khảo sát quy trình chế biến trà túi lọc từ lá diếp cá

Nội dung đề tài: - Khảo sát các quá trình trong quy trình chế biến trà túi lọc từ lá diếp cá: quá trình sấy, quá trình sao, quá trình phối trộn - Xác định thành phần các hợp chất có hoạt

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu thí nghiệm

Thời gian thực hiện: Từ ngày 1/10/2020 đến 15/6/2021

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm thực phẩm của khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Nguyên liệu được dùng là lá diếp cá được mua tại chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương, được phân loại và làm sạch để đảm bảo về sự đồng nhất của nguyên liệu về màu sắc, kích thước, loại bỏ các lá hư và dập nát Cỏ ngọt cũng được mua tại chợ Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương đã được làm khô

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị thông thường trong phòng thí nghiệm: tủ sấy, lò nung, nhiệt kế, bếp, máy xay, tủ cấy, đĩa petri, micropipet, ống nghiệm, erlen, becher, que cấy, đèn cồn, cân phân tích, máy đo OD, v.v

Hóa chất: NaNO2 5%, AlCl3 10%, NaOH 1M, dung dịch Folin – Ciocalteau,

Na2CO3 bão hòa, acid gallic, DPPH + , TTC (Tetrazolium Chloride), môi trường NA, môi trường NB, Dimethyl sulfoxid (DMSO),

Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu sản phẩm trà túi lọc từ lá diếp cá

Khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu Đề xuất quy trình dự kiến trà túi lọc diếp cá

Khảo sát các công đoạn chính của quy trình

Khảo sát hàm lượng polyphenol và flavonoid của cao và trà diếp cá

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao và trà diếp cá

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao và trà diếp cá Đánh giá chất lượng sản phẩm

Quy trình chế biến trà túi lọc từ lá diếp cá dự kiến

Hình 2.3: Quy trình dự kiến chế biến trà túi lọc từ lá diếp cá

Trà diếp cá Phối trộn Đóng gói

2.3.1 Nguyên liệu lá diếp cá

Lá diếp cá được mua tại chợ Thủ Dầu Một Nguyên liệu mua phải còn tươi, lá xanh, mướt, không bị sâu

Mục đích: Tạo sự đồng bộ nguyên liệu và loại bỏ tạp chất đất cát trong nguyên liệu, loại bỏ những nguyên liệu hư, không đạt tiêu chuẩn và làm sạch nguyên liệu góp phần nâng cao chất lượng của sản phẩm sau này

Cách tiến hành: Lá diếp cá mua về tiến hành loại bỏ những lá hư, già úa sau đó rửa sạch với nước, tránh làm giập lá và thất thoát chất dinh dưỡng

Mục đích: Giảm kích thước nguyên liệu để chuẩn bị cho quá trình sấy và góp phần hỗ trợ cho các quá trình tiếp theo.

Cách tiến hành: Dùng dao cắt lá từng khúc bằng nhau với kích thước khoảng

Mục đích: Làm giảm độ ẩm nguyên liệu đến độ ẩm thích hợp Dưới tác dụng của nhiệt độ góp phần tiêu diệt các tế bào vi sinh vật và thay đổi tính chất nguyên liệu và chuẩn bị cho quá trình xay Độ ẩm ≤ 8%

Cách tiến hành: Nguyên liệu sau khi được cắt khúc sẽ được rải đều trên khay cho vào máy sấy và sấy theo từng mốc nhiệt độ trong khoảng thời gian như khảo sát

50 0 C,60 0 C,70 0 C và 80 0 C Lâu lâu mở tủ sấy và đảo đều lá

Các biến đổi của nguyên liệu: Lượng ẩm giảm, thay đổi kích thước, giảm khối lượng, tăng độ giòn Xảy ra một số phản ứng oxy hóa làm biến đổi màu chlorophyll, các hợp chất polyphenol, trong nguyên liệu bị oxy hóa tạo màu nâu cho sản phẩm, các hợp chất mùi bị lôi cuốn theo hơi nước nên mùi của sản phẩm sẽ giảm

Mục đích: Phá vỡ các tế bào nguyên liệu, giảm kích thước nguyên liệu để thuận lợi cho quá trình trích ly các chất tan trong trà

Cách tiến hành: Nguyên liệu sau khi được sấy xong sẽ tiến hành xay bằng máy xay sao cho các lá có kích thước đồng đều

Mục đích : để kích thước lá được đồng nhất với nhau

Cách tiến hành: lá sau khi xay xong thì ray qua lỗ ray với kích thước 1mm 2.3.7 Sao

Mục đích: Dưới tác dụng của nhiệt tạo các phản ứng làm tăng cường màu sắc và hương vị cho sản phẩm đồng thời giảm hàm ẩm của sản phẩm xuống giá trị an toàn tăng thời gian bảo quản

Cách tiến hành: Trà bán thành phẩm sau khi được xay sẽ được sao khô bằng thiết bị sao trà trong khoảng nhiệt độ và thời gian như khảo sát 80 0 C, 90 0 C và 100 0 C Độ ẩm yêu cầu ≤ 5 %.

Các biến đổi: Thể tích nguyên liệu giảm, độ ẩm giảm, độ giòn tăng lên, tăng độ màu cho sản phẩm, tăng mùi vị thơm do các phản ứng hóa học xảy ra, các chất nhạy nhiệt bị phân hủy làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Giảm hoạt độ nước, giảm mật độ vi sinh vật

Mục đích: thêm cỏ ngọt sẽ tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm

Cách tiến hành: Phối trộn các nguyên liệu với nhau tỉ lệ thích hợp để chọn được tỉ lệ thích hợp nhằm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm

Mục đích: Bảo quản sản phẩm

Cách tiến hành: sau khi phối trộn xong sản phẩm ta cho sản phẩm vào túi lọc để bảo quản sản phẩm.

Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu

Tìm hiểu thành phần và tính chất nguyên liệu dùng trong quá trình nghiên cứu trà túi lọc từ lá diếp cá

Lá diếp cá mua về tiến hành khảo sát các thành phần theo bảng 2.1

Bảng 2.1: Phương pháp khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu

Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại, kết quả cuối cùng là giá trị trung bình 3 lần đo

2.4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ sấy đến chất lượng trà

Khảo sát quá trình sấy nhằm tìm ra thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu để tìm ra nghiệm thức cho giá trị cảm quan trà tốt nhất và đảm bảo độ ẩm thích hợp cho trà

2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng trà

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố, 3 lần lặp lại Tên yếu tố: Thời gian sấy – ký hiệu A

Thí nghiệm được tiến hành với 8 nghiệm thức như bảng 2.2

Thông số cố định: Nhiệt độ: 60 0 C

Chỉ tiêu Phương pháp Độ ẩm (%) Sấy đến khối lượng không đổi

Hàm lượng chất khô hòa tan ( %) Sử dụng Brix kế pH Sử dụng máy đo pH

Hàm lượng tro tổng (%w/w khô) Nung ở 550 - 600 0 C đến khối lượng không đổi Hàm lượng polyphenol (%w/w khô) Phương pháp Folin - Ciocalteu Hàm lượng flavonoid (%w/w khô) Phương pháptạo màu với AlCl3

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian sấy

Lá diếp cá sau khi mua về loại bỏ các lá hư và già, chọn những lá tốt đồng đều về màu sắc, không bị dập nát Cân 100 g lá diếp cá, cắt khúc 2-3 cm và tiến hành sấy ở 60 0 C với các mốc thời gian như bố trí ở bảng 2.2

Lá sau khi sấy được tiến hành đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm Tiến hành thực hiện lặp lại 3 lần mỗi nghiệm thức và ghi nhận kết quả

• Chỉ tiêu đánh giá Điểm đánh giá cảm quan theo chỉ tiêu màu sắc và mùi, theo phương pháp cho điểm với thang điểm như bảng 2.3 và độ ẩm ≤ 8%

Bảng 2.3: Chỉ tiêu cảm quan lá diếp cá sau khi sấy Điểm Chỉ tiêu cảm quan

5 Màu nâu, mùi thơm của diếp cá sấy, gần như mất mùi tanh diếp cá, sản phẩm khô không bị vón cục

4 Màu nâu nhạt hay nâu hơi đậm, mùi thơm của diếp cá sấy, có mùi tanh diếp cá nhẹ, sản phẩm khô không bị vón cục

3 Màu xanh ngả nâu hay nâu đậm, thơm mùi diếp cá sấy nhẹ, thoảng mùi tanh diếp cá, sản phẩm hơi ẩm hoặc quá khô

Thời gian sấy ( giờ ) Nghiệm thức

2 Màu xanh xen ít nâu hay màu nâu đen, có mùi tanh diếp cá nhẹ hay mùi cháy nhẹ

1 Màu đen, mùi cháy khét hay màu xanh diếp cá tươi, có mùi tanh diếp cá

0 Màu cháy đen, sản phẩm có mùi lạ

Ghi nhận kết quả của hội đồng cảm quan gồm 7 thành viên đã qua huấn luyện, dùng phần mềm Statgraphic plus 3,0 để xử lý thống kê Biện luận kết quả để chọn được mẫu có nhiệt độ và thời gian sấy tối ưu nhất

2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất lượng sản phẩm trà

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố, 3 lần lặp lại Tên yếu tố: Nhiệt độ sấy – ký hiệu B

Thông số cố định: Thời gian: theo kết quả của thí nghiệm 1

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ sấy

Nhiệt độ sấy ( 0 C) Nghiệm thức

Lá diếp cá sau khi mua về loại bỏ các lá hư và già, chọn những lá tốt đồng đều về màu sắc, không bị dập nát Cân 100 g lá diếp cá, cắt khúc và tiến hành sấy ở thời gian tối ưu đã tìm được ở thí nghiệm trên với các khoảng nhiệt độ như bố trí ở bảng 2.4

Lá sau khi sấy được tiến hành đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm Tiến hành thực hiện lặp lại 3 lần mỗi nghiệm thức và ghi nhận kết quả

• Chỉ tiêu đánh giá Điểm đánh giá cảm quan theo chỉ tiêu màu sắc và mùi, theo phương pháp cho điểm với thang điểm như bảng 2.3 kết hợp với độ ẩm nguyên liệu ≤ 8 %

2.4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ sao đến chất lượng sản phẩm trà

Khảo sát quá trình sao nhằm tìm ra thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu để tìm ra nghiệm thức cho giá trị cảm quan trà tốt nhất đồng thời loại bỏ nước để trà đạt độ ẩm an toàn góp phần bảo quản sản phẩm được lâu

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố, 3 lần lặp lại Tên yếu tố: Nhiệt độ sao – ký hiệu C

Thời gian sao – ký hiệu D

Lá diếp cá sau thí nghiệm 2.4.2 với thông số tối ưu

Nhiệt độ và thời gian của quá trình sao được bố trí như bảng 2.5

Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ - thời gian sao trà

Cân 100 g lá diếp cá mang đi sấy với các thông số tối ưu ở thí nghiệm 2.4.2 rồi tiến hành đem sao ở các khoảng nhiệt độ và thời gian như bố trí ở bảng 2.5

Tiến hành thực hiện lặp lại 3 lần mỗi nghiệm thức và ghi nhận kết quả

• Chỉ tiêu đánh giá Điểm đánh giá cảm quan theo chỉ tiêu màu sắc và mùi theo phương pháp cho điểm với thang điểm như bảng 2.6 kết hợp với độ ẩm nguyên liệu ≤ 5 %

Bảng 2.6: Chỉ tiêu cảm quan lá diếp cá sau khi sao Điểm Chỉ tiêu cảm quan

5 Màu nâu đều, mùi thơm đặc trưng

4 Màu nâu nhưng không đều , mùi thơm đặc trưng

3 Màu nâu nhạt hay nâu đậm, mùi thơm nhẹ thoảng mùi diếp cá

2 Màu vàng nâu hay nâu hơi đen, mùi thơm nhẹ nhưng còn tanh mùi diếp cá

1 Màu đen, mùi cháy khét

0 Màu đen, mùi lạ khó chịu

Ghi nhận kết quả của hội đồng cảm quan gồm 7 thành viên đã qua huấn luyện, dùng phần mềm Statgraphic plus 3,0 để xử lý thống kê Biện luận kết quả để chọn được mẫu có nhiệt độ và thời gian sao tối ưu nhất

2.4.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ phối trộn của lá diếp cá và cỏ ngọt đến chất lượng sản phẩm trà

Tìm được tỉ lệ phối trộn cỏ ngọt thích hợp nhất để tạo hương vị cảm quan tốt nhất cho trà lá diếp cá

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố, lần lập lại Tên yếu tố: Hàm lượng cỏ ngọt – ký hiệu E

Bảng 2.7: Hàm lượng cỏ ngọt phối trộn

Nghiệm thức Hàm lượng cỏ ngọt (%)

Lá diếp cá sau khi đem sấy và sao với thông số tối ưu đã tìm được ở thí nghiệm trước cùng với cỏ ngọt đã sấy khô mang chúng đi xay nhỏ

Cân 2 g nguyên liệu gồm lá diếp cá và cỏ ngọt, trong đó cỏ ngọt được bổ sung theo hàm lượng % tổng khối lượng nguyên liệu như bảng 2.7

Trích ly với 100 ml nước sôi trong 5 phút, tiến hành đánh giá cảm quan dịch trà vừa thu được

Tiến hành thực hiện lặp lại 3 lần mỗi nghiệm thức và ghi nhận kết quả

• Chỉ tiêu đánh giá: Điểm đánh giá cảm quan theo chỉ tiêu vị theo phương pháp cho điểm với thang điểm như bảng 2.8

Bảng 2.8: Chỉ tiêu cảm quan vị nguyên liệu trà lá diếp cá sau khi phối trộn Điểm Chỉ tiêu cảm quan

5 Vị ngọt vừa phải, vị chua nhẹ hài hòa, hậu vị tốt

4 Vị ngọt vừa, vị chua nhẹ, hậu vị tốt

3 Vị hơi ngọt, hậu vị nhẹ hoặc gắt

2 Vị ngọt hơi gắt hoặc vị ngọt quá nhẹ

1 Vị ngọt gắt hoặc nhạt

Xác định thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ lá diếp cá và trà thành phẩm

2.5.1 Quy trình điều chế cao diếp cá

Hình 2.4: Quy trình điều chế cao tổng từ lá diếp cá

Lá diếp cá sau khi mua về, phân loại theo màu và loại bỏ các lá hư hại hay dập nát Rửa sạch với nước để loại bỏ đất cát sau đó tiến hành sấy khô và xay nhuyễn Lá diếp cá sau khi xay đem ngâm dầm bằng dung môi ethanol 96 % để tách các hợp chất tự nhiên trong lá diếp cá với tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:5 (g/ml) Sau 3-5 ngày, hỗn hợp diếp cá xay được lọc để thu dung dịch chiết, sau đó thu dịch đem đi cô quay

Cao tổng đuổi dung môi để thu cao tổng Thay dung môi ethanol 96 % bằng nước ấm 60 0 C trích trong vòng 1 tiếng để thu được cao nước

2.5.2 Khảo sát hàm lượng flavonoid trong các cao chiết từ lá diếp cá và trà thành phẩm

Hàm lượng flavonoid của chất chiết xuất được xác định theo phương pháp tạo màu với AlCl3 bằng cách xây dựng đường chuẩn quercetin.[22]

Lấy 1 ml mẫu trà (hoặc mẫu cao) và pha loãng nồng độ thích hợp Sau thêm vào

4 ml nước cất thu được hỗn hợp 1 Sau đó, thêm vào 0,3 ml dung dịch NaNO2 5 % Sau 5 phút thêm tiếp 0,3 ml dung dịch AlCl3 10 %, sau 6 phút cho vào 2 ml dung dịch NaOH 1M và định mức đến thể tích 10 ml bằng nước cất Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 425 nm

Dựa vào đường chuẩn quercetin để xác định hàm lượng flavonoid có trong mẫu cao bán thành phẩm Hàm lượng flavonoid có trong mẫu được tính bằng đương lượng quercetin có trong mẫu cao đem định lượng

2.5.3 Khảo sát hàm lượng polyphenol trong các cao chiết từ lá diếp cá và trà thành phẩm

2.5.3.1 Nguyên tắc Định lượng hợp chất polyphenol tổng số của dịch chiết ban đầu theo phương pháp Folin – Ciocalteau của Aiyegoro và Okoh.[23]

Lấy 1ml cao chiết thành phẩm (hay mẫu trà) và pha loãng nồng độ thích hợp Sau đó lấy 1ml dung dịch vừa pha loãng vào bình định mức 10 ml, thêm 0,5 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu, lắc đều, để phản ứng diễn ra trong 3 phút rồi thêm vào 1 ml dung dịch Na2CO3 bão hòa, lắc đều và bổ sung nước cất đến vạch định mức Để yên trong

30 phút rồi đem so màu ở bước sóng 760 nm với nước cất làm chuẩn

Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng polyphenol có trong mẫu cao bán thành phẩm Hàm lượng polyphenol có trong mẫu được tính bằng đương lượng acid gallic (GAE) có trong mẫu cao đem định lượng

2.5.4 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa – phương pháp DPPH của ba loại: cao cồn, cao nước và trà thành phẩm

Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH + bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Chuẩn bị các nghiệm thức như bảng sau:

Bảng 2.9: Bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chống oxy hóa Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6

Thêm 1ml dung dịch DPPH 1 mM, lắc đều, để yên trong tối 30 phút Đo OD ở bước sóng 517 nm

• Cân 0.0394 mg DPPH + định mức bằng cồn nguyên chất thành 100 ml Để ổn định trong bóng tối 30 phút Lúc này DPPH + có nồng độ là 1mM

• Mẫu thử:Các mẫu thử được hòa tan với ethanol nguyên chất để đạt được nồng độ pha loóng liờn tiếp là : 250 àg/ml, 125àg/ml, 62,5àg/ml, 31,25 àg/ml và 15,625 àg/ml

• Mẫu đối chứng: được tiến hành tương tự như mẫu thí nghiệm nhưng được thay bằng dung dịch vitamin C pha thành cỏc nồng độ 50 àg/ml, 25àg/ml, 12,5àg/ml, 6,25 àg/ml và 3,125àg/ml

• Mẫu trắng: gồm dung dịch ethanol và DPPH + (1 mM)

• Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, % ức chế là giá trị trung bình của ba lần lặp lại được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphicplus 3.0 Sau khi chuẩn bị các mẫu, tiến hành khảo sát khả năng ức chế gốc tự do như bảng bố trí thí nghiệm 2.9 Các mẫu sẽ được đo bằng máy UV-Vis đọc kết quả ở giá trị mật độ quang 517 nm

Odo là giá trị OD mẫu trắng: mật độ quang của dung dịch DPPH + và ethanol Odt là giá trị OD thử: mật độ quang của DPPH + và mẫu thử

Khả năng kháng oxy hóa được đánh giá bằng giá trị IC50 Giá trị IC50 của mỗi mẫu được tính dựa trên phương pháp hồi quy từ đồ thị giữa % DPPH + với nồng độ chất ức chế.

Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao chiết từ lá diếp cá và trà thành phẩm lên 2 chủng: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp MIC và MBC 29

và trà thành phẩm lên 2 chủng: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp MIC và MBC [22]

2.6.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ lá diếp cá và trà thành phẩm lên 2 chủng: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp MIC( Minimun Inhibitory Concetration)

Dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loãng của dung dịch cần xác định đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mỗi nồng độ dung dịch khác nhau mà ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của dung dịch có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao và trà thành phẩm được xác định bằng phương pháp pha loãng trong ống nghiệm với sự đổi màu của TTC

Mẫu cao cồn lá diếp cá pha loãng trong DMSO 10% Với DMSO 10% làm đối chứng

Mẫu cao nước và trà thành phẩm được pha loãng trong nước

• Chuẩn bị một dãy gồm 10 ống nghiệm, từ ống 2 đến ống 10 cho 2 ml NB đã vô trùng

- Ống 1: cho 2ml dung dịch cần xác định MIC

- Cho 2ml dung dịch cần xác định vào ống 2 Sau đó lấy 2 ml từ ống 2 chuyển qua ống 3, cứ chuyển theo thứ tự đến ống 9 Sau đó hút bỏ 2 ml dung dịch từ ống 9 bỏ đi

- Bổ sung vào dãy 10 ống nghiệm 0,1 ml huyền phù vi khuẩn 10 6 CFU/ml đã pha loãng trong nước muối vô trùng

- Ống 10 chứa 2 ml NB và vi khuẩn

• Lấy 0,1 ml dung dịch từ các ống nghiệm trang trên đĩa NA, ủ 24 – 48 h và đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành

• Lấy 1 ml dung dịch từ các ống nghiệm, bổ sung 0,1 ml dung dịch nhuộm màu 0,4 % TTC (Tetrazolium Chloride) vào các ống nghiệm để xác định ống nghiệm không hiện màu với thuốc nhuộm Sau đó chụp hình, ghi nhận lại số liệu

Giá trị MIC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ thử nghiệm của cao và trà diếp cá trong ống nghiệm mà tại đó không có vi khuẩn phát triển (ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn) và không làm dung dịch trong ống nghiệm hóa đỏ (không làm đổi màu TTC)

2.6.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết từ lá diếp cá và trà thành phẩm lên 2 chủng: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp MBC

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được xác định bằng phương pháp trải đĩa Giá trị MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ của cao và trà thành phẩm có thể tiêu diệt toàn bộ vi khuẩn trong ống nghiệm, không có khuẩn lạc vi khuẩn nào xuất hiện trên đĩa môi trường thạch agar (NA)

Từ các ống nghiệm MIC ta hút 0.1 ml dung dịch trang trên đĩamôi trường thạch agar, ủ 24-48 h và kiểm tra các đĩa mọc khuẩn hoặc không mọc khuẩn

Xác định đĩa môi trường thạch agar (NA) không có khuẩn lạc mọc ở nồng độ thấp nhất đó chính là MBC.

Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm trà túi lọc từ lá diếp cá

• Mục đích Đánh giá chất lượng sản phẩm hoàn thiện

Sau khi khảo sát tất cả các công đoạn chính trong quy trình chế biến trà túi lọc từ lá diếp cá với các thông số tối ưu tôi tiến hành chế biến tạo trà thành phẩm Với trà túi lọc thành phẩm, định lượng 2 g và trích trong 100 ml nước sôi trong thời gian 5 phút và thu được 1 tách trà hoàn chỉnh, tiến hành đánh giá chỉ tiêu chất lượng sản phẩm, hoạt tính trà thành phẩm như bảng 2.10 và cho điểm cảm quan của trà diếp cá theo TCVN 3215:79 với hội đồng gồm 7 thành viên đã qua huấn luyện theo thang điểm như bảng 2.11

Bảng 2.10: Các phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm cuối

Hàm lượng ẩm (%) Sấy đến khối lượng không đổi Hàm lượng chất khô hòa tan (%) Sử dụng Brix kế pH pH kế

Hàm lượng tro tổng (%w/w khô) Nung ở 550 – 600 0 C đến khối lượng không đổi Hàm lượng polyphenol (%w/w khô) Phương pháp Folin – Ciocalteu Hàm lượng flavonoid (% w/w khô) Phương pháp tạo màu với AlCl3

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) TCVN 4884-2005

Tổng số nấm men, nấm mốc (CFU/g) TCVN 8275-1:2010

Cách tiến hành được thực hiện như phụ lục A

Tiến hành thí nghiệm lặp lại ba lần, kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của ba lần đo

• Đánh giá cảm quan sản phẩm

Tiến hành đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm hoàn thiện theo TCVN 3215-79 với thành viên hội đồng gồm 7 đánh giá viên

Bảng 2.11: Thang điểm đánh giá cảm quan chất lượng trà thành phẩm

Tên chỉ tiêu Hệ số quan trọng Điểm Yêu cầu

Màu 1 5 Màu vàng rơm đặc trưng

3 Màu vàng rơm nhạt hoặc đậm

0 Màu đen hay màu lạ

Vị 1 5 Vị chua, ngọt hài hòa

4 Vị chua, ngọt vừa phải

3 Vị hơi chua, ngọt nhẹ

2 Vị chua hoặc ngọt gắt

1 Vị rất chua hoặc ngọt rất gắt hay không ngọt

Mùi 1 5 Mùi thơm lá diếp cá hài hòa

4 Mùi thơm nhẹ lá diếp cá

3 Thoảng mùi tanh lá diếp cá

2 Mùi tanh lá diếp cá nồng

1 Mùi tanh lá diếp cá rất nồng

Trạng thái 1 5 Trong, không cặn

0 Rất đục, rất nhiều cặn

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát nguyên liệu ban đầu

Chỉ tiêu Phương pháp Hàm lượng Độ ẩm ( %) Sấy đến khối lượng không đổi

Hàm lượng chất khô hòa tan ( %)

Sử dụng Brix kế 0,4 pH Sử dụng máy đo pH 4.02 Độ tro (%W/W khô) Nung ở 550 – 600 0 C đến khối lượng không đổi

Phương pháp tạo màu với

Nhận xét: Theo phân tích, hàm lượng ẩm trong lá đạt khoảng 87,83% Có thể thấy rằng lá diếp cá có lượng ẩm cao Độ tro đạt 1,567 % (w/w) Hàm lượng ẩm và độ tro tùy theo độ tuổi, đất trồng, đặc tính cây, và thời điểm trong năm Hàm lượng tro phản ánh hàm lượng khoáng của nguyên liệu Tro tổng trong lá diếp cá tương đối cao từ đó cho thấy hàm lượng khoáng trong lá diếp cá khá cao Hàm lượng poplyphenol đạt 17,32 % và flavonoid đạt 7,136 % cho thấy lá diếp cá là một nguyên liệu dồi dào dinh dưỡng thích hợp để chế biến trà túi lọc.

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chế độ sấy đến chất lượng trà

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy đến chất lượng trà

Lá diếp cá sau khi khảo sát thành phần và tính chất nguyên liệu được tiến hành khảo sát quá trình sấy với nhiệt độ 60 0 C và thời gian khảo sát là 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 giờ Kết quả cảm quan theo phương pháp cho điểm và độ ẩm được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 : Kết quả đánh giá các mẫu ở các mốc thời gian sấy khác nhau

Thời gian (giờ ) Độ ẩm (%) Điểm cảm quan diếp cá sau sấy

Ghi chú: Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức 0,05 qua phép thử

Qua bảng 3.2 cho thấy các nghiệm thức sau khi sấy có sự khác biệt về độ ẩm còn lại trong các mẫu Khi sấy cùng mốc nhiệt độ thì thời gian sấy càng dài độ ẩm trong mẫu càng ít và ngược lại khi sấy thời gian càng ngắn độ ẩm trong mẫu càng cao Ở thời gian 6 giờ, 7 giờ và 8 giờ độ ẩm còn lại trong lá phù hợp với yêu cầu độ ẩm mong muốn

Ngoài ra bảng 3.2 còn cho thấy các mẫu sau khi sấy có sự khác biệt có ý nghĩa về giá trị cảm quan Trong cùng mốc nhiệt độ, thời gian sấy càng dài thì các phản ứng tạo màu, tạo hương xảy ra càng nhiều nên chất lượng cảm quan càng tăng Ngược lại thời gian sấy càng ngắn thì chưa đủ để các phản ứng tạo màu, tạo hương xảy ra nên giá trị cảm quan thấp Ở thời gian 6 giờ và 7 giờ giá trị cảm của lá diếp cá cao và không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê đồng thời chúng khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các mốc thời gian còn lại

Từ kết quả của các thông số trên tôi chọn mốc thời gian là 6 giờ Vì ở mốc thời gian này giá trị cảm quan cũng như độ ẩm không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với thời gian 7 giờ mà còn tiết kiệm được thời gian hơn 7 giờ

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất lượng trà

Lá diếp cá sau khi tìm được mốc thời gian tối ưu dựa trên thí nghiệm 1 ta tiếp tục tiến hành khảo sát quá trình sấy với thời gian tối ưu là 6 giờ và nhiệt độ khảo sát là

50 0 C, 60 0 C, 70 0 C, 80 0 C.Kết quả cảm quan theo phương pháp cho điểm và độ ẩm được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả đánh giá các mẫu ở các mốc nhiệt độ sấy khác nhau

Nhiệt độ ( 0 C) Độ ẩm (%) Điểm cảm quan diếp cá sau sấy

Qua bảng 3.3 cho thấy các nghiệm thức sau khi sấy có sự khác biệt về độ ẩm còn lại trong các mẫu Khi ta sấy cùng mốc thời gian thì nhiệt độ sấy càng cao thì độ ẩm còn lại trong lá càng ít và ngược lại Ở nhiệt độ 50 0 C thì lá còn ẩm khá cao màu xanh của lá vẫn còn chưa bị hóa nâu hoàn toàn do chưa đủ điều kiện để phản ứng xảy ra Ở nhiệt độ 70 0 C và 80 0 C do nhiệt độ cao nên lá bị quá khô phản ứng hóa nâu xảy ra mạnh nên lá không còn giữ được màu nâu mong muốn Tuy ở 3 nhiệt độ 60 0 C, 70 0 C,

80 0 C, cho độ ẩm mong muốn nhưng giá trị cảm quan ở nhiệt độ 60 0 C cao nhất và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với 70 0 C và 80 0 C Vì vậy ta chọn nghiệm thức có nhiệt độ 60 0 C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian sao đến chất lượng trà

Lá diếp cá sau khi khảo sát các công đoạn chế biến và chọn được các thông số tối ưu, tiến hành xay nhỏ đồng nhất kích thước và khảo sát quá trình sao với 3 mốc nhiệt độ và 4 khoảng thời gian, kết quả cảm quan theo phương pháp cho điểm được trình bày như sau:

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá các mẫu ở chế độ sao khác nhau

Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian ( phút) Điểm cảm quan diếp cá sau sao

Qua bảng 3.4 ta thấy được các mẫu có sự khác biệt có ý nghĩa theo phương pháp cho điểm cảm quan Nhiệt độ và thời gian sao trà có ảnh hưởng lớn đến chất lượng cảm quan của sản phẩm trà diếp cá Ở nhiệt độ 80 0 C hoặc thời gian ngắn 1 phút lá trà còn mùi tanh diếp cá Ở nhiệt độ 100 0 C hoặc thời gian dài 5 - 7 phút lá trà bắt đầu có hiện tượng bị cháy khét Ở nhiệt độ 90 0 C ở mốc thời gian 3 phút và 5 phút không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng ở thời gian 3 phút cho giá trị cảm quan cao nhất đồng thời tiết kiệm được thời gian so với 5 phút Vì vậy, nghiệm thức 90 0 C,

3 phút là nghiệm thức tốt nhất được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ phối trộn của lá diếp cá và cỏ ngọt đến chất lượng trà

Lá diếp cá sau khi tìm được các thông số tối ưa dựa vào các thí nghiệm trên Ta tiến hành phối trộn với cỏ ngọt Kết quả cảm quan theo phương pháp cho điểm được trình bày như sau:

Bảng 3.5: Kết quả đánh giá các mẫu ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau

Qua bảng 3.5 ta thấy cỏ ngọt có ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của trà Cụ thể là nghiệm thức cỏ ngọt 0,2 g/2 g có độ ưa thích là cao nhất và nghiệm thức cỏ ngọt 0,1g là nghiệm thức có điểm cảm quan thấp nhất Vì có ngọt giúp thanh vị, tạo độ ngọt thơm cho trà nên khi bổ sung quá ít hoặc quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến vị của sản phẩm Sau khi có kết quả điểm có thể nhận thấy rằng với tỉ lệ cỏ ngọt 0,2 g/2 g cho điểm cảm quan cao nhất với vị ngọt, chua hài hòa.

Kết quả hàm lượng flavonoid và polyphenol có trong cao diếp cá và trà thành phẩm

Bảng 3.6 : Kết quả hàm lượng flavonoid và polyphenol

Hàm lượng cỏ ngọt (%) Điểm cảm quan trung bình

Qua bảng 3.6, ta thấy rằng cả cao diếp cá và trà thành phẩm đều có polyphenol và flavonoid Trong đó, cao cồn diếp cá có hàm lượng polyphenol và flavonoid cao nhất với 17,32% và 7,518% khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức còn lại Polyphenol là một trong các nhóm hợp chất chính có chức năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn, flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa sơ vữa động mạch, lão hóa Kết quả thí nghiệm chứng tỏ trà thành phẩm là sản phẩm có giá trị, có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng.

Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa – phương pháp DPPH

Để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết từ lá diếp cá cùng với trà thành phẩm chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá diếp cá và trà diếp cá bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH và kết quả được thể hiện trong bảng 3.7:

Bảng 3.7: Kết quả khả năng kháng oxy hóa – DPPH

Hợp chất Nồng độ (àg/ml) IC 50 (àg/ml)

250 125 62,5 31,25 15,625 Cao cồn diếp cá 83,84 58,07 31,81 23,17 11,16 124,40 b Cao nước diếp cá 77,43 40,63 18,30 12,32 6,653 159,31 c Trà thành phẩm 66,25 33,45 16,74 7,759 2,218 188,75 d

Hợp chất Nồng độ (àg/ml) IC 50 (àg/ml)

Ghi chú: Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05

• Nhận xét và kết luận:

Từ bảng 3.7 ta có thể thấy rằng trên các mẫu thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau thì khả năng kháng oxy hóa khác nhau Khi tăng nồng độ mẫu thì khả năng kháng oxy hóa cũng tăng vì trong nguyên liệu có polyphenol – một hợp chất có khả năng kháng oxy hóa nên khi nồng độ cao chiết tăng thì khả năng kháng oxy hóa tăng

Khi so sánh giá trị IC50 các mẫu khảo sát và đối chứng dương acid ascorbic là một loại thuốc thương mại đã được tinh sạch có hoạt tính kháng oxy hóa cao, nhận thấy rằngacid ascorbic có khả năng kháng oxy hóa cao nhất với giá trị IC50 là 24,85 àg/ml trà thành phẩm khỏng oxy húa thấp nhất với 188,75 àg/ml Cao nước diếp cỏ là 159,31àg/ml và cao cồn diếp cỏ là 124,40àg/ml.

coli

những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí tùy nghi, nhiệt độ từ 5 – 40 o C

Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút

E coli là vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hóa của người, có thể được tìm thấy ở đường hô hấp trên hay đường sinh dục

E coli đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết

E coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà bình thường chúng không hiện diện

E coli hội sinh có trong phân người khỏe mạnh chỉ gây bệnh khi có dị vật hay hệ thống miễn dịch của ký chủ bị suy yếu

E coli gây bệnh đường ruột Tác nhân gây bệnh qua đường tiêu hóa bất cứ khi nào ký chủ nuốt vào đủ số lượng vi khuẩn Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác (Buchanan và Gibbons, 1994)

Loài: Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994)

P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn, dài 1–5 μm, rộng 0,5–1 μm, ít khi có vỏ có một ít lông ở một đầu, di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram âm Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 – 44 o C), nhưng tối ưu ở 35 o C Trong môi trường đặc, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên; một loại khác thì xù xì (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

Khả năng gây bệnh của P aeruginosa :

Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như: khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện Chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc,

Ngoài ra P.aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng) Trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh) Khi có điều kiện thuận lợi chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xương tủy (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm