trong thực phẩm chẳng hạn như phương pháp vi sinh, đòi hỏi nhiều bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, sau đó là xét nghiệm sinh hóa và huyết thanh học.. Vì vậy, việc phát triển và
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TIỂU LUẬN MÔN HỌC
PHÁT HIỆN Salmonella spp TRONG THỊT GÀ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP IC-LAMP (MAGNETIC IMMUNOCAPTURED LOOP MEDIATED
Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ BÍCH ĐÀO
NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH NGUYỄN THỊ MINH HẠNH
TP Thủ Đức, 10/2023
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TIỂU LUẬN MÔN HỌC
PHÁT HIỆN Salmonella spp TRONG THỊT GÀ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP IC-LAMP (MAGNETIC IMMUNOCAPTURED LOOP MEDIATED
Môn Thiết bị và kỹ thuật Công nghệ sinh học
Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện
TS HUỲNH VĂN BIẾT VÕ THỊ BÍCH ĐÀO
TRƯƠNG QUANG TOẢN NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH
TP Thủ Đức, 10/2023
Trang 3MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii
DANH SÁCH CÁC BẢNG iii
DANH SÁCH CÁC HÌNH iv
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu ngiên cứu 3
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4
2.1 Thu thập mẫu 4
2.2 Định tính Salmonella spp 4
2.2.1 Thiết kế hạt từ tính miễn dịch 4
2.2.2 Phản ứng IC-LAMP 5
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ DỰ KIẾN 7
Trang 4DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
IC-LAMP : Magnetic Immunocaptured Loop Mediated Isothermal Amplification PCR : Polemerase Chain Reaction
EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid
FIP : Forword inner primer
BIP : Backward inner primer
PBS-T : Phosphate-buffered saline
Trang 5DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Trình tự bốn đoạn primer được sử dụng trong kỹ thuật LAMP 5 Bảng 2.2 Các thành phần có trong phản ứng IC-LAMP 5
Trang 6DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1 Kết quả của mẫu sau khi quan sát dưới tia UV (Zhang, L và cộng sự, 2020) 7
Trang 7CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề
Thịt gà là thực phẩm rất được ưa chuộng trên thế giới cũng như ở Việt Nam, mang lại nhiều giá trị dinh dưỡng đối với sức khỏe cho con người Bên cạnh đó, việc chăn nuôi gà cũng đóng góp rất lớn vào chuyển dịch cơ cấu chăn nuôi và tăng trưởng chung của ngành nông nghiệp, mang lại một nguồn thu nhập đáng kể cho người nông dân Theo niên thám thống kê năm 2022, số lượng thịt gà hơi xuất chuồng là 1,720,730 tấn Tuy nhiên thịt gà là
một trong những ổ chứa Salmonella spp chính và các lò mổ được xác định là địa điểm quan
trọng gây lây nhiễm chéo mầm bệnh này Việc tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc từ động vật bị ô nhiễm như thịt gà và các sản phẩm từ gia cầm là nguồn lây truyền phổ biến nhất
của Salmonella spp sang người Chúng xâm nhập và định cư trong ruột của người, dẫn đến
viêm dạy dày-ruột, nhiễm trùng huyết, sốt thương hàn, … Số lượng các bệnh truyền nhiễm
liên quan đến Salmonella spp ngày càng tăng, trở thành gánh nặng đối với hầu hết các nước
đang phát triển do chi phí điều trị, phòng ngừa và các chiến dịch kiểm soát bệnh cao Chính
vì sự nguy hiểm ấy mà hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam và
thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella spp trong thực phẩm
Salmonellosis, một trong những bệnh do vi khuẩn lây truyền qua thực phẩm phổ biến
nhất trên toàn cầu là do Salmonella spp (Kirk và ctv, 2015) Hai tác nhân gây bệnh Salmonellosis chính là Salmonella Enteritis and Salmonella Typhimurium (Andreoletti và ctv,2008; Abd El-Aziz và ctv,2021) Salmonella spp là vi khuẩn gram âm, hình que, kỵ khí tùy ý, thuộc họ Enterobacteriaceae Có rất nhiều phương pháp để phát hiện Salmonella
spp trong thực phẩm chẳng hạn như phương pháp vi sinh, đòi hỏi nhiều bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, sau đó là xét nghiệm sinh hóa và huyết thanh học Do đó các xét nghiệm này rất phức tạp và quy trình vận hành tốn thời gian (5-7 ngày) gây khó khăn cho
việc xử lý số lượng lớn các xét nghiệm thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp Bên cạnh đó còn có một số kỹ thuật phát hiện Salmonella spp khác như PCR cũng được thực hiện, chẳng
hạn như immuno-PCR, real-time PCR và multiplex PCR Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch dựa trên kháng nguyên cho kết quả đặc hiệu, chính xác, thời gian phát hiện
Trang 8ngắn (2 ngày) Tuy nhiên, các phương pháp này không thể đáp ứng nhu cầu xét nghiệm tại chỗ vì yêu cầu các thiết bị phức tạp và chi phí cao Vì vậy, việc phát triển và ứng dụng một phương pháp chẩn đoán nhanh, đáng tin cậy, ít tốn kém, có thể phát hiện và sàng lọc
Salmonella spp ngay tại hiện trường là yêu cầu cấp thiết
Công nghệ LAMP là một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn cho các phương pháp chẩn đoán dựa trên DNA truyền thống nhờ ưu điểm đáng kể về độ nhạy, độ đặc hiệu và thời gian phân tích Kỹ thuật LAMP là phương pháp khuếch đại DNA (tổng hợp một đoạn DNA lớn) mà không cần các chu trình biến nhiệt được phát triển bởi Notomi và cộng tác viên (2000), thường ứng dụng để phát hiện mầm bệnh trong mẫu bệnh phẩm và mẫu thực phẩm
Kỹ thuật LAMP sử dụng bốn hoặc sáu đoạn mồi để thực hiện khuếch đại gen mục tiêu ở
mức nhiệt độ duy nhất là 60°C - 65°C trong khoảng 15 - 60 phút Và Bst DNA
polymerase không chỉ tổng hợp DNA mà còn có hoạt động tổng hợp DNA dịch chuyển chuỗi tự động theo chu kỳ LAMP khuếch đại DNA mục tiêu khá hiệu quả, với 109 bản sao được tạo ra trong vòng một giờ Hơn nữa, bởi vì LAMP tổng hợp một lượng lớn DNA, các sản phẩm có thể được phát hiện bằng mắt thường do sự kết tủa của phản ứng tạo muối pyrophotphate (Mg2P2O7) hoặc phát quang khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Kỹ thuật LAMP
sẽ phù hợp cho các hoạt động thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm cũng như phòng thí nghiệm với trang thiết bị còn hạn chế Vì vậy LAMP là một tiềm năng để phát hiện
Salmonella spp nhanh chóng, có độ đặc hiệu cao, tiết kiệm chi phí và thời gian.Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế khi sử dụng phương pháp này, bao gồm nhu cầu trích xuất DNA bộ gen hoặc plasmid để sử dụng làm mẫu và khó áp dụng công nghệ này cho số lượng lớn mẫu Hiện nay cũng có nhiều bước phát triển và cải tiến phương pháp này, một trong số đó
là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng kết hợp với xét nghiệm thu hồi miễn dịch từ tính (IC-LAMP) Kỹ thuật IC-LAMP lần đầu tiên được phát triển để phát hiện
Shigella sp trong môi trường nuôi cấy nguyên chất, sữa nhân tạo và mẫu phân lâm sàng
(Zhang và ctv,2018) Phương pháp này thể hiện giới hạn phát hiện là 8,7 CFU/ml (Zhang
và ctv,2018) Kỹ thuật này sử dụng tích hợp cả tính đặc hiệu của kháng thể và LAMP, giúp làm tăng tế bào mầm bệnh hiệu quả hơn và không cần tách chiết DNA bộ gen Thời gian phân tích tổng thể là khoảng 1 giờ, bao gồm cả quá trình làm tăng và ly giải tế bào vi khuẩn,
Trang 9thời gian phát hiện ngắn Gen mục tiêu cho hầu hết các xét nghiệm đã phát triển là inv A
chỉ hiện diện ở Salmonella spp (Hara-Kudo và ctv, 2005; Jiang và ctv, 2012) Gen invA,
một trong những gen độc lực của nhiễm sắc thể, đã được chứng minh là độc nhất đối
với Salmonella spp (Zahraei Salehi và ctv, 2005; Rahn và ctv, 1992; Malmarugan và ctv,
2011) Nghiên cứu được tiến hành để tập trung thiết lập quy trình IC-LAMP dựa trên gen
độc lực invA và kháng thể kháng Salmonella spp để phát hiện Salmonella spp nhanh
chóng, chính xác, với độ đặc hiệu cao
1.2 Mục tiêu ngiên cứu
Phát hiện Salmonella spp trong thịt gà bằng kỹ thuật IC-LAMP
Trang 10CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thu thập mẫu
Mẫu thịt gà tươi được lấy ở chợ đầu mối và các địa điểm giết mổ trong chợ Thủ Đức thành phố Thủ Đức Thành phố Hồ Chí Minh trong điều kiện vô trùng, dụng cụ lấy
và chứa mẫu phải được khử trùng, thao tác thực hiện không làm nhiễm chéo vi khuẩn cũng như nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài Lấy mẫu ngẫu nhiên và đủ lượng mẫu theo quy định
Thời gian lấy mẫu và vị trí lấy: Lấy ngẫu nhiên 1 mẫu/100 thân thịt gà Mẫu được thu thập trong khoảng thời gian 6 giờ đến 6 giờ 30 sáng Đối với lò mổ mẫu được lấy tại
vị trí rửa lần cuối hoặc trước khi làm lạnh khi quá trình giết mổ đang diễn ra và lấy tại bàn đối với chợ đầu mối
Qui trình lấy mẫu
Bước 1: chuẩn bị đầy đủ vật liệu và dụng cụ trước khi thực hiện việc lấy mẫu
Bước 2: dán tem ghi ký hiệu mẫu
Bước 3: đeo găng tay trước khi bắt đầu thao tác lấy mẫu
Bước 4: lấy ngẫu nhiên thân thịt gia cầm tại vị trí rửa lần cuối/trước khi làm lạnh (lò mổ) hoặc tại bàn bán buôn của chợ đầu mối
Bước 5: cho thân thịt vào túi vô trùng, đóng kín miệng túi
Bước 6: cho túi mẫu vào trong thùng bảo quản
Ngay sau khi lấy mẫu, mẫu phải được cho vào thùng lạnh có đá và giữ ở mức nhiệt độ 1℃ đến 5℃ từ lúc lấy mẫu đến khi phân tích Đối với phân tích vi sinh vật, thời gian lưu mẫu tối đa từ lúc lấy mẫu tới khi phân tích là 24 giờ Không được để mẫu đông lại trước khi phân tích vi sinh
2.2 Định tính Salmonella spp
2.2.1 Thiết kế hạt từ tính miễn dịch
Các hạt từ tính (Fe3O4) được phủ protein A/G (Biotool, Hoa Kỳ) sau đó được tạo huyền phù và chuyển 25μl sang effendoft Các hạt từ tính được rửa bằng dung dịch đệm (150mM/L NaCl, 50mM/L Tris, 0,5% Tween 20, pH=7,5) Quá trình tách từ: phần nổi phía trên được loại bỏ và thêm vào 200 μl dung dịch đệm Tiếp đến 50 μl kháng thể
Trang 11PA1-73021 (Invitrogen, Mỹ) được chuyển vào effendoft và ủ trong 2 giờ ở 37ºC Các kháng thể không liên kết sẽ được loại bỏ và các hạt được rửa ba lần bằng PBS-T Các hạt từ
tính miễn dịch sẽ thu giữ Salmonella spp (mẫu đã được lắc với nước cất trong 30 phút nếu có Salmonella spp) ở 37ºC trong 30 phút Thêm 10 μl dung dịch A (125mM NaOH,
1mM EDTA, 0,1% Tween 20) vào các ống sau đó ủ ở 65ºC trong 10 phút để ly giải tế bào vi khuẩn Bước cuối cùng thêm 10 μl dung dịch B (125mM HCl, 10 mM Tris) vào
để kết thúc phản ứng
2.2.2 Phản ứng IC-LAMP
Thiết lập đối chứng âm và đối chứng dương
Đối chứng âm là mẫu thịt đã được tiệt trùng và chắc chắn không có sự hiện diện của
Salmonella spp hay bất cứ vi khuẩn nào Đối chứng dương là mẫu thịt đã được tiệt trùng
sau đó ngâm với dịch vi khuẩn Salmonella spp
Chuẩn bị primer
Xét nghiệm LAMP được thực hiện theo mô tả của Notomi và ctv (2000), Savan và ctv
(2004), LAMP yêu cầu một bộ bốn primer để phát hiện gen invA ở Salmonella spp
(Nguyen Pham Truc Phuong và ctv, 2022)
Bảng 2.1 Trình tự bốn đoạn primer được sử dụng trong kỹ thuật LAMP
FIP GCGCGGCATCCGCATCAATA-TGCCCGGTAAACAGATGAGT BIP GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC
Thành phần phản ứng
Bảng 2.2 Các thành phần có trong phản ứng IC-LAMP
Tên Nơi sản xuất Nồng độ ban
đầu
Nồng độ cuối cùng lysate vi khuẩn
Isothermal Amplification Buffer II 10X 1X
Trang 12MgSO4 100mM 6 mM Bst 3.0 polymerase NEB, Mỹ 8000 U ml−1 320 U ml−1
Primer FIP, BIP IDT, Mỹ 40 μM 1,6 μM Primer F3, B3 IDT, Mỹ 5 µM 0,2 μM
H2O
Quy trình thực hiện
Cho lần lượt các chất vào effendoft và ủ ở 65°C trong 60 phút Sau đó tăng nhiệt
độ lên 80°C trong 10 phút để kết thúc phản ứng Cho vào effendoft chất nhuộm SYBR Green I (1µl/25µl) mẫu và quan sát phản ứng dương tính nếu chuyển màu từ cam nhạt sang xanh dưới tia UV 310 nm
Trang 13CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ DỰ KIẾN
Sau khi kết thúc phản ứng LAMP và nhuộm mẫu bằng SYBR Greeen I, quan sát dưới tia
UV 300 nm ta được kết quả như hình
Hình 3.1 Kết quả của mẫu sau khi quan sát dưới tia UV (Zhang, L và cộng sự, 2020).
(1), (2) Dương tính; (3),(4),(5),(6),(7),(8) Âm tính
Trang 14Tài liệu tham khảo
1 Nguyen Pham Truc Phuong, Doan Thi Quynh Huong, Nguyen Van Luong (2022) DETECTION OF Salmonella spp IN FOOD BY LAMP (LOOP-MEDIATED
ISOTHERMAL AMPLIFICATION) METHOD TNU Journal of Science and
Technology 227(01), 92-101
2 Abd El-Aziz NK, Tartor YH, Gharieb RMA, et al (2021) Extensive Drug-Resistant
Salmonella enterica Isolated From Poultry and Humans: Prevalence and Molecular
Determinants Behind the Co-resistance to Ciprofloxacin and Tigecycline Front
Microbiol 12: 738784
3 Andreoletti O, Budka H, Buncic S, et al (2008) Microbiological risk assessment in feeding stuffs for food-producing animals Scientific Opinion of the Panel on Biological
Hazards European Food Safety Authority 720, 1-84
4 Hara-Kudo, Y., Yoshino, M., Kojima, T., Ikedo, M (2005) Loop-mediated isothermal
amplification for the rapid detection of Salmonella FEMS Microbiol Lett 253(1),
155-161
5 Jiang, K., Lv, Q., Zhang, D., et al (2012) A novel, sensitive, accurate multiplex
loop-mediated isothermal amplification method for detection of Salmonella spp., Shigella spp and Staphylococcus aureus in food J Food Agric Environ 10(3):252-256
6 Kirk MD, Pires SM, Black RE, et al (2015) World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 22 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: a data synthesis PLoS Med 12(12): e1001921 doi:10.1371/journal.pmed.1001921
7 Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., et
al (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Reseach
vol 28 (12): 63 doi: 10.1093/nar/28.12.e63
8 Savan, R., Igarashi, A., Matsuoka, S., and Sakai, M (2004) Sensitive and rapid detection of edwardsiellosis in fish by a loop-mediated isothermal amplification
method Appl Environ Microbiol 70: 621-624 doi: 10.1128/aem.70.1.621-624.2004
Trang 159 Zhang, L., Du, X., Chen, C., Han, Q., Chen, Q., Zhang, M., Xia, X., Song, Y., & Zhang,
J (2020) Development of a rapid, one-step-visual method to detect Salmonella based on IC-LAMP method Iranian journal of veterinary research 21(1), 20-25
10 Zhang, L., Wei, Q., Han, Q., Chen, Q., Tai, W., Zhang, J., Song, Y., Xia, X (2018)
Detection of Shigella in Milk and Clinical Samples by Magnetic Immunocaptured-Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay Original Research vol 9: 94
https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00094
11 Zahraei Salehi, T., Mahzounieh, M., and Saeedzadeh, A (2005).Detection of InvA
Gene in Isolated Salmonella from Broilers by PCR Method International Journal of
Poultry Science 4 (8): 557-559
12 Malmarugan, S., Thenmozhi, V., Johnson, R (2011) Inv A gene specific PCR for
detection of Salmonella from broilers Research vol 4(12): 562-564
13 Rahn, K., De Grandis, S A., Clarke, R C., McE en, S A., Galan, J E., Ginocchio, C., Curtiss, R., 3rd, and Gyles, C L (1992) Amplification of an invA gene sequence of
Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection
of Salmonella Molecular and cellular probes 6(4): 271–279 https://doi.org/10.1016/0890-8508(92)90002-f