Nguyễn Thị Lệ Thủy Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thủy Lớp DH16YD01 Ngày sinh: 18/04/1998 Nơi sinh: Ninh Thuận Tên đề tài: CÔ LẬP VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE CỦA
TỔNG QUAN VỀ CHI LUMNITZERA
Phân loại
Chi Lumnitzera là một chi sống trong rừng ngập mặn Theo tác giả Phạm Hoàng
Hộ [2] , ở Việt Nam chi Lumnitzera gồm hai loài là cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cóc trắng (Lumnitzera racemosa)
- Loài: cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cóc trắng (Lumnitzera racemosa)
Mô tả thực vật
Hai cây cóc đỏ (Luminitzera littorea) và cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) có đặc điểm giống nhau, chỉ khác ở màu cánh hoa
Cây thân gỗ, cao 10–20 m, vỏ màu nâu thẫm, có vết nứt, mặt trong vỏ màu nâu đỏ, phần giác màu vàng, lõi màu nâu thẫm, cành nhánh hình khúc khuỷu, vuông, khi non màu đỏ nhạt, có nhiều mặt do những vết sẹo của lá rụng để lại [8]
Lá mọc cách, tập trung ở đầu cành, phiến lá hình trứng ngược, mặt trên lá bóng, dài 2–8 cm, rộng 1–2,5 cm, đỉnh tròn có khía tai bèo, gốc hình nêm, ít gân, cuống đài 0,5–1 cm, lá tích nhiều muối [13]
Rễ có khả năng đâm sâu vào lớp mùn dày Rễ khí thường không phát triển thành hệ rễ trên mặt đất như các cây khác Tuy nhiên trong môi trường ẩm thấp, rễ khí có thể phát triển thành hệ rễ vòng trên mặt đất dạng mẫu rễ nhỏ
Hoa mọc thành chùm hình chum ở đầu cành, dài 1,5-3 cm Hoa có cuống ngắn, đài dài 1,5-2 mm, hình ống tạo thành đĩa chứa mật Tràng hoa có 5 thùy hình bầu dục thuôn dài 5-6 mm, thẳng đứng, màu đỏ và sớm rụng Hai bao hoa dạng vảy đính vào ống đài Nhị dài 5-10 cm, dài gấp đôi cánh hoa Nhụy hơi nhô ra khi hoa nở, vòi nhụy và đài bền Bầu nhụy gồm 5 lá noãn hợp, noãn nhỏ dài 3-5 cm và đính treo Hoa được thụ phấn chủ yếu nhờ chim, đặc biệt là chim hút mật và các loài ăn mật Ong mật và ong vò vẽ cũng tham gia vào quá trình thụ phấn.
Quả hạch, 1 hạt, hình trứng dài 3–4 cm, với nhiều sự cương mô của vỏ quả nằm rải rác, vỏ quả trong cứng Quả non màu nâu đỏ, quả chín rụng, mùa ra hoa vào tháng 6 đến tháng 8, mùa quả chín vào tháng 8 đến tháng 10.
Phân bố
Cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa) là loài cây ngập mặn, phân bố ở Châu Á và Châu Úc thuộc vùng nhiệt đới [13] Ở Việt Nam, hai loài cây này phân bố ở các rừng ngập mặn cửa đông, ven biển nơi chỉ ngập triều cao hoặc ít ngập mặn như Cần Giờ, Cà Mau, Phú Quốc, Trước năm 2001, Cóc đỏ đã bị nhiều người dân khai thác rất nhiều Vì thân cây cóc đỏ khi già thường bị rỗng hoặc mối ăn, nên trước khi chặt cây, người ta thường đục lỗ trên thân cây để kiểm tra Nhiều cây cóc đỏ già nhưng không bị chặt, nhưng cũng bị chết do các vết đục quá sâu Sau khi Vườn Quốc Gia Phú Quốc được thành lập 2011, công tác bảo vệ rừng đã thực hiện khá tốt, phần nào ngăn chặn được việc khai thác cây cóc đỏ tại Phú Quốc Hiện nay, tại Phú Quốc đang tiến hành một số dự án ươm và trồng cây cóc đỏ để nhân giống phát triển loài cây này Điều kiện thiên nhiên của Phú Quốc là môi trường rất phù hợp với cây cóc đỏ.
Giá trị kinh tế
Màu cánh hoa đẹp có tiềm năng trong nghệ thuật, trang trí Gỗ tốt, có thể nằm trong bùn và nước ngập mặn lâu năm mà không bị mục nên sử dụng làm cột, cừ hay người dân
Cây cóc đỏ đóng vai trò thiết thực trong đời sống với nhiều ứng dụng khác nhau Người dân địa phương sử dụng nó làm cán cuốc Ngoài ra, cây khi cho vào hầm than sẽ sinh nhiệt cao và chứa hàm lượng NaCl thấp, giúp bảo vệ máy móc Lá cây còn mang lại giá trị y học khi được sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất chữa nấm vòm họng ở trẻ em, làm thuốc chữa tiêu chảy, viêm ruột và loét miệng.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học
1.1.5.1 Cây cóc trắng ( Lumnitzera racemosa )
Năm 1980, Majumdar và Patra [15] từ lá và vỏ cây của Lumnitzera racemosa đã phân lập được một số hợp chất như triacontanol (1), taraxerol (2), -amyrin (3), betulin (4), -sitosterol (5) và friedelin (6)
Năm 1993, Lin T C và cộng sự [13] đã phân lập được 11 hợp chất tannin từ lá cây
Lumnitzera racemosa gồm có castalagin (7); corilagin (8); chebulagic acid (9); acid chebulinic (10); acid neochebulinic (11); 2,3-di-O-galloyl-D-glucopyranose (12); 1,2,3,6- tetra-O-galloyl-D-glucopyranose (13); 2,3,4,6-O-galloyl-D-glucopyranose (14); 1,2,3,4,6- penta-O-galloyl--D-glucopyranose (15); 2,3-(S)-HHDP-D-glucose (16) và punicalagin (17)
Cũng trong năm này, tác giả Connolly và cộng sự, từ lá và thân cây đã cô lập được
10 hợp chất bao gồm 2-methyl-1,3-dihydroxy-5-tridecylbenzene (18), 1,3-dihydroxy-5- undecylbenzene (19), ergosta-7,22-dien-3β-ol (20), emodin (21), kaempferol (22), quercetin (23), quercitrin (24), isoquercitrin (25), (-)-epigallocatechin (26), và acid gallic (27)
In 2015, 36 compounds were isolated from the leaves of the "Coc white" tree by Nguyen Phuong Thao and colleagues These compounds include 1,5,6- trihydroxy-3-methoxyxanthone, 5,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyxanthone, perforaphenonoside A, acetylannulatophenonoside, (6S,9R)-6-hydroxy-3-oxo-α- ionol 9-O-β-D-glucopyranoside, (6S,9R)-9-hydroxy-4,7-megastigmadien-3-one 9-O- (β-D-apiofuranosyl-(1′′→6′)-β-D-glucopyranoside), (6S,9R)-vomifoliol 9-O-β- apiofuranosyl-(1′′→6′)-O-β-D-glucopyranoside, (+)-pinoresinol, polystachyol, (+)-lyoniresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside, (–)-lyoniresinol 3α-O-β-D- glucopyranoside, 1,6-di-O-p-coumaroyl-β-D-glycopyranoside, alangilignoside C, polygalatenoside E, and others.
1.1.5.2 Cây cóc đỏ ( Lumnitzera littorea )
Năm 2017, Phạm Thị Huyền và cộng sự đã cô lập được 11 hợp chất từ lá và cành của cây Cóc đỏ bao gồm: 1 hợp chất lipid (1,3-dihydroxy-2-methyl-5-tridecylbenzene (18); 2 hợp chất flavonoid gồm: quercetin (23) và astragalin (62), 2 hợp chất hexitol: 1- acetyl-D-mannitol (63) và D-mannitol (64); β-sitosterol (5) và stigmasterol (61)
CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP TỪ CHI LUMNITZERA Lignan
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học
1.1.6.1 Cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa)
Năm 2013, Trần Mỹ Linh [5] và cộng sự đã chứng minh hoạt tính ức chế nấm và vi khuẩn gây bệnh của ba loại thực vật ngập mặn Aegiceras corniculatum, Avicennia marina và Lumnitzera racemosa tại vườn quốc gia Xuân Thủy với độ dịch chiết từ 10 –
Nghiên cứu của Lisette D [16] và cộng sự năm 2010 đã chứng minh rằng cao ethanol thô và cao n-butanol chiết xuất từ cây cóc trắng (Lumnitzera racemosa Willd.) có đặc tính diệt khuẩn Trong số các flavonoid được thử nghiệm, myricetin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất (MIC - 1,5 μg/ml) và có khả năng ức chế Pseudomonas aeruginosa (MIC - 6 μg/ml).
Năm 2011, Sundaram R và Murugesan G [22] đã chứng minh cao chiết ethanol của lá cây Lumnitzera racemosa có khả năng bảo vệ chức năng gan in vitro khi thử nghiệm trên chuột và có khả năng đánh bắt một số gốc tự do như DPPH•, HRSA•, NO•, FRAP•, LPO•, SOD•
1.1.6.2 Cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea)
Năm 2011, Shahbudin S [20] và cộng sự đã chứng minh hoạt tính n-hexane từ lá cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea) có khả năng kháng khuẩn Khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tại nồng độ 0.04 mg/ml.
TỔNG QUAN VỀ ENZYME α – GLUCOSIDASE
Cấu trúc enzyme α-glucosidase
Enzyme α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase- glucoamylase, nitrophenyl α-D- glucosidase, transglucosidase, α- glucosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α- glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase ( nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân) [2]
Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase được trình bày theo hình 1.3
Hình 1 3: Cấu trúc không gian của enzyme α -glucosidase
Cơ chế hoạt động của enzyme α – glucosidase
Carbohydrate chứa trong thức ăn là nguồn cung cấp chất đường cho cơ thể Sau khi vào cơ thể, những carbohydrat được thủy phân thành những phân tử đường đơn bởi những enzyme trong ruột non và các phân tử đường này được tỏa ra nuôi các tế bào cơ thể Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrate lớn thành oligosaccharide, màng tế bào ruột non lại tiết ra α- glucosidase để tiếp tục phân hóa các oligosaccharide thành các phân tử đường đơn rồi mới thẩm thấu vào máu Chức năng chính của enzyme này là xúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4- α - D -glucosid của cơ chất để giải phóng ra α-D-glucose Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzyme α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu.
Tác nhân ức chế enzyme α – glucosidase
Enzyme α-glucosidase là một mục tiêu quan trọng trong các lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm Tuy nhiên, các chất ức chế enzyme α-glucosidase hiện nay thường gây ra tác dụng phụ không mong muốn Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase mới vẫn đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm.
Chất ức chế enzyme
Chất ức chế enzyme là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác Hoạt động của một enzyme có thể giết chết một mầm bệnh hoặc điều chỉnh lại sự không cân bằng trong chuyển hóa Có nhiều loại thuốc ức chế enzyme, chúng cũng được sử dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu Không phải tất cả các phân tử liên kết với enzyme đều là chất ức chế enzyme, những chất hoạt hóa liên kết với các enzyme và làm tăng hoạt tính enzyme mà chúng liên kết [1]
Chất ức chế có thể gắn vào enzyme theo các kiểu thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Chất ức chế không thuận nghịch phản ứng hóa học với enzyme, thay đổi cấu trúc của enzyme và ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Ngược lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết không đồng hóa trị với enzyme, phá vỡ liên kết giữa chất nền và enzyme, ngăn chặn phản ứng của enzyme Các liên kết giữa chất ức chế và enzyme chủ yếu là liên kết yếu như liên kết hydro, tương tác kỵ nước và liên kết ion, tạo nên tương tác đặc hiệu và mạnh mẽ với tâm hoạt động của enzyme.
Ngược lại đối với các chất nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận nghịch thường không trải qua phản ứng hóa học khi liên kết với enzyme và có thể dễ dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thẩm tách
Có 4 kiểu của ức chế enzyme thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo tác động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzyme trên chất ức chế:
❖ Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
Chất nền và chất ức chế không liên kết với enzyme cùng một lúc Điều này có thể là do chất ức chế có ái lực với tâm hoạt động của một loại enzyme nên xảy ra sự cạnh tranh giữa chất nền và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzyme Đây là loại ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ đủ cao của chất nền bởi vì những chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự như cấu trúc của chất nền
❖ Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)
Chất ức chế chỉ kết hợp với phức enzyme-chất nền mà không kết hợp với enzyme tự do Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzyme làm giảm hoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzyme-chất nền Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế
❖ Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition)
Chất ức chế hợp với enzyme ở vị trí khác với vị trí kết hợp của chất nền tạo thành phức enzyme-chất nền-chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp Như vậy, enzyme có thể đồng thời kết hợp cả chất ức chế và chất nền Chất nền và chất ức chế không cạnh tranh với nhau để kết hợp enzyme và cũng không thể loại trừ tác dụng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ chất nền
❖ Ức chế hỗn hợp (mixed inhibition)
Chất ức chế không những liên kết với enzyme tự do mà còn liên kết với cả phức hợp enzyme-chất nền tạo thành phức hợp enzyme-chất ức chế -chất nền nên không tạo được sản phẩm Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Tốc độ ức chế cực đại đo được khi không có chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế.
VẬT LIỆU
Đối tượng nghiên cứu
Lá của cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam vào tháng 6 năm 2019 Được định danh bởi TS Phạm Văn Ngọt, khoa Sinh trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh Mẫu (LL-012) được lưu tại khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.
Địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 6/2019 đến tháng 12/2019.
Hóa chất và thiết bị
- Các loại dung môi ethanol, n-hexane, ethyl acetate, methanol, chloroform: Chemsol (Việt Nam)
- Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)
Enzyme α- glucosidase (EC 3.2.1.20) saccharomyces cerevisiae (750 UN), cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ( Aldrich Sigma) Acarbose và DMSO (Merck)
- Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III tần số 500 MHz của viện Công nghệ Hóa Học- viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu nghiên cứu được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ TP.HCM Mẫu được giám định tên khoa học bởi TS Phạm Văn Ngọt (trường Đại học Sư Phạm TP.HCM) Mẫu được rửa sạch, phơi khô, xay mịn và ngâm dầm với ethanol.
Phương pháp ngâm dầm
Ngâm bột cây trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy (tránh sử dụng bình bằng nhựa) Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến khi sấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Phương pháp chiết pha rắn
Kỹ thuật chiết pha rắn được áp dụng để xác định mức độ phân cực của một hợp chất chưa biết, làm đậm đặc một hợp chất đang ở trong một dung dịch rất loãng và lượng thế tích lớn Có thể dùng để phân chia cao thô ban đầu (có chứa tất cả các loại hợp chất từ không phân cực đến phân cực) thành các phân đoạn có tính phân cực khác nhau: Cao thô nạp trên dầu cột, giải ly với dung môi có độ phân cực tăng theo kiểu bậc thang, sau khi đuổi dung môi, thu được những loại cao chiết có độ phân cực khác nhau Và dùng để cô lập một mẫu hợp chất thiên nhiên cần khảo sát ra khỏi cao thô ban đầu.
Phương pháp cô lập các hợp chất
Từ cao chiết tổng ban đầu tiến hành phân bố lại trong các dung môi hexan, ethylacetat và ethanol Dùng sắc ký cột để chia cao ethyl acetate thành nhiều phân đoạn, từ các phân đoạn được đem đi phân lập chất tinh khiết Chất tinh khiết sẽ được phân lập dựa trên các kỹ thuật sắc ký cột pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, HPLC điều chế kết hợp với sắc ký bản mỏng
❖ Sắc ký bản mỏng (TLC) [4]
Sắc ký bản mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254
(Merck 1.05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng
254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2 SO 4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu
Sắc ký cột được tiến hành trên cột thủy tinh, với chất nhồi cột là silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040–0,063 mm (240–430 merck), silica gel pha đảo, sephadex LH–20 để phân lập chất.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
❖ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo bằng máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hóa Học-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các phổ bao gồm: 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz).
Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme α- glucosidase
Nghiên cứu khả năng ức chế α-glucosidase được xác định theo phương pháp của
Apostolidis và cộng sự (2007) Để khảo sát khả năng ức chế hoạt tính enzyme α- glucosidase trên cao chiết, sử dụng p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) làm cơ chất Cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid sẽ bị enzyme α-glucosidase thủy phân chuyển hóa thành α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP)
Phản ứng enzyme α- glucosidase được trình bày theo hình 2.1
Hình 2 1:Phản ứng xúc tác enzyme α- glucosidase
Kết quả được thể hiện qua giá trị % ức chế và được thể hiện theo phương trình (1)
• A chuan : là độ hấp thụ hoạt hóa của enzyme khi không có chất ức chế
• A sample : là độ hấp thụ hoạt hóa của enzyme khi có chất ức chế
Nồng độ ức chế (IC 50 ) của mẫu là nồng độ cần thiết để ức chế 50% độ hoạt động của enzyme Giá trị IC 50 của mỗi mẫu được tính dựa trên phương pháp hồi quy từ đồ thị giữa % ức chế enzyme α-glucosidase với nồng độ chất ức chế
- Mẫu thử: pha cao chiết trong DMSO thành các dãy nồng độ Sau đó ủ ở 30 o C trong 5 phút dung dịch A
- Một hỗn hợp chứa 60 àl dung dịch đệm phosphate 100 mM ( pH=6,8), 20 àl dung dịch A (tại cỏc nồng độ khỏc nhau) và 100 àl dung dịch p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside 200 àM (trong dung dịch đệm phosphate 100 mM), được ủ trong cỏc đĩa
- Tiếp theo, thờm vào hỗn hợp 20 àL dung dịch α-glucosidase 0,3 U/ml pha trong đệm phosphate Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37 0 C trong 10 phút Sau đó, phản ứng được dừng bằng cỏch thờm 20 àl dung dịch NaOH 50 mM Độ hấp thụ của mẫu thớ nghiệm được đo ở bước sóng 405 nm để xác định khả năng ức chế hoạt tính enzyme α – glucosidase được thể hiện ở lượng p–nitrophenyl sinh ra
- Mẫu trắng: được tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng thay cao chiết bằng dung dịch đệm phosphate pH = 6,8
- Mẫu chuẩn: được tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng thay cao bằng dung dịch DMSO
- Mẫu đối chứng: được tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng thay cao chiết bằng acarbose Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, % ức chế là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphicplus 3.0
Sau khi chuẩn bị các mẫu, tiến hành khảo sát khả năng ức chế enzyme α- glucosidase đưa đĩa 96 giếng vào máy ELISA đọc kết quả ở giá trị mật độ quang 405 nm.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Quy trình điều chế cao tổng từ lá cóc đỏ
Lá cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea) trưởng thành được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ Những lá hư hỏng sâu bệnh được loại bỏ, lá được rửa sạch, phơi khô và xay nhuyễn Các nghiên cứu tiếp theo được tiến hành theo sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2 1 Quy trình điều chế cao tổng từ lá cây cóc đỏ
Lá cóc đỏ tươi Điều chế cao phân đoạn
Mẫu lá cóc đỏ (Lumnitzera littorea) được thu hái tại rừng ngập mặn Cần Giờ, sau đó loại bỏ những lá hư hỏng sâu bệnh, rửa sạch loại đất cát, phơi khô và xay nhuyễn Sau đó, dung môi ethanol 96°C sẽ được sử dụng để trích ly các hợp chất trong lá cây bằng phương pháp ngâm dầm với tỉ lệ và nguyên liệu dung môi là 1:12 g/ml Quá trình trích ly được thực hiện với thời gian ngâm là 15 ngày, trong quá trình ngâm dung môi được thay sau mỗi 24 giờ Sau đó, hỗn hợp sau khi trích ly được lọc thô rồi lọc tinh để loại bỏ bã, dịch sau khi lọc được loại dung môi bằng phương pháp cô quay chân không Cao tổng này được sử dụng để tiến hành điều chế cao phân đoạn ở các thí nghiệm tiếp theo.
Quy trình cô lập hợp chất tự nhiên từ cao tổng
Sắc ký cột silica gel (CC) EA:Me (98:2 – 0:100, v/v)
Sắc ký cột silica gel (CC) C:Me (100:0 – 0:100, v/v)
Sắc ký cột sephadex LH–20 C:Me (1:1, v/v)
Sơ đồ 2 2 Quy trình điều chế cao phân đoạn và cô lập hợp chất tự nhiên
Sắc ký cột silica gel EA:Me (9:1–0:1, v/v) E
Cao phân đoạn được điều chế từ cao tổng bằng phương pháp chiết pha rắn Quy trình điều chế cao phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2.2 Đầu tiên, cao tổng được tiền hấp thụ bằng silica gel với tỉ lệ 1:1 (g/g) Mẫu cao chiết sau khi tiền hấp thụ được chạy sắc ký cột silica gel (6*15 cm) với dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate, methanol
Cao ethyl acetace (200 g) tiếp tục chạy sắc ký cột silica gel (120*6 cm) lần lượt với hệ dung môi EA:Me (98:2–0:100, v/v), thu được năm phân đoạn được ký hiệu từ EM1-
Phân đoạn EM2 được tái sắc ký trên silica gel với hệ C:Me lần lượt với tỉ lệ là 100:0–0:100 (v/v) được hai phân đoạn (EM2.1 – EM2.2) Phân đoạn EM2.2 (80.0 mg) được chạy sắc ký cột sephadex LH–20 với hệ dung môi C:Me (1:1, v/v) thu được hợp chất TT01 (10.2 mg) Từ phân đoạn EM2.1 (200.0 mg) tiến hành chạy sắc ký cột silica gel hệ dung môi EA :Me (9:1–0:1, v/v) thu được hợp chất TT02 (9.8 mg) và phân đoạn E (49.0 mg) Tiếp theo, từ phân đoạn E chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi EA:Me:H2O (9:1:0.1, v/v) thu được hợp chất TT03 (11.4 mg).
Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase
Sơ đồ 2 3 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α- glucosidase của các hợp chất
Sau khi chuẩn bị các mẫu, tiến hành khảo sát khả năng ức chế enzyme α- glucosidase, các mẫu thí nghiệm sẽ được bơm vào giếng 96 lỗ và đưa vào máy ELISA đọc kết quả ở giá trị mật độ quang 405 nm
Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được đánh giá bằng giá trị IC50 Giá trị IC 50 của mỗi mẫu được tính dựa trên phương pháp hồi quy từ đồ thị giữa % ức chế enzyme α- glucosidase với nồng độ chất ức chế
Lắc đều Ủ 20 phút, ở nhiệt độ phòng
Lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng Đo quang phổ ở 405 nm
Giá trị IC 50 p-nitrophenyl- α-D- glucosidase
KẾT QUẢ CÔ LẬP HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY CÓC ĐỎ
Biện luận cấu trúc của hợp chất TT01
Hợp chất TT01 được cô lập từ phân đoạn EM2.5 (sơ đồ 2.2) Tính chất vật lý của hợp chất này được mô tả như sau:
- Chất rắn vô định hình, dạng bột, màu vàng (10.2 mg)
- Dữ liệu phổ 1 H, 13 C–NMR (DMSO) (Phụ lục 1 và 2) bảng 3.1
❖ Thảo luận cấu trúc hóa học
Dữ liệu phổ 1 H–NMR của TT01 cho thấy có một cặp tín hiệu mũi đôi tại vị trí δH
5.84 (d, 2.0 Hz, H6) và δ H 5.89 (d, 2.0, H8) chứng minh rằng hợp chất TT01 có dạng khung sườn của 5,7–dihydroxy flavonoid của vòng A Các tín hiệu proton mũi đôi ghép cặp ortho xuất hiện tại vị trí δH 7.75 (d, 8.5 Hz, H–2′ và H–6′) và 6.91 (d, 8.5 Hz, H–3′ và H–5′) là tín hiệu đặc trưng của các proton thơm của vòng B Dịch chuyển về vùng từ trường thấp có sự xuất hiện của một tín hiệu proton mũi đơn tại vị trí δH 12.61 là tín hiệu của nhóm –OH kiềm nối tại vị trí C–5 Bên cạnh đó, tại vị trí C–3 có gắn một đơn vị đường, điều này được chứng minh bởi sự xuất hiện của một proton anomer tại δH 5.29 (d, 1.5 Hz, H–1") và một chuỗi các tín hiệu mũi đa tại δ H 3.08–3.98 (m, H–2" – H–5") Cấu hình α–L–glycoside được xác định dựa trên hằng số ghép J=1.5 Hz [11] Đặc biệt, tín hiệu mũi đôi tại δH 0.79 (d, 6.0 Hz, H–6") có 3 proton là tín hiệu đặc trưng của nhóm methyl
Dữ liệu này cho thấy đây là cấu trúc của đường rhamnopyranoside
Dữ liệu phổ 13 C NMR của TT01 (bảng 3.1) cho thấy 21 tín hiệu carbon bao gồm: một tín hiệu của nhóm carbonyl tại vị trí δ C 177.6 (C–4); sáu tín hiệu carbon tứ cấp thơm tại vị trí δ C 161.2 (C–5), 164.7 (C–7), 156.5 (C–9), 103.9 (C–10), 120.5 (C–1′), 160.0 (C–4′); sáu tín hiệu carbon methine thơm tại δ C 98.8 (C–6), 93.8 (C–8), 130.5 (C–2′), 115.4 (C–3′), 115.4 (C–5′), 130.5 (C–6′); hai tín hiệu carbon tại δ C 157.1 (C–2) và 134.2 (C–3) đặc trưng của khung sườn flavonol; các tín hiệu của phân tử đường rhamnopyranoside bao gồm: bốn tín hiệu của carbon glycosyl tại vị trí δ C 70.6 (C–2"), 70.0 (C–3"), 71.1 (C– 4"), 70.3 (C–5"), một tín hiệu của carbon anomer tại vị trí δ C 101.8 (C–1") và một tín hiệu của nhóm methyl tại δ C 17.4 (C–6")
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C–NMR của hợp chất TT01, khi so sánh với tài liệu tham khảo [11] , cho thấy rằng đây là cấu trúc của afzelin
Bảng 3 1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TT01 và afzelin
STT TT01 (DMSO) afzelin (DMSO) [12] δ H , J (Hz) δ C δ H , J (Hz) δ C
5′ 6.91 (2H, d, 8.5 Hz) 115.4 6.92 (2H, d, 8.8 Hz) 115.5 6′ 7.75 (2H, d, 8.5 Hz) 130.5 7.76 (2H, d, 8.8 Hz) 130.6 1" 5.29 (1H, d, 1.5 Hz) 101.8 5.32 (1H, d, 1.47 Hz) 101.8
Biện luận cấu trúc của hợp chất TT02
Hợp chất TT02 được cô lập từ phân đoạn EM2.5 (Sơ đồ 2.2) của cây cóc đỏ với các thông số vật lý được mô tả như sau:
- Chất rắn vô định hình, dạng bột, màu vàng (9.8 mg)
- Dữ liệu phổ 1 H, 13 C–NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 3 và 4) bảng 3.2
❖ Thảo luận cấu trúc hóa học
Dữ liệu phổ 1 H–NMR của TT02 cho thấy có một tín hiệu mũi đơn tại vị trí δH 5.87 (s, H6, H8), một cặp tín hiệu mũi đôi ghép cặp ortho xuất hiện tại vị trí δ H 7.31 (d, 8.5 Hz, H–2′ và H–6′), một tín hiệu mũi đôi tại δH 6.79 (d, 8.5 Hz, H–3′ và H–5′), một tín hiệu proton mũi đơn tại δH 12.14 là tín hiệu của nhóm –OH kiềm nối tại vị trí C–5 và một tín hiệu mũi đơn δ H 9.60 là các tín hiệu của nhóm –OH tại vị trí C–4′ Các dữ liệu này chứng minh hợp chất TT02 có cấu trúc là một flavonoid Ngoài ra, sự hiện diện của một hệ
ABX tại δH 5.44 (dd, 12.5, 3.0 Hz, H–2), 3.24 (dd, 17.5, 3.0 Hz, H–3ax ) và 2.68 (dd, 17.5, 3.0 Hz, H–3eq ) là dấu hiệu đặc trưng của dạng khung sườn flavanone
Dữ liệu phổ 13 C NMR của TT02 (bảng 3.2) cho thấy 15 tín hiệu carbon bao gồm: một tín hiệu của nhóm carbonyl tại vị trí δ C 196.3 (C–4); sáu tín hiệu carbon tứ cấp thơm tại vị trí δ C 163.5 (C–5), 166.7 (C–7), 162.9 (C–9), 101.8 (C–10), 128.8 (C–1′), 157.7 (C– 4′); sáu tín hiệu carbon methine thơm tại δ C 95.8 (C–6), 95.0 (C–8), 128.4 (C–2′), 115.1
(C–3′), 115.1 (C–5′), 128.4 (C–6′); hai tín hiệu tại δ C 78.4 và 41.9 đặc trưng của C–2 và C–3 của khung sườn flavanone
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C–NMR của hợp chất TT02 và khi so sánh với tài liệu tham khảo [14] , cho thấy rằng cấu trúc của hợp chất TT02 là naringenin
Bảng 3 2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TT02 và naringenin
STT TT02 (DMSO) Naringenin (DMSO) [14] δ H , J (Hz) δ C δ H , J (Hz) δ C
Biện luận cấu trúc của hợp chất TT03
Hợp chất TT03 được cô lập từ phân đoạn EM2.5 (Sơ đồ 2.2) của cây cóc đỏ với các thông số vật lý được mô tả như sau:
- Chất rắn vô định hình, dạng bột, màu trắng (11.4 mg)
- Dữ liệu phổ 1 H, 13 C–NMR (DMSO–d 6 ) (Phụ lục 5 và 6) bảng 3.3
❖ Thảo luận cấu trúc hóa học
Khi so sánh dữ liệu phổ 1 H–NMR và 13 C–NMR của TT03 và TT02 cho thấy rằng hai hợp chất này có cấu trúc tương đồng nhau, đó là một tín hiệu proton tại δH 11.89 chỉ ra sự hiện diện của 1 nhóm –OH kiềm nối tại vị trí C–5, một tín hiệu proton tại δ H 8.99 là tín hiệu của nhóm –OH tại vị trí C–4′, một cặp tín hiệu mũi đôi tại vị trí δ H 5.84 (d, 2.0 Hz, H6) và δH 5.89 (d, 2.0, H8) Thêm vào đó, phổ 1 H–NMR của TT03 chỉ ra sự hiện diện của một tín hiệu mũi đơn có 2 proton tại vị trí δ H 6.74 (brs, H–2′, H–6′), bên cạnh đó có một tín hiệu mũi đơn có 1 proton tại δ H 6.87 (s, H5′) thay vì một cặp tín hiệu mũi đôi trong dữ liệu phổ của hợp chất TT02, cho thấy dạng 3′,4′–dihydroxy flavonoid của vòng
B Ngoài ra, sự hiện diện của một cặp tín hiệu mũi đôi có 1 proton tại vi trí δ H 4.96 (d, 11.0 Hz, H–2) và 4,48 (d, 11.0 Hz, H–3) trong cấu trúc của TT03 thay vì ba tín hiệu mũi đôi–đôi của hệ ABX như trong dữ liệu phổ của hợp chất TT02, chứng tỏ tại vị trí C–3 có
1 ptoton bị thay thế bới một nhóm hydroxy, đây là điểm đặc trưng của dạng khung sườn flavanonol
Dữ liệu phổ 13 C–NMR của TT03 (bảng 3.3) cho thấy 15 tín hiệu carbon bao gồm: một tín hiệu của nhóm carbonyl tại vị trí δ C 196.5 (C–4); 7 tín hiệu carbon tứ cấp thơm tại vị trí δ C 163.5 (C–5), 167.2 (C–7), 162.7 (C–9), 100.5 (C–10), 128.2 (C–1′), 145.1 (C–3′), 145.9 (C–4′); 5 tín hiệu carbon methine thơm tại δ C 96.2 (C–6), 95.2 (C–8), 115.3 (C–2′), 115.5 (C–5′), 119.6 (C–6′); 2 tín hiệu tại δ C 83.2 và 71.7 đặc trưng của C–2 và C–3 của khung sườn flavanonol
Từ các dữ liệu phổ 1 H và 13 C–NMR của hợp chất TT03 và khi so sánh với tài liệu tham khảo [26] , cho thấy rằng cấu trúc của hợp chất TT03 là taxifolin
Bảng 3 3 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TT03 và taxifolin
STT TT03 (DMSO) Taxifolin [26] δ H , J (Hz) δ C δ H , J (Hz) δ C
3 4.48 (1H, d, 11.0 Hz) 71.7 4.52 (dd, 6.0, 11.3 Hz) 71.6 3-OH 5.73 (1H, d, 6.0 Hz) 5.78 (d, 6.0 Hz)
KẾT QUẢ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE
Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ cao chiết
Từ cao tổng, cao n–hexane, cao ethyl acetate, cao methanol và chất chuẩn acarbose tiến hành khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase kết quả được trình bày ở bảng
Bảng 3 4: Kết quả khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết
Nồng độ (àg/ml) IC50
Giá trị được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± SD (-) Giá trị tỷ lệ ức chế (%I) < 1
Qua kết quả thể hiện ở bảng 3.4, nhận thấy rằng khi nồng độ cao chiết của phân đoạn cao tổng và các phân đoạn cao n-hexane, ethyl acetate, methanol từ lá cây cóc đỏ tăng lên thì khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cũng tăng
Khi nồng độ cao chiết tăng, hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase cũng gia tăng Hoạt lực của enzyme α-glucosidase suy yếu do bị các hoạt chất ức chế, dẫn đến phản ứng xúc tác với ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside tạo ra hàm lượng p-nitrophenol thấp Ngược lại, ở nồng độ cao chiết thấp, hoạt chất ức chế không đủ hoặc ức chế yếu, khiến enzyme α-glucosidase phản ứng nhiều hơn, tạo ra hàm lượng p-nitrophenol cao, tương ứng với phần trăm ức chế enzyme α-glucosidase thấp.
Khi so sánh giá trị IC50 về khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao chiết thì khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của cao tổng và cao methanol cao hơn so với cao n-hexane và cao ethyl acetate Kết quả phân tích cho thấy các cao chiết điều có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cao hơn acarbose Từ đó cho thấy tiềm năng của lá cóc đỏ trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường.
Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ các hợp chất
Từ các hợp chất được cô lập tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α- glucosidase, kết quả được trình bày bảng 3.5
Bảng 3 5:Kết quả khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất cô lập
Hợp chất Nồng độ (àg/ml) IC50
Hợp chất Nồng độ (àg/ml) IC50
Giá trị được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± SD (-) Giá trị tỷ lệ ức chế (%I) < 1
Qua bảng kết quả 3.5, nhận thấy rằng khi tăng nồng độ hợp chất thì hàm lượng các hoạt chất có khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase trong hợp chất cũng tăng, khi đó hoạt tính enzyme α-glucosidase bị các hoạt chất trong hợp chất ức chế nên hoạt lực của enzyme α-glucosidase hoạt động trong dung dịch yếu đi, nên khi enzyme α- glucosidase tham gia phản ứng xúc tác với cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside sẽ tạo hàm lượng p-nitrophenol thấp thể hiện ở giá trị mật độ quang thấp, thì phần trăm ức chế của enzyme α-glucosidase sẽ cao Khi nồng độ hợp chất còn thấp thì lượng các hoạt chất có khả năng ức chế hoạt tính enzyme α-glucosidase không đủ hoặc ức chế nhưng thấp, khi đó enzyme α-glucosidase tham gia phản ứng xúc tác với cơ chất sẽ tạo hàm lượng p-nitrophenol nhiều, dẫn đến giá trị mật độ quang cao thì phần trăm ức chế của enzyme thấp Do đó, nồng độ hợp chất càng cao thì khả năng ức chế enzyme α- glucosidase càng cao
Kết quả phân tích cho thấy rằng các hợp chất cô lập được từ lá cóc đỏ đều có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase tốt hơn chất chuẩn acarbose Trong đó, naringenin
(TT02) là hợp chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase cao hơn hai hợp chất afzelin (TT01) và taxifolin (TT03) so với chất đối chứng dương là acarbose
So sánh cấu trúc naringenin (TT02) và afzelin (TT01) cho thấy rằng hai hợp chất có cấu trúc tương tự nhau, tuy nhiên ở hợp chất TT01 có gắn thêm một đơn vị đường rhamnopyranoside tại vị trí C–3 mà hợp chất TT02 không có nhóm thế này Vì hợp chất afzelin (TT02) có gắn thêm một phân tử đường làm tăng chướng ngại lập thể dẫn đến làm giảm tăng khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của hợp chất TT01 Bên cạnh đó, cấu trúc của TT01 và TT02 cũng có sự khác biệt đặc trưng ở nối đôi tại vị trí C–2 và C–3 của
TT01 Do đó, cấu trúc mặt phẳng của vòng A và vòng C ở hợp chất TT01 bị phá hủy dẫn đến khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của hợp chất TT01 thấp hơn so với TT02, điều này phù hợp với công bố của tác giả Carina Proenca và cộng sự vào năm 2017 [10] Đối với hai hợp chất naringenin (TT02) và taxifolin (TT03), hai hợp chất này cũng có cấu trúc tương tự nhau, nhưng ở hợp chất TT03 có thêm hai nhóm hydroxylm, một nhóm gắn tại vị trí C–3 và một nhóm tại vị trí C–3’ mà hợp chất TT02 không có hai nhóm thế này Do đó làm giảm hoạt tính của hợp chất TT03 dẫn đến khả năng ức chế enzyme α- glucosidase yếu hơn hợp chất TT02.
KIẾN NGHỊ
Một số kiến nghị nhằm hoàn thiện công trình nghiên cứu :
- Nghiên cứu thành phần hóa học của các cao chiết còn lại của lá cóc đỏ
- Khảo sát độc tính của nguyên liệu
- Ứng dụng nguồn nguyên liệu này để sản xuất sản phẩm hỗ trợ bệnh đái tháo đường
[1] Phạm T T C., Phan T N (2009), Công nghệ sinh học tập 3: Enzym và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo Dục Việt Nam, trang 56-80
[2] Phạm H H (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển 2, Nhà xuất bản trẻ, trang 110
[3] Lê C K (1986), Rừng ngập mặn và rừng nhiệt đới trên đất chua phèn, Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh, trang 40–80
[4] Nguyễn K P P (2007), Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP.HCM, trang 20–53
[5] Adrielli T., Ariela M B., Catarina C B., Alexandre B., Caio M M C and Valdir
C (2017), Chemical composition, antibacterial and antimycoplasma activities of four Eugenia species growing in Brazil, Academic journal, 11(39), 596–602
[6] Apostolidis E., Kwon Y.I and Shetty K (2007), Inhibitory potential of herb, fruit, and fungal-enriched cheese against key enzymes linked to type 2 diabetes and hypertension, Innovative Food Science and Emerging Technologies, 8, 46–54
[7] Andrea D S (2012), Diabetes: what you need to know, Copyright Australian Diabetes Council, 6–90
[8] Bandaranayake W M (2002), Bioactivities, bioactive compounds and chemical constituents of mangrove plants, Wetlands Ecology and Management, 10, 421– 452 [9] Bo-wei Z., Yan X., Chen W., Xiao-xia Y., Wen-long S., Zhi-long X., Yue-sheng
D (2017), Pentacyclic triterpenes as a-glucosidase and a-amylase inhibitors: Structure-activity relationships and the synergism with acarbose, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 27, 5065-5070.
In vitro and in silico studies by Carina P et al (2017) investigated the α-glucosidase inhibitory properties of flavonoids Their findings revealed a structure-activity relationship, with specific flavonoid structural features influencing inhibitory potency This study suggests the potential of flavonoids as natural antidiabetic agents by targeting α-glucosidase, an enzyme involved in carbohydrate digestion.
[11] Evelyn N D and Charles E B (1997), Application of NMR to Biochemical Kinetics, Journal of Chemical Education, 54(2), 124-127
[12] Hee J P., Han S Y., Kun Y P., Sook H R., Hae Y C and Jae S C (1991), Flavonoids from the Whole Plants of Orostachys japonicus, Arch Pharm Res, 14, 167-
[13] Ishikawa T., Navarro L B., Donatini R S., Bacchi E M., Kato E T M (2014), Gastroprotective property of Plinia edulis (Vell.) Sobral (Myrtaceae): The role of triterpenoids and flavonoids, Pharmacologyonline, 1, 36-43
[14] Jinyoung K., Youngshim L., Hojung K., Seock-Yong K., Kwang-Su P., Jun-Ho C., Yun-Yeong L., Byeong-Soo K., Yoongho L and Youhoon C., (2005), Synthesis of Naringenin Amino Acid Esters as Potential CDK2 Inhibitors, Bull Korean Chem, (26)12 [15] Lin T C., Hsu F L and Cheng J T (1993), Journal of Natural Products, 56, 629 [16] Lisette D., Wahidulla Solimabi & Devi P (2010), Antibacterial phenolics from the mangrove Lumnitzera racemosa, Indian Journal of Marine Sciences, 39(2), 294–298 [17] Majumdar S G and Patra G (1980), Journal of the Indian Chemical Society, 57,
[18] Miaomiao G., Renchao Z., Yelin H., Jianhua O., Suhua S (2011), Molecular comfirmation of natural hybridization between Luminitzera racemosa and Lumnitzera littorrea, Aquatic Botany, 95, 59–64
[19] Selvam V (2007), FAO Regional Office for Asia and the Pacific, Trees and shrubs of the Maldives, first edition, 195
[20] Shabbudin S., Muhammad T., Deny S., Haitham Q., Nurul A B and Abdul R (2011), Antimicrobial activity of mangrove plant (Lumnitzera littorea), Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 4, 523–525
[21] Shashank K and Abhay K P (2013), Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview, The ScientificWorld Journal
[22] Sundaram R., Murugesan G (2011), Hepatoprotective and antioxidant activity of a mangrove plant Lumnitzera racemosa, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine,1,
[23] Ta-Chen L., Feng-Lin H and Juei-Tang C (1993), Journal of Natural Products,
[24] Thao N P., Luyen B T T., Diep C N., Tai B H., Kim E J., Kang H K., Lee S H., Jang H D , Cuong N T., Thanh N V., Cuong N X., Nam N H., Minh C V., Kim Y
H (2015), In vitro evaluation of the antioxidant and cytotoxic activities of constituents of the mangrove Lumnitzera racemosa Willd, Archives of Pharmacal Research, 38 (4), 446–
[25] Tian M., Dai H., Li X., Wang B (2009), Chemical constituents of marine medicinal mangrove plant Sonneratia caseolaris, Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 27(2), 288–296
[26] Trofimova N N., E V., Stolpovskaya V A Babkina, Fedorov S V., Kalabin G A., Goryainov S V., Zolotarev E E., Safronov A Y., Kashevski A V., and Zhitov R G (2015), The Structure and Electrochemical Properties of Metal Complexes with Dihydroquercetin, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 41(7), 745-752
[27] Verma N., Singh A P., Amresh G., Sahu P K (2010), “Different approaches for treatment of type 2 diabetes mellitus with special reference to traditional medicines: a review”, The Pharma Research, 3, 27-50
Phụ lục 1 Phổ 1 H–NMR (DMSO, 500 MHz) của hợp chất TT01 (afzelin)
Phụ lục 2 Phổ 13 C–NMR (DMSO, 500 MHz) của hợp chất TT01 (afzelin)
Phụ lục 3 Phổ 1 H–NMR (DMSO, 500 MHz) của hợp chất TT02 (naringenin)
Phụ lục 4 Phổ 13 C–NMR (DMSO, 500 MHz) của hợp chất TT02 (naringenin)
Phụ lục 5 Phổ 1 H–NMR (DMSO, 500 MHz) của hợp chất TT03 (taxifolin)
