Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Ngô Mạnh Dũng NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2021 Cơng trình đƣợc hồn thành : Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Chu Hoàng Hà GS.TS Chu Hoàng Mậu Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án cấp Trƣờng họp tại: Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên Vào hồi phút, ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thƣ viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Thƣ viện Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Biến đổi khí hậu, nƣớc biển dâng diễn quy mơ tồn cầu dẫn tới tình trạng hạn hán, đặc biệt hạn mặn ngày kéo dài, gây khó khăn lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp Stress hạn gia tăng trở thành trở ngại lớn, gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến suất sản lƣợng nơng nghiệp tồn cầu Đậu tƣơng nông nghiệp quan trọng giới, nguồn cung cấp protein bổ dƣỡng với chi phí thấp giữ vai trị cải tạo đất nơng nghiệp Cây đậu tƣơng thuộc nhóm trồng chịu hạn Stress hạn nguyên nhân làm giảm suất, sản lƣợng đậu tƣơng Trong bối cảnh nay, vấn đ nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng để giảm thiểu thiệt hại suất u kiện môi trƣờng thiếu nƣớc nhiệm vụ cấp bách nhà chọn giống nông nghiệp Việc cải thiện khả chịu hạn đậu tƣơng đƣợc quan tâm nghiên cứu với nhi u hƣớng tiếp cận khác nhau, đó, kỹ thuật chuyển gen mở triển vọng lớn việc cải thiện đặc tính chịu hạn đậu tƣơng Đặc tính chịu hạn tính trạng số lƣợng phức tạp, chịu ảnh hƣởng hệ thống gen mục tiêu Sự biểu gen tác động trực tiếp đến đặc tính chịu hạn u hịa chức nhóm gen chịu hạn Một hƣớng nghiên cứu tiếp cận chế chống chịu hạn làm gia tăng chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu tế bào khỏi cân v nƣớc Trong đó, glycine betaine (GB) chất bảo vệ thẩm thấu đƣợc nghiên cứu rộng rãi Một số trồng chuyển gen mã hoá enzyme liên quan đến sinh tổng hợp GB c ng thể khả chống chịu với u kiện bất lợi mơi trƣờng nhƣ chịu nóng, chịu lạnh, chịu hạn chịu mặn Phƣơng pháp chuyển gen codA từ A globiformis vào loại trồng nhƣ đậu xanh, khoai tây, cà chua để nâng cao khả chống chịu u kiện stress phi sinh học khác đƣợc chứng minh phƣơng pháp đơn giản hiệu Tại Việt Nam, gen codA mã hoá sinh tổng hợp GB đƣợc chuyển thành công vào xoan, thuốc cho thấy khả chịu hạn, chịu mặn Chính vậy, việc nghiên cứu tăng cƣờng biểu gen codA liên quan đến sinh tổng hợp GB nhằm nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng giúp phát triển tốt hơn, cho suất sản lƣợng cao u kiện môi trƣờng bất lợi nghiên cứu mang tính thực tiễn cần thiết Xuất phát từ sở khoa học nhu cầu thực tiễn v tạo giống đậu tƣơng có khả chống chịu hạn công nghệ chuyển gen, lựa chọn thực đ tài luận án “Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill)” Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp đƣợc cấu trúc mang gen chuyển codA vào đậu tƣơng tạo đƣợc đậu tƣơng chuyển gen codA mã hóa choline oxydase có khả chịu hạn cao không chuyển gen Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu tạo cấu trúc chuyển gen mang gen codA vector biểu thực vật 1) Thiết kế vector biểu gen thực vật chứa cấu trúc mang gen codA 2) Biến nạp cấu trúc chuyển gen mang gen codA vào mô thuốc Đánh giá hoạt động biểu gen chuyển codA dòng thuốc chuyển gen 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen codA đậu tƣơng 1) Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ phosphinothricin (ppt) đến khả tạo chồi từ mầm đậu tƣơng 2) Phân tích ảnh hƣởng nồng độ khuẩn thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi đậu tƣơng 3) Phân tích ảnh hƣởng nồng độ kháng sinh thời gian diệt khuẩn đến phát sinh sinh trƣởng chồi đậu tƣơng 3.3.Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen codA vào giống đậu tƣơng ĐT22 tạo đậu tƣơng chuyển gen chịu hạn 1) Biến nạp di truy n tạo đậu tƣơng chuyển gen codA 2) Phân tích đậu tƣơng chuyển gen codA 3) Đánh giá khả chịu hạn số dòng đậu tƣơng chuyển gen codA Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu Việt Nam tạo thành công đậu tƣơng mang gen codA tăng khả chịu hạn so với đậu tƣơng khơng mang gen Luận án cơng trình có hệ thống với nội dung đƣợc trình bày từ thiết kế vector chuyển gen thực vật, phân tích biểu gen tạo dịng chuyển gen codA có hàm lƣợng GB tích luỹ cao Cụ thể là: 1) Đã xác định đƣợc yếu tố thích hợp cho chuyển gen codA tạo đa chồi giống đậu tƣơng ĐT22 Nồng độ PPT mg/l giai đoạn cảm ứng tạo chồi môi trƣờng SIM nồng độ PPT 1,5 mg/l giai đoạn kéo dài chồi môi trƣờng SEM; dịch khuẩn có giá trị OD 650= 0,6, thời gian ủ khuẩn 30 phút, đồng nuôi cấy ngày tối diệt khuẩn cefotaxime 500 mg/l thích hợp cho cảm ứng tạo chồi kéo dài chồi môi trƣờng chọn lọc 2) Lần gen codA đƣợc chuyển thành công biểu mạnh đậu tƣơng Việt Nam Sự biểu gen chuyển codA đậu tƣơng chuyển gen làm tăng hàm lƣợng GB, proline, tăng hoạt độ POD, giảm hàm lƣợng MDA so với cây đậu tƣơng khơng chuyển gen 3) Bốn dịng đậu tƣơng chuyển gen codA hệ T1 đƣợc đánh giá, hàm lƣợng GB dòng đậu tƣơng chuyển gen tăng từ 248,9% - 288,3% so với không chuyển gen; hàm lƣợng proline tăng 1,5- lần, hoạt động POD tăng gấp lần hàm lƣợng MDA giảm 0,5 lần so với không chuyển gen Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Kết nghiên cứu đạt đƣợc luận án có giá trị khoa học thực tiễn tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả chống chịu stress phi sinh học đậu tƣƣơng kỹ thuật chuyển gen V mặt khoa học, kết luận án chứng minh đƣợc tăng cƣờng biểu gen codA mã hóa enzyme chìa khóa đƣờng sinh tổng hợp GB làm tăng khả chống chịu hạn đậu tƣơng Kết nghiên cứu sở khoa học để cải thiện khả chống chịu yếu tố bất lợi ngoại cảnh thực vật nói chung họ đậu nói riêng kỹ thuật biểu gen Kết đăng tải báo khoa học tài liệu tham khảo có giá trị phục vụ nghiên cứu giảng dạy sinh học V mặt thực tiễn, dịng đậu tƣơng chuyển gen codA đƣợc sử dụng làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu tƣơng có khả chống chịu hạn Kết nghiên cứu luận án áp dụng vào giống họ đậu loài thực vật khác định hƣớng nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lƣợng GB giúp tăng khả chống chịu với u kiện bất lợi môi trƣờng Cấu trúc luận án Luận án có 134 trang (kể phụ lục), đƣợc chia thành chƣơng, phần: Mở đầu (5 trang); Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu (40 trang); Chƣơng 2: Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu (16 trang); Chƣơng 3: Kết thảo luận (39 trang); Kết luận đ nghị (1 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (23 trang); Phụ lục (10 trang) Luận án có bảng, 26 hình, phụ lục 180 tài liệu tham khảo Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 180 tài liệu, có 11 tài liệu tiếng Việt, 169 tài liệu tiếng Anh v ba vấn đ bản, là: (1) Tác động hạn chế chịu hạn thực vật; (2) GB, choline oxidase; (3) Nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng kỹ thuật chuyển gen Stress hạn gây ảnh hƣởng đến hình thái, sinh lý sinh trƣởng gây hậu nghiêm trọng giai đoạn hoa, kết hạt, tạo quả, dẫn tới giảm 73– 82% hạt/cây đậu tƣơng Stress hạn gây rối loạn chức máy quang hợp, giảm diệp lục, từ giảm hiệu suất q trình quang hợp Stress hạn tăng cƣờng máy chống oxy hóa: loại bỏ gốc ROS, giảm rò rỉ điện giải peroxy hóa lipid giúp trì sức sống, tính tồn vẹn bào quan màng tế bào Ngoài ra, Stress hạn giảm khả hấp thụ nguồn khoáng đất rễ, giảm tốc độ vận chuyển chất khoáng thân dẫn đến giảm hàm lƣợng ion mô thể thực vật Trong u kiện hạn, thực vật thƣờng chủ động trì cân nƣớc sinh lý cách sau: (i) Tăng cƣờng phát triển rễ đồng thời đóng khí khổng để giảm thất nƣớc (ii) Tăng cƣờng tích l y chất tan u chỉnh áp suất thẩm thấu mô (iii) Tăng cƣờng khả chống oxy hóa (iv) Tăng cƣờng u hoà hormone GB dẫn xuất đƣợc thay hồn tồn N-metyl glycine GB có khối lƣợng phân tử thấp, hợp chất amoni bậc bốn, lƣỡng cực trung tính v điện pH sinh lý GB hợp chất không độc, không màu, khơng vị khơng mùi, tích tụ nhi u lồi thực vật Mức độ tích l y GB khơng giống loài khác nhau, quan khác thể thực vật GB chất thẩm thấu, chất bảo vệ thẩm thấu chất hòa tan tƣơng thích GB đƣợc coi chất kích thích sinh học, sử dụng nồng độ thấp để thúc đẩy phát triển trồng, tăng khả chống chịu stress phi sinh học nâng cao sản lƣợng GB đƣợc tổng hợp thông qua nhi u đƣờng, nhƣng phổ biến đƣờng thứ choline Trong đó, thực vật gồm bƣớc oxy hoá: (i) choline chuyển thành betaine aldehyde, nhờ xúc tác choline monooxygenase (CMO), sau (ii) betaine aldehyde chuyển thành GB nhờ xúc tác betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) Ở động vật nhi u vi khuẩn, bƣớc thứ lại sử dụng choline dehydrogenase (CHDH) bƣớc oxy hoá thứ hai, enzyme BADH Ở vi khuẩn A globiformis A pascens sử dụng enzyme choline oxidase (CHO) mã hóa gen đơn codA xúc tác trình oxy hóa trực tiếp bốn điện tử choline thành GB Từ đƣờng sinh tổng hợp GB đối tƣợng sinh vật khác nhận thấy, đƣờng sinh tổng hợp GB A globiformis A panescens đơn giản Từ ti n chất choline chuyển hoá GB cần enzyme nhất, choline oxidase (COD) mã hóa gen codA Chính vậy, gen codA mã hoá choline oxidase trở thành mục tiêu nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học cải thiện khả chống lại stress thẩm thấu Choline oxidase từ A globiformis lần đƣợc tinh chế Ikuta năm 1977 Enzyme flavoprotein, xúc tác q trình oxy hóa bốn electron choline thành GB với sản phẩm trung gian betaine aldehyde chất nhận điện tử cuối oxy phân tử Cụ thể bƣớc 1, choline bị oxy hóa thành betaine aldehyde, O2 bị khử thành hydro peroxide (H2O2); bƣớc 2, betaine aldehyde liên kết với enzyme đƣợc hydrat hóa tạo gem-diol choline, sau đƣợc oxy hóa thành GB Gen codA mã hoá choline oxidase vi khuẩn A globiformis (GenBank, mã số AY304485) có kích thƣớc 1641 bp mã hóa polypeptit 547 aa, bão hịa hàm lƣợng G + C, cản trở dẫn truy n phản ứng chuỗi polymerase cấu trúc kẹp tóc có khả chống nóng chảy Vì vậy, cần thiết kế mã di truy n, tổng hợp nhân tạo gen codA phù hợp với biểu gen hệ thống tế bào thực vật (với hàm lƣợng A + T dƣ thừa) Ngoài ra, bổ sung vào đầu 5’ trình tự gen nhân tạo codA đoạn nucleotide dài 216 bp transit peptide- TP (mã hóa protein vận chuyển tiểu đơn vị Rubisco thuốc lá) để vận chuyển enzyme vào lục lạp Đầu 3’ gen nhân tạo codA đƣợc bổ sung đoạn nucleotide dài 30 bp mã hóa kháng nguyên cmyc đƣợc sử dụng để kiểm tra diện protein codA tái tổ hợp chuyển gen kĩ thuật lai western blot Nhƣ vậy, kích thƣớc gen codA đƣợc tổng hợp nhân tạo 1887 bp (216 bp TP+ 1641 bp codA+ 30 bp cmyc) Chức choline oxidase mã hóa gen codA tổng hợp nhân tạo khơng bị thay đổi so với trình tự gen gốc Đậu tƣơng nguồn cung cấp protein bổ dƣỡng với chi phí thấp, đƣợc sử dụng làm thức ăn cho ngƣời gia súc, loại trồng cải tạo đất Đậu tƣơng có thời gian sinh trƣởng ngắn, khả thích ứng rộng, bố trí phù hợp với nhi u cấu trồng sản xuất, nhƣng lại thuộc nhóm trồng chịu hạn Hạn làm giảm khả nảy mầm, sinh trƣởng phát triển kém, còi cọc, giảm quang hợp, giảm khả hút khống Chính vậy, nâng cao khả chịu hạn đậu tƣơng để giảm thiểu thiệt hại suất u kiện môi trƣờng thiếu nƣớc nhiệm vụ cấp bách nhà chọn giống trồng nông nghiệp Đậu tƣơng chuyển gen loại trồng biến đổi gen đƣợc đƣa vào sản xuất đại trà sớm, với diện tích trồng nhi u giới Kỹ thuật chuyển gen qua Agrobacterium đƣợc sử dụng rộng rãi Trên giới Việt Nam, nhi u cơng trình nghiên cứu thành công việc tạo đậu tƣơng chuyển gen cải thiện khả chống chịu stress phi sinh học Nhi u cơng trình nghiên cứu chuyển gen codA mã hóa choline oxidase sinh tổng hợp GB làm tăng khả chống chịu trồng trƣớc u kiện môi trƣờng bất lợitừ ngoại cảnh Tuy nhiên, chƣa có cơng bố v nghiên cứu chuyển gen codA đậu tƣơng Chính vậy, việc chuyển gen codA vào đậu tƣơng nhằm nâng cao khả chịu hạn hƣớng mới, có tính thời cấp thiết Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các vật liệu thực vật: Giống thuốc K326 đƣợc cung cấp Viện Nghiên cứu thuốc Giống đậu tƣơng ĐT22 đƣợc cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Phát triển đậu đỗ Các chủng vi khuẩn loại vector: Chủng vi khuẩn E coli DH5α A tumefaciens C58/pGV2206 Vector pIBTII, pCAMBIA đƣợc thiết kế sử dụng phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trình tự gen codA mã hóa cho choline oxidase từ A globiformis khai thác Genbank (Mã số AY304485) đƣợc tối ƣu hóa nhằm tăng tính biểu thực vật đƣợc cung cấp công ty Epoch Life Science Inc, Mỹ Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR: codA-F/R, Bar-F/R, F/TP-XbaI, R/cmyc-SacI 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ Hóa chất: Sử dụng hố chất hãng Fermentas, Invitrogen, Sigma, Merck, Amersham Pharmacia Biotech Thiết bị: Sử dụng thiết bị Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nhóm phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen codA chuyển gen thuốc Phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA: Các phản ứng cắt enzyme giới hạn, lai tạo vector tái tổ hợp Plasmid tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phƣơng pháp xung điện Cohen cộng (1972) Chuyển cấu trúc vector sau thiết kế vào thuốc kiểm tra có mặt gen chuyển: theo phƣơng pháp Topping (1998) Phân tích hàm lượng GB thuốc chuyển gen: theo phƣơng pháp Grieve cộng (1983) 2.3.2 Nhóm phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cho chuyển gen giống đậu tƣơng ĐT22 Khử trùng hạt: Hạt đậu tƣơng đƣợc khử trùng khí chlore (Cl2) Chuẩn bị khuẩn: Các loại môi trƣờng sử dụng q trình ni cấy tạo dịch huy n phù vi khuẩn gồm: môi trƣờng nuôi khuẩn đặc, môi trƣờng nuôi khuẩn lỏng môi trƣờng tạo dịch huy n phù vi khuẩn Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen codA: Các yếu tố ảnh hƣởng đƣợc thử nghiệm ngƣỡng nồng độ khác để lựa chọn u kiện tối ƣu cho quy trình chuyển gen 2.2.3 Nhóm phƣơng pháp tạo đậu tƣơng chuyển gen codA Biến nạp di truyền tạo đậu tương chuyển gen: Chuyển gen vào giống ĐT22 theo pháp Olhoft cs (2001), có cải tiến Các dịng đậu tƣơng chuyển gen đƣợc sàng lọc chất diệt cỏ PPT Phân tích đậu tương chuyển gen: DNA tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Delllaporta (1983) Xác nhận diện gen chuyển codA kỹ thuật PCR cặp mồi đặc hiệu Kiểm tra hợp gen chuyển codA vào hệ gen chuyển gen kỹ thuật Southern blot Kiểm tra biểu protein tái tổ hợp codA kỹ thuật Western blot Đánh giá khả chịu hạn số dòng chuyển gen điều kiện hạn nhân tạo: Các dòng chuyển gen đƣợc đánh giá khả chịu hạn u kiện hạn nhân tạo thiết đặt buồng sinh trƣởng Đánh giá số GB theo phƣơng pháp Grieve cộng (1983); số MDA, proline hoạt độ POD theo phƣơng pháp Chen Zhang (2016) 2.3.4 Phân tích xử lý liệu: Số liệu đƣợc xử lý phần m m SPSS 2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Thí nghiệm đƣợc thực Viện Cơng nghệ sinh học thời gian từ 2017- 2020 Luận án đƣợc hồn thành Bộ mơn Di truy n học Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học Trƣờng Đại học Sƣ phạm, ĐH Thái Nguyên Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN codA 3.1.1 Tạo cấu trúc chuyển gen codA Ba vector biểu gen thực vật pBTII mang promoter 35S, rd29A HSP tƣơng ứng để u khiển biểu gen codA đậu tƣơng đƣợc thiết kế Sau tiến hành tách chiết tinh sạch, vector pIBTII pCAMBIA-HSP- mơi trƣờng hạn nhân tạo có khả trì áp suất thẩm thấu, phát triển mạnh rễ để tăng cƣờng sức chống chịu, đối chứng môi trƣờng hạn nhân tạo bị cân áp suất thẩm thấu dẫn đến còi cọc chết Chúng tơi tiến hành thí nghiệm gây hạn nhân tạo cho dòng chuyển gen nhà lƣới, thí nghiệm đƣợc thực buồng sinh trƣởng 37°C, độ ẩm 55% hồn tồn khơng tƣới nƣớc suốt thời gian thí nghiệm Kết đánh giá kiểu hình sau ngày thí nghiệm cho thấy, dòng thuốc chuyển gen sinh trƣởng tốt đối chứng héo sau ngày thứ gây hạn chết hoàn toàn sau ngày gây hạn Sự tích l y GB dƣới u kiện hạn c ng đƣợc đánh giá vào ngày thứ thí nghiệm Hình 3.7 Kết gây hạn sinh lý PEG 8000 2,5% dòng thuốc chuyển gen A) B) chồi tạo rễ môi trường hạn sinh lý; mảnh tạo chồi môi trường hạn sinh lý Hình 3.8 Kết định lƣợng hàm lƣợng GB thuốc chuyển gen Các chữ khác cột biểu thị khác biệt P