.2.2 Gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit)

Hình 1.3: Cấu trúc gen và vị trí mồi LR0R/LR5 khuếch đại vùng gen nrLSU.Gen nrLSU là gen mã hóa RNA của ribosome nên chứa nhiều thông tin di

truyền có tính bảo tồn cao, được sử dụng phổ biến do có khả năng thiết kế các

cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự vùng gen nrLSU của nhiều loàinấm Gen nrLSU-rRNA là gen mã hóa RNA 25S-28S của ribosome (tiểu phần

lớn của ribosome) Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn cao nên phù

hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ hay xa hơn Trong nghiên cứu này sử dụng cặp

mồi LR0R/LR5 để khuếch đại gen nrLSU do cặp mồi có tính phổ quát và đã

được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu phả hệ phân tử nấm Cặp mồi nàykhuếch đại đoạn DNA khoảng 800-1300bp (Sonnenberg và cộng sự, 2007).

1.6.2.3 Gen Atp6 (Mitochondrially encoded ATP synthase 6)

Gen Atp6 thuộc nhóm gen giữ nhà (house keeping gene).

Gen Atp6 mã hóa cho enzyme ATPase của ty thể tiểu phần số 6 ATPase

là enzyme giúp ty thể thực hiện quá trình tạo năng lượng từ ADP chuyển thànhATP với sự hiện diện của kênh gradient proton qua màng, được tạo ra bởi tổ hợpvận chuyển điện tử của chuỗi hô hấp, cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động.

(Sun và cộng sự, 2003; White và cộng sự 1990) Atp6 là tiểu đơn vị của phức

hợp F1-F0 ATPase trong ty thể, được tìm thấy hầu hết ở sinh vật nhân chuẩn F1có chứa các lõi xúc tác trên màng và F0 nằm trong màng ty thể, có chứa các kênhproton màng, liên kết với nhau bởi một thân cây trung ương và một cuốn ngoạivi (Huang và cộng sự 2009) Tiểu đơn vị này là một thành phần quan trọng củacác kênh proton và đóng vai trò trực tiếp trong việc di chuyển của proton qua

màng Do gen Atp6 có chức năng quan trọng và gen có kích thước nhỏ thuộc

DNA ty thể nên được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ

gen phục vụ nghiên cứu về phân loại Điển hình gen Atp6 trong DNA ty thể củanấm men Saccharomyces cerevisiae có vị trí từ 28.487 bp đến 29.266 bp chiều

dài khoảng 779 bp (Foury và cộng sự, 1998).

Gần đây các nhà nghiên cứu nấm học như Spatafora và cộng sự 2007 đãtiến hành sử dụng các gen mã hóa cho protein có vai trò quan trọng trong tế bào

để bổ sung trong nghiên cứu phát sinh loài (Atp6, Rpb1, Rpb2, Tef, Tub ) (Sung

và cộng sự, 2007).

Hơn nữa, các nghiên cứu điều dựa vào DNA vì chúng có ưu điểm là chonhiều thông tin hơn, trong khi acid amin có tính thoái hóa Do DNA đột biếnnhiều hơn nhờ đó có thể chỉ ra mối quan hệ gần gũi giữa các loài tốt hơn dựa vàocác vùng biến động Cụ thể, Zukerkandl và Pauling nhận ra rằng trình tự chínhcủa acid nucleic chứa một nguồn thông tin phong phú về lịch sử tiến hóa

(Moreira D và cộng sự, 2000) Vì vậy, gen Atp6 giúp cải thiện được những hạnchế việc phân loại giữa chi và loài; cho thấy kiến thức về các mối quan hệ tiến

hóa của các loài trong cùng họ Clavicipitaceae (Sung và cộng sự, 2007) Một sốnghiên cứu đã sử dụng gen Atp6 như: Atp6 dùng kiểm tra mối quan hệ phát sinhloài giữa 27 đơn vị phân loại từ Boletales và 4 nhóm đối chứng (out group); pháthiện loài nấm mới Stachybotrys chartarum dựa trên cây phát sinh loài đa gen;phân loại phát sinh loài của nấm Cordyceps và Clavicipitaceous (Castlebury và

cộng sự, 2004; Kretzer và cộng sự, 1999; Sumit S.D và cộng sự 2011).

1.6.3 Những bước chính trong nghiên cứu cây phả hệ phân tử.

Bước 1: Sắp giống cột (xây dựng bộ dữ liệu cục bộ và xử lý bộ dữ liệu của phảhệ phân tử).

Sắp giống cột là phương pháp giúp phân tích những vùng trình tự khôngrõ ràng và kiểm tra việc chèn hoặc xóa gap (indels) để tiến hành xử lý trongchương trình dựng cây phả hệ phân tử.

Sắp giống cột là quá trình được thiết kế để đưa các khoảng trống vào trìnhtự để dịch chuyển các bazo đến các vị trí tương đồng tương ứng của chúng trongbộ dữ liệu trình tự, đồng thời giúp bộ dữ liệu đồng hóa về mặt độ dài và trình tự.

Kết quả cây phát sinh loài đều phụ thuộc vào bước sắp giống cột Cácvùng trình tự biến động và indels là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự saikhác về chiều dài của các trình tự trong bộ dữ liệu sau quá trình sắp giống cột.Swofford và cộng sự (1996) đã tiến hành loại bỏ indels sau khi sắp giống cột gópphần đồng nhất bộ dữ liệu và giúp đưa ra mô hình thay thế phù hợp nhất cho cáctrình tự Khi loại bỏ indels làm cho vùng biến động bị mất đi ảnh hưởng đến sựphân nhóm trong cây phát sinh loài.

Như vậy, khi sắp giống cột cần lưu ý một số điểm sau: Bước sắp giốngcột là bước quan trọng nhất trong xây dựng cây phát sinh loài vì nó giúp đưa bộdữ liệu vào mô hình tiến hóa một cách phù hợp nhất Ở bước sắp giống cột có thểdễ dàng chỉnh sửa, xóa một vùng không phù hợp và chèn hoặc xóa khoảng trốngđể phản ánh quá trình tiến hóa có thể xảy ra dẫn đến sự khác nhau giữa cácchuỗi trình tự Việc sắp giống cột rất hữu ích để thực hiện các phân tích dựa trên

dựa trên sự sai khác của các nucleotide, giúp chỉ ra các vùng bảo tồn ảnh hưởngđến kết quả, qua đó rút ra nhận xét mức độ tin tưởng của cây phát sinh loài cóphù hợp hay không.

Sắp giống cột hiện nay được thực hiện tự động bằng các phần mềm vi tính.Một số phần mềm giúp sắp giống cột trình tự dễ dàng có thể kể đến như: Clustalomega, MEGA, Sea view Trong nghiên cứu này, việc sắp giống cột được thựchiện bằng phần mềm MEGA X.

Bước 2: Lựa chọn mô hình tiến hóa tối thích.

Việc lựa chọn mô hình tiến hóa cũng rất quan trọng, mô hình tiến hóađược lựa chọn phụ thuộc vào kết quả của sắp giống cột Có hai mô hình tiến hóađược tính toán và đánh giá dựa trên các thuật toán khác nhau để xây dựng câyphát sinh loài cho dữ liệu trình tự Trong đó, một mô hình dựa vào sự thay thếgiữa các trình tự, mô hình còn lại dựa vào tỷ lệ xác suất, tần suất của sự thay thếgiữa các nucleotide trong các vùng trình tự của bộ dữ liệu.

Mỗi thông số tiến hóa trong mô hình tiến hóa đều làm rõ và thể hiện mứcđộ quan trọng trong bộ dữ liệu, tuy vậy một mô hình tiến hóa tốt nhất không phảilúc nào cũng phù hợp với hầu hết các thông số tiến hóa Mô hình tiến hóa tốtnhất là mô hình có càng ít thông số tiến hóa thì càng tối ưu và chính xác hơn, bởimỗi sự thiết lập thông số đều liên quan đến mức độ sai số khi xây dựng cây.

Trong trường hợp của các chuỗi DNA mã hóa cho protein đôi khi phụthuộc vào sự khác nhau của mẫu, những thay đổi hữu ích cơ bản nằm ở vị trícodon đầu tiên và thứ hai, còn vị trí thứ ba thì hoàn toàn ngẫu nhiên thông quaviệc xây dựng bộ dữ liệu, hoặc ở vị trí thứ 3 khi vị trí đầu tiên và vị trí thứ haikhông thay đổi Phương pháp sắp giống cột sẽ điều chỉnh cho tốc độ không đồngnhất này, mặc dù loại bỏ vùng không mã hóa protein sẽ thiết lập lại một cáchchính xác hơn về tỷ lệ không đồng nhất trong các vùng trình tự còn lại.

Bước 3: Xây dựng cây phát sinh loài.

Cây phát sinh loài được thực hiện bằng phần mềm MEGA X Hiện nayngười ta thường quan tâm đến hai phương pháp dựng cây phát sinh loài làphương pháp đặc tính và phương pháp khoảng cách.

Phương pháp khoảng cách là quá trình tính toán khoảng cách liên kết giữatừng cặp base theo một tiêu chuẩn tối thích và sử dụng kết quả khoảng cách trênđể xây dựng cây phát sinh loài Phương pháp đặc tính sẽ xây dựng một cây cơbản sau đó cây này được đưa vào các mô hình có các thông số tiến hóa để dò tìmra cây tối ưu dựa vào số liệu thực tế của các trình tự Khoảng cách giữa từng cặpbase, các tiêu chuẩn tối thích để xây dựng cây được xác định bởi địa hình họccủa cây (topology) Phương pháp khoảng cách áp dụng với phương phápNeighbor-Joining và phương pháp đặc tính áp dụng cho phương pháp Maximumparsimony và Maximum likelihood.

Phương pháp khoảng cách có thuật toán đơn giản và có lợi thế là có thểdùng như một mô hình tiến hóa của trình tự Các phương pháp dựa trên khoảngcách áp dụng phổ biến nhất là phương pháp gom cụm không có trọng số dùngtrung bình số học (UPGMA) và phương pháp Neighbor-joining (NJ).

Neighbor-Joining (NJ) là thuật toán được sử dụng rộng rãi, không phụthuộc tiêu chí tối ưu nào Đầu tiên các trình tự được xây dựng theo mô hình phânrã hình ngôi sao Hai trình tự có độ tương đồng cao nhất được xem là một nhánh.Một trình tự khác được so sánh với nhánh vừa tạo ra để tính khoảng cách tiếnhóa, bước này được lặp lại cho đến khi chỉ còn một trình tự được phân chianhánh Phương pháp NJ được thực hiện nhanh chóng nên thường được sử dụngđể phân tích bộ dữ liệu lớn với nhiều taxa.

Các phương pháp đặc tính có ít điểm chung với nhau, bên cạnh việc sửdụng các dữ liệu đặc tính ở tất cả các bước trong phân tích Điều này cho phépđánh giá mức độ tin cậy của từng vị trí trong sắp giống cột trên tất cả các vị trícủa trình tự trong bộ dữ liệu.

Phương pháp đặc tính thường được sử dụng là phương pháp MaximumParsimony (MP) Tiêu chuẩn MP giả định rằng cây tiến hóa tốt nhất mô tả quátrình tiến hóa tốt nhất, nghĩa là ít đột biến nhất Nguyên lý của phương pháp MPlà tìm kiếm một cây sao cho số lượng thay đổi tiến hóa là thấp nhất Khi phântích bằng MP thường sẽ có rất nhiều cây có cùng một điểm số tiến hóa Bởi vìmỗi cây đều được tối ưu như bất kỳ cây khác dựa vào nhóm, nhánh hiện tại có độ

bảo tồn cao trong tất cả các cây và được xem xét một cách cẩn thận nhờ vào cácbộ dữ liệu Cây khoảng cách và cây ML có xu hướng xác định một cây đơn tốtnhất phụ thuộc vào thuật toán liên quan đến phân chi nhánh và tính toán đến mứcđộ tiến hóa, trong khi cây MP chỉ đơn thuần tính toán từng mức độ tương đồnggiữa các trình tự để xây dựng cây.

Phương pháp Maximum likelihood (ML) còn gọi là khả năng tối đa làphương pháp mất nhiều thời gian nhất nhưng cho kết quả đáng tin cậy nhất MLsẽ tìm kiếm các mô hình tiến hóa để tìm ra khả năng tối đa nào cao nhất phù hợpvới bộ dữ liệu quan sát Trên thực tế, khi xây dựng mô hình tiến hóa ML đều phụthuộc vào kết quả sắp giống cột của từng vị trí base trên chuỗi trình tự Khả năng(likelihood) được tính toán dựa trên xác suất có điều kiện của các mô hình (môhình sẽ thay đổi phụ thuộc vào bộ dữ liệu) để tạo ra một mô hình thay thế phùhợp Sau đó, khả năng (likelihood) của tất cả các vùng trình tự được gom lại vớinhau để đưa ra một tham số chung nhất (likelihood of the tree) Đối với một câycụ thể thì bộ dữ liệu chứa vùng trình tự có độ tương đồng thấp thì khả năng xácsuất của cây không được đánh giá cao và ngược lại Các mô hình tiến hóa đềuđược tối ưu hóa để phù hợp với bộ dữ liệu quan sát Tuy nhiên phải có sự đồngđều giữa các mô hình tiến hóa với các thông số đặc trưng phù hợp với các vùngtrình tự trong bộ dữ liệu để tránh trường hợp khả năng xây dựng cây phát sinhloài theo một mô hình duy nhất đối với tất cả các bộ dữ liệu Vì mô hình đó phùhợp với quá nhiều vùng trình tự và sẽ tạo nên tính không đồng nhất của phươngpháp khả năng (likelihood) Việc giảm bớt các thông số thay thế sẽ làm thay đổicác khả năng của bộ dữ liệu liên quan đến quá trình xây dựng cây Như vậy câycó năng suất cao nhất là cây có mô hình chứa ít thông số thay thế nhất so với cácmô hình khác Cây phát sinh loài ML cần sử dụng nhiều thời gian để tính toán vàkhông thể đồng thời vừa tìm kiếm mô hình tiến hóa phù hợp vừa tối ưu hóa cácmô hình thay thế để phù hợp với bộ dữ liệu cho trước Trong nghiên cứu này môhình ML được xây dựng bằng phần mềm MEGA X.

Bước 4: Đánh giá cây phát sinh loài.

Cây phát sinh loài thường được đánh giá thông qua giá trị bootstrap đểkiểm tra độ chính xác và tin cậy của sự phân nhóm một loài trên cây Đây làphương pháp có thể áp dụng cho tất cả các phương pháp dựng cây cơ bản.

Giá trị bootstrap là số lần xuất hiện của một nhóm (cluster) trên số lầngiản đồ được thiết lập Đơn vị tính là phần trăm (%) Chỉ số bootstrap nói lên độtin cậy của sự gần gũi giữa các taxa được nhóm trên cây phả hệ.

Efron là người đã đề cập đến giá trị bootstrap trong quá trình xây dựngcây phát sinh loài vào năm 1979 Phân tích bootstrap là đánh giá các cấu trúc liênkết cây xây dựng cây phát sinh loài bằng số lần lặp lại giả định của dữ liệu Kếtquả phân tích bootstrap thường là một con số liên quan đến ngành cụ thể trongcây phát sinh loài, cung cấp tỷ lệ bootstrap để hỗ trợ định danh các đơn ngànhcủa nhánh phát sinh loài Tính giá trị bootstrap được thực hiện gồm hai bước thứnhất là so sánh dữ liệu mới thiết lập (các vị trí trong chuỗi trình tự được đảo chổcho nhau một cách ngẫu nhiên) so với bộ dữ liệu ban đầu và tính toán được mộtcon số tỷ lệ từ một ngành cụ thể xuất hiện trong nhánh của cây phát sinh loài.Con số đó được gọi là giá trị bootstrap và > 70% tương ứng với giá trị xác suất95% thì giá trị phân nhóm được ủng hộ mạnh mẽ Tương tự như vậy, nếu giá trịbootstrap lớn hơn 50% thì sự phân nhánh của trình tự trong bộ dữ liệu được ủnghộ đánh giá cao cho việc phân nhóm đó (Hillis và Bull, 1993) Tốc độ tính toángiá trị bootstrap phụ thuộc vào số lượng các trình tự, độ dài của trình tự(bootstrap phi tham số).

1.7 Tình hình nghiên cứu:

Chi nấm Cordyceps đã nhận được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà

khoa học trên thế giới nhờ vào tiềm năng dược tính của mình Tại Việt Namnhững năm gần đây cũng đã có nhiều nghiên cứu nhằm định danh và xác định

các hoạt chất trong chi nấm Cordyceps thu nhận tại Việt Nam, có thể kể đến như

các nghiên cứu: Lần đầu tiên tại Việt Nam Đái Duy Ban và cộng sự đã tìm vànhân nuôi thành công Đông Trùng Hạ Thảo với công trình “Nghiên cứu phát

hiện mới loài Đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae ở Việt Nam và xác định

một số hoạt chất sinh học trong đông trùng hạ thảo” vào năm 2009 Nhóm tác

giả Lê Thị Anh Đào và cộng sự đã công bố bài báo nghiên cứu phân lập và định

danh loài nấm Cordyceps pseudomilitaris tại núi Langbiang - Đà Lạt vào năm

2010 Năm 2011 Phạm Thị Hạnh và cộng sự đã phát hiện nhiều loài mới thuộc

chi Cordyceps, Ophiocordyceps langbianensis tại núi LangBiang, Lâm Đồng.

Năm 2012 Đặng Hoàng Quyên và cộng sự tiến hành khảo sát các hoạt chất cógiá trị trong y dược Năm 2014, Đinh Minh Hiệp và cộng sự đã nghiên cứu tiềm

năng và ứng dụng liên quan đến chi nấm Cordyceps với đề tài “Nghiên cứunhóm nấm Cordyceps ở Tây Nguyên và khảo sát tiềm năng ứng dụng của chúng

trong y dược” Cũng trong năm 2014 nhóm tác giả Vũ Tiến Luyện và cộng sự

đã nghiên cứu định danh phân tử gen nrLSU hỗ trợ định danh các chi nấm

Cordyceps thu nhận tại Langbiang - Lâm Đồng Ngoài ra còn có nhiều nghiên

cứu khác.

PHẦN II

VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 12/2020-6/2021

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Trường đại học Mở Tp HồChí Minh, 68 Lê Thị Trung, Tp Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Mẫu nấm ký sinh côn trùng.

Mẫu nấm ký sinh côn trùng DL0036, DL0091, DL0099 được Tiến sĩ TrươngBình Nguyên - Khoa Sinh học - Trường Đại học Đà Lạt cung cấp.

2.2.2 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất.2.2.2.1 Thiết bị:

Máy vortex ZX3, Velp (Ý)

Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)Bộ điện di DNA Mulpid@- One (Nhật)

Tủ lạnh (Sanyo)Tủ ủ nhiệtCân kỹ thuật

Tủ hút (Ascent Max)Máy đo OD

Máy luân nhiệt Benchmark, TC9636 (Mỹ)Bàn soi UV Major Scientific (Đài Loan)Lò vi sóng (Sharp)

2.2.2.2 Hóa chất:

Hóa chất dùng cho tách chiết DNA gồm:100mM Tris-HCl pH 1M

10mM EDTA 0.5MSDS 10%

NaCl 0.5M (đã hấp)β-mecaptoethanol 99.9%

Dd H2O (đã hấp)Proteinase K

PCI: Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v)TE buffer (Tris 1M pH 8.0 và EDTA 0.5M)

Ethanol 70%Isopropanol

Hóa chất cần cho phản ứng PCR và điện di gồm:Master Mix

Mồi xuôi 10 μMMồi ngược 10 μMDd H2O (đã hấp)Agarose 1.5gTBE 1X 100 mlGel red

2.4 Tiến trình nghiên cứu:

Mẫu nấm ký sinh côn trùng

Tách chiết DNA từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng theo phương phápPhenol/Chloroform

Khuếch đại vùng gen ITS, nrLSU, Atp6 bằng cặp mồi đặc hiệu tương ứng

Giải trình tự sản phẩm PCR đã khuếch đại và hiệu chỉnh trình tựKiểm tra độ tương đồng bằng phần mềm trực tuyến BLAST

Xây dựng bộ dữ liệu DNA

Dò tìm mô hình tiến hóa bằng phần mềm MEGA XDựng cây phát sinh loài (NJ, MP, ML)

Phân tích cây phát sinh loài

Kết luận tên cho các mẫu nấm ký sinh côn trùng

2.4.1 Nghiên cứu in silico

Thu nhận thông tin về gen ITS, nrLSU, Atp6 và cặp mồi đặc hiệu cho các

gen tương ứng Thu nhận thông tin về vai trò, chức năng, vị trí nằm trên exon,mức độ bảo tồn của gen Đồng thời tìm hiểu các nguyên nhân, lý do mà các

nghiên cứu trước đã sử dụng các gen ITS, nrLSU, Atp6 để tiến hành định danhcác chi nấm trong họ nấm túi Ascomycota Cặp mồi tương ứng của các gen Tiếp

theo tiến hành thu nhận thông tin về tiêu chí đánh giá cặp mồi này, các công trìnhnghiên cứu khác có sử dụng cặp mồi này, khảo sát kích thước sản phẩm khuếchđại khi sử dụng cặp mồi này.

Đánh giá thông số vật lý cho cặp mồi bằng phần mềm trực tuyến IDTanalyzer Các thông số của mồi phải đạt tiêu chí: Chiều dài trong khoảng 17-28bps, %GC nằm trong khoảng 40-60%, không có sự lặp lại các base G hay C liêntiếp dài hơn 3 base tại đầu 3’ của mồi, Tm nằm trong khoảng 50-65oC, ∆G(kcal/mole) của mồi >= 9Kcal/mole.

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng công cụ trực tuyến BLAST để kiểm trađoạn mồi có tính phổ quát hay không và mức độ tương đồng với các loài nào trêntrên ngân hàng dữ liệu NCBI.

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm Annhyb, kiểm tra kích thướcsản phẩm dự kiến có sai khác gì nhiều so với các nghiên cứu đã công bố haykhông.

Kiểm tra sản phẩm PCR và giải trình tự, các sản phẩm khuếch đại được kiểmtra lại dựa vào thang chuẩn, xác định kích thước sản phẩm có đúng với dự đoánhay không Tiếp theo, sản phẩm PCR được gửi giải trình tự tại công ty NamKhoa.

Ủ qua đêm ở nhiệt độ 65oC.

2.4.2.2 Tách chiết DNA

Ly tâm mẫu ở 13000 vòng/phút trong 10 phút.

Loại bỏ cặn, thu dịch nổi, thêm 700 μl dung dịch PCI(Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v)), đảo đều ống và ly tâm13000 vòng/phút trong 10 phút.

Thu dịch nổi, bổ sung 1 V chloroform, lắc đều sau đó ly tâm 13000vòng/phút trong 10 phút.

Thu dịch nổi, bổ sung 1/10 V NaOAc 3M, lắc đều, bổ sung 1V isopropanol,lắc đều và ủ ở 4oC trong 2h.

Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.

Bổ sung 1 ml ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, loạibỏ dịch nổi.

Loại bỏ ethanol và làm khô cặn.Bổ sung 50 μl TE.

2.4.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch của DNA đã tách chiết.

Xác định độ tinh sạch thông qua tỷ số OD260/OD280 Tỷ số OD260/OD280nằmtrong khoảng 1.8-2.0 được xem là tinh sạch.

2.4.2.4 Thông số cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR

Sử dụng các cặp mồi phổ quát để khuếch đại các gen ITS, Atp6, nrLSU

của các mẫu nấm ký sinh côn trùng Thông tin các cặp mồi được thể hiện trongbảng sau:

Bảng 2.1: Thông tin cặp mồi khuếch đại các gen ITS, nrLSU, Atp6 sử dụng trong

nghiên cứu.

GCG G

cộng sự,1990

cộng sự,1990

nrLSU LR0R (F) GTACCCGCTGAACTTAAGC 19 Vilgalys vàSun, 1994

Sun, 1994

C1A (F) GAG Và cộng sự,2004ATP-

C2A (R)

Và cộng sự,2004

2.4.2.5 Phản ứng PCR

Trong ống PCR thể tích 15 μl bao gồm:Master mix: 7.5 μl

Mồi xuôi (10 μM): 0.5 μlMồi ngược (10μM): 0.5 μlDNA mẫu: 2 μl

2.4.2.7 Đọc và hiệu chỉnh kết quả giải trình tự:

95oC5 phút

95oC30 giây

72oC1 phút

72oC5 phút

30 giây