Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀO TẠOBỘ NÔNG NGHIỆPVÀPTNTVIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƯỚNG NÂNG

CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬUTƯƠNG (GLYCINEMAX(L.)Merr.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀO TẠOBỘ NÔNG NGHIỆPVÀPTNTVIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƯỚNGNÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY

ĐẬUTƯƠNG(GLYCINE MAX(L.)Merr.)

Chuyênngành: Công nghệ sinhhọc

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Khuất HữuTrung2 GS.TS Ngô XuânBình

Hà Nội - 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôixincamđoan,đâylàcôngtrìnhnghiêncứucủacánhântôi,cácsốliệuvà kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào hoặc chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứunào.

Tôixincamđoanrằng,mọisựgiúpđỡ,hợptácchoviệcthựchiệnluậnánnày đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ dẫn rõ nguồngốc.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô giáo, các tập thể, cá nhân, gia đình cùng bạn bè đồng nghiệp.

TôixinbàytỏlòngbiếtơnsâusắcđếnPGS.TS.KhuấtHữuTrung,GS.TSNgô XuânBình-làthầygiáohướngdẫnkhoahọc,đãtậntìnhgiúpđỡ,truyềntảikiếnthức

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam;tậpthểcánbộBanThôngtinvàĐàotạo;tậpthểLãnhđạovàcánbộviênchức Trung Tâm chuyển giao công nghệ và khuyến nông đã giúp đỡ, hỗ trợ tận tình cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đềtài.

TôixinchânthànhcảmơnKhoaCôngnghệsinhhọcvàCôngnghệthựcphẩm, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên là nơi tôi triển khai thực hiện đề tài, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về tài liệu khoa học, cơ sở vật chất, thiết bị phục vụ nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án Đặc biệt, tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa Công nghệ sinh học và

chiasẻkiếnthứcvàkinhnghiệmchuyênmônđểtôihoànthànhnghiêncứutrongthời gian sớmnhất Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp trong và ngoài cơ quan và người thân trong gia đình luôn hết lòng động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành công trình trình nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

4 Đối tượng và phạm vinghiên cứu 4

4.1 Đối tượngnghiên cứu 4

4.2 Phạm vi, thời giannghiên cứu 4

5 Những đóng góp mới củaluận án 4

CHƯƠNG I.TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀT À I 6

1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới vàViệtNam 6

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trênthế giới 6

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ởViệt Nam 8

1.2 Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương trênthếgiới 9

1.2.1 Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở câyđậu tương 9

1.2.1.1 Vật liệu sử dụng trong tái sinh in vitro ở câyđậutương 9

1.2.1.2 Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro câyđậutương 10

1.2.2 Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trênthếgiới 15

1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩnAgrobacteriumtumefaciens 15

1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen bằng súngbắngen 18

1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen bằngxungđiện 18

1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen quaốngphấn 19

1.2.3 Cáctínhtrạngđượccảithiệnthôngquachuyểngenởcâyđậutương 20

1.2.3.1 Đặc tính kháng thuốcdiệtcỏ 20

1.2.3.2 Đặc tính khángcôntrùng 21

1.2.3.3 Chuyển gen nâng cao hàmlượngdầu 25

1.2.3.4 Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiệnngoạicảnh 25

1.2.3.5 Chuyển gen nâng caonăngsuất 25

1.2.3.6 Chuyển gen tạo cây trồng đatínhtrạng 26

1.2.4 Thành tựu về cây trồng chuyển gen trênthếgiới 26

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứutrongnước 30

1.3.1 Chọntạogiốngthôngquatuyểnchọnvậtliệunhậpnộivàđịaphương 30

1.3.2 Chọn tạo giống đậu tương mới bằng laihữutính 31

1.3.3 Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lýđộtbiến 32

1.3.4 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương ởViệtNam 32

1.3.4.1 Nghiêncứutáisinhcâyinvitrophụcvụchuyểngenởcâyđậutương 32

1.3.4.2 Nghiên cứu chuyển gen ởđậutương 33

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu về tính trạng gen có khả năng nâng caonăng suất hạt ở câyđậutương 34

2.4.2.1 Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóaláAtore1 50

2.4.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóaláAtore1 52

2.4.2.3 ĐánhgiákhảnăngbiểuhiệncủagenkìmhãmgiàhóaláAtore1trêncâymôhìnhArabid opsisthaliana 53

3.1.1.1.Nghiên cứu tạo vật liệuvôtrùng 62

3.1.1.2.Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ nốtlámầm 63

3.1.1.3.Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ nốtlámầm 68

3.1.1.4.Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng GA3đến khả năng kéo dài chồi của mộtsố giốngđậutương 75

3.1.1.5.Tái sinh rễ tạo câyhoàn chỉnh 76

3.1.2 Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giốngđậutương 78

3.2 Kếtquảtáchdòngvàthiếtkếvectorchuyểngenmanggenkìmhãmgiàhóalá Ore1

và đánh giá biểu hiện trên câyArabidopsisthaliana 85

3.2.1 Tách dòng gen kìm hãm giàhóaAtore1 85

3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóaláAtore1 89

3.2.2.1.Gắn gen Atore1 vào vectorchuyểngen 89

3.2.2.2.Tạo chủng vi khuẩn E.coli và Agrobacterium tumefaciens mang genAtore1 91

3.2.3 Đánh giá khả năng biểu hiện của gen kìm hãm già hóa lá Atore1 trên câymô hìnhArabidopsisthaliana913.2.3.1. Chuyển gen Atore1 vào cây mô hìnhArabidopsisthaliana 91

3.2.3.2.Chọn lọc cây Arabidopsis thaliana chuyển gen T1manggenAtore1 92

3.2.3.3.Đánh giá cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệT1 93 3.2.3.4.Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái của cây Arabidopsis thalianachuyển gen Atore1 thếhệT1 94

3.2.3.5.ĐánhgiácâyArabidopsisthalianachuyểngenAtore1bằngPCRởthếhệT2 95

3.2.3.6.Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái lá ở cây Arabidopsis thalianachuyển gen Atore1 thếhệT2 96

3.3 Kết quảchuyểngenkìm hãm già hóa lá Atore1 vào cây đậu tương và đánhgiá các dòngchuyểngen 100

3.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi khuẩnAgrobacteriumtumefaciens1003.3.1.1.Nuôi cấy hạt đậu tương nảy mầm chuẩn bị để biếnnạpgen 100

3.3.1.2.Tạo dung dịch vi khuẩn biến nạpgenAtore1 101

3.3.1.3.Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến khả năngbiếnnạp 102

3.3.1.5.ẢnhhưởngcủanồngđộAcetosyringon(AS)đếnkhảnăngbiếnnạpgen 105

3.3.1.8.Tạo cây đậu tương chuyển gen Atore1hoànchỉnh 110

3.3.1.9.Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen trồng trong vườnthínghiệm 110

3.3.3.1.Chọn lọc dòng đậu tươngđồng hợp tử mangg e n Atore1 123

3.3.3.2.Đánh giá biểu hiện gen của dòng đậu tương mang gen Atore1 đồng hợp tửthông quahìnhthái 126

3.3.3.3.Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển ở các dòng đậu tương

chuyểngen Atore1 đồng hợp tử bằngSouthernblot 128

3.3.4 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AtBBX32 The Arabidopsis thaliana BBX32 Atore1 Arabidopsis thalianaOre1

CBF C-repeat/dehydration responsive element bingding factor

CCM Co-Culture Medium (Môi trường đồng nuôicấy)

DNA Deoxyribonucleic acid (Axít Deoxyribonucleic)

FAOSTAT Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc)

GMO Genetically Modified Organism(Sinh vật biến đổi gen)

ISAAA International Service for the Acquisition of Agri-biotech

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

SEM Shoot Elongation Medium (Môi trường kéo dàichồi)

SAAT SonicateAssistedAgrobacterium-mediaTransformation(Phương pháp biến nạp gen ở đậutương)

SIM Shoot Inducing Medium (Môi trường cảm ứng chồi)

DANH MỤC BẢNG

1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những nămgầnđây 6

1.2 Tìnhhìnhsảnxuấtđậutươngcủamộtsốnướcđứngđầutrênthếgiớitrongnhữngnăm gần đây (sản lượng trên 1triệutấn) 7

1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2012-2021 8

1.4 Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2020-2022 9

1.5 Một số môi trường tái sinh cây đậu tươnginvitro 14

1.6 Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu năm 2019 (theoquốcgia) 27

1.7 Các giống Đậu tương tuyển chọn từ nguồnnhậpnội 31

2.1 Danh sách các giống đậu tương sử dụng trongnghiêncứu 41

2.2 Trình tự mồi sử dụng tách dònggenAtore1 43

2.3 Công thức ảnh hưởng của BAP đến khả năngtạochồi 45

2.4 Công thức ảnh hưởng của Kinetin đến khả năngtạochồi 45

2.5 Công thức ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéodàichồi 46

2.6 Công thức ảnh hưởng của IBA đến khả năngrarễ 46

2.7 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu tách dònggenAtore1 51

2.8 Danh sách mồi sử dụng để nhângenAtore1 54

2.9 Thành phần phản ứng PCR nhân dònggenAtore1 54

2.10 ThànhphầncácmôitrườngdùngchochuyểngenởcâyđậutươngthôngquavikhuẩnAgrobacteriumtumefaciens 57

2.11 Danh sách mồi sử dụng để nhângenAtore1 59

3.1. Ảnh hưởng của NaClO đến khả năng vô trùng mẫunuôicấy 62

3.2. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ nốt lá mầm của các giống đậu tươngsau 14 ngàynuôicấy 63

3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến tái sinh chồi từ nốt lá mầm sau 14 ngày nuôicấy.69 3.4. ẢnhhưởngcủahàmlượngGA3đếnkhảnăngkéodàichồicủamộtsốgiốngđậutương (sau 30 ngàynuôicấy) 75

3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của một số giống đậu

3.11. Kết quả nuôi cấy tạo vật liệu biếnnạpgen 100

3.12. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biếnnạpgen 104

3.13. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biếnnạpgen 105

3.14. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biếnnạpgen 106

3.15. ẢnhhưởngcủaPPTđếnkhảnăngchọnlọcchồichuyểngenởcâyđậutương

3.16. Kết quả chọn lọc và tái sinh cây đậu tương chuyểngenAtore1 109

3.17. Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen T0ratrồng 110

3.18. Kết quả sàng lọc cây đậu tương chuyển gen T0ngoàiđồngruộng 112

3.19. Kết quả đánh giá sơ bộ cây đậu tương chuyển gen thếhệT0 113

3.20. Đánh giá hiện diện gen ở cây đậu tương chuyển gen T0bằngPCR 113

3.21. Kết quả phân tích hiện diện của gen bằng PCRởT1 116

3.22. Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây đậu tương chuyển genAtore1thếhệT1

117 3.23. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển genAtore1thếhệT1 118

3.24. Kết quả chọn lọc các cây đậu tương chuyển genAtore1thế hệ T2bằng thuốcdiệtcỏBasta 120

3.25. Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây chuyển genAtore1thế hệ T2120 3.26. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển genAtore1thếhệT2 121

31 Kết quả tách chiết DNA tổng số 128

3.32 Đặc điểm sinh trưởng của dòng đậu tương chuyển genAtore1đồng hợp tử130

3.33 MộtsốyếutốcấuthànhnăngsuấtcủadòngđậutươngchuyểngenAtore1đồnghợptử 1313.34 Hiện trạng hoóc-môn ở các dòng đậu tương chuyển gen độtbiếnAtore1 133

DANH MỤC HÌNH

1.1 Một số vật liệu nuôi cấy trong nuôi cấy môđậutương 10

1.2 Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu năm2019[10] 29

1.3 Dòng đậu tương chuyển gen GmBS1 tăng kích thướchạt[116] 35

1.4 Kiểu hình của cây chuyển gen kìm hãm già hóa láore1và cây đối chứng (wildtype) sau 50 ngày nảymầm[122] 39

2.1 Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương từ nốtlámầm 48

2.2 Vùng T-DNA của vector pCAMBIA3301 mang genBarvàGUS, điều khiểnbởipromoter35S 49

2.3 Sơ đồ tổng quát mô tả quá trình chuyển gen trên câyArabidopsisthaliana 55

3.1 Một số hình ảnh thực hiện các bước tiến hànhthínghiệm 74

3.2 Nuôi cấy tạo đa chồi ở một số giống đậu tươngnghiêncứu 74

3.3 Ảnh hưởng của IBA (1,0mg/l) đến khả năng ra rễ ở giống ĐT26 sau 3 tuần nuôicấy 78

3.4 Biểu hiện genGUSvà tái sinh câychuyểngen 79

3.5 Hình vẽ mô phỏng cấu trúc vector pBS nhân dònggenAtore1 87

3.6 KếtquảkiểmtrakhuẩnlạcmanggenAtore1bằngPCRvàenzymecắtgiớihạn.873.7 KếtquảgiảitrìnhtựgentáchdòngAtore1vàsosánhvớitrìnhtừgenAt5g39610 bằng phần mềm BioEdit Vị trí mũi tên trên hình chỉ đoạn chèn thêm của gen Atore1trên vùng mã hóa củagenAt5g39610 88

3.8 Hình vẽ cấu trúc vector chuyểngenAtore1 90

3.13 Biểuđồ sosánh hàmlượngdiệp lục(chlorophyll)giữa

câyArabidopsischuyểngenAtore1và câyArabidopsisđối chứng Col-wt ở giai

đoạn thu hoạch9 8

3.14 Hạt đậu tương nảy mầm và mẫubiếnnạp 101 3.15 VikhuẩnmanggenđượcnuôitrảitrênmôitrườngLB(A)sauđóđượcchuyểnsang môi trường LB lỏng để thu tế bào Tế bào vi khuẩn được hòa tan bằng môitrường CCM lỏng (B) để sử dụng cho biếnnạpgen 102 3.16 Chọn lọc chồi chuyển gen sau 14 ngày trên môi trường SIM PPT 10mg/l108 3.17 Một số hình ảnh mẫu biến nạp gen sau 5 ngày trên môi trường đồng nuôi

cấyCCM 108 3.18 Một số hình ảnh cây đậu tương chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM

chứakháng sinh10mg/lPPT 109 3.19 Hình ảnh cây đậu tương chuyển gen trên môi trường rarễRM 110

3.20 Cây đậu tương chuyển genAtore1thế hệ T0giai đoạn cảm ứng trong phòngnuôi 111

3.21 Hình ảnh sàng lọc cây đậu tương chuyển gen sau 3 ngày bằng thuốc diệt cỏBasta 112 3.22 Kết quả phân tích PCR cây đậu tương chuyển gen Atore1 thếhệT0 114 3.23 Kết quả chọn lọc đậu tương chuyển gen T1bằng thuốc diệtcỏBasta 114 3.24 Kết quả phân tích biểu hiện của gen chọn lọc Bar bằng PCR của các cây

đậutương chuyểngenT1 115 3.25 .KếtquảphântíchbiểuhiệngenAtore1củacáccâyđậutươngchuyểngenT1.116

3.26 Kết quả lai Southern của các dòng đậu tương mang genAtore1thếhệT1 119 3.27 Biểu hiện kết quả chọn lọc cây đậu tương chuyển gen T2bằng thuốc diệt

bằng thuốc diệtcỏBasta 126

3.32 Hình thái cây đậu tương mang genAtore1đồng hợp tử giai đoạn thu hoạch

sovới cây đậu tương không chuyểngen(Đ/c) 127 3.33 Kết quả phân tích biểu hiện của gen chọn lọc Bar bằng PCR của các cây

đậutương chuyểngenT3 128

3.34 Hình thái cây đậu tương mang genAtore1đồng hợp tử giai đoạn thu hoạch

sovới cây đậu tương không chuyểngen(Đ/c) 129

3.35 KếtquảlaiSoutherncủacácdòngđậutươngmanggenAtore1đồnghợptử 129

3.36 .KiểuhìnhtuổithọcủaláởcácdòngđậutươngAtore1ởgiaiđoạnthuhoạchR81353.37 Năng suất hạt của dòng đậu tương biểu hiệnAtore1độtbiến 136

MỞ ĐẦU1 Tínhcấp thiết của đềtài

Đậu tương [Glycine max(L.) Merrill] được xếp vào cây trồng nông nghiệp

quan trọng nhất Hạt đậu tương được xếp trong 8 loại hạt có dầu có giá trị kinh tế và nhucầusửdụngcao,đượcsảnxuấtvàgiaodịchphổbiếntrênthjtrườngquốctế[10], [46] Ở Việt Nam, đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng quan trọng thứ ba sau lúa và ngô Đồng thời Việt Nam có nguồn gen đậu tương rất phong phú, riêng tại vùng miền núi phía Bắc, nơi sản xuất đậu tương lớn của cả nước (chiếm khoảng hơn 65% diện tích), hiện có nhiều nguồn gen

CúcHàBắc,CọcChùmCaoBằng,VàngMườngKhương,đậutươngHữuLũng,đậu tương hạt vàng Lạng Sơn… Các giống này có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, nhưng năng suất thấp [2],[3].

Một thực tế ở Việt Nam hiện nay là: trong khi nhu cầu sử dụng hạt đậu tương ngàycàngcaothìdiệntíchtrồngđậutươngcủaViệtNamngàycanggiảm.Theobáo

củaBộNN&PTNTdiệntíchvàsảnlượngđậutươngcủaViệtNamliêntụcgiảmdần qua các năm: năm 2010, diện tích trồng đậu tương là 197.800 ha, đến năm 2021 chỉ còn khoảng 37.000 ha, diện tích giảm hơn 75% và sản lượng giảm trên 70% so với năm 2010 Nguyên nhân của việc giảm nhanh về diện tich sản xuất là do cây đậu tương bị sâu bệnh phá hoại nặng, việc áp dụng tiến bộ kỹ thuật chậm hơn so vơi các cây trồng khác, vì vậy năng suất đậu tương rất thấp chỉ đạt khoảng 1,5 tấn/ha (bằng 50%năngsuấtcủathếgiới).ThựctrạngđódẫnđếnviệcViệtNamthiếuhụt3,5-5,0

- 3tỉUSD/năm,gầntươngvơigiátrịxuấtkhẩulúagạocủaViệtNamhiệnnay.Thực tế trên cho thấy, để phát triển sản xuất đậu tương, Việt Nam cần đầu tư đẩy mạnh

câytrồng chuyểngenđượcứngdụngphổbiếnvàrộng rãi,tạoracácgiốngcâytrồngcónăng suất cao, chống chịutốt vớiđiều kiện biếnđổi khí hậugiúp manglại lợi íchnhiềumặtvềkinhtế, môitrường,xãhộivàxóa đóigiảm nghèo.Tính đến năm 2019, diện tích cây trồng chuyển gen đã lên đến 190,4 triệu ha ở 29 quốc gia, sản lượng tăng 94 lần (so với năm 1996 là năm đầu tiên cây trồng chuyển gen được thương mại hóa) trở thành ngành công nghệ phát triển nhanh nhất trong lịchsử thế giới hiện đại Cây đậu tương là cây trồng chuyển gen được trồng ở nhiều quốc gia, đến năm 2021 diện tích đậu tương chuyển gen lên đến gần 100 triệu ha, chiếm 50% tổng diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới, chiếm 78% diện tích canhtác đậu tương toàn cầu Các tính trạng phổ biến ở cây đậu tương chuyển gen là: kháng sâu, kháng, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao hàm lượng dầu[10].

Xu hướng hiện nay chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng và cây trồng nói chung đó là tiếp tục cải biến di truyền với các tính trạng chống chịu và nhất là các tính trạng nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng Một trong những hướng chọn tạogiốngchonăngsuấtcaonhữngnămgầnđâyđượcnhiềunhàchọngiốngquantâm đó là kéo dài thời gian sinh trưởng của bộ lá bằng cách đưa gen xác định tính trạng “trẻ lâu” (juvenile trait) vào các giống chín sớm thông qua lai tạo hoặc cải biến di truyền bằng chuyển gen/chỉnh sửa là15-30ngày[71],[123].Năm2015,trườngĐạihọcĐôngA(HànQuốc)đãthành công trong việc

chuyển genOre1vào cây lúa, kết quả là làm tăng tuổi thọ của bộ lá nhất là bộ lá

đòng, lá giữ được màu xanh ngay cả khi hạt đã chín, vì thế đã làm tăng năng suất lúa 15 -25%.

Trên cơ sở những kiến thức hiểu biết trước đó, chúng tôi đã xác định hướng

nghiên cứu chuyển genore1vào cây đậu tương và tiến hành thực hiện luận án

“Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậutương(Glycine max(L.) Merr.)”.Kết quả của đề tài có ý nghĩa quan trọng, góp

phần phát triển kỹ thuật cải biến di truyển tạo ra các giống đậu tương có năng suất cao phục vụ sản xuất.

2 Mụctiêu nghiêncứu

2.1 Mụctiêu tổngquát

Nghiên cứu chuyển gen tạo các dòng đậu tương mang gen kìm hãm già hoá

của bộ lá (genAtore1) theo hướng nâng cao năng suất hạt trên giống đậu tương của

Việt Nam.

2.2 Mụctiêu cụthể

- Đánh giá được khả năng tái sinh và khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương Việt Nam phục công tác chuyểngen.

- Thiếtkếthành công vector chuyểngenmanggenđích (genAtore1)có

-TạođượccácdòngđậutươngchuyểngenmanggenđíchAtore1vàbướcđầu đánh giá được

biểu hiện của gen ở các dòng đậu tương chuyểngen.

3 Ýnghĩa khoa học và thực tiễn của luậnán

3.1 Ýnghĩa khoahọc

- Kết quả của luận án là tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật di truyền hiện đại (chuyển gen, chỉnh sửa gen) nhằm tạo ra các giống đậu tương có năng suất cao hơn, có khả năng chống chịu tốthơn.

- Kếtquảnghiêncứucủaluậnánlàcơsởkhoahọcvàthựctiễnchoviệchoàn thiện kỹ thuật tái sinh các giống đậu tương cho chuyển gen, thiết kế vector chuyển gen, chuyển gen, sàng lọc đánh giá cây chuyển gen; xây dựng cơ sở phương pháp luậnđánhgiáchọnlọcdòngchuyểngenđồnghợptửcókiểugenổnđịnhđểchọnlọc giống đậu tương chuyển gen ở ViệtNam.

- Kết quả nghiên cứu của luận án có giá trị làm tư liệu, tài liệu cho giảng dạy, nghiêncứusâuhơn về chuyểngenở câyđậutương nóiriêngvàở câytrồngnói

chung.Bổsungphươngphápluậnvềchuyểngenvàchọnlọcdòngchuyểngenđồng hợptử.

3.2 Ýnghĩa thựctiễn

Tạo được các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1, T2, tạo được một số

dòng chuyển genAtore1đồng hợp tử thế hệ T3có tuổi thọ của bộ lá kéo dài hơn vàcho năng suất cao hơn giống đối chứng không chuyển gen.

4 Đốitượng và phạm vi nghiêncứu

4.1 Đốitượng nghiêncứu

Cây mô hìnhArabidopsis thaliana.

30 giống đậu tương của Việt Nam (bao gồm các giống trồng canh tác và các giống địa phương), 02 giống đậu tương mô hình là Kwangan (KW) và William82.

4.2 Phạmvi, thời gian nghiêncứu

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính (nhà lưới) tại Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm,trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên trong thời gian từ năm 2019 - 2022.

5 Nhữngđóng góp mới của luậnán

- Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học để xây dựng cơ sở dữliệu và phương pháp luận về nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen ở cây đậu tương Trong đó, tối ưu hóa được các điểu kiện tái

sinhin vitrovà lựa chọn được các giống đậu tương thích hợp cho tái sinh là: ĐT22,

VX93, ĐVN11, ĐVN9, ĐVN6, ĐVN5, ĐVN10,ĐT26.

- NhândòngthànhcônggenAtore1,thiếtkếthànhcôngcấutrúcvectorchuyển genpER8-Atore1mang gen kìm hãm già hóa bộ láAtore1, thử nghiệm trên cây môhìnhArabidosischo thấy vector và gen hoạt động tốt, sẵn sàng cho việc chuyểng e n

vàocâyđậutương.Kếtquảthiếtkếvectorlàcơsởlýluậnđểthiếtkếhệthốngvector chuyển gen cho đối tượng thực vật nhằm nâng cao việc ứng dụng kỹ thuật di truyền hiện tại và tươnglai.

- Thành công trong việc tạo được cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1, T2và T3, sử dụng chất chỉ thị, phân tích PCR, phân tích biểu hiện hình thái, phân tíchSouthernđểsànglọccâychuyểngenquacácthếhệ.Nhấtlàđãthànhcôngtrongviệcchọn lọc được 02 dòng chuyển gen đồng hợp tử thế hệ T3, ổn định về kiểu gen, cótuổi thọ của bộ lá dài hơn từ 17 - 22 ngày so với đối chứng và có năng suất cao hơn đối chứng không chuyển trên trên 18% Việc thành công trong chọn lọc được dòngđồng hợp tử ở thế hệ thứ 3 (T3) là cơ sở khoa học có tính thuyết phục cao trong việchướng đến chọn thành giống đậu tương chuyểngen.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI1.1 Tìnhhình sản xuất đậu tương trên thế giới và ViệtNam

1.1.1 Tìnhhình sản xuất đậu tương trên thếgiới

Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ và chiếm tỷ lệ tới 87,4 %, tiếp đến là Châu Á với 8,5 % tổng diện tích đậu tương trên thế giới từ năm 2012 - 2021 [46] Trong những năm gần đây, diện tích trồng, sản lượng và năng suất đậu tương đều có những biến động nhất định Cụ thể, giai đoạn 2012 - 2021 diện tích đậu tương tăng đều từ 105,35 triệu ha đến 129,06 triệu ha Sản lượng cũng tăng đều từ 241,18 triệu tấn đến 364,06 triệu tấn kéo theo sự tăng năng suất từ 22,89 tạ/ha đến 28,21 tạ/ha Năm2020và2021,năngsuấtvàdiệntíchđậutươngtiếptụctăngnhẹ,đạtsảnlương cao nhất năm 2021 là 364,06 triệu tấn [46] Số liệu được thu thập và trình bày trong Bảng1.1.

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây

Sảnxuấtđậutươngtậptrungởcácquốcgiacóưuthếvềsảnxuấtnôngnghiệp, 12 quốc gia đứng đầu trên thế giới có sản lượng hàng năm trên 1 triệu tấn ĐứngđầulàBrazil(trên121triệutấnnăm2021),tiếpđólàMỹ,ArgentinavàTrungQuốc.Trong

số12quốcgiađứngđầuthếthếgiớivềsảnxuấtđậutươngcó4quốcgialàBrazil,Mỹ,TrungQuốcvàNga cósảnlượngổnđịnhvàliêntụctăngtrong5nămtrởlạiđây(Bảng 1.2)[46].

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tương của một số nước đứng đầu trên thếgiới trong những năm gần đây (sản lượng trên 1 triệu tấn)

1.1.2 Tìnhhình sản xuất đậu tương ở ViệtNam

Tại Việt Nam, đậu tương là cây trồng quan trọng thứ ba sau cây lúa và ngô Song diện tích gieo trồng ngày càng giảm, không đáp ứng được nhu cầu của ngành công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản và công nghệ ép dầu do giốngbảnđịanăngsuấtthấp,giốngnhậpngoạinăngsuấtcaonhưngkhôngcónhững đặc tính nổi trội của giống bản địa, giá bán không cao so với các cây công nghiệp khác.Nhìnchung,diệntíchđậutươngViệtNamkhôngổnđịnh,sảnxuấtnộiđịamới chỉ đủ cung cấp cho khoảng 8 - 10% nhu cầu Tính đến năm 2021, diện tích trồng trên cả nước giảm mạnh chỉ còn 37,3 nghìn ha, giảm hơn 3 lần so với năm 2012 [2], [3].

Bảng 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2012 - 2021

từ14,5tạ/ha(năm2012)lên15,7tạ/ha(năm2020)và16,1tạ/ha(năm2021)songso với thế giới Việt Nam vẫn là nước có năng suất thấp, chỉ bằng 65% năng suất trung bình của thế giới[2].

Bảng 1.4 Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2020 - 2022

Nguồn: Bộ Công thương

Dựa trênsốliệu Bảng 1.4 chothấy,nhu cầu tiêu thụ đậutươngtạiViệtNamtươngđối cao,trongkhiđósản xuấttrongnước mới đáp ứng được một phần nhỏnhucầu nội địa chủ yếuđểchế biến sữa đậu nànhvàmộtsốloại thực phẩmkhác,cóđến

90%lànhậpkhẩuđểphụcvụsảnxuấtdầuănvàchếbiếnthứcănchănnuôi.Năm2014,cảnước nhập khẩu hơn 1,5triệutấn đậutương,đến năm 2022 nướctavẫn phải nhập khẩuhơn4,9triệutấnvớichiphíhơn2,7tỷUSDđểphụcvụchocôngnghiệpchếbiến,sản xuất dầuăn vàthứcănchănnuôi Chínhvìvậy, việc tăng năngsuất và sản lượng đậu tương là rất cần thiết Tuy nhiên, thực tế sản xuất đậu tương ở nước ta còn gặp nhiều khó khăn, bên cạnh tình hình giá phân bón, thuốc trừ sâu tăng cao và sâu bệnh diễn biến

phức tạp còn thiếu nguồn giống tốt cho sản xuất[3].

1.2 Tổngquan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương trên thếgiới

1.2.1 Nghiêncứu về tái sinh in vitro ở cây đậutương

1.2.1.1 Vậtliệu sử dụng trong tái sinh in vitro ở cây đậutương

Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây đậu tươngin vitrocho thấy, vật liệuđược

- cotyledon,nốtlámầm(cotyledonnode)[80],[112],trụtrênlámầm(epicotyl)[73],[80], sử dụng một nửa lá mầm (half-seed), chồi ngọn (shoot tip) (Hình 1.1) [29],[56] Tùy vào điều kiện, môi trường nuôi cấy và đặc điểm giống để có thể sử dụng

đậutươngchochuyểngen,cácnhànghiêncứuchủyếusửdụngmẫunửalámầm,trụ dưới hoặc trụ trên của lámầm.

Hình 1.1 Một số vật liệu nuôi cấy trong nuôi cấy mô đậu tương

A: Trụ trên lá mầm; B: Lá mầm; C: Trụ dưới lá mầm; D: Chồingọn;E: Nốt lá mầm[56]

1.2.1.2 Phátsinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậutương

Phátsinhphôisomalàmộtkỹthuậtquantrọngtrongnuôicấymôthựcvật.Ưu điểm chính của phương pháp này là sự phát triển của phôi soma bắt chước phôi hợp tửvànếuđượcbaobọc,sẽgiốngnhưhạtgiống(hạtnhântạo).Tuynhiên,mộtsốloài

cócáctếbàotiềnphôiđượcxácđịnh,nêndễpháttriểnphôiinvitro,mộtsốloàivẫn chưa cóphương pháp hình thành phôi somain vitro Các nghiên cứu cho thấy đậu

tươngphảnứngthuậnlợiđốivớiviệctạophôisoma(thôngquamẫucấylámầm)và có thể được khai thác một cách thích hợp cho quá trình tạo phôi Ở các giống đậu tương khác nhau, sự hình thành phôi soma có khác nhau về yêu cầu môi trường với từng kiểu gen Chao Yang và cs cho rằng các kiểu gen đậu tương khác nhau yêu cầu nồng độ đường sucrose khác nhau (môi trường MS biến đổi với vitamin B5) để phát triển phôi soma hiệu quả [31] Tương tự, các giống đậu tương trồng ở các địa điểm

cấymầmhạt.Dođó,sựpháttriểncủaphôisomathayđổitheocáckiểugenkhácnhau và các dòng khác nhau phải được sàng lọc để phát triển phôi soma hiệu quả Mặcdù

quá trình tạo phôi soma cung cấp một số ứng dụng, nhưng khó khăn trong việc sử dụngphôisomalàtỷlệthànhcôngkhôngcao.Thôngthường,chỉcómộtsốphôisoma phát triển thành cây con hoàn chỉnh Nguyên nhân là do tương tác giữa kiểu gen và môitrườngnuôicấytrongquátrìnhpháttriểnphôi.TácgiảBirchvàCollinsonđãchỉ ra rằng nếu phôi soma đậu tương được xử lý bằng một lượng axit abscicic thích hợp thìsẽdẫnđếncảithiệnsựpháttriểnvàtrưởngthànhcủaphôi.Axitabscisichoạtđộng như một hormone chống stress, giúp phôi vượt qua các điều kiện bất lợi và đảm bảo sự hình thành cây con tốt hơn khi điều kiện thích hợp [26], [37],[72],

Phôi soma có khả năng phát sinh cả chồi, rễ và hình thành cây hoàn chỉnh khi tái sinh Mặc dù quá trình phát sinh phôi vô tính đã được báo cáo ở một số phòng thí nghiệm nhưng hầu hết các quy trình này khi tiến hành các thử nghiệm chuyển gen ban đầu đã không thành công [31, [34],[77], [113] Năm 1988, Finer J.J đã xây dựng thành công một hệ thống phát sinh phôi soma từ nốt lá mầm còn non ở cây đậu tương khi ông nuôi cấy mẫu trên môi trường có chứa nồng độ 2,4D cao (40mg/l) Phôi vô tính được nhân lên khi nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc môi trường dạng lỏng huyền phù có nồng độ 2,4D thấp hơn [50] Phân tích hình thái và quan sát sự sinh trưởng của phôi cho thấy hầu hết những phôi soma mới đều được sinh ra từ bề mặt phôi ban đầu hoặc cạnh đó có dạng hình cầu, màu xanh sáng [49],

[50] Khi cấy chuyển những phôi này sang môi trường MS (Murashige and Koog) không có chất kích thích sinh trưởng thu được cây con tái sinh hoàn chỉnh Với hệ thống này, phôi mới sinh ra được sử dụng là mô thích hợp cho chuyển gen [48].

Việc phát sinh phôi soma trong tái sinhin vitrocây đậu tương cũng được ứng dụng

trong bảo tồn, lưu giữ và ứng dụng các kỹ thuật di truyền ở cây đậu tương.

Phát sinh cơ quan (chồi/rễ ) từ mẫu cấy thông qua giai đoạn mô sẹo (callus) Trong phương pháp này, mẫu cấy đầu tiên được kích thích để tạo ra callus, sau đó

được định hướng để tạo thành cơ quan biệt hóa (chồi, rễ ) và được phát triển thành cây con hoàn chỉnh.

Lợi ích của phương pháp này bao gồm việc nhân nhanh giống cây trồng và

pháttriểncácgiốngmớibằngcácbiếndịdòngsoma.Cácbiếndịnàylàdođiềukiện nuôi cấyinvitrocung cấp cho các tế bào chưa biệt hóa, tạo ra các biến dị di truyền trong các mô

tái sinh Giống được phát triển như vậy cũng dễ dàng được chấp nhận vì nó không liên quan đến thao tác gen ngoại lai Đối với cây đậu tương, một số nghiên cứu đã được thực hiện để sản xuất cây con qua trung gian mô sẹo Nhóm tác giả Liu và cs đã nghiên cứu hiệu quả của hạt từ phôi trên cây tái sinh từ mô sẹo và tạophôitrênmôitrườngMScóchứaBAP,NAAvàchorằngbêncạnhviệcứngdụng chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh, hàm lượng IAA và polyamine nội sinh trong mẫu đậu tương rất quan trọng trong việc xác định hiệu quả của cảm ứng mô sẹo và

sựpháttriểntronginvitro[82].Bêncạnhmẫucấynon,lámầmvàphôitrưởngthành cũng đã

được sử dụng để tái sinh mô sẹo ở đậu tương [81] Nuôi cấy lá đậu tương cũng đã được dùng để phát triển các giống đậu tương chịu mặn thông qua nuôi cấy mô sẹo trung gian Wada và cs đã tạo ra các giống đậu tương chịu mặn trên môi trường được bổ sung tới 0,1% NaCl, họ cũng chỉ ra rằng stress do muối có thể đượcgiảm bớt bằng cách bổ sung CaCl2trong môi trường nuôi cấy [79] Nghiên cứu thửnghiệm này có thể hữu ích trong việc tạo ra các giống đậu tương chịu mặn và có thể được thử nghiệm thêm trên đồng ruộng về năng suất trong điều kiện tự nhiên Lá được coi là mẫu cấy thích hợp vì có thể cung cấp các tế bào đồng nhất để phân hóa và nhân giống Wright và cs đã thiết lập quy trình tạo cây đậu tương hoàn chỉnh có thể được phát triển từ các đoạn lá nhỏ của cây mẹ, trong đó sử dụng tuần tự môi trườngMSvàmôitrườngB5cóbổsungcácchấtđiềuhòasinhtrưởngthựcvậtkhác nhau[130].

1.2.1.4 Phátsinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việchìnhthành môsẹo)

Phát sinh cơ quan trực tiếp là sự phát sinh cơ quan chồi/rễ từ mẫu cấy không qua mô sẹo Các đốt thân được sử dụng phổ biến nhất để tạo mẫu cấy chồi không có

môsẹovàpháttriểnthànhcáccâyconlàdòngvôtínhcủacâymẹ[81].Trongphương pháp này, các chồi nách được kích thích hình thành từ các đoạn có đốt thân và được nhân lên thành các bản sao giống hệt nhau về mặt di truyền của cây mẹ Tác giả Hitoshivàcsđãnhângiốnghàngloạtcâyđậutươngbằngcáchsửdụngcácđoạnđốt thân Họ đã sử dụng dung dịch natri hypochlorite để khử trùng bề mặt mẫu và môi trườngMS,BAPvàIBAđểkíchthíchsựhìnhthànhnhiềuchồi.Tuynhiên,cácmẫu cấy cần được thu thập từ các cây mẹ khỏe mạnh và cấy mẫu ngay sau khi xử lý vào môi trường nuôi cấy, việc phát sinh cơ quan trực tiếp không qua mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào kiểu gen (tùy từng giống) mà môi trường nuôi cấy[126].

Việc hình thành các bộ phận cơ quan trực tiếp không qua mô sẹo, quan trọng nhất là quá trình phát hình thành và phát triển chồi Chồi hình thành từ một khối mô khác nhau được tách ra để tạo rễ và hình thành cây mới Để biến nạp, gen ngoại lai cần được chuyển vào mô phân sinh chồi hoặc các khối mô có khả năng tái sinhchồi Phát sinh hình thái chồi ở đậu tương, lần đầu tiên được Wright và cs báo cáo năm 1986, sử dụng nốt lá mầm của cây mầm làm mẫu cấy; Barwale và cs (1986) sử dụng nốt lá mầm của hạt non Khi nuôi cấy trên môi trường có chứa BAP chồi được hình thànhtừlớpmôbiểubìdưới(subepidermaltissue).Ưuđiểmchínhcủaphươngpháp

nàylàchồiđượcnhânlênvàcóthểhìnhthànhrễdưới3tháng.Trongkhiđó,phương pháp phôi vô tính phải mất 4 tháng hoặc hơn nữa.Trụdưới (hypocotyl)vàtrụtrên (epicotyl)lámầm của cây đậutương cũng đượcsửdụngđểtáisinh trực tiếp thànhcâyhoàn chỉnh[47], [125],tạophôivôtính[81] vàtạo câychuyểngen[61],[100].

1.2.1.5 Ảnhhưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đếnkhảnăng tái sinh đậutương

Môitrườngnuôicấycóảnhhưởngquantrọngđếnkhảnăngtáisinhđậutương Tuy nhiên, mức phản ứng với điều kiện môi trường còn tùy thuộc kiểu gen vànguồn vậtliệu.Dođó,cầnnghiêncứuđiềukiệnmôitrườngnuôicấychođậutươngphùhợp với từng giống và từng giaiđoạn.

Bảng 1.5 Một số môi trường tái sinh cây đậu tươngin vitro

1 Nuôi cấy hạt/phôi

Môi trường MS Shan và cs (2005); Vural (2010); Phat và cs

MS bố sung BAP, NAA, IBA Bonacin và cs (2000) MS bổ sung 2,4-D, BAP và IBA Branch và cs (2002)

MS bổ sung 2,4 D, NAA, BAP

MS bổ sung BAP, NAA và IBA Islam và cs (2017) nghiên cứu ảnh hưởng của BA và 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở chồi ngọnv à nốtlámầmđậutương Thínghiệmchothấy môitrườngMSbổsung2,5 mg/lBAP+0,5mg/l 2,4D cho tỷ lệ phát sinh callus cao nhất (76,60%) Kết quả cũng chothấytỷlệphátsinhcalluscủachồingọncaohơncóýnghĩasovớinốtlámầm[56], [61].

Begumvàcsđãnghiêncứuảnhhưởngcủa2,4D,NAA,BAđếnkhảnăngtạomôsẹo Môi trường thích hợp nhất là MS + 3,32mg/l 2,4D và MS + 1,5mg/l BAP (tỷ lệ 100%) Môi trường phát sinh chồi sử dụng BA và NAA cho kết quả tốt nhất MS + 2,5mg/l BAP + 1,0mg/l NAA (tỷ lệ 79,4%, chồi cao 5,32cm) [29] Theo Hu CY và cs, môi trường MS + 1mg/l BA thích hợp

chỉrarằngchồichỉphátsinhtrongmôitrườngcónồngđộBAtừ5-10µM/l(khoảng 1 - 2mg/l), ở nồng độ cao hơn 10µM/l 35 chồi không hình thành [59] Điều này phù hợpvớinhữngnghiêncứucủaSairamvàcs[127].Saukhicallusphátsinhchồi,chồi

đượcchuyểnsangmôitrườngkéodàichồi(SEM),môitrườngphùhợplàmôitrườngMS bổ sung 0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3, 1mg/l ZR trong 14 ngày[85].

1.2.2 Kếtquả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thếgiới

1.2.2.1 Chuyểngen thông qua vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens

ĐâylàphươngphápsửdụngvikhuẩnAgrobacteriumnhưmộtvectorsinhhọcđể biến nạp

một phần DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả là tạo đượccâybiến đổi

gen.Agrobacteriumxâm nhiễm vào cây trồng thông qua vết thương Khi bị tổn

thương, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chất phenol, hợp chất này sẽ dẫn dụ vi

khuẩnAgrobecteriumbiểuhiệngenvùngvir.KếtquảbiểuhiệncủagenVir,sợiđơnT-DNAsẽ được

chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật Vấn đề chính của phương pháp chuyểngennàylàsựkếthợpgiữtếbàochủvớivectortươngứng[57].

Mặcdùbanđầuđậutươngkhôngphảilàđốitượngđượcxemxétđểlâynhiễm với vi khuẩn cho tới khi Pederson và cs chứng minh đậu tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này [38], [115] Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn bị kiểm soát bởi yếu tố về giống [41], [96], [110], [113] Mặt khác, khả năng thu được các chồi chuyển gen từ những khối mô có khả năng tái sinh như phôi vô tính và nốt lá mầm ban đầu rất thấp Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trò

xúc tác như acetosyringone để kích thích sự biểu hiện của genVir, L-cystein, hoặc sử dụng

các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [109], xác định các yếu tố ảnh

chuyểngenthôngquanốtlámầm,nghiêncứucảitiếnnốtlámầmlàmvậtliệubiến

nạp, kết hợp lây nhiễm với tái sinh [110] Vấn đề khác khi sử dụng vi

khuẩnAgrobacteriumcòn phụ thuộc vào chủng khuẩn, số lượng bản DNA copy được

tổng hợp trong hệ gen thực vật, pH môi trường, mức độ gây tổn thương của mẫu Trái ngượcvớicácphươngphápchuyểnDNAtrựctiếpcóthểchokếtquảvớisốbảncopy nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khuôn mẫu không được kiểm

cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợiDNAchèn vào Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báo cáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương khi được lây nhiễm với vi

câychuyểngentừgiốngPioneer9341.Cácyếutốquantrọnggiúphọthànhcôngđó là: (1) sử dụng chất acetosyringone; (2) giới hạn nhiệt độ giai đoạn đồng nuôi cấy được kiểm soát trong khoảng 18 - 280C; (3) mật độ tế bào vi khuẩn lây nhiễm từ 108đến3x109/ml;(4)sửdụngaxitpyroglutamicđểbổsungvàotrongmôitrườngtáisinh [130].

Vi khuẩnAgrobacteriumvà nốt lá mầm cũng được sử dụng để chuyển gen

tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pod Mottle (một loại vius lây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tương Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu Phân tích Southern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây

R1 Khoảng 30% cây R2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu được xét nghiệm ELISA (Enzym-linked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng kháng hoàntoànvớivirusnày.TínhtrạnghìnhtháikhôngbịbiếnđổisovớithếhệR1[91], [130].

Parrott và cs đã đưa ra phương pháp chuyển gen khác đó là sử dụng vi

khuẩnAgrobacteriumlây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo phôi vô tính sauđó tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ba cây chuyển gen có chứa genzeinkích thước

15kD đượchìnhthành.Tuynhiên,nhữngcâychuyểngennàyđềubịkhảmvàkhiphântích các

cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa genzein15kD[113].

Gầnđây,mộtphươngphápmớivàcókhảnăngchohiệuquảhơnđãđượcphát triển để biến

nạp vi khuẩnAgrobacteriummang gen vào thẳng tế bào mô đích KỹthuậtmớinàygọilàSAAT(SonicateAssistedAgrobacterium-mediatransformation)

[131].SửdụngSAATvớinuôicấyhuyềnphùphátsinhphôivôtínhđãchohiệuquả chuyển gen ổn định và không có hiện tương thể khảm Phương pháp này có ưu điểm

nhỏgiốngnhau,xuyênquamô,chophépAgrobacteriumdễdàngđivàomôđíchmong muốn không giống

như phương pháp chuyển nạp gen khác Sử dụng kỹ thuật SAAT đểchuyểngenvàođỉnhsinhtrưởngđãlàmgiatănghiệuquảchuyểnnạpgentạmthời trong nhiều cơ quan như: lá, nốt lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể

hiệnGUStăng gấp 100 - 400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa

chuyểnnạptươngđốiổnđịnhquacácthếhệ.Meurervàcsápdụngphươngphápnêu trên ở 28 giống đậu tương, nhóm tác giả cho rằng, để thực hiện thành công phương pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mô mong muốn Với phương phương pháp SAAT, chọn

chuyển lên môi trường chứa 400 mg timentin/l Hai tuần sau khi SAAT, chuyển mô sang môi trường có 20 mg hygromycin/l và 400 mg timentin/l Những dòng chuyển genđượcquansátvàphânlậpkhoảng6-8tuầnsaukhiSAAT.Kỹthuậtnàychohiệu

quảchuyểngencaohơnsovớicácphươngphápchuyểngenkhác.Mởramộthướng mới sử

dụng vi khuẩnAgrobacteriumđể biến nạp gen cho các mô đích khác nhau [97],[131].1.2.2.2 Nghiêncứu chuyển gen bằng súng bắngen

Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc của các hạt bọc DNA về phía tế bào thực vật.NhờcógiatốclớnmàcáchạtDNAcóthểđâmxuyênquathànhtếbàovàmàng tế bào Bên trong tế bào, DNA được phân tách từ các hạt nhỏ và tổng hợp ở trong hệ genthựcvật.Ưuđiểmcủasúngbắngenlàcóthểloạibỏcáctácnhânsinhhọckhông thích hợp, đặc biệt là với những loại mẫu không thích hợp với chuyển gen bằng vi

khuẩnAgrobacterium.Phươngphápnàychophépchuyểntrựctiếpgenquantâmvào mô phân

sinh đỉnh của thực vật Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu phải có dụng cụ,máymócchuyêndụngcóthểphânchiachínhxáccáchạtDNAsâutrongmôphân sinh đích [97] Báo cáo đầu tiên về chuyển gen bằng súng bắn gen vào đậu tương sử dụngchồiphânsinhđỉnhlàmmôđíchđượcMcCabevàcstiếnhànhnăm1988.Chồi đỉnh sau khi biến nạp được cảm ứng tạo đa chồi trước khi tái sinh thành cây hoàn chỉnh Phân tích khối mô chuyển gen nhận thấy có các hạt nhỏ mang DNA và có sự tái tổ hợp DNA trong tế bào chủ [87], [97] Khả năng tổng hợp DNA trong tế bào được xem như biểu hiện của quá trình chuyển gen có hiệu quả[62].

1.2.2.3 Nghiêncứu chuyển gen bằng xungđiện

Sử dụng xung điện cho hiệu quả biến nạp khá cao đối với tế bào động vật.

Tế bào trần đậu tương được xung điện đảm bảo mật độ 2 - 4 x 106tế bào/ml môitrườngKaobổsung40mMNaCl.Mộtmldungdịchhuyềnphùtếbàotrầnđược hút cho vào cuvet 1,5ml và làm lạnh trong thời gian ngắn trên đá Dòng điện xung phát ra từ các sợi bạch kim có khoảng cách 1cm Dòng điện này được cung cấp bởi một tụ điện 490µF (Sprague Power-lytic 36D, Marsh Electronics, Milwaukee, WI) và là nguồn cung cấp điện áp ổn định Điện thế được điều chỉnh bằng một vôn kế [54].

Chowriravàcssửdụngphươngphápxungđiệnđểbiếnnạpgenvàođiểmsinh trưởng của cây mầm đậu tương Cây mầm 7 - 10 ngày được loại bỏ lá mầm,DNAđược tiêm vào đỉnh chồi bằng hệ thống ống tiêm có chứa dung dịch lipofectin.DNAđược chuyển vào bằng một dòng điện xung, cây sinh trưởng mà không cần tác nhân chọn lọc Quá trình này đã được thực hiện trên nhiều mô phân sinh và thu được một vài thể khảm Đây là phương pháp tốt nhưng việc ứng dụng còn nhiều hạn chế[35].

1.2.2.4 Nghiêncứu chuyển gen qua ốngphấn

Hầu hết các phương pháp chuyển gen hiện tại đều dựa trên cơ sở nuôi cấymô tế bào, nó đòi hỏi các tế bào chuyển gen phải được tái sinh thành cây [26] Pháttriển mộthệthốngchuyểngenđộclậpvớinuôicấymôtếbàođãgiànhđượcnhiềusựquan tâm của các nhà khoa học Cách tiếp cận này cho phép vượt qua rào cản về kiểu gen củacâybiếnnạpvốnảnhhưởngrấtnhiềuđếnhiệuquảchuyểngen.Mặtkhácchiphí tài chính và thời gian chọn tạo sẽ được rút ngắn Phương pháp chuyển gen qua ống phấn lần đầu tiên được báo cáo thành công trên cây bông [35] Kỹ thuật này sau đó được sử dụng để chuyển gen ở một số cây trồng như: ngô [33], bông [102], lúa [39], [87],đậutương[138],dưahấu[32].Mộtsốbáocáođãchỉrarằngcóthểchuyểngen

racâyđậutươngvàcâybôngchuyểngen,nhómtácgiảđãthuđược50hạtđậutương, 226 hạt bông Nhưng tất cả đều cho kết quả âm tính khi xử lý thuốc diệt cỏ[99].

ZengluLivàcsđãthuđượcxấpxỉ5.000hạtđậutươngsaukhixửlýhoavới DNA mang

genbar Khi kiểm tra tất cả các hạt thu được từ cây xử lý với DNA có chứagenbarđều không cho kết quả dương tính với gen này Quan sát hình tháicủa

Thínghiệmkhácvớigengus,nhómtácgiảthuđượcgần2%sốhạtcủacáccâyđược xử lý vớiDNA có chứa gengusphản ứng dương tính với gen này khi kiểm tra Tuy nhiên, khi

cho hạt nảy mầm và tiến hành lấy lá phân tích thì không thấy có sự hoạt động của

gengus 3% hạt thu từ các cây thế hệ sau được kiểm tra đều không thấy có biểu hiệncủagus[137] Huixia Shou và cs tiến hành chuyển gen vào 8 giống đậu tương, trong

đó có giống mô hình Williams 82 bằng kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn, tuy nhiên kết quả đã không thành công như mong muốn [59] Nhiều báo cáo trước đây khi sử dụng phương pháp chuyển gen này cũng đều chỉ ra một số hạn chế của

Bằng công nghệ sinh học người ta đã có thể tạo ra những giống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ, cho phép loại trừ được cỏ dại một cách chọn lọc Nhìn chung, sản xuất cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được tiến hành bằng việc chuyển gen mã hóa enzyme gây bất hoạt thuốc diệt cỏ vào cây trồng.

Theo tác giả Lawton có khoảng 1.000 giống đậu tương kháng thuốc diệt cỏ glyphosate đang được bán bởi hơn 200 công ty trên thế giới Monsanto, công ty giữ bản quyền về giống đậu tương chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấy năm 1996 có khoảng 0,4 triệu hecta trồng đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997 tăng lên 3,6 triệu hecta và năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta [75].

Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS), gen mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase (PAT) đã được chuyển vào cây đậu tương và tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glyphosate/glufosinate.

Cácgiốngđậutươngchuyểngenkhángthuốcdiệtcỏglufosinate,Roundupvà imidazoline đã được thương mại hóa Năm 2004, hàng loạt các giống đậu tương chuyểngenkhángcácloạithuốcdiệtcỏkhácnhauđượctrồngchủyếuởMỹvàchúng

đãđượcnhậpkhẩuvàocộngđồngchungChâuÂu,mặcdùvẫntồntạikhánhiềutranh cãi Trong giai đoạn 1995 - 2006, đối với cây chuyển gen, đặc tính kháng thuốc diệt cỏ liên tục là tính trạng nổi bật (chiếm 71%), tiếp sau là đặc tính kháng sâu bệnh (chiếm 18%) và các cây mang cả hai đặc tính này (chiếm 11%)[10].

1.2.3.2 Đặctính kháng côntrùng

Việc sử dụng giống kháng bị hạn chế vì không có giống kháng cao để hoàn toànphòngtrừsâuhạiđậutương.ỞMỹmộtvàikỹthuậtcanhtácđượcápdụngnhư gieo trồng sớm hay trồng các giống ngắn ngày để né tránh các đỉnh bộc phát của sâu Velvetbean; trồng gần bên các ruộng cây trồng khác được sâu đo ưa thích hơn đậu tươngcũnghạnchếmứcgâyhạicủasâuđođếnruộngđậutươngởmộtsốvùngtrồng đậu tương [10], [45] Thuốc trừ sâu thường được dùng khi mật độ sâu lên đến mức ngưỡng gây hại Tổng chi phí ước tính cho thuốc trừ sâu sử dụng để phòng trừ 4loại côn trùng như sâu ăn lá

vảy(Lepidoptera)bằng các phương pháp lai chọn giữa hai hay nhiều giống đậu

tương với nhau gặp nhiều khó khăn và không thành công Nguyên nhân là do nguồngenkhángvớisâubộcánhvảyrấthiếmởđậutươngvàconlaitạođượctừcác

nguồnbốmẹmangtínhkhángsâuhại nhưPI171451,PI229358cóthờigiansinh