Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀPTNTVIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƯỚNG NÂNG

CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬUTƯƠNG (GLYCINE

MAX(L.)Merr.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội - 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀPTNTVIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƯỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY

ĐẬUTƯƠNG(GLYCINE MAX(L.)Merr.)

Chuyênngành : Công nghệ sinhhọc

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Khuất HữuTrung

2 GS.TS Ngô XuânBình

Hà Nội - 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôixincamđoan,đâylàcôngtrìnhnghiêncứucủacánhântôi,cácsốliệuvà kết quảtrong luận án là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào hoặcchưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứunào

Tôixincamđoanrằng,mọisựgiúpđỡ,hợptácchoviệcthựchiệnluậnánnày đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ dẫn rõ nguồngốc

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tìnhcủa các Thầy, Cô giáo, các tập thể, cá nhân, gia đình cùng bạn bè đồng nghiệp

TôixinbàytỏlòngbiếtơnsâusắcđếnPGS.TS.KhuấtHữuTrung,GS.TSNgô làthầygiáohướngdẫnkhoahọc,đãtậntìnhgiúpđỡ,truyềntảikiếnthức

XuânBình-vàkinhnghiệmtrongsuốtquátrìnhthựchiệnđềtàivàhoànthànhluậnán

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp ViệtNam;tậpthểcánbộBanThôngtinvàĐàotạo;tậpthểLãnhđạovàcánbộviênchức Trung Tâmchuyển giao công nghệ và khuyến nông đã giúp đỡ, hỗ trợ tận tình cho tôi trong quátrình học tập và thực hiện đềtài

TôixinchânthànhcảmơnKhoaCôngnghệsinhhọcvàCôngnghệthựcphẩm, Trường Đạihọc Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên là nơi tôi triển khai thực hiện đề tài, đã tạo mọi điều kiệnthuận lợi về tài liệu khoa học, cơ sở vật chất, thiết bị phục vụ nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án.Đặc biệt, tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa Công nghệ sinh học và

chiasẻkiếnthứcvàkinhnghiệmchuyênmônđểtôihoànthànhnghiêncứutrongthời gian sớmnhất

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp trong và ngoài cơquan và người thân trong gia đình luôn hết lòng động viên, khích lệ và giúp đỡ tôitrong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành công trình trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

MỤC LỤC

LỜICAM ĐOAN i

LỜICẢM ƠN ii

MỤCLỤC iii

DANH MỤC CHỮVIẾT TẮT ix

DANHMỤC BẢNG xi

DANHMỤC HÌNH xiv

MỞĐẦU 1

1 Tính cấp thiết củađề tài 1

2 Mục tiêunghiên cứu 3

2.1 Mục tiêutổng quát 3

2.2 Mục tiêucụ thể 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn củaluận án 3

3.1 Ý nghĩakhoa học 3

3.2 Ý nghĩathực tiễn 4

4 Đối tượng và phạm vinghiên cứu 4

4.1 Đối tượngnghiên cứu 4

4.2 Phạm vi, thời giannghiên cứu 4

5 Những đóng góp mới củaluận án 4

CHƯƠNG I.TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀT À I 6

1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới vàViệtNam 6

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trênthế giới 6

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ởViệt Nam 8

1.2 Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương trênthếgiới 9

1.2.1 Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở câyđậu tương 9

1.2.1.1 Vật liệu sử dụng trong tái sinh in vitro ở câyđậutương 9

1.2.1.2 Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro câyđậutương 10

1.2.1.3 Phát sinhcơquan thôngquamôsẹotrongtáisinhinvitrocâyđậutương 11

1.2.1.4 Phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việc hình thành môsẹo) 12 1.2.1.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đến khả năng táisinhđậutương 13

1.2.2 Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trênthếgiới 15

1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩnAgrobacteriumtumefaciens 15

1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen bằng súngbắngen 18

1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen bằngxungđiện 18

1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen quaốngphấn 19

1.2.3 Cáctínhtrạngđượccảithiệnthôngquachuyểngenởcâyđậutương 20

1.2.3.1 Đặc tính kháng thuốcdiệtcỏ 20

1.2.3.2 Đặc tính khángcôntrùng 21

1.2.3.3 Chuyển gen nâng cao hàmlượngdầu 25

1.2.3.4 Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiệnngoạicảnh 25

1.2.3.5 Chuyển gen nâng caonăngsuất 25

1.2.3.6 Chuyển gen tạo cây trồng đatínhtrạng 26

1.2.4 Thành tựu về cây trồng chuyển gen trênthếgiới 26

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứutrongnước 30

1.3.1 Chọntạogiốngthôngquatuyểnchọnvậtliệunhậpnộivàđịaphương 30

1.3.2 Chọn tạo giống đậu tương mới bằng laihữutính 31

1.3.3 Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lýđộtbiến 32

1.3.4 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương ởViệtNam 32

1.3.4.1 Nghiêncứutáisinhcâyinvitrophụcvụchuyểngenởcâyđậutương 32

1.3.4.2 Nghiên cứu chuyển gen ởđậutương 33

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu về tính trạng gen có khả năng nâng caonăng suất hạt ở câyđậutương 34

1.4.1 Nghiên cứu gen điều khiển quá trình tăng cường kích thước hạt ở cây

đậutương

34 1.4.2 Nghiên cứu về vai trò của gen kìm hãm già hóabộlá 36

1.5 Một số nhận xét rút ra từ tổng quantàiliệu 39

CHƯƠNGII.V ẬT L I Ệ U , N Ộ I D U N G V À P H Ư Ơ N G P H Á P N G HI Ê N C Ứ U 41

2.1 Vật liệunghiêncứu 41

2.1.1 Vật liệuthựcvật 41

2.1.2 Vậtditruyền 42

2.1.3 Hóa chất, thiết bịsửdụng 43

2.2 Nội dungnghiêncứu 43

2.3 Địa điểm và thời giannghiêncứu 44

2.4 Phương phápnghiêncứu 44

2.4.1 Nộidung1:Nghiêncứukhảnăngtáisinhbằngkỹthuậtnuôicấyinvitrovàkhả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệuphục vụ chochuyểngen 44 2.4.1.1 Nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của các giốngđậutương 44

2.4.1.2 Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giốngđậutương 49

2.4.2 Nộidung2:Táchdòngvàthiếtkếvectorchuyểngenmanggenkìmhãmgiàhóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên câyArabidopsisthaliana 50 2.4.2.1 Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóaláAtore1 50

2.4.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóaláAtore1 52

2.4.2.3 ĐánhgiákhảnăngbiểuhiệncủagenkìmhãmgiàhóaláAtore1trêncâymôhìnhArabid opsisthaliana 53

2.5 Phương pháp xử lýsốliệu 61

62 3.1 Kếtquảnghiêncứukhảnăngtáisinhbằngkỹthuậtnuôicấyinvitrovàkhảnăng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệuphụcvụ chochuyểngen 62

3.1.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

62

3.1.1.1 Nghiên cứu tạo vật liệuvôtrùng 62

3.1.1.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ nốtlámầm 63

3.1.1.3 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ nốtlámầm 68

3.1.1.4 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng GA 3 đến khả năng kéo dài chồi của mộtsố giốngđậutương 75

3.1.1.5 Tái sinh rễ tạo câyhoàn chỉnh 76

3.1.2 Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giốngđậutương 78

3.2 Kếtquảtáchdòngvàthiếtkếvectorchuyểngenmanggenkìmhãmgiàhóalá Ore1

và đánh giá biểu hiện trên câyArabidopsisthaliana 85

3.2.1 Tách dòng gen kìm hãm giàhóaAtore1 85

3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóaláAtore1 89

3.2.2.1 Gắn gen Atore1 vào vectorchuyểngen 89

3.2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn E.coli và Agrobacterium tumefaciens mang genAtore1 91

3.2.3 Đánh giá khả năng biểu hiện của gen kìm hãm già hóa lá Atore1 trên câymô hìnhArabidopsisthaliana 91 3.2.3.1. Chuyển gen Atore1 vào cây mô hìnhArabidopsisthaliana 91

3.2.3.2 Chọn lọc cây Arabidopsis thaliana chuyển gen T 1 manggenAtore1 92

3.2.3.3 Đánh giá cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệT1 93 3.2.3.4 Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái của cây Arabidopsis thalianachuyển gen Atore1 thếhệT1 94

3.2.3.5 ĐánhgiácâyArabidopsisthalianachuyểngenAtore1bằngPCRởthếhệT2 .95

3.2.3.6 Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái lá ở cây Arabidopsis thalianachuyển gen Atore1 thếhệT2 96

3.3 Kết quảchuyểngenkìm hãm già hóa lá Atore1 vào cây đậu tương và đánhgiá các dòngchuyểngen 100

3.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi khuẩnAgrobacteriumtumefaciens 100 3.3.1.1 Nuôi cấy hạt đậu tương nảy mầm chuẩn bị để biếnnạpgen 100

3.3.1.2 Tạo dung dịch vi khuẩn biến nạpgenAtore1 101

3.3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến khả năngbiếnnạp 102

3.3.1.4 Ảnhhưởngcủathờigianđồngnuôicấyđếnkhảnăngbiếnnạpgen 104

3.3.1.5 ẢnhhưởngcủanồngđộAcetosyringon(AS)đếnkhảnăngbiếnnạpgen 105

3.3.1.8 Tạo cây đậu tương chuyển gen Atore1hoànchỉnh 110

3.3.1.9 Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen trồng trong vườnthínghiệm 110

3.3.2 ChọnlọcvàđánhgiábiểuhiệngenAtore1trêncâyđậutươngchuyểngen 111

3.3.2.1 Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển genthếhệT0 111

3.3.2.2 Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển genthế hệ thếhệT1 114

3.3.3.1 Chọn lọc dòng đậu tươngđồng hợp tử mangg e n Atore1 123

3.3.3.2 Đánh giá biểu hiện gen của dòng đậu tương mang gen Atore1 đồng hợp tửthông quahìnhthái 126

3.3.3.3 Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển ở các dòng đậu tương

chuyểngen Atore1 đồng hợp tử bằngSouthernblot 128

3.3.4 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương

130

3.3.5 SựthayđổithànhphầnchấtđiềuhòasinhtrưởngliênquanđếncâychuyểngenAtore1 131

KẾT LUẬN VÀĐỀNGHỊ 138

1 Kếtluận 138

2 Đềnghị 139

DANHMỤCCÁCCÔNGTRÌNHCÔNGBỐLIÊNQUANĐẾNLUẬNÁN 140

TÀI LIỆUTHAMKHẢO 141

TIẾNGVIỆT 141

PHỤLỤC 163

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AtBBX32 The Arabidopsis thaliana BBX32

Atore1 Arabidopsis thalianaOre1

CBF C-repeat/dehydration responsive element bingding factor

CCM Co-Culture Medium (Môi trường đồng nuôicấy)

DNA Deoxyribonucleic acid (Axít Deoxyribonucleic)

FAOSTAT Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông

nghiệp Liên Hợp Quốc)GMO Genetically Modified Organism(Sinh vật biến đổi gen)

ISAAA International Service for the Acquisition of Agri-biotech

Applications(TổchứcDịchvụquốctếvềứngdụngcôngnghệsinh họcnôngnghiệp)

LSD Least Significant Difference Test (Giá trị sai khác nhỏ nhất có ý

nghĩa)

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

DANH MỤC BẢNG

1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những nămgầnđây 6

1.2 Tìnhhìnhsảnxuấtđậutươngcủamộtsốnướcđứngđầutrênthếgiớitrongnhữngnăm gần đây (sản lượng trên 1triệutấn) 7

1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2012-2021 8

1.4 Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2020-2022 9

1.5 Một số môi trường tái sinh cây đậu tươnginvitro 14

1.6 Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu năm 2019 (theoquốcgia) 27

1.7 Các giống Đậu tương tuyển chọn từ nguồnnhậpnội 31

2.1 Danh sách các giống đậu tương sử dụng trongnghiêncứu 41

2.2 Trình tự mồi sử dụng tách dònggenAtore1 43

2.3 Công thức ảnh hưởng của BAP đến khả năngtạochồi 45

2.4 Công thức ảnh hưởng của Kinetin đến khả năngtạochồi 45

2.5 Công thức ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéodàichồi 46

2.6 Công thức ảnh hưởng của IBA đến khả năngrarễ 46

2.7 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu tách dònggenAtore1 51

2.8 Danh sách mồi sử dụng để nhângenAtore1 54

2.9 Thành phần phản ứng PCR nhân dònggenAtore1 54

2.10 ThànhphầncácmôitrườngdùngchochuyểngenởcâyđậutươngthôngquavikhuẩnAgr obacteriumtumefaciens 57

2.11 Danh sách mồi sử dụng để nhângenAtore1 59

3.1. Ảnh hưởng của NaClO đến khả năng vô trùng mẫunuôicấy 62

3.2. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ nốt lá mầm của các giống đậu tươngsau 14 ngàynuôicấy 63

3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến tái sinh chồi từ nốt lá mầm sau 14 ngày nuôicấy.69 3.4. ẢnhhưởngcủahàmlượngGA3đếnkhảnăngkéodàichồicủamộtsốgiốngđậutương (sau 30 ngàynuôicấy) 75

3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của một số giống đậu

tương(sau 30 ngàynuôicấy) 77

3.6. Biểu hiện nhuộm GUS của mẫu lây nhiễmAgrobacteriumtumefaciens 81

3.7. KếtquảchuyểngenAtore1vàocâyArabidopsisthalianathôngquavikhuẩn Agrobacteriumtumefaciens 92

3.8. Kết quả chọn lọc câyArabidopsis thalianachuyểngenAtore1 92

3.9. ĐặcđiểmhìnhtháivàsinhtrưởngởcâyArabidopsisthalianachuyểngenAtore1 thếhệT1 94

3.10. HìnhtháilácủacâyArabidopsisthalianachuyểngenAtore1thếhệT2 96

3.11. Kết quả nuôi cấy tạo vật liệu biếnnạpgen 100

3.12. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biếnnạpgen 104

3.13. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biếnnạpgen 105

3.14. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biếnnạpgen 106

3.15. ẢnhhưởngcủaPPTđếnkhảnăngchọnlọcchồichuyểngenởcâyđậutương

107

3.16. Kết quả chọn lọc và tái sinh cây đậu tương chuyểngenAtore1 109

3.17. Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen T0ratrồng 110

3.18. Kết quả sàng lọc cây đậu tương chuyển gen T0ngoàiđồngruộng 112

3.19. Kết quả đánh giá sơ bộ cây đậu tương chuyển gen thếhệT0 113

3.20. Đánh giá hiện diện gen ở cây đậu tương chuyển gen T0bằngPCR 113

3.21. Kết quả phân tích hiện diện của gen bằng PCRởT1 116

3.22. Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây đậu tương chuyển genAtore1thếhệT1

117 3.23. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển genAtore1thếhệT1 118

3.24. Kết quả chọn lọc các cây đậu tương chuyển genAtore1thế hệ T2bằng thuốcdiệtcỏBasta 120

3.25. Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây chuyển genAtore1thế hệ T2120 3.26. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển genAtore1thếhệT2 121

3.27. KếtquảsànglọcdòngđậutươngchuyểngenAtore1đồnghợptửởthếhệT2

124

3.28. KếtquảsànglọcdòngđậutươngchuyểngenAtore1đồnghợptửởthếhệT3

125

3.29. Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng đậu tương chuyển

genAtore1đồnghợptửT3 127

3.30. Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển genAtore1đồng hợp tửT3

1273

31 Kết quả tách chiết DNA tổng số 128

3.32 Đặc điểm sinh trưởng của dòng đậu tương chuyển genAtore1đồng hợp tử130

3.33 MộtsốyếutốcấuthànhnăngsuấtcủadòngđậutươngchuyểngenAtore1đồnghợptử 131 3.34 Hiện trạng hoóc-môn ở các dòng đậu tương chuyển gen độtbiếnAtore1 133

DANH MỤC HÌNH

1.1 Một số vật liệu nuôi cấy trong nuôi cấy môđậutương 10

1.2 Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu năm2019[10] 29

1.3 Dòng đậu tương chuyển gen GmBS1 tăng kích thướchạt[116] 35

1.4 Kiểu hình của cây chuyển gen kìm hãm già hóa láore1và cây đối chứng (wildtype) sau 50 ngày nảymầm[122] 39

2.1 Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương từ nốtlámầm 48

2.2 Vùng T-DNA của vector pCAMBIA3301 mang genBarvàGUS, điều khiểnbởipromoter35S 49

2.3 Sơ đồ tổng quát mô tả quá trình chuyển gen trên câyArabidopsisthaliana 55

3.1 Một số hình ảnh thực hiện các bước tiến hànhthínghiệm 74

3.2 Nuôi cấy tạo đa chồi ở một số giống đậu tươngnghiêncứu 74

3.3 Ảnh hưởng của IBA (1,0mg/l) đến khả năng ra rễ ở giống ĐT26 sau 3 tuần nuôicấy 78

3.4 Biểu hiện genGUSvà tái sinh câychuyểngen 79

3.5 Hình vẽ mô phỏng cấu trúc vector pBS nhân dònggenAtore1 87

3.6 KếtquảkiểmtrakhuẩnlạcmanggenAtore1bằngPCRvàenzymecắtgiớihạn.87 3.7 KếtquảgiảitrìnhtựgentáchdòngAtore1vàsosánhvớitrìnhtừgenAt5g39610 bằng phần mềm BioEdit Vị trí mũi tên trên hình chỉ đoạn chèn thêm của gen Atore1trên vùng mã hóa củagenAt5g39610 88

3.8 Hình vẽ cấu trúc vector chuyểngenAtore1 90

3.9 KếtquảkiểmtrakhuẩnlạcmanggenAtore1bằngPCRvàenzymecắtgiớihạn.90 3.10.KếtquảđiệndisảnphẩmPCRkiểmtrasựcómặtcủagenAtore1ởcâyArabidopsis chuyển gen thếhệT1 93

3.11 Hình thái lá của câyArabidopsischuyển genAtore1thếhệT1 95

3.12.KếtquảđiệndisảnphẩmPCRkiểmtrasựcómặtcủagenAtore1ởcâyArabidopsis chuyển gen thếhệT2 96

3.13 Biểuđồ sosánh hàmlượngdiệp lục(chlorophyll)giữa

câyArabidopsischuyểngenAtore1và câyArabidopsisđối chứng Col-wt ở giai

đoạn thu hoạch9 8

3.14 Hạt đậu tương nảy mầm và mẫubiếnnạp 1013.15 VikhuẩnmanggenđượcnuôitrảitrênmôitrườngLB(A)sauđóđượcchuyểnsang môitrường LB lỏng để thu tế bào Tế bào vi khuẩn được hòa tan bằng môitrường CCMlỏng (B) để sử dụng cho biếnnạpgen 1023.16 Chọn lọc chồi chuyển gen sau 14 ngày trên môi trường SIM PPT 10mg/l1083.17 Một số hình ảnh mẫu biến nạp gen sau 5 ngày trên môi trường đồng nuôi cấyCCM 1083.18 Một số hình ảnh cây đậu tương chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM chứakháng sinh10mg/lPPT 1093.19 Hình ảnh cây đậu tương chuyển gen trên môi trường rarễRM 110

3.20 Cây đậu tương chuyển genAtore1thế hệ T0giai đoạn cảm ứng trong phòngnuôi111

3.21 Hình ảnh sàng lọc cây đậu tương chuyển gen sau 3 ngày bằng thuốc diệt cỏBasta 1123.22 Kết quả phân tích PCR cây đậu tương chuyển gen Atore1 thếhệT0 1143.23 Kết quả chọn lọc đậu tương chuyển gen T1bằng thuốc diệtcỏBasta 1143.24 Kết quả phân tích biểu hiện của gen chọn lọc Bar bằng PCR của các cây đậutương chuyểngenT1 1153.25 .KếtquảphântíchbiểuhiệngenAtore1củacáccâyđậutươngchuyểngenT1.116

3.26 Kết quả lai Southern của các dòng đậu tương mang genAtore1thếhệT1 1193.27 Biểu hiện kết quả chọn lọc cây đậu tương chuyển gen T2bằng thuốc diệt cỏBasta 119

3.28 Kết quả phân tích PCR các cây đậu tương chuyển genAtore1thếhệT2 122

bằng thuốc diệtcỏBasta 126

3.32 Hình thái cây đậu tương mang genAtore1đồng hợp tử giai đoạn thu hoạch

sovới cây đậu tương không chuyểngen(Đ/c) 1273.33 Kết quả phân tích biểu hiện của gen chọn lọc Bar bằng PCR của các cây đậutương chuyểngenT3 128

3.34 Hình thái cây đậu tương mang genAtore1đồng hợp tử giai đoạn thu hoạch

sovới cây đậu tương không chuyểngen(Đ/c) 129

3.35 KếtquảlaiSoutherncủacácdòngđậutươngmanggenAtore1đồnghợptử 129

3.36 .KiểuhìnhtuổithọcủaláởcácdòngđậutươngAtore1ởgiaiđoạnthuhoạchR8135 3.37 Năng suất hạt của dòng đậu tương biểu hiệnAtore1độtbiến 136

MỞ ĐẦU

1 Tínhcấp thiết của đềtài

Đậu tương [Glycine max(L.) Merrill] được xếp vào cây trồng nông nghiệp

quan trọng nhất Hạt đậu tương được xếp trong 8 loại hạt có dầu có giá trị kinh tế vànhucầusửdụngcao,đượcsảnxuấtvàgiaodịchphổbiếntrênthjtrườngquốctế[10], [46] Ở ViệtNam, đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng quan trọng thứ ba sau lúa và ngô Đồng thờiViệt Nam có nguồn gen đậu tương rất phong phú, riêng tại vùng miền núi phía Bắc, nơi sảnxuất đậu tương lớn của cả nước (chiếm khoảng hơn 65% diện tích), hiện có nhiều nguồn gen

CúcHàBắc,CọcChùmCaoBằng,VàngMườngKhương,đậutươngHữuLũng,đậu tương hạtvàng Lạng Sơn… Các giống này có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh,nhưng năng suất thấp [2],[3]

Một thực tế ở Việt Nam hiện nay là: trong khi nhu cầu sử dụng hạt đậu tươngngàycàngcaothìdiệntíchtrồngđậutươngcủaViệtNamngàycanggiảm.Theobáo

củaBộNN&PTNTdiệntíchvàsảnlượngđậutươngcủaViệtNamliêntụcgiảmdần qua cácnăm: năm 2010, diện tích trồng đậu tương là 197.800 ha, đến năm 2021 chỉ còn khoảng37.000 ha, diện tích giảm hơn 75% và sản lượng giảm trên 70% so với năm 2010.Nguyên nhân của việc giảm nhanh về diện tich sản xuất là do cây đậu tương bị sâu bệnhphá hoại nặng, việc áp dụng tiến bộ kỹ thuật chậm hơn so vơi các cây trồng khác, vì vậynăng suất đậu tương rất thấp chỉ đạt khoảng 1,5 tấn/ha (bằng50%năngsuấtcủathếgiới).ThựctrạngđódẫnđếnviệcViệtNamthiếuhụt3,5-5,0

triệutấnđậutương/năm,trởthànhnướcnhậpkhẩuđậutươngrấtlớnvớikimngạch2

- 3tỉUSD/năm,gầntươngvơigiátrịxuấtkhẩulúagạocủaViệtNamhiệnnay.Thực tế trên chothấy, để phát triển sản xuất đậu tương, Việt Nam cần đầu tư đẩy mạnhnghiêncứutạocácgiốngđậutươngcónăngsuấtvàchấtlượngcaophổbiếnchosản xuất [2],[3],[46]

Ứngdụngcôngnghệsinhhọctrongcôngtácchọntạogiốngcâytrồngnóichung

vàcâyđậutươngnóiriênglàhướngmớivàhiệuquảởcácquốcgianôngnghiệptrênthếgiới.Trongđó,chọntạogiống bằng công nghệ chuyểngenđểtạorasảnphẩm

câytrồng chuyểngenđượcứngdụngphổbiếnvàrộngrãi,tạoracácgiốngcâytrồngcónăng suất cao, chống chịutốt vớiđiều kiện biếnđổi khíhậugiúp manglại lợi íchnhiềumặtvềkinhtế, môitrường,xãhộivàxóa đóigiảmnghèo.Tính đến năm 2019, diện tích cây trồng chuyển gen đã lên đến 190,4 triệu ha

ở 29 quốc gia, sản lượng tăng 94 lần (so với năm 1996 là năm đầu tiên cây trồngchuyển gen được thương mại hóa) trở thành ngành công nghệ phát triển nhanh nhấttrong lịchsử thế giới hiện đại Cây đậu tương là cây trồng chuyển gen được trồng ở nhiều quốc gia, đến năm 2021 diện tích đậutương chuyển gen lên đến gần 100 triệu ha, chiếm 50% tổng diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới, chiếm 78% diện tíchcanhtác đậu tương toàn cầu Các tính trạng phổ biến ở cây đậu tương chuyển gen là: kháng sâu, kháng, bệnh,kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao hàm lượng dầu[10]

Xu hướng hiện nay chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng và cây trồng nóichung đó là tiếp tục cải biến di truyền với các tính trạng chống chịu và nhất là cáctính trạng nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng Một trong những hướng chọntạogiốngchonăngsuấtcaonhữngnămgầnđâyđượcnhiềunhàchọngiốngquantâm đó là kéo dàithời gian sinh trưởng của bộ lá bằng cách đưa gen xác định tính trạng “trẻ lâu” (juvenile trait)vào các giống chín sớm thông qua lai tạo hoặc cải biến di truyền bằng chuyển gen/chỉnh sửagen [48],[51]

Năm 1996, tác giả Oh và cs đã sàng lọc hơn 25.000 dòng đột

biếncâyArabidopsisvàpháthiện5dònggenđộtbiếncủagenORE1(lầnlượtđượcđặttênlà:ore1,2

,3,9và11)cóbiểuhiệnkéodàituổithọcủabộlá[105].Cácnghiêncứutiếp

theochothấy:dòngArabidopsisđộtbiếnore1cóhàmlượngdiệplụccaohơn30%so

vớiđốichứng,kếtquảlàbộládòngore1cótuổithọdàihơnsovới,cáccâyđốichứng 30ngày[71],[123].Năm2015,trườngĐạihọcĐôngA(HànQuốc)đãthành công trong việc

là15-chuyển genOre1vào cây lúa, kết quả là làm tăng tuổi thọ của bộ lá nhất là bộ lá

đòng, lá giữ được màu xanh ngay cả khi hạt đã chín, vì thế đã làm tăng năng suấtlúa 15 -25%

Trên cơ sở những kiến thức hiểu biết trước đó, chúng tôi đã xác định hướng

nghiên cứu chuyển genore1vào cây đậu tương và tiến hành thực hiện luận án

“Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương(Glycine max(L.) Merr.)”.Kết quả của đề tài có ý nghĩa quan trọng, góp

phần phát triển kỹ thuật cải biến di truyển tạo ra các giống đậu tương có năng suấtcao phục vụ sản xuất

2 Mụctiêu nghiêncứu

2.1 Mụctiêu tổngquát

Nghiên cứu chuyển gen tạo các dòng đậu tương mang gen kìm hãm già hoá

của bộ lá (genAtore1) theo hướng nâng cao năng suất hạt trên giống đậu tương của

-TạođượccácdòngđậutươngchuyểngenmanggenđíchAtore1vàbướcđầu đánh giá được

biểu hiện của gen ở các dòng đậu tương chuyểngen

3 Ýnghĩa khoa học và thực tiễn của luậnán

- Kết quả nghiên cứu của luận án có giá trị làm tư liệu, tài liệu cho giảng dạy,nghiêncứusâuhơn về chuyểngenở câyđậutương nóiriêngvàở câytrồngnói

chung.Bổsungphươngphápluậnvềchuyểngenvàchọnlọcdòngchuyểngenđồng hợptử.

3.2 Ýnghĩa thựctiễn

Tạo được các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1, T2, tạo được một số

dòng chuyển genAtore1đồng hợp tử thế hệ T3có tuổi thọ của bộ lá kéo dài hơnvàcho năng suất cao hơn giống đối chứng không chuyển gen

4 Đốitượng và phạm vi nghiêncứu

4.1 Đốitượng nghiêncứu

Cây mô hìnhArabidopsis thaliana.

30 giống đậu tương của Việt Nam (bao gồm các giống trồng canh tác và cácgiống địa phương), 02 giống đậu tương mô hình là Kwangan (KW) và William82

4.2 Phạmvi, thời gian nghiêncứu

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính(nhà lưới) tại Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm,trường Đại họcNông lâm, Đại học Thái Nguyên trong thời gian từ năm 2019 - 2022

5 Nhữngđóng góp mới của luậnán

- Luậnánlàcôngtrìnhđầutiênnghiêncứuvềchuyểngennângcaonăngsuất

ởcâyđậutươngthôngquaviệckéodàituổithọcủabộláởViệtNam.Luậnánnghiên

cứucótínhhệthốngvềđặcđiểmtáisinhphụcvụchuyểngen,thiếtkếvector,tạocác dòng đậutương chuyển gen và đánh giá biểu hiện của gen, cung cấp phương pháp luận về chọn dòngchuyển gen đồng hợptử

- Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học để xây dựng cơ sở dữliệu

và phương pháp luận về nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen ở cây đậu tương Trong đó, tối ưu hóa được các điểu kiện tái

sinhin vitrovà lựa chọn được các giống đậu tương thích hợp cho tái sinh là: ĐT22,

VX93, ĐVN11, ĐVN9, ĐVN6, ĐVN5, ĐVN10,ĐT26

- NhândòngthànhcônggenAtore1,thiếtkếthànhcôngcấutrúcvectorchuyển Atore1mang gen kìm hãm già hóa bộ láAtore1, thử nghiệm trên cây mô hìnhArabidosischo thấy vector và gen hoạt động tốt, sẵn sàng cho việc chuyểng e n

genpER8-vàocâyđậutương.Kếtquảthiếtkếvectorlàcơsởlýluậnđểthiếtkếhệthốngvector chuyển gencho đối tượng thực vật nhằm nâng cao việc ứng dụng kỹ thuật di truyền hiện tại vàtươnglai.

- Thành công trong việc tạo được cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1,

T2và T3, sử dụng chất chỉ thị, phân tích PCR, phân tích biểu hiện hình thái, phântíchSouthernđểsànglọccâychuyểngenquacácthếhệ.Nhấtlàđãthànhcôngtrongviệcchọn lọcđược 02 dòng chuyển gen đồng hợp tử thế hệ T3, ổn định về kiểu gen, cótuổi thọcủa bộ lá dài hơn từ 17 - 22 ngày so với đối chứng và có năng suất cao hơn đốichứng không chuyển trên trên 18% Việc thành công trong chọn lọc được dòngđồnghợp tử ở thế hệ thứ 3 (T3) là cơ sở khoa học có tính thuyết phục cao trongviệchướng đến chọn thành giống đậu tương chuyểngen

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Tìnhhình sản xuất đậu tương trên thế giới và ViệtNam

1.1.1 Tìnhhình sản xuất đậu tương trên thếgiới

Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tương được trồng khắp các châulục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ và chiếm tỷ lệ tới 87,4 %, tiếp đến làChâu Á với 8,5 % tổng diện tích đậu tương trên thế giới từ năm 2012 - 2021 [46].Trong những năm gần đây, diện tích trồng, sản lượng và năng suất đậu tương đều cónhững biến động nhất định Cụ thể, giai đoạn 2012 - 2021 diện tích đậu tương tăngđều từ 105,35 triệu ha đến 129,06 triệu ha Sản lượng cũng tăng đều từ 241,18 triệutấn đến 364,06 triệu tấn kéo theo sự tăng năng suất từ 22,89 tạ/ha đến 28,21 tạ/ha.Năm2020và2021,năngsuấtvàdiệntíchđậutươngtiếptụctăngnhẹ,đạtsảnlương cao nhấtnăm 2021 là 364,06 triệu tấn [46] Số liệu được thu thập và trình bày trong Bảng1.1

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây

Sảnxuấtđậutươngtậptrungởcácquốcgiacóưuthếvềsảnxuấtnôngnghiệp, 12 quốc giađứng đầu trên thế giới có sản lượng hàng năm trên 1 triệu tấn.ĐứngđầulàBrazil(trên121triệutấnnăm2021),tiếpđólàMỹ,ArgentinavàTrungQuốc.Trong

số12quốcgiađứngđầuthếthếgiớivềsảnxuấtđậutươngcó4quốcgialàBrazil,Mỹ,TrungQuốcvàNgacósảnlượngổnđịnhvàliêntụctăngtrong5nămtrởlạiđây(Bảng 1.2)[46]

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tương của một số nước đứng đầu trên thế

giới trong những năm gần đây (sản lượng trên 1 triệu tấn)

1.1.2 Tìnhhình sản xuất đậu tương ở ViệtNam

Tại Việt Nam, đậu tương là cây trồng quan trọng thứ ba sau cây lúa và ngô.Song diện tích gieo trồng ngày càng giảm, không đáp ứng được nhu cầu của ngànhcông nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản và công nghệ ép dầu

do giốngbảnđịanăngsuấtthấp,giốngnhậpngoạinăngsuấtcaonhưngkhôngcónhững đặc tínhnổi trội của giống bản địa, giá bán không cao so với các cây công nghiệpkhác.Nhìnchung,diệntíchđậutươngViệtNamkhôngổnđịnh,sảnxuấtnộiđịamới chỉ đủ cungcấp cho khoảng 8 - 10% nhu cầu Tính đến năm 2021, diện tích trồng trên cả nước giảmmạnh chỉ còn 37,3 nghìn ha, giảm hơn 3 lần so với năm 2012 [2], [3]

Bảng 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2012 - 2021

uhướnggiảmdần,đặcbiệttrong05nămgầnđây.Năm2012,diệntíchđạt119,6nghìnha,sảnlượngđạt173,5nghìntấn,đếnnăm2021diệntíchchỉđạt37,3nghìnhavàsảnlượnggiảmcòn60,2nghìntấn.Tuynhiên,từbảngsốliệuthốngkêcũngchothấynăngsuấthàngnămcủacâyđậutươn

gtươngđốiổnđịnhvàcóchiềuhướngtăngnhẹ

từ14,5tạ/ha(năm2012)lên15,7tạ/ha(năm2020)và16,1tạ/ha(năm2021)songso với thế giớiViệt Nam vẫn là nước có năng suất thấp, chỉ bằng 65% năng suất trung bình của thếgiới[2].

Bảng 1.4 Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2020 - 2022

Nguồn: Bộ Công thương

Dựa trênsốliệu Bảng 1.4 chothấy,nhu cầu tiêu thụđậutươngtạiViệtNamtươngđối cao,trongkhiđósản xuấttrongnước mới đáp ứng đượcmột phần nhỏnhucầu nội địa chủ yếuđểchế biến sữa đậu nànhvàmộtsốloại thựcphẩmkhác,cóđến

90%lànhậpkhẩuđểphụcvụsảnxuấtdầuănvàchếbiếnthứcănchănnuôi.Năm2014,cảnướcnhập khẩu hơn 1,5triệutấn đậutương,đến năm 2022 nướctavẫn phải nhậpkhẩuhơn4,9triệutấnvớichiphíhơn2,7tỷUSDđểphụcvụchocôngnghiệpchếbiến,sản xuấtdầuăn vàthứcănchănnuôi Chínhvìvậy, việc tăng năngsuất và sản lượng đậu tương làrất cần thiết Tuy nhiên, thực tế sản xuất đậu tương ở nước ta còn gặp nhiều khókhăn, bên cạnh tình hình giá phân bón, thuốc trừ sâu tăng cao và sâu bệnh diễn biến

phức tạp còn thiếu nguồn giống tốt cho sản xuất[3].

1.2 Tổngquan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương trên thếgiới

1.2.1 Nghiêncứu về tái sinh in vitro ở cây đậutương

1.2.1.1 Vậtliệu sử dụng trong tái sinh in vitro ở cây đậutương

Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây đậu tươngin vitrocho thấy, vật liệuđược

sửdụngkháđadạngvàphongphúbaogồmtrụdướilámầm-hypocotyl[80],lámầm

- cotyledon,nốtlámầm(cotyledonnode)[80],[112],trụtrênlámầm(epicotyl)[73],[80], sửdụng một nửa lá mầm (half-seed), chồi ngọn (shoot tip) (Hình 1.1) [29],[56] Tùyvào điều kiện, môi trường nuôi cấy và đặc điểm giống để có thể sử dụng

cácmẫunuôicấykhácnhauchotáisinhinvitrocâyđậutương.Hiệnnay,đểtáisinh

đậutươngchochuyểngen,cácnhànghiêncứuchủyếusửdụngmẫunửalámầm,trụ dưới hoặc trụtrên của lámầm

Hình 1.1 Một số vật liệu nuôi cấy trong nuôi cấy mô đậu tương

A: Trụ trên lá mầm; B: Lá mầm; C: Trụ dưới lá mầm; D: Chồi

ngọn;E: Nốt lá mầm[56]

1.2.1.2 Phátsinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậutương

Phátsinhphôisomalàmộtkỹthuậtquantrọngtrongnuôicấymôthựcvật.Ưu điểm chính củaphương pháp này là sự phát triển của phôi soma bắt chước phôi hợptửvànếuđượcbaobọc,sẽgiốngnhưhạtgiống(hạtnhântạo).Tuynhiên,mộtsốloài

cócáctếbàotiềnphôiđượcxácđịnh,nêndễpháttriểnphôiinvitro,mộtsốloàivẫn chưa có phương pháp hình thành phôi somain vitro Các nghiên cứu cho thấy đậu

tươngphảnứngthuậnlợiđốivớiviệctạophôisoma(thôngquamẫucấylámầm)và có thể đượckhai thác một cách thích hợp cho quá trình tạo phôi Ở các giống đậu tương khác nhau,

sự hình thành phôi soma có khác nhau về yêu cầu môi trường với từng kiểu gen ChaoYang và cs cho rằng các kiểu gen đậu tương khác nhau yêu cầu nồng độ đườngsucrose khác nhau (môi trường MS biến đổi với vitamin B5) để phát triển phôi somahiệu quả [31] Tương tự, các giống đậu tương trồng ở các địa điểm

khácnhauphảnứngkhácnhauđốivớiinvitrođểpháttriểnphôisomathôngquanuôi

cấymầmhạt.Dođó,sựpháttriểncủaphôisomathayđổitheocáckiểugenkhácnhau và các dòng khácnhau phải được sàng lọc để phát triển phôi soma hiệu quả Mặcdù

quá trình tạo phôi soma cung cấp một số ứng dụng, nhưng khó khăn trong việc sửdụngphôisomalàtỷlệthànhcôngkhôngcao.Thôngthường,chỉcómộtsốphôisoma phát triển thànhcây con hoàn chỉnh Nguyên nhân là do tương tác giữa kiểu gen vàmôitrườngnuôicấytrongquátrìnhpháttriểnphôi.TácgiảBirchvàCollinsonđãchỉ ra rằng nếuphôi soma đậu tương được xử lý bằng một lượng axit abscicic thích hợpthìsẽdẫnđếncảithiệnsựpháttriểnvàtrưởngthànhcủaphôi.Axitabscisichoạtđộng như mộthormone chống stress, giúp phôi vượt qua các điều kiện bất lợi và đảm bảo sự hình thành câycon tốt hơn khi điều kiện thích hợp [26], [37],[72],

Phôi soma có khả năng phát sinh cả chồi, rễ và hình thành cây hoàn chỉnhkhi tái sinh Mặc dù quá trình phát sinh phôi vô tính đã được báo cáo ở một sốphòng thí nghiệm nhưng hầu hết các quy trình này khi tiến hành các thử nghiệmchuyển gen ban đầu đã không thành công [31, [34],[77], [113] Năm 1988, FinerJ.J đã xây dựng thành công một hệ thống phát sinh phôi soma từ nốt lá mầm cònnon ở cây đậu tương khi ông nuôi cấy mẫu trên môi trường có chứa nồng độ 2,4Dcao (40mg/l) Phôi vô tính được nhân lên khi nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc môitrường dạng lỏng huyền phù có nồng độ 2,4D thấp hơn [50] Phân tích hình thái vàquan sát sự sinh trưởng của phôi cho thấy hầu hết những phôi soma mới đều đượcsinh ra từ bề mặt phôi ban đầu hoặc cạnh đó có dạng hình cầu, màu xanh sáng [49],

[50] Khi cấy chuyển những phôi này sang môi trường MS (Murashige and Koog)không có chất kích thích sinh trưởng thu được cây con tái sinh hoàn chỉnh Với hệthống này, phôi mới sinh ra được sử dụng là mô thích hợp cho chuyển gen [48]

Việc phát sinh phôi soma trong tái sinhin vitrocây đậu tương cũng được ứng dụng

trong bảo tồn, lưu giữ và ứng dụng các kỹ thuật di truyền ở cây đậu tương

thôngquamôsẹotrongtáisinhinvitrocâyđậutương

Phát sinh cơ quan (chồi/rễ ) từ mẫu cấy thông qua giai đoạn mô sẹo (callus)Trong phương pháp này, mẫu cấy đầu tiên được kích thích để tạo ra callus, sau đó

được định hướng để tạo thành cơ quan biệt hóa (chồi, rễ ) và được phát triển thànhcây con hoàn chỉnh.

Lợi ích của phương pháp này bao gồm việc nhân nhanh giống cây trồng và

pháttriểncácgiốngmớibằngcácbiếndịdòngsoma.Cácbiếndịnàylàdođiềukiện nuôi cấyin vitrocung cấp cho các tế bào chưa biệt hóa, tạo ra các biến dị di truyền trong các mô

tái sinh Giống được phát triển như vậy cũng dễ dàng được chấp nhận vì nó khôngliên quan đến thao tác gen ngoại lai Đối với cây đậu tương, một số nghiên cứu đãđược thực hiện để sản xuất cây con qua trung gian mô sẹo Nhóm tác giả Liu và cs

đã nghiên cứu hiệu quả của hạt từ phôi trên cây tái sinh từ mô sẹo vàtạophôitrênmôitrườngMScóchứaBAP,NAAvàchorằngbêncạnhviệcứngdụng chất điều tiếtsinh trưởng ngoại sinh, hàm lượng IAA và polyamine nội sinh trong mẫu đậu tương rất quantrọng trong việc xác định hiệu quả của cảm ứng mô sẹo và

sựpháttriểntronginvitro[82].Bêncạnhmẫucấynon,lámầmvàphôitrưởngthành cũng đã

được sử dụng để tái sinh mô sẹo ở đậu tương [81] Nuôi cấy lá đậu tương cũng đã đượcdùng để phát triển các giống đậu tương chịu mặn thông qua nuôi cấy mô sẹo trung gian.Wada và cs đã tạo ra các giống đậu tương chịu mặn trên môi trường được bổ sung tới0,1% NaCl, họ cũng chỉ ra rằng stress do muối có thể đượcgiảm bớt bằng cách bổ sungCaCl2trong môi trường nuôi cấy [79] Nghiên cứu thửnghiệm này có thể hữu íchtrong việc tạo ra các giống đậu tương chịu mặn và có thể được thử nghiệm thêmtrên đồng ruộng về năng suất trong điều kiện tự nhiên Lá được coi là mẫu cấy thíchhợp vì có thể cung cấp các tế bào đồng nhất để phân hóa và nhân giống Wright và

cs đã thiết lập quy trình tạo cây đậu tương hoàn chỉnh có thể được phát triển từ cácđoạn lá nhỏ của cây mẹ, trong đó sử dụng tuần tự môitrườngMSvàmôitrườngB5cóbổsungcácchấtđiềuhòasinhtrưởngthựcvậtkhác nhau[130]

1.2.1.4 Phátsinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việc hìnhthành môsẹo)

Phát sinh cơ quan trực tiếp là sự phát sinh cơ quan chồi/rễ từ mẫu cấy khôngqua mô sẹo Các đốt thân được sử dụng phổ biến nhất để tạo mẫu cấy chồi không có

môsẹovàpháttriểnthànhcáccâyconlàdòngvôtínhcủacâymẹ[81].Trongphương pháp này, cácchồi nách được kích thích hình thành từ các đoạn có đốt thân và được nhân lên thành các bản saogiống hệt nhau về mặt di truyền của cây mẹ Tác giảHitoshivàcsđãnhângiốnghàngloạtcâyđậutươngbằngcáchsửdụngcácđoạnđốt thân Họ đã

sử dụng dung dịch natri hypochlorite để khử trùng bề mặt mẫu và môitrườngMS,BAPvàIBAđểkíchthíchsựhìnhthànhnhiềuchồi.Tuynhiên,cácmẫu cấy cầnđược thu thập từ các cây mẹ khỏe mạnh và cấy mẫu ngay sau khi xử lý vào môi trườngnuôi cấy, việc phát sinh cơ quan trực tiếp không qua mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vàokiểu gen (tùy từng giống) mà môi trường nuôi cấy[126]

Việc hình thành các bộ phận cơ quan trực tiếp không qua mô sẹo, quan trọngnhất là quá trình phát hình thành và phát triển chồi Chồi hình thành từ một khối môkhác nhau được tách ra để tạo rễ và hình thành cây mới Để biến nạp, gen ngoại laicần được chuyển vào mô phân sinh chồi hoặc các khối mô có khả năng tái sinhchồi.Phát sinh hình thái chồi ở đậu tương, lần đầu tiên được Wright và cs báo cáo năm 1986, sử dụng nốt lá mầm của cây mầm làm mẫucấy; Barwale và cs (1986) sử dụng nốt lá mầm của hạt non Khi nuôi cấy trên môi trường có chứa BAP chồi được hìnhthànhtừlớpmôbiểubìdưới(subepidermaltissue).Ưuđiểmchínhcủaphươngpháp

nàylàchồiđượcnhânlênvàcóthểhìnhthànhrễdưới3tháng.Trongkhiđó,phương pháp phôi vôtính phải mất 4 tháng hoặc hơn nữa.Trụdưới (hypocotyl)vàtrụtrên (epicotyl)lámầmcủa cây đậutương cũng đượcsửdụngđểtáisinh trực tiếp thànhcâyhoàn chỉnh[47],[125],tạophôivôtính[81] vàtạo câychuyểngen[61],[100]

1.2.1.5 Ảnhhưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đến khảnăng tái sinh đậutương

Môitrườngnuôicấycóảnhhưởngquantrọngđếnkhảnăngtáisinhđậutương Tuy nhiên,mức phản ứng với điều kiện môi trường còn tùy thuộc kiểu gen vànguồnvậtliệu.Dođó,cầnnghiêncứuđiềukiệnmôitrườngnuôicấychođậutươngphùhợp với từng giống

và từng giaiđoạn

Bảng 1.5 Một số môi trường tái sinh cây đậu tươngin vitro

1 Nuôi cấy hạt/phôi

Môi trường MS Shan và cs (2005); Vural (2010); Phat và cs

(2015); Rathod và cs (2017); Begum và cs (2019)

và cs (2016); Raza và cs (2017)Kết hợp môi trường MS và B5 Zia và cs (2010); Mariashibu và cs 2013; Soto và

cs, 2013

2 Phát sinh phôi soma/các cơ

quan

MS bố sung BAP, NAA, IBA Bonacin và cs (2000)

MS bổ sung 2,4-D, BAP và IBA Branch và cs (2002)

MS bổ sung 2,4 D, NAA, BAP

MS bổ sung BAP, NAA và IBA Islam và cs (2017)

Nguồn: Singh và cs(2020) [126]Trongnuôicấymôđậutương, pHmôitrườngthường sửdụnglà 5,8, môit

rườngthíchhợpchogiaiđoạngieohạtlàmôitrường½MSbổsungBA.Cáctácgiảđã nghiên

cứu ảnh hưởng của nồng độ BA khác nhau đến khả năng nảymầmv à kếtluậnnồngđộBA=1mg/lchokếtquảtốtnhất.Hạtđượcgieotrongđiềukiện16hsáng8htốidướiánhsánghuỳnhquang,nhiệtđộ240Ctrong7ngày.Islamvàcsđã

nghiên cứu ảnh hưởng của BA và 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở chồingọnv à nốtlámầmđậutương Thínghiệmchothấy môitrườngMSbổsung2,5mg/lBAP+0,5mg/l 2,4D cho tỷ lệ phát sinh callus cao nhất (76,60%) Kết quả cũngchothấytỷlệphátsinhcalluscủachồingọncaohơncóýnghĩasovớinốtlámầm[56],

[61]

Begumvàcsđãnghiêncứuảnhhưởngcủa2,4D,NAA,BAđếnkhảnăngtạomôsẹo Môi trườngthích hợp nhất là MS + 3,32mg/l 2,4D và MS + 1,5mg/l BAP (tỷ lệ 100%) Môi trường phátsinh chồi sử dụng BA và NAA cho kết quả tốt nhất MS + 2,5mg/l BAP + 1,0mg/l NAA (tỷ lệ79,4%, chồi cao 5,32cm) [29] Theo Hu CY và cs, môi trường MS + 1mg/l BA thích hợp

chỉrarằngchồichỉphátsinhtrongmôitrườngcónồngđộBAtừ5-10µM/l(khoảng 1 - 2mg/l), ởnồng độ cao hơn 10µM/l 35 chồi không hình thành [59] Điều này phùhợpvớinhữngnghiêncứucủaSairamvàcs[127].Saukhicallusphátsinhchồi,chồi

đượcchuyểnsangmôitrườngkéodàichồi(SEM),môitrườngphùhợplàmôitrườngMS bổ sung0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3, 1mg/l ZR trong 14 ngày[85]

1.2.2 Kếtquả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thếgiới

1.2.2.1 Chuyểngen thông qua vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens

ĐâylàphươngphápsửdụngvikhuẩnAgrobacteriumnhưmộtvectorsinhhọcđể biến nạp

một phần DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả là tạo đượccâybiến đổi

gen.Agrobacteriumxâm nhiễm vào cây trồng thông qua vết thương Khi bị tổn

thương, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chất phenol, hợp chất này sẽ dẫn dụ vi

xúc tác như acetosyringone để kích thích sự biểu hiện của genVir, L-cystein, hoặc sử dụng

các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [109], xác định các yếu tố ảnh

chuyểngenthôngquanốtlámầm,nghiêncứucảitiếnnốtlámầmlàmvậtliệubiến

nạp, kết hợp lây nhiễm với tái sinh [110] Vấn đề khác khi sử dụng vi

khuẩnAgrobacteriumcòn phụ thuộc vào chủng khuẩn, số lượng bản DNA copy được

tổng hợp trong hệ gen thực vật, pH môi trường, mức độ gây tổn thương của mẫu.Trái ngượcvớicácphươngphápchuyểnDNAtrựctiếpcóthểchokếtquảvớisốbảncopy nhiềuhơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khuôn mẫu không được kiểmsoát [110],[114]

Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp nốt

lámầmsửdụngvikhuẩnAgrobacteriumlàmtrunggianđượcbáocáovàonăm1988 [55] Nốt lá

mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng vi

khuẩnAgrobacteriummanggenchỉthịgus,genkhángkanamycinvàglyphosate.Mẫuđược

nuôicấytrênmôitrườngcóchứaBAPđểcảmứngtạochồi,kanamycincùngvớicác kháng sinhkhác có tác dụng loại bỏ lượng vi khuẩn còn lại sau khi đồng nuôi cấy.Saumộtvàitháng,câyconđượctáisinhvàđượckiểmtrathôngquasựbiểuhiệncủa

gengushoặckhảnăngkhángglyphosate.Chỉ6%tổngsốchồilựachọnđượcchuyển gen Tám

cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợiDNAchèn vào Mặc dù

sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báo cáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tếbào chuyển gen của một giống đậu tương khi được lây nhiễm với vi

khuẩnAgrobacteriumthíchhợp.

NhómtácgiảTownsendvàThomasđãsửdụngquytrìnhtươngtựvàthuđược

câychuyểngentừgiốngPioneer9341.Cácyếutốquantrọnggiúphọthànhcôngđó là: (1) sửdụng chất acetosyringone; (2) giới hạn nhiệt độ giai đoạn đồng nuôi cấy được kiểmsoát trong khoảng 18 - 280C; (3) mật độ tế bào vi khuẩn lây nhiễm từ

108đến3x109/ml;(4)sửdụngaxitpyroglutamicđểbổsungvàotrongmôitrườngtáisinh [130]

Vi khuẩnAgrobacteriumvà nốt lá mầm cũng được sử dụng để chuyển gen

tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pod Mottle (một loại vius lây bệnh đốm vỏ trênhạt đậu) vào đậu tương Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyểngen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu Phân tíchSouthern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây

R1 Khoảng 30% cây R2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu được xétnghiệm ELISA (Enzym-linked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng khánghoàntoànvớivirusnày.TínhtrạnghìnhtháikhôngbịbiếnđổisovớithếhệR1[91], [130].

Parrott và cs đã đưa ra phương pháp chuyển gen khác đó là sử dụng vi

khuẩnAgrobacteriumlây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo phôi vô tính sau

đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ba cây chuyển gen có chứa genzeinkích thước

15kD đượchìnhthành.Tuynhiên,nhữngcâychuyểngennàyđềubịkhảmvàkhiphântích các

cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa genzein15kD[113].

Gầnđây,mộtphươngphápmớivàcókhảnăngchohiệuquảhơnđãđượcphát triển để biến

nạp vi khuẩnAgrobacteriummang gen vào thẳng tế bào mô đích Kỹ thuậtmớinàygọilàSAAT(SonicateAssistedAgrobacterium-mediatransformation)

[131].SửdụngSAATvớinuôicấyhuyềnphùphátsinhphôivôtínhđãchohiệuquả chuyển gen

ổn định và không có hiện tương thể khảm Phương pháp này có ưu điểm

làthờigiannuôicấycộngsinhmôthựcvậtvớiAgrobacteriumđượcrútngắn.Vớikỹ

thuậthiểnviđiệntửquét,nhómtácgiảkhámpháraSAAT,tạoranhữngrãnhvàkhe

nhỏgiốngnhau,xuyênquamô,chophépAgrobacteriumdễdàngđivàomôđíchmong muốn không giống

như phương pháp chuyển nạp gen khác Sử dụng kỹ thuật SAATđểchuyểngenvàođỉnhsinhtrưởngđãlàmgiatănghiệuquảchuyểnnạpgentạmthời trong nhiều cơquan như: lá, nốt lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể

hiệnGUStăng gấp 100 - 400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa

(cowpea),câyvânsamtrắng(whitespruce),lúamì,ngôvàđậutương,đồngthờigen

chuyểnnạptươngđốiổnđịnhquacácthếhệ.Meurervàcsápdụngphươngphápnêu trên ở 28giống đậu tương, nhóm tác giả cho rằng, để thực hiện thành công phương pháp SAAT thìcần khảo sát các yếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gencủa mô mong muốn Với phương phương pháp SAAT, chọn nhữngcụmphôicó10-20phôi(đườngkính2-

4mm)đượclâynhiễmvới1mldịchkhuẩnAgrobacteriumtumefacienscónồngđộOD600=0,5trongthờigian0-

0,1-300giây.Sau2ngàytrênmôitrườnglâynhiễmcó0,1mMacetosyringonemẫuđược

chuyển lên môi trường chứa 400 mg timentin/l Hai tuần sau khi SAAT, chuyển môsang môi trường có 20 mg hygromycin/l và 400 mg timentin/l Những dòng chuyểngenđượcquansátvàphânlậpkhoảng6-8tuầnsaukhiSAAT.Kỹthuậtnàychohiệu

quảchuyểngencaohơnsovớicácphươngphápchuyểngenkhác.Mởramộthướng mới sử

dụng vi khuẩnAgrobacteriumđể biến nạp gen cho các mô đích khác nhau [97],[131].

1.2.2.2 Nghiêncứu chuyển gen bằng súng bắngen

Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc của các hạt bọc DNA về phía tế bào thựcvật.NhờcógiatốclớnmàcáchạtDNAcóthểđâmxuyênquathànhtếbàovàmàng tế bào Bêntrong tế bào, DNA được phân tách từ các hạt nhỏ và tổng hợp ở trong hệgenthựcvật.Ưuđiểmcủasúngbắngenlàcóthểloạibỏcáctácnhânsinhhọckhông thích hợp, đặcbiệt là với những loại mẫu không thích hợp với chuyển gen bằng vi

khuẩnAgrobacterium.Phươngphápnàychophépchuyểntrựctiếpgenquantâmvào mô phân

sinh đỉnh của thực vật Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu phải có dụngcụ,máymócchuyêndụngcóthểphânchiachínhxáccáchạtDNAsâutrongmôphân sinh đích [97].Báo cáo đầu tiên về chuyển gen bằng súng bắn gen vào đậu tương sửdụngchồiphânsinhđỉnhlàmmôđíchđượcMcCabevàcstiếnhànhnăm1988.Chồi đỉnh sau khibiến nạp được cảm ứng tạo đa chồi trước khi tái sinh thành cây hoàn chỉnh Phân tích khối

mô chuyển gen nhận thấy có các hạt nhỏ mang DNA và có sự tái tổ hợp DNA trong tế bàochủ [87], [97] Khả năng tổng hợp DNA trong tế bào được xem như biểu hiện của quátrình chuyển gen có hiệu quả[62]

1.2.2.3 Nghiêncứu chuyển gen bằng xungđiện

Sử dụng xung điện cho hiệu quả biến nạp khá cao đối với tế bào động vật.FrommM.vàcslầnđầutiênchorằngcóthểcảitiếnphươngphápnàyđểbiếnnạpgenvào thực vật,nhóm tác giả đã sử dụng kỹ thuật xung điện để chuyển gen vàotếbàotrầncủacâyngôvàhọđãthuđượccâyngôchuyểngenbềnvữngbằngphươngphápnày.Cùngvớicácthínghiệmthuđượctrêncâythuốclácủanhiềutácgiảkhác,phương

phápnàyđãđượcsửdụngđểchuyểngenchocâyđậutương[118],[52]

Tế bào trần đậu tương được xung điện đảm bảo mật độ 2 - 4 x 106tế bào/mlmôitrườngKaobổsung40mMNaCl.Mộtmldungdịchhuyềnphùtếbàotrầnđược hút chovào cuvet 1,5ml và làm lạnh trong thời gian ngắn trên đá Dòng điện xung phát ra từcác sợi bạch kim có khoảng cách 1cm Dòng điện này được cung cấp bởi một tụ điện490µF (Sprague Power-lytic 36D, Marsh Electronics, Milwaukee, WI) và là nguồncung cấp điện áp ổn định Điện thế được điều chỉnh bằng một vôn kế [54].

Chowriravàcssửdụngphươngphápxungđiệnđểbiếnnạpgenvàođiểmsinh trưởng củacây mầm đậu tương Cây mầm 7 - 10 ngày được loại bỏ lá mầm,DNAđược tiêm vào đỉnhchồi bằng hệ thống ống tiêm có chứa dung dịch lipofectin.DNAđược chuyển vàobằng một dòng điện xung, cây sinh trưởng mà không cần tác nhân chọn lọc Quátrình này đã được thực hiện trên nhiều mô phân sinh và thu được một vài thể khảm.Đây là phương pháp tốt nhưng việc ứng dụng còn nhiều hạn chế[35]

1.2.2.4 Nghiêncứu chuyển gen qua ốngphấn

Hầu hết các phương pháp chuyển gen hiện tại đều dựa trên cơ sở nuôi cấymô

tế bào, nó đòi hỏi các tế bào chuyển gen phải được tái sinh thành cây [26] Pháttriểnmộthệthốngchuyểngenđộclậpvớinuôicấymôtếbàođãgiànhđượcnhiềusựquan tâm của các nhàkhoa học Cách tiếp cận này cho phép vượt qua rào cản về kiểu gencủacâybiếnnạpvốnảnhhưởngrấtnhiềuđếnhiệuquảchuyểngen.Mặtkhácchiphí tài chính vàthời gian chọn tạo sẽ được rút ngắn Phương pháp chuyển gen qua ống phấn lần đầu tiênđược báo cáo thành công trên cây bông [35] Kỹ thuật này sau đó được sử dụng để chuyểngen ở một số cây trồng như: ngô [33], bông [102], lúa [39],[87],đậutương[138],dưahấu[32].Mộtsốbáocáođãchỉrarằngcóthểchuyểngen

vàođậutươngthôngquaốngphấn,Meurervàcsđãsửdụngphươngphápnàyđểtạo

racâyđậutươngvàcâybôngchuyểngen,nhómtácgiảđãthuđược50hạtđậutương, 226 hạt bông.Nhưng tất cả đều cho kết quả âm tính khi xử lý thuốc diệt cỏ[99]

ZengluLivàcsđãthuđượcxấpxỉ5.000hạtđậutươngsaukhixửlýhoavới DNA mang

genbar Khi kiểm tra tất cả các hạt thu được từ cây xử lý với DNA có chứa genbarđều không cho kết quả dương tính với gen này Quan sát hình tháicủa

Thínghiệmkhácvớigengus,nhómtácgiảthuđượcgần2%sốhạtcủacáccâyđược xử lý với DNA có chứa gengusphản ứng dương tính với gen này khi kiểm tra Tuy nhiên, khi

cho hạt nảy mầm và tiến hành lấy lá phân tích thì không thấy có sự hoạt động của

gengus 3% hạt thu từ các cây thế hệ sau được kiểm tra đều không thấy có biểu hiện củagus[137] Huixia Shou và cs tiến hành chuyển gen vào 8 giống đậu tương, trong

đó có giống mô hình Williams 82 bằng kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn, tuynhiên kết quả đã không thành công như mong muốn [59] Nhiều báo cáo trước đâykhi sử dụng phương pháp chuyển gen này cũng đều chỉ ra một số hạn chế củaphương pháp này [79],[102]

1.2.3.1 Đặctính kháng thuốc diệtcỏ

Bằng công nghệ sinh học người ta đã có thể tạo ra những giống cây trồngkháng thuốc diệt cỏ, cho phép loại trừ được cỏ dại một cách chọn lọc Nhìn chung,sản xuất cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được tiến hành bằng việc chuyển gen mã hóaenzyme gây bất hoạt thuốc diệt cỏ vào cây trồng

Theo tác giả Lawton có khoảng 1.000 giống đậu tương kháng thuốc diệt cỏglyphosate đang được bán bởi hơn 200 công ty trên thế giới Monsanto, công ty giữbản quyền về giống đậu tương chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấynăm 1996 có khoảng 0,4 triệu hecta trồng đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997tăng lên 3,6 triệu hecta và năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta [75]

Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS),gen mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase (PAT) đã được chuyển vàocây đậu tương và tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏglyphosate/glufosinate.

1.2.3.2 Đặctính kháng côntrùng

Việc sử dụng giống kháng bị hạn chế vì không có giống kháng cao để hoàntoànphòngtrừsâuhạiđậutương.ỞMỹmộtvàikỹthuậtcanhtácđượcápdụngnhư gieo trồngsớm hay trồng các giống ngắn ngày để né tránh các đỉnh bộc phát của sâu Velvetbean;trồng gần bên các ruộng cây trồng khác được sâu đo ưa thích hơn đậutươngcũnghạnchếmứcgâyhạicủasâuđođếnruộngđậutươngởmộtsốvùngtrồng đậu tương [10],[45] Thuốc trừ sâu thường được dùng khi mật độ sâu lên đến mức ngưỡng gây hại Tổng chiphí ước tính cho thuốc trừ sâu sử dụng để phòng trừ 4loại côn trùng như sâu ăn lá

đo(Pseudoplusiaincludens),sâuxanhcornearworn(Heliothiszea)vàsâuđụcthân(Elesmop alplus)ở Mỹ lên đến 6,5 triệu USD hằng năm [45], [75] Tuy nhiên, do tính kháng thuốc trừ sâucaocủamộtsốloàisâubộcánhvảy,việcphòngtrừsâuhạiđậutươngbằngthuốc trừ sâu trở

nên kém hiệuquả

Côngtácnghiêncứulaitạođậutươngkhángsâuhại,đặcbiệtđốivớisâuthuộc bộ cánh

vảy(Lepidoptera)bằng các phương pháp lai chọn giữa hai hay nhiều giống đậu

tương với nhau gặp nhiều khó khăn và không thành công Nguyên nhân là donguồngenkhángvớisâubộcánhvảyrấthiếmởđậutươngvàconlaitạođượctừcác

nguồnbốmẹmangtínhkhángsâuhại nhưPI171451,PI229358cóthờigiansinh