Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương glycine max l merrill

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐÀO XUÂN TÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmDREB2 NHẰM CẢI THIỆN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) trồng quan trọng hàng đầu nhiều q́ c gia giới, đó có Việt Nam Việc tiêu thụ đậu tương sản phẩm từ đậu tương gia tăng toàn giới tác dụng có lợi tới sức khỏe người như: Phòng chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tiểu đường béo phì, hạ cholesterol bảo vệ rối loạn thận Hạt đậu tương nguồn cung cấp dồi protein (32%-52%), lipid (12%-25%), vitamin (B1, B2, C, D, E ), nhiều amino acid thiết yếu (lysine, tryptophan, methionine, cysteine leucine), chất xơ, lượng chất chuyển hóa thứ cấp Vì vậy, hạt đậu tương sử dụng làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc, nguồn nguyên liệu cho cơng nghiệp chế biến, mặt hàng xuất có giá trị kinh tế cao Khơng có giá trị kinh tế dinh dưỡng cao, đậu tương giữ vai trị quan trọng việc cải thiện độ phì sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác Gần đây, ứng dụng quan tâm nhiều đậu tương sản xuất dầu diesel sinh học Đâ ̣u tương xem trồng nhạy cảm với hạn Hạn yếu tố phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng làm giảm suất đậu tương khoảng 40% Hạn ảnh hưởng đến tất thời kì sinh trưởng phát triển đậu tương, thời kì hoa thời kì sau hoa chứng minh thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng Hiện nay, biến đổi khí hậu, đặc biệt hạn kéo dài, lượng mưa không thời điểm năm vùng miền gây khó khăn cho sản xuất nông nghiệp nhiều quốc gia, Việt Nam khơng tránh khỏi tác động tiêu cực Hơn nữa, Việt Nam có khoảng 75% diện tích đồi núi, đất dốc, khả giữ nước nên việc canh tác trồng nói chung đậu tương nói riêng gặp nhiều khó khăn Do đó, việc cho ̣n ta ̣o giố ng đâ ̣u tương có khả chiụ ̣n tố t là vấ n đề cấ p thiế t, mang tính thời sự ở Viê ̣t Nam thế giới Tính chịu hạn đậu tương nhiều gen quy định, sản phẩm gen liên quan trực tiếp đến biểu khả chịu hạn có chức điều hịa nhóm gen chịu hạn Một số gen đậu tương mô tả là có phản ứng với tác động hạn mức phiên mã Trình tự cis nhân tố trans giữ vai trò quan trọng biểu gen đáp ứng tác động hạn Các protein DREB - Những nhân tố có tác động trans liên kết với trình tự cis để kích hoạt biểu gen mu ̣c tiêu có tín hiệu stress thực vật Việc cải thiện đặc tính di truyền đậu tương để thích nghi với hạn nhà khoa học tiếp cận theo nhiều hướng: Lai hữu tính, gây đột biến thực nghiệm, chọn lọc quần thể, công nghệ tế bào, công nghệ gen Trong đó, cơng nghệ gen xem biện pháp đem lại hiệu cao Gần đây, có tiến việc cải thiện tính chịu hạn đậu tương thông qua các kỹ thuâ ̣t tác đô ̣ng vào nhân tố phiên mã yếu tố tín hiệu ở trồng chuyển gen Tuy nhiên ở nước ta, mô ̣t số nghiên cứu mới chỉ dừng lại việc chuyể n các gen chức liên quan trực tiếp đến tính chiụ ̣n vào đâ ̣u tương, ít thấ y công bố kế t quả hồn chỉnh chủ n gen mã hóa protein là nhân tố kích hoa ̣t quá trình phiên ma,̃ có gen GmDREB2 Do đó, việc nghiên cứu đặc tính phân tử, xác định chức gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới tính chịu hạn, việc chuyển gen từ giống đậu tương có khả chịu hạn tốt sang giống có khả chịu hạn trở thành hướng nghiên cứu triển vọng, nhận quan tâm đặc biệt nhà khoa học nước Xuất phát từ lý trên, đã tiế n hành đề tài luận án: "Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)" Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Phân tích đươ ̣c đặc điểm gen GmDREB2 phân lập từ giống đậu tương Viê ̣t Nam có khả chịu hạn khác 2.2 Biể u hiêṇ đươ ̣c protein tái tổ hơ ̣p và chức sinh ho ̣c của gen chuyể n GmDREB2 thuố c lá chuyể n gen 2.3 Ta ̣o đâ ̣u tương chuyể n gen và biể u hiêṇ đươ ̣c protein tái tổ hơ ̣p GmDREB2 đậu tương chuyển gen Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu thơng tin, tách dịng xác định trình tự gen GmDREB2 phân lập từ đậu tương Phân tích tính đa dạng trình tự nucleotide protein gen GmDREB2 đậu tương 3.2 Nghiên cứu thiế t kế vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc mang gen GmDREB2 3.3 Nghiên cứu chuyển gen phân tích biểu gen GmDREB2 thuốc lá: (i) Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc gen GmDREB2 (ii) Phân tích biểu protein tái tở hơ ̣p GmDREB2 thuốc (iii) Đánh giá khả chiụ hạn của thuốc chuyể n gen 3.4 Nghiên cứu chuyển cấ u trúc mang gen GmDREB2 vào đâ ̣u tương và phân tích đậu tương chuyể n gen Những đóng góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống, từ việc phân lập, tách dòng phân tử gen GmDREB2 đế n thiế t kế vector chuyển gen, ta ̣o chuyể n gen và phân tích biể u hiê ̣n gen chuyể n GmDREB2, cu ̣ thể là: (1) Gen GmDREB2 phân lâ ̣p từ đâ ̣u tương có kích thước 480 nucleotide, mã hóa cho 159 amino acid Các trình tự gen GmDREB2 đăng ký Ngân hàng Gen mang mã số: LK936507, LK936508, LK936509, HG965097, HG965098, HG965099 (2) Protein tái tổ hơ ̣p GmDREB2 biể u hiêṇ ma ̣nh thuố c lá chuyể n gen Khi bi ̣ ̣n, ở các th́ c chủ n gen có hàm lươ ̣ng prolin tăng từ 211,17% - 332,44% sau ngày bi ̣stress ̣n và tăng từ 262,79% - 466,04% sau ngày bi ̣stress ̣n (3) Ta ̣o đươc̣ đâ ̣u tương chuyể n gen mang gen GmDREB2 và biể u hiê ̣n thành công protein tái tổ hơ ̣p GmDREB2 giố ng đâ ̣u tương DT84 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án 5.1 Về mặt khoa học Kết nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc gen GmDREB2 phân lập từ giống đậu tương Việt Nam (DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐT51, ĐVN5) Những sở khoa học của viê ̣c sử du ̣ng kỹ thuật chuyển gen nhằ m cải thiện đặc tính chịu hạn trồng khẳng định thông qua việc tăng cường protein tái tổ hơ ̣p GmDREB2 và biể u hiê ̣n chức sinh ho ̣c của gen chuyể n GmDREB2 thuố c lá và đâ ̣u tương Những kế t quả bước đầ u ta ̣o chuyể n gen đã mở hướng nghiên cứu ứng du ̣ng kỹ thuâ ̣t chuyể n gen mu ̣c đích nâng cao khả chiụ ̣n đâ ̣u tương Việt Nam Các báo công bớ tạp chí Khoa học - Cơng nghệ quốc tế và nước, với trình tự gen công bố Ngân hàng Gen tư liệu tham khảo có giá trị việc nghiên cứu, giảng da ̣y sinh ho ̣c và công nghê ̣ sinh ho ̣c 5.2 Về mặt thực tiễn Các trình tự gen GmDREB2 phân lâ ̣p đươ ̣c, cấ u trúc vector chuyển gen thực vâ ̣t mang gen GmDREB2, thuốc chuyển gen tạo có khả chịu hạn tốt so với đối chứng, các đâ ̣u tương chuyể n gen đã góp phần giải vấn đề cụ thể việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen cải thiện khả chịu hạn đậu tương nói riêng trồng khác nói chung, mở triển vọng ứng du ̣ng công nghê ̣ mớ i thực tiễn chọn giống trồng chiụ ̣n ở Viê ̣t Nam Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦ A ĐẶC TÍ NH CHIỤ HẠN Ở THỰC VẬT 1.1.1 Cơ chế chịu hạn thực vật Stress phi sinh học ngun nhân dẫn đến mùa tồn giới, gây thiệt hại đế n suất bình quân 50% ở loại trồng [18] Trong số stress phi sinh học, hạn yếu tố làm giảm suất trồng Stress hạn phá vỡ cân nội môi phân bố ion tế bào [197] Cây trồng phản ứng với stress hạn thông qua đường truyền tin phản ứng tế bào như: Sản xuất protein stress, tăng cường chất chống oxi hóa, tích lũy chất tan [36] Các nghiên cứu gần cho thấy, hạn gây tác động tiêu cực tới tất cấp độ giai đoạn phát triển thực vật Để chống chịu với stress hạn, thực vật phải thực thơng qua chuỗi q trình, với tham gia nhiều yếu tố Khi có hạn, phản ứng sinh hóa khác kích hoạt trồng để tích lũy nhiều loại chất dễ hòa tan, đường, amino acid, glycine betaine polyamine để giúp trồng đối phó với hạn [71], tăng lượng chất chống oxy hóa khác nhau, chẳng hạn glutathione S-transferase (GST), superoxide dismutase (SOD), guaiacol peroxidase (POD) catalase (CAT) để chống lại điều kiện oxy hóa, giúp phục hồi sau thời gian định bị hạn [12] Gần đây, những tiến việc hiểu biết biểu gen, chế phiên mã việc truyền tín hiệu phản ứng với stress hạn trồng đã đươ ̣c công bố [198] Mặt khác, phân tích sinh ho ̣c phân tử di truyền ho ̣c tạo điều kiện thuận lợi cho khám phá chức gen [155], [170] ứng dụng kỹ thuật di truyền với viê ̣c sử dụng số gen chức mơ ̣t số gen điều hịa để kích hoạt chế liên quan đến tính chịu hạn, chịu mặn của trồng [176] Vì vậy, sở phân tử đặc tính chịu hạn thực vật nói chung đậu tương nói riêng dần sáng tỏ Các gen phản ứng với stress hạn chia thành nhóm chính: Nhóm gen chức mà sản phẩm chúng tham gia trực tiếp vào phản ứng stress hạn gen điều hòa áp suất thẩm thấu [167], gen mã hóa protein chống oxi hóa [100], gen mã hóa protein LEA (Late embryogenesis abundant) [181], gen mã hóa protein vận chuyển LTP (Lipid trasfer protein) [111], aquaporin [48]; nhóm gen điều khiển cho sản phẩm bao gồm nhân tố phiên mã protein kinase truyền tin Các nhân tố phiên mã liên quan đến khả chịu hạn quan tâm nghiên cứu bao gồm DREB [24], WRKY [193], [195], bZIP (Basic leucine zipper) [54], MYB (Myeloblastosis oncogene) [90], [103], NCED (Nine-cisepoxycarotenoid dioxygenase) [137] AP2/ERF [193] Các protein kinase truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc Ca2+ [80], MAPK (Mitogen activated protein kinase) [112], RPK (Receptor-like protein kinase) [29], PIK (Phophatidyl inositol kinase) [185] protein kinase serine/threonine [102] (Hình 1.1) Hình 1.1 Cơ chế chịu hạn thực vật Sự biểu gen cảm ứng với stress hạn liên quan chặt chẽ với trình phiên mã Vì vậy, biểu gen chịu ảnh hưởng nhiều môi trường thể, với nhiều mức độ điều hòa Các nhân tố phiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trị điều khiển quan trọng thay đổi biểu gen phản ứng với stress mơi trường Có thể thấy rõ trồng, gen mã hóa nhân tố phiên mã chiế m phần lớn hệ gen Ví dụ, Arabidopsis có đến 1500 TF hệ gen [140] Cả hai loa ̣i: Nhân tớ kích hoạt ức chế quá trình phiên mã sử dụng để nâng cao khả chịu hạn cho trồng, hầu hết gen xác định phân tích Arabidopsis [19] Hiện nay, protein DREB (một bốn phân họ lớn họ AP2/ERF) nhóm TF nghiên cứu thành cơng điều kiện phi sinh học, kích hoạt biểu nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát yếu tố liên quan [71] Wang cs (2009) xác định Arabidopsis có 474 gen mục tiêu mà nhân tố phiên mã DREB tác động [183] Trong số gen này, có 160 gen có đáp ứng với stress phi sinh học 27 gen cảm ứng với tình trạng thiếu nước [106] 1.1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2/ERF Các nhân tố phiên mã phân chia thành nhiều loại khác dựa cấu trúc vùng liên kết chúng với sợi DNA Các nhân tố phiên mã nhân tớ có tác động trans và trình tự cis giữ vai trị trung tâm hoạt hóa promoter biểu gen mục tiêu Kế t quả phân tích hoạt hóa promoter phản ứng với điều kiện bất lợi, trình tự cis nhân tố có tác động trans liên quan đến phản ứng gen với điều kiện bất lợi xác định [178] Họ AP2/ERF nhóm lớn nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm bốn phân họ lớn: AP2 (APETALA 2), RAV (RelatedtoABI3/VP1), ERF (Ethylene-responsive element binding factor) DREB (Dehydration responsive element binding ) [148] 10 1.1.2.1 Cây phát sinh họ nhân tố phiên mã AP2/ERF Họ AP2/ERF nhóm lớn nhân tố phiên mã có chứa miền AP2/ERF Ở Arabidopsis chứa 145 locus gen mã hóa nhân tố phiên mã họ AP2/ERF [148] lúa có 167 locus [152] Miền AP2/ERF lần tìm thấy Arabidopsis homeotic APETALA [74] Tương tự, miền tìm thấy thuốc (Nicotiana tabacum), yếu tố phản ứng với ethylene (EREBPs) [124] Miền AP2/ERF có khoảng 60 amino acid, amino acid có liên quan chặt chẽ với [184] Protein thuộc họ AP2/ERF nhân tố phiên mã có thực vật người ta tìm thấy miền AP2/ERF thực vật bậc thấp tảo xanh (Chlamydomonas reinhardtii) [157], tương đồng với miền AP2/ERF vi khuẩn Do đó, có giả thuyết cho miền AP2/ERF chuyển từ loài vi khuẩn Cyanobacterium cộng sinh từ loại vi khuẩn hay virus tượng biến nạp gen [98] Ở đầu N đầu C miền AP2/ERF có chứa đoạn xoắn β tương tự kiểu xoắn α có chức nhận biết điểm bám promoter [158] Phân tích mối quan hệ thiết lập phát sinh họ AP2/ERF từ bốn phân họ: Arabidopsis, Selaginella moellendorffii, Physcomitrella patens Chlamydomonas reinhardtii, mà đại diện tương ứng thực vật hạt kín, thơng đất, rêu tảo xanh (Hình 1.2) Mỗi nhánh phát sinh đại diện cho nhóm thành viên họ AP2/ERF chia thành ba nhóm dựa cấu trúc tổng thể [141] Phân họ AP2/ERF nhóm Arabidopsis gồm 14 thành viên chứa hai miền AP2/ERF, phân họ RAV gồm thành viên có chứa miền AP2/ERF thêm miền B3, phân họ khác gồm 125 thành viên có miền AP2/ERF [152] Phân họ AP2/ERF thực vật có hạt chia thành phân nhóm AP2 ANT [13] Sakuma cs (2002) phân tích mối quan hệ 125 thành viên chứa miền AP2/ERF dựa sở miền AP2/ERF nhóm Arabidopsis 114 DRE/CRT-binding transcription factor DREB2C enhances thermotolerance, Biochem Biophys Res Commun., 362, pp 431-436 92 Lin R.C., Park H.J., Wang H.Y (2008), Role of Arabidopsis RAP2.4 in regulating light and ethylene-mediated developmental processes and drought stress tolerance, Mol Plant, 1, pp 42-57 93 Liu N., Zhong N.Q., Wang G.L., Li L.J., Liu X.L., He Y.K., Xia G.X (2007), Cloning and functional characterization of PpDBF1 gene encoding a DRE-binding transcription factor from Physcomitrella patens, Planta, 226, pp 827-838 94 Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (1998), Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temper-ature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis, Plant Cell, 10, pp 1391-1406 95 Liu S.J., Wei Z.M and Huang J.Q (2008), The effect of cocultivation and selection parameters on Agrobacterium-mediated transformation of Chinese soybean varieties, Plant Cell Rep., 27, pp 489-498 96 Liu Y.W., Chen M., Xu Z.S., Zh G.Y., Li L.C., Ma Y.Z (2007), Glycine max dehydration-responsive element binding protein mRNA, complete cds., NCBI, Accession EF551166, http://www.ncbi.nlm.nih.gov 97 Lozovaya V.V., Lygin A.V., Zernova O.V., Li S., Hartman G.L., and Widholm J.M (2004), Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani, Plant Physiol Biochem., 42, pp 671-679 98 Magnani E., Sjölander K., Hake S (2004), From endonucleases to transcription factors: evolution of the AP2 DNA binding domain in plants, Plant Cell, 16, pp 2265-2277 99 Mai V.Q., Pham C.T.B., Nguyen M.V., Le H.A.T (2010), Results of 115 research, creation, drought-tolerant soybean variety, DT2008, Journal of Vietnamese Agricultural Science and Technology, 6, pp 46-50 100 Manaa A., Ben A.H, Valot B., Bouchet J.P., Aschi-Smiti S., et al (2011), Salt and genotype impact on plant physiology and root proteome variations in tomato, J Exp Bot., 62, pp 2797-2813 101 Manavalan L.P., Guttikonda S.K., Tran L.S., Nguyen H.T (2009), "Physiological and molecular approaches to improve drought resistance in soybean", Plant Cell Physiol., 50(7), pp 1260-1276 102 Mao X., Zhang H., Tian S., Chang X., Jing R (2009), TaSnRK2.4, an SNF1typeserine/threonine protein kinase of wheat (Triticum aestivum L.), confers enhancedmultistress tolerance in Arabidopsis, J Exp Bot., 61, pp 683-696 103 Mao X., Jia D., Li A., Zhang H., Tian S., et al (2011), Transgenic expression of TaMYB2A confers enhanced tolerance to multiple abiotic stresses in Arabidopsis, Functional & Integrative Genomics, 11(3), pp 445-65 104 Maruyama K., Sakuma Y., Kasuga M., Ito Y., Seki M., Goda H., Shimada Y, Yoshida S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), Identification of cold inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems, The Plant J., 38, pp 982-993 105 Maruyama K., Takeda M., Kidokoro S., Yamada K., Sakuma Y., Urano K., Fujita M., Yoshiwara K., Matsukura S., Morishita Y., Sasaki R., Suzuki H., Saito K., Shibata D., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2009), Metabolic pathways involved in cold acclimation identified by integrated analysis of metabolites and transcripts regulated by DREB1A and DREB2A, Plant Physiol., 150, pp 1972-1980 106 Marcolino-Gomes J., Rodrigues F.A., Oliveira M.C.N., Farias J.R.B., Neumaier N., et al (2013), Expression Patterns of GmAP2/EREB-Like Transcription Factors Involved in Soybean Responses to Water Deficit, PLoS ONE, 8(5): e62294 doi: 10.1371/journal.pone.0062294 116 107 Matsukura S., Mizoi J., Yoshida T., Todaka D., Ito Y., Maruyama K., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2010), Comprehensive analysis of rice DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes, Mol Genet Genomics, 283, pp 185-196 108 Mauro A.O.O., Pfeiffer T.W and Collins G.B (1995), Inheritance of soybean susceptibility to Agrobacterium tumefaciens and its relationship to transformation, Crop Sci., 35, pp 1152-1156 109 Mizoi J., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2012), AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses, Biochim Biophys Acta, 1819, pp 86-96 110 Mittler R (2006), Abiotic stress, the field environment and stress combination, Trends Plant Sci., 11, pp 15-19 111 Morino M., Natsui S., Ono T., Swartz T.H., Krulwich T.A., et al (2010), Single site mutations in the heterooligomeric MRP antiporter from alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4 that affect Na+/H+ antiport activity, sodium exclusion, individual MRP protein levels, or MRP complex formation, J Biol Chem., 285, pp 30942-30950 112 Moris P.C (2010) Integrating lipid signalling, mitogen-activated protein kinase cascades and salt tolerance, New Phytologist, 188, pp 640-643 113 Morran S., Eini O., Pyvovarenko T., Parent B., Singh R., Ismagul A., Eilby S., Shirley N., Langridge P., Lopato S (2010), Improvement of stress tolerance of wheat and barley by modulation of expression of DREB/CBF factors, Plant Biotechnol J., doi: 10.1111/ j.1467-7652.2010.00547.x 114 Murray M.G., Thompson W.F (1980), Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Res., 8(19), pp 4321-4325 115 Nakano T., Suzuki K., Fujimura T., Shinshi H (2006), Genome-wide 117 analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice, Plant Physiol., 140, pp 411-432 116 Nakashima K., Shinwari Z.K., Sakuma Y., Seki M., Miura S., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2000), Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration and high-salinity-responsive gene expression, Plant Mol Biol., 42, pp 657-665 117 Narusaka Y., Nakashima K., Shinwari Z.K., Sakuma Y., Furihata T., Abe H., Narusaka M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2003), Interaction between two cis-acting elements, ABRE and DRE, in ABA-dependent expression of Arabidopsis rd29A gene in response to dehydration and highsalinity stresses, The Plant J., 34, pp 137-148 118 Nelson D.E., Repetti P.P., Adams T.R., Creelman R.A., Wu J., Warner D.C., Anstrom D.C., Bensen R.J., Castiglioni P.P., Donnarummo M.G., Hinchey B.S., Kumimoto R.W., Maszle D.R., Canales R.D., Krolikow-ski K.A., Dotson S.B., Gutterson N., Ratcliffe O.J., Heard J.E (2007), Plant nuclear factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres, Proc Natl Acad Sci USA., 104, pp 16450-16455 119 Ni Z., Hu Z., Jiang Q., Zhang H (2013), GmNFYA3, a target gene of miR169, is a positive regulator of plant tolerance to drought stress, Plant Mol Biol., 82(1-2), pp 113 - 129 120 Niu X., Helentjaris T., Bate N.J (2002), Maize ABI4 binds coupling element in abscisic acid and sugar response genes, Plant Cell, 14, pp 2565-2575 121 Nishizawa A., Yabuta Y., Yoshida E., Maruta T., Yoshimura K., Shigeoka S (2006), Arabidopsis heat shock transcription factor A2 as a key regulator in response to several types of environmental stress, The Plant J., 48, pp 535-547 118 122 Nover L., Bharti K., Döring P., Mishra S.K., Ganguli A., Scharf K.D (2001), Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors we need?, Cell Stress Chaperones, 6, pp 177-189 123 Novillo F., Alonso J.M., Ecker J.R., Salinas J (2004), CBF2/DREB1C is a negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis, Proc Natl Acad Sci USA., 101, pp 3985-3990 124 Ohme-Takagi M., Shinshi H (1995), Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element, Plant Cell, 7, pp 173-182 125 Oh S.J., Kwon C.W., Choi D.W., Song S.I.K., Kim J.K (2007), Expression of barley HvCBF4 enhances tolerance to abiotic stress in transgenic rice, J Plant Biotechnol, 5, pp 646-656 126 Oh S.J., Song S.I., Kim Y.S., Jang H.J., Kim M., Kim Y.K (2005), Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth, Plant Physiol., 138, pp 341-351 127 Olhoft P.M., Bernal L.M., Grist L.B and Ozias-Akins P (2007), A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 43, pp 536-549 128 Olhoft P.M., Donovan C.M., Somers D.A (2006), Soybean (Glycine max) transformation using mature cotyledonary node explants, Methods Mol Biol., 343, pp 385-396 129 Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M and Somers D.A (2003), Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonarynode method, Planta, 216, pp 723-735 119 130 Paz M.M., Martinez J.C., Kalvig A.B., Fonger T.M and Wang K (2006), Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation, Plant Cell Rep., 25, pp 206-213 131 Pellegrineschi A., Reynolds M., Pacheco M., Brito R.M., Almeraya R., Yamaguchi-Shinozaki K., Hoisington D (2004), Stress induced expression in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress symptoms under greenhouse conditions, Genom, 47, pp 493-500 132 Pitzschke A and Hirt H (2010), New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation, EMBO J., 29 pp 1021-1032 133 Polizel A.M., Medri M.E., Nakashima K., Yamanaka N., Farias J.R.B., Oliveira M.C.N., Marin S.R.R., Abdelnoor R.V., Marcelino-Guimaraes FC, Fuganti R, et al (2011), Molecular, anatomical and physiological properties of a genetically modified soybean line transformed with rd29A: AtDREB1A for the improvement of drought tolerance, Genet Mol Res., 10, pp 3641-3656 134 Qin F., Kakimoto M., Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Tran L.S.P., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2007), Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L., The Plant J., 50, pp 54-69 135 Qin F., Sakuma Y., Li J., Liu Q., Li Y.Q., Shinozaki K., YamaguchiShinozaki K (2004), Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L., Plant Cell Physiol., 45, pp 1042-1052 136 Qin F., Sakuma Y., Tran L.S.P., Maruyama K., Kidokoro S., Fujita Y., Fujita M., Umezawa T., Sawano Y., Miyazono K., Tanokura M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2008), Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function as RING E3 ligases and negatively regulate plant drought 120 stress-responsive gene expression, Plant Cell, 20, pp 1693-1707 137 Qin X., Zeevaart J.A.D., (1999), The 9-cisepoxycarotenoid cleavage reaction is thekey regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean, Proc Natl Acad Sci USA., 96, pp 15354-15361 138 Qiu Y.P., Yu D.Q (2009), Over-expression of the stress-induced OsWRKY45 enhances disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis, Environ Exp Bot., 65, pp 35-47 139 Rao S.S., Mamadou L., McConnell M., Polisetty R., Kwanyuen P and Hildebrand D (2009) Non-antibiotic selection systems for soybean somatic embryos: The lysine analog aminoethyl-cysteine as a selection agent, BMC Biotechnology, Nov 18;9:94 doi: 10.1186/1472-6750-9-94 140 Ratcliffe O.J., Riechmann J.L (2002), Arabidopsis transcription factors and the regulation of flowering time: a genomic perspective, Curr Issues Mol Biol., 4, pp 77-91 141 Riechmann J.L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C.Z., Keddie J., Adam L., Pineda O., Ratcliffe O.J., Samaha R.R., Crelman R., Pilgrim M., Broun P., Zhang J.Z., Ghandehari D., Sherman B.K, Yu G.L (2000), Arabidopsis transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes, Science, 290, pp 2105-2110 142 Rechsteiner M., Rogers S.W (1996), PEST sequences and regulation by proteolysis, Trends Biochem Sci., 21, pp 267-271 143 Rizhsky L., Liang H., Mittler R (2002), The combined effect of drought stress and heat shock on gene expression in tobacco, Plant Physiol., 130, pp 1143-1151 144 Rizhsky L., Liang H., Shuman J., Shulaev V., Davletova S., Mittler R (2004), When defense pathways collide The response of Arabidopsis to a combination of drought and heat stress, Plant Physiol., 134, pp 1683-1696 121 145 Rogers S., Wells R., Rechsteiner M (1986), Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis, Science, 234, pp 364-368 146 Sakuma Y., Maruyama K., Osakabe Y., Qin F., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2006a), Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in drought-responsive gene expression, Plant Cell, 18, pp 1292-1309 147 Sakuma Y., Maryyama K., Qin F., Osakabe Y., Shinozaki K., YamaguchiShinozaki K (2006b), Dual function of an Arabidopsis transcription factor DREB2A in water-stress-responsive and heat-stress-responsive gene expression, Proc Natl Acad Sci USA., 103, pp 18822-18827 148 Sakuma Y., Liu Q., Dubouzet J.G., Abe H., Shinozaki K., YamaguchiShinozaki K (2002), DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression, Biochem Biophys Res Commun., 290, pp 998-1009 149 Sambrook J., Russell D.W (2001), Molecular cloning a Laboratory Manual, Vol 150 Schramm F., Larkindale J., Kiehlmann E., Ganguli A., Englich G., Vierling E., Von Koskull-Doring P (2008), A cascade of transcription factor DREB2A and heat stress transcription factor HsfA3 regulates the heat stress response of Arabidopsis, The Plant J., 53, pp 264-274 151 Schramm F., Ganguli A., Kiehlmann E., Englich G., Walch D., Von Koskull-Doring P (2006), The heat stress transcription factor HsfA2 serves as a regulatory amplifier of a subset of genes in the heat stress response in Arabidopsis, Plant Mol Biol., 60, pp 759-772 152 Sharoni A.M., Nuruzzaman M., Satoh K., Shimizu T., Kondoh H., Sasaya T., 122 Choi I.-R., Omura T., Kikuchi S (2011), Gene structures, classification, and expression models of the AP2/EREBP transcription factor family in rice, Plant Cell Physiol., 52(2), pp 344-360 153 Shen Y.G., Zhang W.K., He S.J., Liu Q., Chen S.Y (2003), An EREBP/AP2-type protein in Triticum aestivum was a DRE-binding transcription factor inducedby cold, dehydration and ABA stress, Theor Appl Genet.,106, pp 923-930 154 Shinwari Z.K., Nakashima K., Miura S., Kasuga M., Seki M., Yamaguchi Shinozaki K., Shinozaki K (1998), An Arabidopsis gene family encoding DRE/CRT binding proteins involved in low-temperature-responsive gene expression, Biochem Biophys Res Commun., 250, pp 161-170 155 Seki M., Umezawa T., Urano K., Shinozaki K (2007), Regulatory metabolic networks in drought stress responses, Curr Opin Plant Biol., 10, pp 296-302 156 Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2000), Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways, Curr Opin Plant Biol., 3, pp 217-223 157 Shigyo M., Hasebe M., Ito M (2006), Molecular evolution of the AP2 subfamily, Gene, 366, pp 256-265 158 Shigyo M., Ito M (2004), Analysis of gymnosperm two-AP2-domaincontaining genes, Dev Genes Evol 214, pp 105-114 159 Shukla R.K., Raha S., Tripathi V., Chattopadhyay D of CAP2, an (2006), Expression APETALA2-family transcription factor from chickpea, enhances growth and tolerance to dehydration and salt stress in transgenic tobacco, Plant Physiol., 142, pp 113-123 160 Somers D.A., Samac D.A., and Olhoft P.M (2003), Recent advances in legume transformation, Plant Physiol., 131, pp 892-899 161 Subramanian S., Graham M.Y., Yu O., and Graham T.L (2005), RNA 123 interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae, Plant Physiol., 137, pp 1-9 162 Sulieman S., Ha C.V., Nasr Esfahani M., Watanabe Y., Nishiyama R., Pham B.C.T., et al (2015), DT2008: A Promising New Genetic Resource for Improved Drought Tolerance in soybean When Solely Dependent on Symbiotic N2 Fixation, Biomed Res Int., doi:10.1155/2015/687213 163 Sun S., Yu J.P., Chen F., Zhao T.J., Fang X.H., Li Y.Q., Sui S.F (2008), TINY, a dehydration-responsive element (DRE)-binding protein-like transcription factor connecting the DRE- and ethylene-responsive elementmediated signaling pathways in Arabidopsis, J Biol Chem., 283, pp 6261-6271 164 Stockinger E.J., Gilmour S.J., Thomashow M.F (1997), Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit, Proc Natl Acad Sci USA., 94, pp 1035-1040 165 Thao N.P., Thu N.B., Hoang X.L., Van Ha C., Tran L.S (2013), "Differential expression analysis of a subset of drought-responsive GmNAC genes in two soybean cultivars differing in drought tolerance", Int J Mol Sci., 14(12), pp 23828 - 23841 166 Thomashow M.F (1999), Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms, Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 50, pp 571-599 167 Tomy S., Chang Y.M., Chen Y.H., Cao J.C., Wang T.P., et al (2009), Salinity effects on the expression of osmoregulatory genes in the euryhaline black porgy Acanthopagrus Endocrinology, 161, pp 123-132 schlegeli, General and Comparative 124 168 Tong S., Ni Z., Peng H., Dong G., Sun Q (2007), Ectopic overexpression of wheat TaSrg6 gene confers water stress tolerance in Arabidopsis, Plant Science, 172, pp 1079-1086 169 Topping J.F (1998), Tobacco transformation, Methods Mol Biol., 81, pp 365-372 170 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress inducible NAC transcription factors that bind to a drought responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress promoter, Plant Cell, 16, pp 2481-2498 171 Tran L.S., Mochida K (2010a), Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions, Funct Integr Genomics, 10, pp 447-462 172 Tran T.C.H (2007), Study on the response capacity of genetic transformation of soybean varieties grown in Vietnam, Science & Technology Journal of Agriculture and Rural Development, 18, pp 9-14 173 Tran T.C.H., Tran V.H and La C.T (2008), Transformation efficiencies of the soybean variety PC19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method, Omonrice, 16, pp 1-8 174 Trick H.N., Dinkins R.D., Santarem E.R., Di R., Samoylov V., Meurer C.A., Walker D.R., Parrott Trick H.N., and Finer J.J (1997b), SAAT: Aonication-assisted Agrobacterium-mediated trans-formation, Transgenic Res, 6, pp 329-336 175 Tripathi P., Rabara J.S., Subramanian S., Shen R.C., Reese Q.J., Morandi R.N., Miller D., Bücking M.A., Rohila H., Shulaev V., Rushton P.J (2016), A toolbox of genes, proteins, metabolites and promoters for improving drought tolerance in soybean includes the 125 metabolite coumestrol and stomatal development genes, BMC Genomics 17(1),102 doi: 10.1186/s12864-016-2420-0 176 Trujillo L., Menendez C., Ochogavia M.E., Hernandez I., Borras O., Rodriguez R., Coll Y., Arrieta J.G., Banguela A., Ramirez R., Hernandez L (2009), Engineering drought and salt tolerance in plants using SodERF3, a novel sugarcane ethylene responsive factor, Biotech-nologia Aplicada, 26, pp 168-171 177 Valliyodan B., Nguyen H (2006), Understanding regulatory networks and engineering for enhanced drought tolerance in plants, Curr Opin Plant Biol., 9, pp 1-7 178 Vágújfalvi A., Galiba G., Cattivelli L., Dubcovsky J (2003), The coldregulated transcriptional activator Cbf3 is linked to the frost-tolerance locus Fr-A2 on wheat chromosome 5A, Mol Genet Genomics, 269, pp 60-67 179 Wang G and Xu Y (2008), Hypocotyl-based Agrobacterium-medi-ated transformation of soybean (Glycine max) and application for RNA interference, Plant Cell Rep., 27, pp 1177-1184 180 Wang N., Liu M., Cheng X and Ma Y (2006), Glycine max DREB protein (DREB2) gene, complete cds GenBank: DQ054363.1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 181 Wang Y., Jiang J., Zhao X., Liu G , Yang C., et al (2006), A novel LEA gene from Tamarix androssowii confers drought tolerance in transgenic tobacco, Plant Science, 171, pp 655-662 182 Wang Q.Y., Guan Y.C., Wu Y.R., Chen H.L., Chen F., Chu C.C (2008), Overex-pression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice, Plant Mol Biol., 67, pp 589-602 183 Wang S., Yang S., Yin Y., Guo X., Wang S., et al (2009), An in silico strategy identified the target gene candidates regulated by dehydration 126 responsive element binding proteins (DREBs) in Arabidopsis genome, Plant Mol Biol., 69, pp 167-178 doi: 10.1007/s11103-008-9414-5 184 Weigel D (1995), The APETALA2 domain is related to a novel type of DNA binding domain, Plant Cell , 7, pp 388-389 185 Whitman M., Downes C.P., Keeler M., Keller T., Cantley L (1988), Type Iphosphatidylinositol kinase makes a novel inositol phospholipid, phosphatidylinositol-3-phosphate, Nature, 332, pp 644-646 186 Wiebke-Strohm B., Pasquali G., Margis-Pinheiro M., Bencke M., BückerNeto M., Becker-Ritt A.B., Martinelli A.H.S., Polacco J.C., Stolf R., Marcelino F.C., et al (2012), Ubiquitous urease affects soybean susceptibility to fungi, Plant Mol Biol., 79, pp 75-87 187 Xue G.P., Loveridge C.W (2004), HvDRF1 is involved in abscisic acidmediated gene regulation in barley and produces two forms of AP2 transcriptional activators, interacting preferably with a CT-rich element, The Plant J., 37, pp 326-339 188 Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (2006), Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses, Annu Rev Plant Biol., 57, pp 781-803 189 Yoshida T., Sakuma Y., Todaka D., Maruyama K., Qin F., Mizoi J., Kidokoro S., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2008), Functional analysis of an Arabidopsis heat-shock transcription factor HsfA3 in the transcriptional cascade downstream of the DREB2A stress-regulatory system, Biochem Biophys Res Commun., 368, pp 515-521 190 Yorinori J.T., Paiva W.M., Frederick R.D., Costamilan L.M., Bertagnolli P.F., Hartman G.E., Godoy C.V., Nunes J.J.R (2005), Epidemics of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003, Plant Dis, 89, pp 675-677 127 191 Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z and Polacco J.C (2004), Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill], Plant Cell Rep, 22, pp 478-482 192 Zhang G., Chen M., Chen X., Xu Z., Guan S., et al (2008), Phylogeny, gene structures, and expression patterns of the ERF gene family in soybean (Glycine max L.), J Exp Bot., 59, pp 4095-4107 193 Zhang G., Chen M., Li L., Xu Z., Chen X., et al (2009), Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increasedtolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco, J Exp Bot., 60, pp 3781-3796 194 Zhang X., Wollenweber B., Jiang D., Liu F., Zhao J (2008), Water deficits and heat shock effects on photosynthesis of a transgenic Arabidopsis thaliana constitutively expressing ABP9, a bZIP transcription factor, J Exp Bot., 59, pp 839-848 195 Zhou Q.Y., Tian A.G., Zou H.F., Xie Z.M., Lei G., et al (2008), Soybean WRKY type transcription factor genes, GmWRKY13, GmWRKY21, and GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants, Plant Biotechnol J., 6, pp 486-503 196 Zhou J., Xie J., Liao H., Wang X (2014), Overexpression of β-expansin gene GmEXPB2 improves phosphorus efficiency in soybean, Physiol Plant., 150(2), pp 194-204 197 Zhu J.K (2001), Plant salt tolerance, Trends Plant Sci., 6, pp 66-71 198 Zhu Q., Zhang J., Gao X., Tong J., Xiao L., Li W., Zhang H (2010), The Arabidopsis AP2/ERF transcription factor RAP2.6 participates in ABA, salt and osmotic stress responses, Gene, 457, pp 1-12 199 Zhuang J., Cai B., Peng R.H., Zhu B., Jin X.F., et al (2008), Genome-wide analysis of the AP2/ERF gene family in Populus trichocarpa, Biochem Biophys Res Commun., 371, pp 468-474 128 200 Zhuang J., Peng R.H., Cheng Z.M., Zhang J., Cai B., et al (2009), Genome-wide analysis of the putative AP2/ERF family genes in Vitis vinifera, Scientia Horticulturae, 123, pp 73-81 201 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?cmd=retrieve&list_uids=732579 202 http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K0651 ... GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn đậu tương (Glycine max (L. ) Merrill) " 4 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Phân tích đươ ̣c đặc điểm gen GmDREB2 phân l? ??p từ giống đậu tương Viê ̣t Nam có khả chịu hạn khác... TƯƠNG 1.3.1 Cây đâ ̣u tương và tác động hạn đậu tương Đậu tương hay gọi đậu nành, tên khoa học Glycine max (L. ) Merrill (2n= 40) thuộc họ Đậu (Lenguminoceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae)... tự gen GmDREB2 phân l? ??p từ đậu tương Phân tích tính đa dạng trình tự nucleotide protein gen GmDREB2 đậu tương 3.2 Nghiên cứu thiế t kế vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc mang gen GmDREB2