Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merr.)

-NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƯỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU

TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) Merr.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội - 2024

-NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƯỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

(GLYCINE MAX (L.) Merr.)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Khuất Hữu Trung

2 GS.TS Ngô Xuân Bình

Hà Nội - 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, các số liệu

và kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học

vị nào hoặc chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ, hợp tác cho việc thực hiện luận ánnày đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ dẫn

rõ nguồn gốc

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp ViệtNam; tập thể cán bộ Ban Thông tin và Đào tạo; tập thể Lãnh đạo và cán bộ viênchức Trung Tâm chuyển giao công nghệ và khuyến nông đã giúp đỡ, hỗ trợ tận tìnhcho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thựcphẩm, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên là nơi tôi triển khai thựchiện đề tài, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về tài liệu khoa học, cơ sở vật chất, thiết

bị phục vụ nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án Đặc biệt, tôi xin bày tỏ sự biết ơnđến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thựcphẩm đã chia sẻ kiến thức và kinh nghiệm chuyên môn để tôi hoàn thành nghiêncứu trong thời gian sớm nhất

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp trong và ngoài cơquan và người thân trong gia đình luôn hết lòng động viên, khích lệ và giúp đỡ tôitrong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành công trình trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trịnh Hoàng Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC HÌNH xiv

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

2.1 Mục tiêu tổng quát 3

2.2 Mục tiêu cụ thể 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

4.1 Đối tượng nghiên cứu 4

4.2 Phạm vi, thời gian nghiên cứu 4

5 Những đóng góp mới của luận án 4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 6

1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 6

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 6

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 8

1.2 Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương trên thế giới 9

1.2.1 Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở cây đậu tương 9

1.2.1.1 Vật liệu sử dụng trong tái sinh in vitro ở cây đậu tương 9

1.2.1.2 Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương 10

1.2.1.3 Phát sinh cơ quan thông qua mô sẹo trong tái sinh in vitro cây đậu

tương 11

1.2.1.4 Phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việc hình thành mô sẹo) 12

1.2.1.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đến khả năng tái sinh đậu tương 13

1.2.2 Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thế giới 15

1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15

1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen 18

1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen bằng xung điện 18

1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn 19

1.2.3 Các tính trạng được cải thiện thông qua chuyển gen ở cây đậu tương 20

1.2.3.1 Đặc tính kháng thuốc diệt cỏ 20

1.2.3.2 Đặc tính kháng côn trùng 21

1.2.3.3 Chuyển gen nâng cao hàm lượng dầu 25

1.2.3.4 Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh 25

1.2.3.5 Chuyển gen nâng cao năng suất 25

1.2.3.6 Chuyển gen tạo cây trồng đa tính trạng 26

1.2.4 Thành tựu về cây trồng chuyển gen trên thế giới 26

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước 30

1.3.1 Chọn tạo giống thông qua tuyển chọn vật liệu nhập nội và địa phương 30

1.3.2 Chọn tạo giống đậu tương mới bằng lai hữu tính 31

1.3.3 Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lý đột biến 32

1.3.4 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương ở Việt Nam 32

1.3.4.1 Nghiên cứu tái sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương 32

1.3.4.2 Nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương 33

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu về tính trạng gen có khả năng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương 34

1.4.1 Nghiên cứu gen điều khiển quá trình tăng cường kích thước hạt ở cây đậu tương

34

1.4.2 Nghiên cứu về vai trò của gen kìm hãm già hóa bộ lá 36

1.5 Một số nhận xét rút ra từ tổng quan tài liệu 39

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 Vật liệu nghiên cứu 41

2.1.1 Vật liệu thực vật 41

2.1.2 Vật di truyền 42

2.1.3 Hóa chất, thiết bị sử dụng 43

2.2 Nội dung nghiên cứu 43

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44

2.4 Phương pháp nghiên cứu 44

2.4.1 dung Nội 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen

44

2.4.1.1 Nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của các giống đậu tương 44

2.4.1.2 Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương 49

2.4.2 Nội dung 2: Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis thaliana 50

2.4.2.1 Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóa lá Atore1 50

2.4.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Atore1 52

2.4.2.3 Đánh giá khả năng biểu hiện của gen kìm hãm già hóa lá Atore1 trên cây

mô hình Arabidopsis thaliana 53

2.4.3 Nội dung 3: Chuyển gen kìm hãm già hóa lá Ore1 vào cây đậu tương và đánh giá các dòng chuyển gen

55

Agrobacterium tumefaciens 55

2.4.3.2 Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen

58

2.4.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 và đánh giá biểu hiện của gen 59

2.4.3.4 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương chuyển gen…… 59

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 61

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 62

3.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và

khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen 62

3.1.1 Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của các giống đậu tương

62

3.1.1.1 Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng 62

3.1.1.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ nốt lá mầm 63

3.1.1.3 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ nốt lá mầm 68

3.1.1.4 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng GA 3 đến khả năng kéo dài chồi của một số giống đậu tương 75

3.1.1.5 Tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh 76

3.1.2 Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương 78

3.2 Kết quả tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già

hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis thaliana 85

3.2.1 Tách dòng gen kìm hãm già hóa Atore1 85

3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Atore1 89

3.2.2.1 Gắn gen Atore1 vào vector chuyển gen 89

3.2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn E.coli và Agrobacterium tumefaciens mang gen Atore1 91

3.2.3 Đánh giá khả năng biểu hiện của gen kìm hãm già hóa lá Atore1 trên cây

91

3.2.3.1. Chuyển gen Atore1 vào cây mô hình Arabidopsis thaliana 91

3.2.3.2 Chọn lọc cây Arabidopsis thaliana chuyển gen T 1 mang gen Atore1 92

3.2.3.3 Đánh giá cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T 1 93

3.2.3.4 Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái của cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 thế hệ T 1 .94

3.2.3.5 Đánh giá cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 bằng PCR ở thế hệ T 2

95

3.2.3.6 Đánh giá biểu hiện gen thông qua hình thái lá ở cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 thế hệ T 2 .96

3.3 Kết quả chuyển gen kìm hãm già hóa lá Atore1 vào cây đậu tương và đánh giá các dòng chuyển gen 100

3.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

100

3.3.1.1 Nuôi cấy hạt đậu tương nảy mầm chuẩn bị để biến nạp gen 100

3.3.1.2 Tạo dung dịch vi khuẩn biến nạp gen Atore1 101

3.3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến khả năng biến nạp 102

3.3.1.4 hưởng Ảnh của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen 104

3.3.1.5 Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringon (AS) đến khả năng biến nạp gen 105

3.3.1.6 Ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen ở cây đậu tương 107

3.3.1.7 Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen Atore1 trên môi trường kháng sinh 108

3.3.1.8 Tạo cây đậu tương chuyển gen Atore1 hoàn chỉnh 110

3.3.1.9 Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen trồng trong vườn thí nghiệm 110

3.3.2 Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen

111

3.3.2.1 Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen

thế hệ T 0 111

3.3.2.2 Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen thế hệ thế hệ T 1 114

3.3.2.3 Chọn lọc cây đậu tương chuyển gen kìm hãm già hóa lá Atore1 ở thế hệ T 2

119

3.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 và đánh giá biểu hiện gen

123

3.3.3.1 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 123

3.3.3.2 Đánh giá biểu hiện gen của dòng đậu tương mang gen Atore1 đồng hợp tử thông qua hình thái 126

3.3.3.3 Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển ở các dòng đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử bằng Southern blot 128

3.3.4 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương chuyển gen đồng hợp tử T 3

130

3.3.5 Sự thay đổi thành phần chất điều hòa sinh trưởng liên quan đến cây

chuyển gen Atore1

131

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 138

1 Kết luận 138

2 Đề nghị 139

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

140

TÀI LIỆU THAM KHẢO 141

TIẾNG VIỆT 141

PHỤ LỤC 163

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AtBBX32 The Arabidopsis thaliana BBX32

Atore1 Arabidopsis thaliana Ore1

Bp Cặp bazơ (Base pairs)

Bt Bacillus thuringiensis

CBF C-repeat/dehydration responsive element bingding factor

CBF1 C-repeat/DRE binding factor 1

CCM Co-Culture Medium (Môi trường đồng nuôi cấy)

CNSH Công nghệ sinh học

DNA Deoxyribonucleic acid (Axít Deoxyribonucleic)

ELISA Enzym-linked Immuno Sorbent Assay

FAOSTAT Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông

nghiệp Liên Hợp Quốc)GMO Genetically Modified Organism (Sinh vật biến đổi gen)

GM Germination Medium (Môi trường nảy mầm)

GUS Beta-Glucuronidase reporter gene

ISAAA International Service for the Acquisition of Agri-biotech

Applications (Tổ chức Dịch vụ quốc tế về ứng dụng công nghệsinh học nông nghiệp)

LSD Least Significant Difference Test (Giá trị sai khác nhỏ nhất có ý

nghĩa)

mRNA Messenger Ribonucleic acid

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông

thôn ORE1 ORESARA1

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RM Root Medium (Môi trường nuôi cấy rễ)

RNA Ribonucleic acid

SEM Shoot Elongation Medium (Môi trường kéo dài chồi)SAAT Sonicate Assisted Agrobacterium - media Transformation

(Phương pháp biến nạp gen ở đậu tương)SIM Shoot Inducing Medium (Môi trường cảm ứng chồi)

DANH MỤC BẢNG

1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây .6

1.2.Tình hình sản xuất đậu tương của một số nước đứng đầu trên thế giới trong

những năm gần đây (sản lượng trên 1 triệu tấn) .7

1.3.Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2012 - 2021 8

1.4.Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2020 - 2022 9

1.5.Một số môi trường tái sinh cây đậu tương in vitro 14

1.6.Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu năm 2019 (theo quốc gia) .27

1.7.Các giống Đậu tương tuyển chọn từ nguồn nhập nội .31

2.1.Danh sách các giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu .41

2.2.Trình tự mồi sử dụng tách dòng gen Atore1 43

2.3.Công thức ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi 45

2.4.Công thức ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi 45

2.5.Công thức ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi 46

2.6.Công thức ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ .46

2.7.Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu tách dòng gen Atore1 51

2.8.Danh sách mồi sử dụng để nhân gen Atore1 54

2.9.Thành phần phản ứng PCR nhân dòng gen Atore1 54

2.10.Thành phần các môi trường dùng cho chuyển gen ở cây đậu tương thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 57

2.11.Danh sách mồi sử dụng để nhân gen Atore1 59

3.1.Ảnh hưởng của NaClO đến khả năng vô trùng mẫu nuôi cấy .62

3.2.Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ nốt lá mầm của các giống đậu tương

sau 14 ngày nuôi cấy .63

3.3.Ảnh hưởng của kinetin đến tái sinh chồi từ nốt lá mầm sau 14 ngày nuôi cấy 69

3.4.Ảnh hưởng của hàm lượng GA3 đến khả năng kéo dài chồi của một số giống

đậu tương (sau 30 ngày nuôi cấy) 75

3.5.Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của một số giống đậu tương

(sau 30 ngày nuôi cấy) 77

3.6.Biểu hiện nhuộm GUS của mẫu lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens 81

3.7.Kết quả chuyển gen Atore1 vào cây Arabidopsis thaliana thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 92

3.8.Kết quả chọn lọc cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 92

3.9.Đặc điểm hình thái và sinh trưởng ở cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 thế hệ T 1 .94

3.10.Hình thái lá của cây Arabidopsis thaliana chuyển gen Atore1 thế hệ T 2 .96

3.11.Kết quả nuôi cấy tạo vật liệu biến nạp gen .100

3.12.Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biến nạp gen .104

3.13.Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng biến nạp gen .105

3.14.Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biến nạp gen .106

3.15 Ảnh hưởng của PPT đến khả năng chọn lọc chồi chuyển gen ở cây đậu tương 107

3.16.Kết quả chọn lọc và tái sinh cây đậu tương chuyển gen Atore1 109

3.17.Kết quả đưa cây đậu tương chuyển gen T 0 ra trồng 110

3.18.Kết quả sàng lọc cây đậu tương chuyển gen T 0 ngoài đồng ruộng 112

3.19.Kết quả đánh giá sơ bộ cây đậu tương chuyển gen thế hệ T 0 .113

3.20.Đánh giá hiện diện gen ở cây đậu tương chuyển gen T 0 bằng PCR 113

3.21.Kết quả phân tích hiện diện của gen bằng PCR ở T 1 .116

3.22.Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây đậu tương chuyển gen Atore1

thế hệ T 1

117 3.23.Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển gen Atore1 thế hệ T 1 .118

3.24 Kết quả chọn lọc các cây đậu tương chuyển gen Atore1 thế hệ T 2 bằng thuốc

diệt cỏ Basta 120

3.25.Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng cây chuyển gen Atore1 thế hệ T 2 120 3.26.Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển gen Atore1 thế hệ T 2 .121

3.27 Kết quả sàng lọc dòng đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử ở thế hệ T 2

124 3.28 Kết quả sàng lọc dòng đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử ở thế hệ T 3

125 3.29 Đặc điểm sinh trưởng bộ lá của các dòng đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử T 3 .1273.30.Hàm lượng diệp lục của các cây đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử T 3

127 3.31 Kết quả tách chiết DNA tổng số 128

3.33 Một số yếu tố cấu thành năng suất của dòng đậu tương chuyển gen Atore1

đồng hợp tử .131

DANH MỤC HÌNH

1.1.Một số vật liệu nuôi cấy trong nuôi cấy mô đậu tương 10

1.2.Diện tích cây trồng CNSH toàn cầu năm 2019 [10] 29

1.3.Dòng đậu tương chuyển gen GmBS1 tăng kích thước hạt [116] 35

1.4 Kiểu hình của cây chuyển gen kìm hãm già hóa lá ore1 và cây đối chứng (wild

type) sau 50 ngày nảy mầm [122] 39

2.1.Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương từ nốt lá mầm 48

2.2.Vùng T-DNA của vector pCAMBIA3301 mang gen Bar và GUS , điều khiển

bởi promoter 35S .49

2.3.Sơ đồ tổng quát mô tả quá trình chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana 55

3.1.Một số hình ảnh thực hiện các bước tiến hành thí nghiệm 74

3.2.Nuôi cấy tạo đa chồi ở một số giống đậu tương nghiên cứu .74

3.3.Ảnh hưởng của IBA (1,0mg/l) đến khả năng ra rễ ở giống ĐT26 sau 3 tuần nuôi cấy 78

3.4.Biểu hiện gen GUS và tái sinh cây chuyển gen .79

3.5.Hình vẽ mô phỏng cấu trúc vector pBS nhân dòng gen Atore1 87

3.6.Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gen Atore1 bằng PCR và enzyme cắt giới hạn

87 3.7 Kết quả giải trình tự gen tách dòng Atore1 và so sánh với trình từ gen At5g39610

bằng phần mềm BioEdit Vị trí mũi tên trên hình chỉ đoạn chèn thêm của gen Atore1 trên vùng mã hóa của gen At5g39610 88

3.8.Hình vẽ cấu trúc vector chuyển gen Atore1 90

3.9.Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gen Atore1 bằng PCR và enzyme cắt giới hạn

90 3.10.Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen Atore1 ở cây

Arabidopsis chuyển gen thế hệ T 1 .93

3.11.Hình thái lá của cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T 1 .95

3.12.Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen Atore1 ở cây

Arabidopsis chuyển gen thế hệ T 2 .96

3.13.Biểu đồ so sánh hàm lượng diệp lục (chlorophyll) giữa cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 và cây Arabidopsis đối chứng Col-wt ở giai đoạn thu hoạch 983.14.Hạt đậu tương nảy mầm và mẫu biến nạp .1013.15.Vi khuẩn mang gen được nuôi trải trên môi trường LB (A) sau đó đượcchuyển sang môi trường LB lỏng để thu tế bào Tế bào vi khuẩn được hòa tan bằngmôi

trường CCM lỏng (B) để sử dụng cho biến nạp gen .1023.16.Chọn lọc chồi chuyển gen sau 14 ngày trên môi trường SIM PPT 10mg/l 1083.17.Một số hình ảnh mẫu biến nạp gen sau 5 ngày trên môi trường đồng nuôi cấy CCM 108 3.18.Một số hình ảnh cây đậu tương chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM chứakháng sinh 10mg/l PPT 109 3.19.Hình ảnh cây đậu tương chuyển gen trên môi trường ra rễ RM .1103.20.Cây đậu tương chuyển gen Atore1 thế hệ T 0 giai đoạn cảm ứng trong phòng nuôi 111 3.21.Hình ảnh sàng lọc cây đậu tương chuyển gen sau 3 ngày bằng thuốc diệt cỏ Basta 112 3.22.Kết quả phân tích PCR cây đậu tương chuyển gen Atore1 thế hệ 0 T 1143.23.Kết quả chọn lọc đậu tương chuyển gen T 1 bằng thuốc diệt cỏ Basta 1143.24.Kết quả phân tích biểu hiện của gen chọn lọc Bar bằng PCR của các cây đậu tương chuyển gen 1 T 115 3.25 Kết quả phân tích biểu hiện gen Atore1 của các cây đậu tương chuyển gen

T

1 . 116

3.26.Kết quả lai Southern của các dòng đậu tương mang gen Atore1 thế hệ T 1 .1193.27.Biểu hiện kết quả chọn lọc cây đậu tương chuyển gen T2 bằng thuốc diệt cỏ Basta 119 3.28.Kết quả phân tích PCR các cây đậu tương chuyển gen Atore1 thế hệ T 2 .1223.29.Kết quả lai Southern của các dòng đậu tương mang gen Atore1 và thế hệ T 2 .123 3.30.Hình ảnh sàng lọc các dòng đậu tương chuyển gen Atore1 thế hệ T bằng 2 thuốc diệt

cỏ Basta 124 3.31.Kết quả sàng lọc dòng đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử ở thế hệ T 3

bằng thuốc diệt cỏ Basta 1263.32.Hình thái cây đậu tương mang gen Atore1 đồng hợp tử giai đoạn thu hoạch so với cây đậu tương không chuyển gen (Đ/c) 127 3.33.Kết quả phân tích biểu hiện của gen chọn lọc Bar bằng PCR của các cây đậu tương chuyển gen 3 T 128 3.34.Hình thái cây đậu tương mang gen Atore1 đồng hợp tử giai đoạn thu hoạch so với cây đậu tương không chuyển gen (Đ/c) 129 3.35.Kết quả lai Southern của các dòng đậu tương mang gen Atore1 đồng hợp tử .129 3.36 Kiểu hình tuổi thọ của lá ở các dòng đậu tương Atore1 ở giai đoạn thu hoạch R8 135

3.37.Năng suất hạt của dòng đậu tương biểu hiện Atore1 đột biến 136

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] được xếp vào cây trồng nông nghiệp

quan trọng nhất Hạt đậu tương được xếp trong 8 loại hạt có dầu có giá trị kinh tế vànhu cầu sử dụng cao, được sản xuất và giao dịch phổ biến trên thj trường quốc tế[10], [46] Ở Việt Nam, đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng quan trọng thứ basau lúa và ngô Đồng thời Việt Nam có nguồn gen đậu tương rất phong phú, riêngtại vùng miền núi phía Bắc, nơi sản xuất đậu tương lớn của cả nước (chiếm khoảnghơn 65% diện tích), hiện có nhiều nguồn gen bản địa quý như giống đậu tươngSông Mã, Cúc Hà Bắc, Cọc Chùm Cao Bằng, Vàng Mường Khương, đậu tươngHữu Lũng, đậu tương hạt vàng Lạng Sơn… Các giống này có khả năng chống chịutốt với điều kiện ngoại cảnh, nhưng năng suất thấp [2], [3]

Một thực tế ở Việt Nam hiện nay là: trong khi nhu cầu sử dụng hạt đậu tươngngày càng cao thì diện tích trồng đậu tương của Việt Nam ngày cang giảm Theobáo của Bộ NN&PTNT diện tích và sản lượng đậu tương của Việt Nam liên tụcgiảm dần qua các năm: năm 2010, diện tích trồng đậu tương là 197.800 ha, đến năm

2021 chỉ còn khoảng 37.000 ha, diện tích giảm hơn 75% và sản lượng giảm trên70% so với năm 2010 Nguyên nhân của việc giảm nhanh về diện tich sản xuất là docây đậu tương bị sâu bệnh phá hoại nặng, việc áp dụng tiến bộ kỹ thuật chậm hơn sovơi các cây trồng khác, vì vậy năng suất đậu tương rất thấp chỉ đạt khoảng 1,5tấn/ha (bằng 50% năng suất của thế giới) Thực trạng đó dẫn đến việc Việt Namthiếu hụt 3,5 - 5,0 triệu tấn đậu tương/năm, trở thành nước nhập khẩu đậu tươngrấtlớn với kim ngạch 2

- 3 tỉ USD/năm, gần tương vơi giá trị xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam hiện nay.Thực tế trên cho thấy, để phát triển sản xuất đậu tương, Việt Nam cần đầu tư đẩymạnh nghiên cứu tạo các giống đậu tương có năng suất và chất lượng cao phổ biếncho sản xuất [2], [3], [46]

Ứng dụng công nghệ sinh học trong công tác chọn tạo giống cây trồng nóichung và cây đậu tương nói riêng là hướng mới và hiệu quả ở các quốc gia nôngnghiệp trên thế giới Trong đó, chọn tạo giống bằng công nghệ chuyển gen để tạo

ra sản phẩm

cây trồng chuyển gen được ứng dụng phổ biến và rộng rãi, tạo ra các giống câytrồng có năng suất cao, chống chịu tốt với điều kiện biến đổi khí hậu giúp manglại lợi ích nhiều mặt về kinh tế, môi trường, xã hội và xóa đói giảm nghèo Tínhđến năm 2019, diện tích cây trồng chuyển gen đã lên đến 190,4 triệu ha ở 29 quốcgia, sản lượng tăng 94 lần (so với năm 1996 là năm đầu tiên cây trồng chuyển genđược thương mại hóa) trở thành ngành công nghệ phát triển nhanh nhất trong lịch

sử thế giới hiện đại Cây đậu tương là cây trồng chuyển gen được trồng ở nhiềuquốc gia, đến năm 2021 diện tích đậu tương chuyển gen lên đến gần 100 triệu ha,chiếm 50% tổng diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới, chiếm 78% diện tíchcanh tác đậu tương toàn cầu Các tính trạng phổ biến ở cây đậu tương chuyển genlà: kháng sâu, kháng, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao hàm lượng dầu [10]

Xu hướng hiện nay chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng và cây trồng nóichung đó là tiếp tục cải biến di truyền với các tính trạng chống chịu và nhất là cáctính trạng nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng Một trong những hướng chọntạo giống cho năng suất cao những năm gần đây được nhiều nhà chọn giống quantâm đó là kéo dài thời gian sinh trưởng của bộ lá bằng cách đưa gen xác định tínhtrạng “trẻ lâu” (juvenile trait) vào các giống chín sớm thông qua lai tạo hoặc cảibiến di truyền bằng chuyển gen/chỉnh sửa gen [48], [51]

Năm 1996, tác giả Oh và cs đã sàng lọc hơn 25.000 dòng đột biến cây

Arabidopsis và phát hiện 5 dòng gen đột biến của gen ORE1 (lần lượt được đặt tên

là: ore 1, 2, 3, 9 và 11) có biểu hiện kéo dài tuổi thọ của bộ lá [105] Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy: dòng Arabidopsis đột biến ore1 có hàm lượng diệp lục cao hơn 30% so với đối chứng, kết quả là bộ lá dòng ore1 có tuổi thọ dài hơn so với, các cây

đối chứng là 15 - 30 ngày [71], [123] Năm 2015, trường Đại học Đông A (Hàn

Quốc) đã thành công trong việc chuyển gen Ore1 vào cây lúa, kết quả là làm tăng

tuổi thọ của bộ lá nhất là bộ lá đòng, lá giữ được màu xanh ngay cả khi hạt đã chín,

vì thế đã làm tăng năng suất lúa 15 - 25%

Trên cơ sở những kiến thức hiểu biết trước đó, chúng tôi đã xác định hướng

nghiên cứu chuyển gen ore1 vào cây đậu tương và tiến hành thực hiện luận án

“Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương

(Glycine max (L.) Merr.)” Kết quả của đề tài có ý nghĩa quan trọng, góp phần

phát triển kỹ thuật cải biến di truyển tạo ra các giống đậu tương có năng suất caophục vụ sản xuất

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu chuyển gen tạo các dòng đậu tương mang gen kìm hãm già hoá

của bộ lá (gen Atore1) theo hướng nâng cao năng suất hạt trên giống đậu tương của

Việt Nam

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Đánh giá được khả năng tái sinh và khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương Việt Nam phục công tác chuyển gen

- Thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen đích (gen Atore1) có khả

năng nâng cao năng suất hạt thông qua việc kéo dài tuổi thọ của bộ lá ở cây đậu tương

- Tạo được các dòng đậu tương chuyển gen mang gen đích Atore1 và bước

đầu đánh giá được biểu hiện của gen ở các dòng đậu tương chuyển gen

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả của luận án là tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật di truyền hiện đại(chuyển gen, chỉnh sửa gen) nhằm tạo ra các giống đậu tương có năng suất cao hơn,

có khả năng chống chịu tốt hơn

- Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học và thực tiễn cho việchoàn thiện kỹ thuật tái sinh các giống đậu tương cho chuyển gen, thiết kế vectorchuyển gen, chuyển gen, sàng lọc đánh giá cây chuyển gen; xây dựng cơ sở phươngpháp luận đánh giá chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử có kiểu gen ổn định đểchọn lọc giống đậu tương chuyển gen ở Việt Nam

- Kết quả nghiên cứu của luận án có giá trị làm tư liệu, tài liệu cho giảng dạy,nghiên cứu sâu hơn về chuyển gen ở cây đậu tương nói riêng và ở cây trồng nói

chung Bổ sung phương pháp luận về chuyển gen và chọn lọc dòng chuyển genđồng hợp tử.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo được các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1, T2, tạo được một số

dòng chuyển gen Atore1 đồng hợp tử thế hệ T3 có tuổi thọ của bộ lá kéo dài hơn vàcho năng suất cao hơn giống đối chứng không chuyển gen

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây mô hình Arabidopsis thaliana.

30 giống đậu tương của Việt Nam (bao gồm các giống trồng canh tác và cácgiống địa phương), 02 giống đậu tương mô hình là Kwangan (KW) và William82

4.2 Phạm vi, thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính(nhà lưới) tại Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại họcNông lâm, Đại học Thái Nguyên trong thời gian từ năm 2019 - 2022

5 Những đóng góp mới của luận án

- Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu về chuyển gen nâng cao năngsuất ở cây đậu tương thông qua việc kéo dài tuổi thọ của bộ lá ở Việt Nam Luận ánnghiên cứu có tính hệ thống về đặc điểm tái sinh phục vụ chuyển gen, thiết kếvector, tạo các dòng đậu tương chuyển gen và đánh giá biểu hiện của gen, cung cấpphương pháp luận về chọn dòng chuyển gen đồng hợp tử

- Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở khoa học để xây dựng cơ sở dữliệu và phương pháp luận về nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen ở cây đậu

tương Trong đó, tối ưu hóa được các điểu kiện tái sinh in vitro và lựa chọn được

các giống đậu tương thích hợp cho tái sinh là: ĐT22, VX93, ĐVN11, ĐVN9,ĐVN6, ĐVN5, ĐVN10, ĐT26

- Nhân dòng thành công gen Atore1, thiết kế thành công cấu trúc vector chuyển gen pER8-Atore1 mang gen kìm hãm già hóa bộ lá Atore1, thử nghiệm trên cây mô hình Arabidosis cho thấy vector và gen hoạt động tốt, sẵn sàng cho việc

chuyển gen

vào cây đậu tương Kết quả thiết kế vector là cơ sở lý luận để thiết kế hệ thốngvector chuyển gen cho đối tượng thực vật nhằm nâng cao việc ứng dụng kỹ thuật ditruyền hiện tại và tương lai.

- Thành công trong việc tạo được cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0, T1, T2

và T3, sử dụng chất chỉ thị, phân tích PCR, phân tích biểu hiện hình thái, phân tíchSouthern để sàng lọc cây chuyển gen qua các thế hệ Nhất là đã thành công trongviệc chọn lọc được 02 dòng chuyển gen đồng hợp tử thế hệ T3, ổn định về kiểu gen,

có tuổi thọ của bộ lá dài hơn từ 17 - 22 ngày so với đối chứng và có năng suất caohơn đối chứng không chuyển trên trên 18% Việc thành công trong chọn lọc đượcdòng đồng hợp tử ở thế hệ thứ 3 (T3) là cơ sở khoa học có tính thuyết phục caotrong việc hướng đến chọn thành giống đậu tương chuyển gen

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu tương được trồng khắp các châulục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ và chiếm tỷ lệ tới 87,4 %, tiếp đến làChâu Á với 8,5 % tổng diện tích đậu tương trên thế giới từ năm 2012 - 2021 [46].Trong những năm gần đây, diện tích trồng, sản lượng và năng suất đậu tương đều cónhững biến động nhất định Cụ thể, giai đoạn 2012 - 2021 diện tích đậu tương tăngđều từ 105,35 triệu ha đến 129,06 triệu ha Sản lượng cũng tăng đều từ 241,18 triệutấn đến 364,06 triệu tấn kéo theo sự tăng năng suất từ 22,89 tạ/ha đến 28,21 tạ/ha.Năm 2020 và 2021, năng suất và diện tích đậu tương tiếp tục tăng nhẹ, đạt sảnlương cao nhất năm 2021 là 364,06 triệu tấn [46] Số liệu được thu thập và trình bàytrong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây

Sản xuất đậu tương tập trung ở các quốc gia có ưu thế về sản xuất nôngnghiệp, 12 quốc gia đứng đầu trên thế giới có sản lượng hàng năm trên 1 triệu tấn.Đứng đầu là Brazil (trên 121 triệu tấn năm 2021), tiếp đó là Mỹ, Argentina vàTrung Quốc Trong số 12 quốc gia đứng đầu thế thế giới về sản xuất đậu tương có 4quốc gia là Brazil, Mỹ, Trung Quốc và Nga có sản lượng ổn định và liên tục tăngtrong 5 năm trở lại đây (Bảng 1.2) [46].

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tương của một số nước đứng đầu trên thế

giới trong những năm gần đây (sản lượng trên 1 triệu tấn)

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Tại Việt Nam, đậu tương là cây trồng quan trọng thứ ba sau cây lúa và ngô.Song diện tích gieo trồng ngày càng giảm, không đáp ứng được nhu cầu của ngànhcông nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản và công nghệ ép dầu

do giống bản địa năng suất thấp, giống nhập ngoại năng suất cao nhưng không cónhững đặc tính nổi trội của giống bản địa, giá bán không cao so với các cây côngnghiệp khác Nhìn chung, diện tích đậu tương Việt Nam không ổn định, sản xuấtnội địa mới chỉ đủ cung cấp cho khoảng 8 - 10% nhu cầu Tính đến năm 2021, diệntích trồng trên cả nước giảm mạnh chỉ còn 37,3 nghìn ha, giảm hơn 3 lần so vớinăm 2012 [2], [3]

Bảng 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2012 - 2021

ha và sản lượng giảm còn 60,2 nghìn tấn Tuy nhiên, từ bảng số liệu thống kê cũngcho thấy năng suất hàng năm của cây đậu tương tương đối ổn định và có chiều

hướng tăng nhẹ

từ 14,5 tạ/ha (năm 2012) lên 15,7 tạ/ha (năm 2020) và 16,1 tạ/ha (năm 2021) song

so với thế giới Việt Nam vẫn là nước có năng suất thấp, chỉ bằng 65% năng suấttrung bình của thế giới [2]

Bảng 1.4 Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2020 - 2022

Nguồn: Bộ Công thương

Dựa trên số liệu Bảng 1.4 cho thấy, nhu cầu tiêu thụ đậu tương tại Việt Namtương đối cao, trong khi đó sản xuất trong nước mới đáp ứng được một phần nhỏ nhucầu nội địa chủ yếu để chế biến sữa đậu nành và một số loại thực phẩm khác, có đến90% là nhập khẩu để phục vụ sản xuất dầu ăn và chế biến thức ăn chăn nuôi Năm

2014, cả nước nhập khẩu hơn 1,5 triệu tấn đậu tương, đến năm 2022 nước ta vẫn phảinhập khẩu hơn 4,9 triệu tấn với chi phí hơn 2,7 tỷ USD để phục vụ cho công nghiệpchế biến, sản xuất dầu ăn và thức ăn chăn nuôi Chính vì vậy, việc tăng năng suất vàsản lượng đậu tương là rất cần thiết Tuy nhiên, thực tế sản xuất đậu tương ở nước

ta còn gặp nhiều khó khăn, bên cạnh tình hình giá phân bón, thuốc trừ sâu tăng cao

và sâu bệnh diễn biến phức tạp còn thiếu nguồn giống tốt cho sản xuất [3].

1.2 Tổng quan về nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương trên thế giới

1.2.1 Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở cây đậu tương

1.2.1.1 Vật liệu sử dụng trong tái sinh in vitro ở cây đậu tương

Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây đậu tương in vitro cho thấy, vật liệu

được sử dụng khá đa dạng và phong phú bao gồm trụ dưới lá mầm - hypocotyl [80],

lá mầm

- cotyledon, nốt lá mầm (cotyledon node) [80], [112], trụ trên lá mầm (epicotyl)[73], [80], sử dụng một nửa lá mầm (half-seed), chồi ngọn (shoot tip) (Hình 1.1)[29], [56] Tùy vào điều kiện, môi trường nuôi cấy và đặc điểm giống để có thể sử

dụng các mẫu nuôi cấy khác nhau cho tái sinh in vitro cây đậu tương Hiện nay, để

tái sinh đậu tương cho chuyển gen, các nhà nghiên cứu chủ yếu sử dụng mẫu nửa lámầm, trụ dưới hoặc trụ trên của lá mầm

Hình 1.1 Một số vật liệu nuôi cấy trong nuôi cấy mô đậu tương

A: Trụ trên lá mầm; B: Lá mầm; C: Trụ dưới lá mầm; D: Chồi

ngọn; E: Nốt lá mầm [56]

1.2.1.2 Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương

Phát sinh phôi soma là một kỹ thuật quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật

Ưu điểm chính của phương pháp này là sự phát triển của phôi soma bắt chước phôihợp tử và nếu được bao bọc, sẽ giống như hạt giống (hạt nhân tạo) Tuy nhiên, một

số loài có các tế bào tiền phôi được xác định, nên dễ phát triển phôi in vitro, một số loài vẫn chưa có phương pháp hình thành phôi soma in vitro Các nghiên cứu cho

thấy đậu tương phản ứng thuận lợi đối với việc tạo phôi soma (thông qua mẫu cấy lámầm) và có thể được khai thác một cách thích hợp cho quá trình tạo phôi Ở cácgiống đậu tương khác nhau, sự hình thành phôi soma có khác nhau về yêu cầu môitrường với từng kiểu gen Chao Yang và cs cho rằng các kiểu gen đậu tương khácnhau yêu cầu nồng độ đường sucrose khác nhau (môi trường MS biến đổi vớivitamin B5) để phát triển phôi soma hiệu quả [31] Tương tự, các giống đậu tương

trồng ở các địa điểm khác nhau phản ứng khác nhau đối với in vitro để phát triển

phôi soma thông qua nuôi cấy mầm hạt Do đó, sự phát triển của phôi soma thay đổitheo các kiểu gen khác nhau và các dòng khác nhau phải được sàng lọc để phát triểnphôi soma hiệu quả Mặc dù

quá trình tạo phôi soma cung cấp một số ứng dụng, nhưng khó khăn trong việc sửdụng phôi soma là tỷ lệ thành công không cao Thông thường, chỉ có một số phôisoma phát triển thành cây con hoàn chỉnh Nguyên nhân là do tương tác giữa kiểugen và môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển phôi Tác giả Birch vàCollinson đã chỉ ra rằng nếu phôi soma đậu tương được xử lý bằng một lượng axitabscicic thích hợp thì sẽ dẫn đến cải thiện sự phát triển và trưởng thành của phôi.Axit abscisic hoạt động như một hormone chống stress, giúp phôi vượt qua các điềukiện bất lợi và đảm bảo sự hình thành cây con tốt hơn khi điều kiện thích hợp [26],[37], [72],

Phôi soma có khả năng phát sinh cả chồi, rễ và hình thành cây hoàn chỉnhkhi tái sinh Mặc dù quá trình phát sinh phôi vô tính đã được báo cáo ở một sốphòng thí nghiệm nhưng hầu hết các quy trình này khi tiến hành các thử nghiệmchuyển gen ban đầu đã không thành công [31, [34], [77], [113] Năm 1988, FinerJ.J đã xây dựng thành công một hệ thống phát sinh phôi soma từ nốt lá mầm cònnon ở cây đậu tương khi ông nuôi cấy mẫu trên môi trường có chứa nồng độ 2,4Dcao (40mg/l) Phôi vô tính được nhân lên khi nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc môitrường dạng lỏng huyền phù có nồng độ 2,4D thấp hơn [50] Phân tích hình thái vàquan sát sự sinh trưởng của phôi cho thấy hầu hết những phôi soma mới đều đượcsinh ra từ bề mặt phôi ban đầu hoặc cạnh đó có dạng hình cầu, màu xanh sáng [49],[50] Khi cấy chuyển những phôi này sang môi trường MS (Murashige and Koog)không có chất kích thích sinh trưởng thu được cây con tái sinh hoàn chỉnh Với hệthống này, phôi mới sinh ra được sử dụng là mô thích hợp cho chuyển gen [48]

Việc phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương cũng được ứng dụng

trong bảo tồn, lưu giữ và ứng dụng các kỹ thuật di truyền ở cây đậu tương

1.2.1.3 Phát sinh cơ quan thông qua mô sẹo trong tái sinh in vitro cây đậu tương

Phát sinh cơ quan (chồi/rễ ) từ mẫu cấy thông qua giai đoạn mô sẹo (callus)Trong phương pháp này, mẫu cấy đầu tiên được kích thích để tạo ra callus, sau đó

được định hướng để tạo thành cơ quan biệt hóa (chồi, rễ ) và được phát triển thànhcây con hoàn chỉnh.

Lợi ích của phương pháp này bao gồm việc nhân nhanh giống cây trồng vàphát triển các giống mới bằng các biến dị dòng soma Các biến dị này là do điều

kiện nuôi cấy in vitro cung cấp cho các tế bào chưa biệt hóa, tạo ra các biến dị di

truyền trong các mô tái sinh Giống được phát triển như vậy cũng dễ dàng đượcchấp nhận vì nó không liên quan đến thao tác gen ngoại lai Đối với cây đậu tương,một số nghiên cứu đã được thực hiện để sản xuất cây con qua trung gian mô sẹo.Nhóm tác giả Liu và cs đã nghiên cứu hiệu quả của hạt từ phôi trên cây tái sinh từ

mô sẹo và tạo phôi trên môi trường MS có chứa BAP, NAA và cho rằng bên cạnhviệc ứng dụng chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh, hàm lượng IAA và polyaminenội sinh trong mẫu đậu tương rất quan trọng trong việc xác định hiệu quả của cảm

ứng mô sẹo và sự phát triển trong in vitro [82] Bên cạnh mẫu cấy non, lá mầm và

phôi trưởng thành cũng đã được sử dụng để tái sinh mô sẹo ở đậu tương [81] Nuôicấy lá đậu tương cũng đã được dùng để phát triển các giống đậu tương chịu mặnthông qua nuôi cấy mô sẹo trung gian Wada và cs đã tạo ra các giống đậu tươngchịu mặn trên môi trường được bổ sung tới 0,1% NaCl, họ cũng chỉ ra rằng stress

do muối có thể được giảm bớt bằng cách bổ sung CaCl2 trong môi trường nuôi cấy[79] Nghiên cứu thử nghiệm này có thể hữu ích trong việc tạo ra các giống đậutương chịu mặn và có thể được thử nghiệm thêm trên đồng ruộng về năng suất trongđiều kiện tự nhiên Lá được coi là mẫu cấy thích hợp vì có thể cung cấp các tế bàođồng nhất để phân hóa và nhân giống Wright và cs đã thiết lập quy trình tạo câyđậu tương hoàn chỉnh có thể được phát triển từ các đoạn lá nhỏ của cây mẹ, trong

đó sử dụng tuần tự môi trường MS và môi trường B5 có bổ sung các chất điều hòasinh trưởng thực vật khác nhau [130]

1.2.1.4 Phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việc hình thành mô sẹo)

Phát sinh cơ quan trực tiếp là sự phát sinh cơ quan chồi/rễ từ mẫu cấy khôngqua mô sẹo Các đốt thân được sử dụng phổ biến nhất để tạo mẫu cấy chồi không có

mô sẹo và phát triển thành các cây con là dòng vô tính của cây mẹ [81] Trongphương pháp này, các chồi nách được kích thích hình thành từ các đoạn có đốt thân

và được nhân lên thành các bản sao giống hệt nhau về mặt di truyền của cây mẹ.Tác giả Hitoshi và cs đã nhân giống hàng loạt cây đậu tương bằng cách sử dụng cácđoạn đốt thân Họ đã sử dụng dung dịch natri hypochlorite để khử trùng bề mặt mẫu

và môi trường MS, BAP và IBA để kích thích sự hình thành nhiều chồi Tuy nhiên,các mẫu cấy cần được thu thập từ các cây mẹ khỏe mạnh và cấy mẫu ngay sau khi

xử lý vào môi trường nuôi cấy, việc phát sinh cơ quan trực tiếp không qua mô sẹophụ thuộc rất nhiều vào kiểu gen (tùy từng giống) mà môi trường nuôi cấy [126]

Việc hình thành các bộ phận cơ quan trực tiếp không qua mô sẹo, quan trọngnhất là quá trình phát hình thành và phát triển chồi Chồi hình thành từ một khối môkhác nhau được tách ra để tạo rễ và hình thành cây mới Để biến nạp, gen ngoại laicần được chuyển vào mô phân sinh chồi hoặc các khối mô có khả năng tái sinhchồi Phát sinh hình thái chồi ở đậu tương, lần đầu tiên được Wright và cs báo cáonăm 1986, sử dụng nốt lá mầm của cây mầm làm mẫu cấy; Barwale và cs (1986) sửdụng nốt lá mầm của hạt non Khi nuôi cấy trên môi trường có chứa BAP chồi đượchình thành từ lớp mô biểu bì dưới (subepidermal tissue) Ưu điểm chính của phươngpháp này là chồi được nhân lên và có thể hình thành rễ dưới 3 tháng Trong khi đó,phương pháp phôi vô tính phải mất 4 tháng hoặc hơn nữa Trụ dưới (hypocotyl) vàtrụ trên (epicotyl) lá mầm của cây đậu tương cũng được sử dụng để tái sinh trựctiếp thành cây hoàn chỉnh [47], [125], tạo phôi vô tính [81] và tạo cây chuyển gen[61], [100]

1.2.1.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đến khả năng tái sinh đậu tương

Môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng tái sinh đậutương Tuy nhiên, mức phản ứng với điều kiện môi trường còn tùy thuộc kiểu gen

và nguồn vật liệu Do đó, cần nghiên cứu điều kiện môi trường nuôi cấy cho đậutương phù hợp với từng giống và từng giai đoạn

Bảng 1.5 Một số môi trường tái sinh cây đậu tương in vitro

1 Nuôi cấy hạt/phôi

Môi trường MS Shan và cs (2005); Vural (2010); Phat và cs

(2015); Rathod và cs (2017); Begum và cs (2019)Môi trường B5 Kim và cs (1990); Younessi và cs (2015); Sojkova

và cs (2016); Raza và cs (2017)Kết hợp môi trường MS và B5 Zia và cs (2010); Mariashibu và cs 2013; Soto và

cs, 2013

2 Phát sinh phôi soma/các cơ

quan

MS bố sung BAP, NAA, IBA Bonacin và cs (2000)

MS bổ sung 2,4-D, BAP và IBA Branch và cs (2002)

Môi trường MS Loganathan và cs (2010)

MS bổ sung 2,4 D, NAA, BAP

MS bổ sung BAP, NAA và IBA Islam và cs (2017)

Nguồn: Singh và cs (2020) [126] Trong nuôi cấy mô đậu tương, pH môi trường thường sử dụng là 5,8, môi

trường thích hợp cho giai đoạn gieo hạt là môi trường ½ MS bổ sung BA Các tácgiả đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA khác nhau đến khả năng nảy mầm vàkết luận nồng độ BA = 1mg/l cho kết quả tốt nhất Hạt được gieo trong điều kiện16h sáng 8h tối dưới ánh sáng huỳnh quang, nhiệt độ 240C trong 7 ngày Islam và

cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của BA và 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở chồi ngọn

và nốt lá mầm đậu tương Thí nghiệm cho thấy môi trường MS bổ sung 2,5mg/lBAP + 0,5mg/l 2,4D cho tỷ lệ phát sinh callus cao nhất (76,60%) Kết quả cũng chothấy tỷ lệ phát sinh callus của chồi ngọn cao hơn có ý nghĩa so với nốt lá mầm

[56], [61]

Begum và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D, NAA, BA đến khả năng tạo môsẹo Môi trường thích hợp nhất là MS + 3,32mg/l 2,4D và MS + 1,5mg/l BAP (tỷ lệ100%) Môi trường phát sinh chồi sử dụng BA và NAA cho kết quả tốt nhất MS +2,5mg/l BAP + 1,0mg/l NAA (tỷ lệ 79,4%, chồi cao 5,32cm) [29] Theo Hu CY và

cs, môi trường MS + 1mg/l BA thích hợp nhất cho tái sinh chồi Hu CYvà cs cũngchỉ ra rằng chồi chỉ phát sinh trong môi trường có nồng độ BA từ 5 - 10µM/l(khoảng 1 - 2mg/l), ở nồng độ cao hơn 10µM/l 35 chồi không hình thành [59] Điềunày phù hợp với những nghiên cứu của Sairam và cs [127] Sau khi callus phát sinhchồi, chồi được chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM), môi trường phù hợp làmôi trường MS bổ sung 0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3, 1mg/l ZR trong 14 ngày [85]

1.2.2 Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thế giới

1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Đây là phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium như một vector sinh

học để biến nạp một phần DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả là tạo được

cây biến đổi gen Agrobacterium xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vết thương.

Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chất phenol, hợp chất này sẽ dẫn dụ vi

khuẩn Agrobecterium biểu hiện gen vùng vir Kết quả biểu hiện của gen Vir, sợi

đơn T- DNA sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật Vấn đề chính củaphương pháp chuyển gen này là sự kết hợp giữ tế bào chủ với vector tương ứng[57]

Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để lâynhiễm với vi khuẩn cho tới khi Pederson và cs chứng minh đậu tương là vật chủthích hợp với loại vi khuẩn này [38], [115] Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn bịkiểm soát bởi yếu tố về giống [41], [96], [110], [113] Mặt khác, khả năng thu đượccác chồi chuyển gen từ những khối mô có khả năng tái sinh như phôi vô tính và nốt

lá mầm ban đầu rất thấp Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiềunghiên cứu nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trò xúc tác như

acetosyringone để kích thích sự biểu hiện của gen Vir, L-cystein, hoặc sử dụng các

chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [109], xác định các yếu tố ảnh hưởngđến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm, nghiên cứu cải tiến nốt lá mầm làmvật liệu biến

nạp, kết hợp lây nhiễm với tái sinh [110] Vấn đề khác khi sử dụng vi khuẩn

Agrobacterium còn phụ thuộc vào chủng khuẩn, số lượng bản DNA copy được tổng

hợp trong hệ gen thực vật, pH môi trường, mức độ gây tổn thương của mẫu Tráingược với các phương pháp chuyển DNA trực tiếp có thể cho kết quả với số bảncopy nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khuônmẫu không được kiểm soát [110], [114]

Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp nốt

lá mầm sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm trung gian được báo cáo vào năm

1988 [55] Nốt lá mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng vi khuẩn

Agrobacterium mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate Mẫu

được nuôi cấy trên môi trường có chứa BAP để cảm ứng tạo chồi, kanamycin cùngvới các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lượng vi khuẩn còn lại sau khi đồngnuôi cấy Sau một vài tháng, cây con được tái sinh và được kiểm tra thông qua sự

biểu hiện của gen gus hoặc khả năng kháng glyphosate Chỉ 6% tổng số chồi lựa

chọn được chuyển gen Tám cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng

có một sợi DNA chèn vào Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báocáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương khi

được lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium thích hợp.

Nhóm tác giả Townsend và Thomas đã sử dụng quy trình tương tự và thuđược cây chuyển gen từ giống Pioneer 9341 Các yếu tố quan trọng giúp họ thànhcông đó là: (1) sử dụng chất acetosyringone; (2) giới hạn nhiệt độ giai đoạn đồngnuôi cấy được kiểm soát trong khoảng 18 - 280C; (3) mật độ tế bào vi khuẩn lâynhiễm từ 108 đến 3x109/ml; (4) sử dụng axit pyroglutamic để bổ sung vào trong môitrường tái sinh [130]

Vi khuẩn Agrobacterium và nốt lá mầm cũng được sử dụng để chuyển gen

tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pod Mottle (một loại vius lây bệnh đốm vỏ trênhạt đậu) vào đậu tương Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyểngen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu Phân tíchSouthern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây

R1 Khoảng 30% cây R2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu được xétnghiệm ELISA (Enzym-linked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng khánghoàn toàn với virus này Tính trạng hình thái không bị biến đổi so với thế hệ R1[91], [130].

Parrott và cs đã đưa ra phương pháp chuyển gen khác đó là sử dụng vi khuẩn

Agrobacterium lây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo phôi vô tính sau đó tái

sinh thành cây hoàn chỉnh Ba cây chuyển gen có chứa gen zein kích thước 15kD

được hình thành Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và khi phân

tích các cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa gen zein 15kD [113].

Gần đây, một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được

phát triển để biến nạp vi khuẩn Agrobacterium mang gen vào thẳng tế bào mô đích.

Kỹ thuật mới này gọi là SAAT (Sonicate Assisted Agrobacterium - media

transformation) [131] Sử dụng SAAT với nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi vôtính đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và không có hiện tương thể khảm Phươngpháp này có ưu điểm là thời gian nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với

Agrobacterium được rút ngắn Với kỹ thuật hiển vi điện tử quét, nhóm tác giả khám

phá ra SAAT, tạo ra những rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép

Agrobacterium dễ dàng đi vào mô đích mong muốn không giống như phương pháp

chuyển nạp gen khác Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng

đã làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan như: lá, nốt

lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện GUS tăng gấp

100 - 400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây vân sam trắng (whitespruce), lúa mì, ngô và đậu tương, đồng thời gen chuyển nạp tương đối ổn định quacác thế hệ Meurer và cs áp dụng phương pháp nêu trên ở 28 giống đậu tương, nhómtác giả cho rằng, để thực hiện thành công phương pháp SAAT thì cần khảo sát cácyếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mômong muốn Với phương phương pháp SAAT, chọn những cụm phôi có 10 - 20

phôi (đường kính 2 - 4 mm) được lây nhiễm với 1 ml dịch khuẩn Agrobacterium

trên môi trường lây nhiễm có 0,1mM acetosyringone mẫu được

chuyển lên môi trường chứa 400 mg timentin/l Hai tuần sau khi SAAT, chuyển môsang môi trường có 20 mg hygromycin/l và 400 mg timentin/l Những dòng chuyểngen được quan sát và phân lập khoảng 6 - 8 tuần sau khi SAAT Kỹ thuật này chohiệu quả chuyển gen cao hơn so với các phương pháp chuyển gen khác Mở ra một

hướng mới sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để biến nạp gen cho các mô đích khác

nhau [97], [131]

1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen

Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc của các hạt bọc DNA về phía tế bào thựcvật Nhờ có gia tốc lớn mà các hạt DNA có thể đâm xuyên qua thành tế bào vàmàng tế bào Bên trong tế bào, DNA được phân tách từ các hạt nhỏ và tổng hợp ởtrong hệ gen thực vật Ưu điểm của súng bắn gen là có thể loại bỏ các tác nhân sinhhọc không thích hợp, đặc biệt là với những loại mẫu không thích hợp với chuyển

gen bằng vi khuẩn Agrobacterium Phương pháp này cho phép chuyển trực tiếp gen

quan tâm vào mô phân sinh đỉnh của thực vật Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầuphải có dụng cụ, máy móc chuyên dụng có thể phân chia chính xác các hạt DNAsâu trong mô phân sinh đích [97] Báo cáo đầu tiên về chuyển gen bằng súng bắngen vào đậu tương sử dụng chồi phân sinh đỉnh làm mô đích được McCabe và cstiến hành năm 1988 Chồi đỉnh sau khi biến nạp được cảm ứng tạo đa chồi trước khitái sinh thành cây hoàn chỉnh Phân tích khối mô chuyển gen nhận thấy có các hạtnhỏ mang DNA và có sự tái tổ hợp DNA trong tế bào chủ [87], [97] Khả năng tổnghợp DNA trong tế bào được xem như biểu hiện của quá trình chuyển gen có hiệuquả [62]

1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung điện cho hiệu quả biến nạp khá cao đối với tế bào động vật.Fromm M và cs lần đầu tiên cho rằng có thể cải tiến phương pháp này để biến nạpgen vào thực vật, nhóm tác giả đã sử dụng kỹ thuật xung điện để chuyển gen vào tếbào trần của cây ngô và họ đã thu được cây ngô chuyển gen bền vững bằng phươngpháp này Cùng với các thí nghiệm thu được trên cây thuốc lá của nhiều tác giảkhác, phương pháp này đã được sử dụng để chuyển gen cho cây đậu tương [118],[52]

Tế bào trần đậu tương được xung điện đảm bảo mật độ 2 - 4 x 106 tế bào/mlmôi trường Kao bổ sung 40mM NaCl Một ml dung dịch huyền phù tế bào trầnđược hút cho vào cuvet 1,5ml và làm lạnh trong thời gian ngắn trên đá Dòng điệnxung phát ra từ các sợi bạch kim có khoảng cách 1cm Dòng điện này được cungcấp bởi một tụ điện 490µF (Sprague Power-lytic 36D, Marsh Electronics,Milwaukee, WI) và là nguồn cung cấp điện áp ổn định Điện thế được điều chỉnhbằng một vôn kế [54].

Chowrira và cs sử dụng phương pháp xung điện để biến nạp gen vào điểmsinh trưởng của cây mầm đậu tương Cây mầm 7 - 10 ngày được loại bỏ lá mầm,DNA được tiêm vào đỉnh chồi bằng hệ thống ống tiêm có chứa dung dịch lipofectin.DNA được chuyển vào bằng một dòng điện xung, cây sinh trưởng mà không cần tácnhân chọn lọc Quá trình này đã được thực hiện trên nhiều mô phân sinh và thuđược một vài thể khảm Đây là phương pháp tốt nhưng việc ứng dụng còn nhiều hạnchế [35]

1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn

Hầu hết các phương pháp chuyển gen hiện tại đều dựa trên cơ sở nuôi cấy

mô tế bào, nó đòi hỏi các tế bào chuyển gen phải được tái sinh thành cây [26] Pháttriển một hệ thống chuyển gen độc lập với nuôi cấy mô tế bào đã giành được nhiều

sự quan tâm của các nhà khoa học Cách tiếp cận này cho phép vượt qua rào cản vềkiểu gen của cây biến nạp vốn ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả chuyển gen Mặtkhác chi phí tài chính và thời gian chọn tạo sẽ được rút ngắn Phương pháp chuyểngen qua ống phấn lần đầu tiên được báo cáo thành công trên cây bông [35] Kỹthuật này sau đó được sử dụng để chuyển gen ở một số cây trồng như: ngô [33],bông [102], lúa [39], [87], đậu tương [138], dưa hấu [32] Một số báo cáo đã chỉ rarằng có thể chuyển gen vào đậu tương thông qua ống phấn, Meurer và cs đã sử dụngphương pháp này để tạo ra cây đậu tương và cây bông chuyển gen, nhóm tác giả đãthu được 50 hạt đậu tương, 226 hạt bông Nhưng tất cả đều cho kết quả âm tính khi

xử lý thuốc diệt cỏ [99]

Zenglu Li và cs đã thu được xấp xỉ 5.000 hạt đậu tương sau khi xử lý hoa

với DNA mang gen bar Khi kiểm tra tất cả các hạt thu được từ cây xử lý với DNA

có chứa gen bar đều không cho kết quả dương tính với gen này Quan sát hình thái

của

một vài cây thấy có sự khác nhau, nhưng hạt của chúng không có khả năng nảy

mầm Thí nghiệm khác với gen gus, nhóm tác giả thu được gần 2% số hạt của các cây được xử lý với DNA có chứa gen gus phản ứng dương tính với gen này khi

kiểm tra Tuy nhiên, khi cho hạt nảy mầm và tiến hành lấy lá phân tích thì không

thấy có sự hoạt động của gen gus 3% hạt thu từ các cây thế hệ sau được kiểm tra đều không thấy có biểu hiện của gus [137] Huixia Shou và cs tiến hành chuyển gen

vào 8 giống đậu tương, trong đó có giống mô hình Williams 82 bằng kỹ thuậtchuyển gen qua ống phấn, tuy nhiên kết quả đã không thành công như mong muốn[59] Nhiều báo cáo trước đây khi sử dụng phương pháp chuyển gen này cũng đềuchỉ ra một số hạn chế của phương pháp này [79], [102]

1.2.3 Các tính trạng được cải thiện thông qua chuyển gen ở cây đậu tương

Hiện nay, để đáp ứng nền nông nghiệp hiện đại thì kỹ thuật di truyền là hướngnghiên cứu chính được áp dụng trên nhiều cây trồng quan trọng như ngô, lúa, bông,đậu tương và đã thu được những kết quả rất khả quan Các gen quy định các đặc tínhquan trọng được đưa vào cây trồng và hầu hết các dòng chuyển gen này đã đượctrồng khảo nghiệm ngoài đồng ruộng, nhiều giống đã được thương mại hóa Đối vớicây đậu tương, một số đặc tính sau đã được cải thiện như kháng thuốc diệt cỏ, khángcôn trùng, chịu hạn, chín sớm, cải thiện chất lượng hạt hay giun tròn hại rễ

1.2.3.1 Đặc tính kháng thuốc diệt cỏ

Bằng công nghệ sinh học người ta đã có thể tạo ra những giống cây trồngkháng thuốc diệt cỏ, cho phép loại trừ được cỏ dại một cách chọn lọc Nhìn chung,sản xuất cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được tiến hành bằng việc chuyển gen mã hóaenzyme gây bất hoạt thuốc diệt cỏ vào cây trồng

Theo tác giả Lawton có khoảng 1.000 giống đậu tương kháng thuốc diệt cỏglyphosate đang được bán bởi hơn 200 công ty trên thế giới Monsanto, công ty giữbản quyền về giống đậu tương chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấynăm 1996 có khoảng 0,4 triệu hecta trồng đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997tăng lên 3,6 triệu hecta và năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta [75]

Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS),gen mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase (PAT) đã được chuyển vàocây đậu tương và tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏglyphosate/glufosinate.

Các giống đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate, Round up

và imidazoline đã được thương mại hóa Năm 2004, hàng loạt các giống đậu tươngchuyển gen kháng các loại thuốc diệt cỏ khác nhau được trồng chủ yếu ở Mỹ vàchúng đã được nhập khẩu vào cộng đồng chung Châu Âu, mặc dù vẫn tồn tại khánhiều tranh cãi Trong giai đoạn 1995 - 2006, đối với cây chuyển gen, đặc tínhkháng thuốc diệt cỏ liên tục là tính trạng nổi bật (chiếm 71%), tiếp sau là đặc tínhkháng sâu bệnh (chiếm 18%) và các cây mang cả hai đặc tính này (chiếm 11%)[10]

1.2.3.2 Đặc tính kháng côn trùng

Việc sử dụng giống kháng bị hạn chế vì không có giống kháng cao để hoàntoàn phòng trừ sâu hại đậu tương Ở Mỹ một vài kỹ thuật canh tác được áp dụngnhư gieo trồng sớm hay trồng các giống ngắn ngày để né tránh các đỉnh bộc phátcủa sâu Velvetbean; trồng gần bên các ruộng cây trồng khác được sâu đo ưa thíchhơn đậu tương cũng hạn chế mức gây hại của sâu đo đến ruộng đậu tương ở một sốvùng trồng đậu tương [10], [45] Thuốc trừ sâu thường được dùng khi mật độ sâulên đến mức ngưỡng gây hại Tổng chi phí ước tính cho thuốc trừ sâu sử dụng để

phòng trừ 4 loại côn trùng như sâu ăn lá Velvetbean (Anticarsia gemmatalis), sâu

đo (Pseudoplusia includens), sâu xanh corn earworn (Heliothis zea) và sâu đục thân

(Elesmopalplus) ở Mỹ lên đến 6,5 triệu USD hằng năm [45], [75] Tuy nhiên, do

tính kháng thuốc trừ sâu cao của một số loài sâu bộ cánh vảy, việc phòng trừ sâu hạiđậu tương bằng thuốc trừ sâu trở nên kém hiệu quả

Công tác nghiên cứu lai tạo đậu tương kháng sâu hại, đặc biệt đối với sâu

thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) bằng các phương pháp lai chọn giữa hai hay nhiều

giống đậu tương với nhau gặp nhiều khó khăn và không thành công Nguyên nhân

là do nguồn gen kháng với sâu bộ cánh vảy rất hiếm ở đậu tương và con lai tạođược từ các nguồn bố mẹ mang tính kháng sâu hại như PI171451, PI229358 cóthời gian sinh