nhóm 10 báo cáo sáng thứ 3 24 10

trong thực phẩm chẳng hạn như phương pháp vi sinh, đòi hỏi nhiều bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, sau đó là xét nghiệm sinh hóa và huyết thanh học.. Vì vậy, việc phát triển và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

PHÁT HIỆN Salmonella spp TRONG THỊT GÀ

BẰNG PHƯƠNG PHÁP IC-LAMP

(MAGNETIC IMMUNOCAPTURED LOOP MEDIATED

Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ BÍCH ĐÀO

NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH NGUYỄN THỊ MINH HẠNH

TP Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

PHÁT HIỆN Salmonella spp TRONG THỊT GÀ

BẰNG PHƯƠNG PHÁP IC-LAMP

(MAGNETIC IMMUNOCAPTURED LOOP MEDIATED

Môn Thiết bị và kỹ thuật Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS HUỲNH VĂN BIẾT VÕ THỊ BÍCH ĐÀO

TRƯƠNG QUANG TOẢN NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

TP Thủ Đức, 10/2023

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu ngiên cứu 3

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IC-LAMP : Magnetic Immunocaptured Loop Mediated Isothermal Amplification PCR : Polemerase Chain Reaction

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid FIP : Forword inner primer

BIP : Backward inner primer

PBS-T : Phosphate-buffered saline

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Trình tự bốn đoạn primer được sử dụng trong kỹ thuật LAMP 5 Bảng 2.2 Các thành phần có trong phản ứng IC-LAMP 5

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Kết quả của mẫu sau khi quan sát dưới tia UV (Zhang, L và cộng sự, 2020) 7

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Thịt gà là thực phẩm rất được ưa chuộng trên thế giới cũng như ở Việt Nam, mang lại nhiều giá trị dinh dưỡng đối với sức khỏe cho con người Bên cạnh đó, việc chăn nuôi gà cũng đóng góp rất lớn vào chuyển dịch cơ cấu chăn nuôi và tăng trưởng chung của ngành nông nghiệp, mang lại một nguồn thu nhập đáng kể cho người nông dân Theo niên thám thống kê năm 2022, số lượng thịt gà hơi xuất chuồng là 1,720,730 tấn Tuy nhiên thịt gà là

một trong những ổ chứa Salmonella spp chính và các lò mổ được xác định là địa điểm quan

trọng gây lây nhiễm chéo mầm bệnh này Việc tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc từ động vật bị ô nhiễm như thịt gà và các sản phẩm từ gia cầm là nguồn lây truyền phổ biến nhất

của Salmonella spp sang người Chúng xâm nhập và định cư trong ruột của người, dẫn đến

viêm dạy dày-ruột, nhiễm trùng huyết, sốt thương hàn, … Số lượng các bệnh truyền nhiễm

liên quan đến Salmonella spp ngày càng tăng, trở thành gánh nặng đối với hầu hết các nước

đang phát triển do chi phí điều trị, phòng ngừa và các chiến dịch kiểm soát bệnh cao Chính vì sự nguy hiểm ấy mà hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam và

thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella spp trong thực phẩm

Salmonellosis, một trong những bệnh do vi khuẩn lây truyền qua thực phẩm phổ biến

nhất trên toàn cầu là do Salmonella spp (Kirk và ctv, 2015) Hai tác nhân gây bệnh Salmonellosis chính là Salmonella Enteritis and Salmonella Typhimurium (Andreoletti và ctv,2008; Abd El-Aziz và ctv,2021) Salmonella spp là vi khuẩn gram âm, hình que, kỵ khí tùy ý, thuộc họ Enterobacteriaceae Có rất nhiều phương pháp để phát hiện Salmonella

spp trong thực phẩm chẳng hạn như phương pháp vi sinh, đòi hỏi nhiều bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, sau đó là xét nghiệm sinh hóa và huyết thanh học Do đó các xét nghiệm này rất phức tạp và quy trình vận hành tốn thời gian (5-7 ngày) gây khó khăn cho

việc xử lý số lượng lớn các xét nghiệm thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp Bên cạnh đó còn có một số kỹ thuật phát hiện Salmonella spp khác như PCR cũng được thực hiện, chẳng

hạn như immuno-PCR, real-time PCR và multiplex PCR Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch dựa trên kháng nguyên cho kết quả đặc hiệu, chính xác, thời gian phát hiện

ngắn (2 ngày) Tuy nhiên, các phương pháp này không thể đáp ứng nhu cầu xét nghiệm tại chỗ vì yêu cầu các thiết bị phức tạp và chi phí cao Vì vậy, việc phát triển và ứng dụng một phương pháp chẩn đoán nhanh, đáng tin cậy, ít tốn kém, có thể phát hiện và sàng lọc

Salmonella spp ngay tại hiện trường là yêu cầu cấp thiết

Công nghệ LAMP là một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn cho các phương pháp chẩn đoán dựa trên DNA truyền thống nhờ ưu điểm đáng kể về độ nhạy, độ đặc hiệu và thời gian phân tích Kỹ thuật LAMP là phương pháp khuếch đại DNA (tổng hợp một đoạn DNA lớn) mà không cần các chu trình biến nhiệt được phát triển bởi Notomi và cộng tác viên (2000), thường ứng dụng để phát hiện mầm bệnh trong mẫu bệnh phẩm và mẫu thực phẩm Kỹ thuật LAMP sử dụng bốn hoặc sáu đoạn mồi để thực hiện khuếch đại gen mục tiêu ở

mức nhiệt độ duy nhất là 60°C - 65°C trong khoảng 15 - 60 phút Và Bst DNA

polymerase không chỉ tổng hợp DNA mà còn có hoạt động tổng hợp DNA dịch chuyển chuỗi tự động theo chu kỳ LAMP khuếch đại DNA mục tiêu khá hiệu quả, với 109 bản sao được tạo ra trong vòng một giờ Hơn nữa, bởi vì LAMP tổng hợp một lượng lớn DNA, các sản phẩm có thể được phát hiện bằng mắt thường do sự kết tủa của phản ứng tạo muối pyrophotphate (Mg2P2O7) hoặc phát quang khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Kỹ thuật LAMP sẽ phù hợp cho các hoạt động thực hiện bên ngoài phòng thí nghiệm cũng như phòng thí nghiệm với trang thiết bị còn hạn chế Vì vậy LAMP là một tiềm năng để phát hiện

Salmonella spp nhanh chóng, có độ đặc hiệu cao, tiết kiệm chi phí và thời gian.Tuy nhiên, vẫn còn một số hạn chế khi sử dụng phương pháp này, bao gồm nhu cầu trích xuất DNA bộ gen hoặc plasmid để sử dụng làm mẫu và khó áp dụng công nghệ này cho số lượng lớn mẫu Hiện nay cũng có nhiều bước phát triển và cải tiến phương pháp này, một trong số đó là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng kết hợp với xét nghiệm thu hồi miễn dịch từ tính (IC-LAMP) Kỹ thuật IC-LAMP lần đầu tiên được phát triển để phát hiện

Shigella sp trong môi trường nuôi cấy nguyên chất, sữa nhân tạo và mẫu phân lâm sàng

(Zhang và ctv,2018) Phương pháp này thể hiện giới hạn phát hiện là 8,7 CFU/ml (Zhang và ctv,2018) Kỹ thuật này sử dụng tích hợp cả tính đặc hiệu của kháng thể và LAMP, giúp làm tăng tế bào mầm bệnh hiệu quả hơn và không cần tách chiết DNA bộ gen Thời gian phân tích tổng thể là khoảng 1 giờ, bao gồm cả quá trình làm tăng và ly giải tế bào vi khuẩn,

thời gian phát hiện ngắn Gen mục tiêu cho hầu hết các xét nghiệm đã phát triển là inv A

chỉ hiện diện ở Salmonella spp (Hara-Kudo và ctv, 2005; Jiang và ctv, 2012) Gen invA,

một trong những gen độc lực của nhiễm sắc thể, đã được chứng minh là độc nhất đối

với Salmonella spp (Zahraei Salehi và ctv, 2005; Rahn và ctv, 1992; Malmarugan và ctv,

2011) Nghiên cứu được tiến hành để tập trung thiết lập quy trình IC-LAMP dựa trên gen

độc lực invA và kháng thể kháng Salmonella spp để phát hiện Salmonella spp nhanh

chóng, chính xác, với độ đặc hiệu cao

1.2 Mục tiêu ngiên cứu

Phát hiện Salmonella spp trong thịt gà bằng kỹ thuật IC-LAMP

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thu thập mẫu

Mẫu thịt gà tươi được lấy ở chợ đầu mối và các địa điểm giết mổ trong chợ Thủ Đức thành phố Thủ Đức Thành phố Hồ Chí Minh trong điều kiện vô trùng, dụng cụ lấy và chứa mẫu phải được khử trùng, thao tác thực hiện không làm nhiễm chéo vi khuẩn cũng như nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài Lấy mẫu ngẫu nhiên và đủ lượng mẫu theo quy định

Thời gian lấy mẫu và vị trí lấy: Lấy ngẫu nhiên 1 mẫu/100 thân thịt gà Mẫu được thu thập trong khoảng thời gian 6 giờ đến 6 giờ 30 sáng Đối với lò mổ mẫu được lấy tại vị trí rửa lần cuối hoặc trước khi làm lạnh khi quá trình giết mổ đang diễn ra và lấy tại bàn đối với chợ đầu mối

Qui trình lấy mẫu

Bước 1: chuẩn bị đầy đủ vật liệu và dụng cụ trước khi thực hiện việc lấy mẫu Bước 2: dán tem ghi ký hiệu mẫu

Bước 3: đeo găng tay trước khi bắt đầu thao tác lấy mẫu

Bước 4: lấy ngẫu nhiên thân thịt gia cầm tại vị trí rửa lần cuối/trước khi làm lạnh (lò mổ) hoặc tại bàn bán buôn của chợ đầu mối

Bước 5: cho thân thịt vào túi vô trùng, đóng kín miệng túi Bước 6: cho túi mẫu vào trong thùng bảo quản

Ngay sau khi lấy mẫu, mẫu phải được cho vào thùng lạnh có đá và giữ ở mức nhiệt độ 1℃ đến 5℃ từ lúc lấy mẫu đến khi phân tích Đối với phân tích vi sinh vật, thời gian lưu mẫu tối đa từ lúc lấy mẫu tới khi phân tích là 24 giờ Không được để mẫu đông lại trước khi phân tích vi sinh

2.2 Định tính Salmonella spp

2.2.1 Thiết kế hạt từ tính miễn dịch

Các hạt từ tính (Fe3O4) được phủ protein A/G (Biotool, Hoa Kỳ) sau đó được tạo huyền phù và chuyển 25μl sang effendoft Các hạt từ tính được rửa bằng dung dịch đệm (150mM/L NaCl, 50mM/L Tris, 0,5% Tween 20, pH=7,5) Quá trình tách từ: phần nổi phía trên được loại bỏ và thêm vào 200 μl dung dịch đệm Tiếp đến 50 μl kháng thể

PA1-73021 (Invitrogen, Mỹ) được chuyển vào effendoft và ủ trong 2 giờ ở 37ºC Các kháng thể không liên kết sẽ được loại bỏ và các hạt được rửa ba lần bằng PBS-T Các hạt từ

tính miễn dịch sẽ thu giữ Salmonella spp (mẫu đã được lắc với nước cất trong 30 phút nếu có Salmonella spp) ở 37ºC trong 30 phút Thêm 10 μl dung dịch A (125mM NaOH,

1mM EDTA, 0,1% Tween 20) vào các ống sau đó ủ ở 65ºC trong 10 phút để ly giải tế bào vi khuẩn Bước cuối cùng thêm 10 μl dung dịch B (125mM HCl, 10 mM Tris) vào để kết thúc phản ứng

2.2.2 Phản ứng IC-LAMP

Thiết lập đối chứng âm và đối chứng dương

Đối chứng âm là mẫu thịt đã được tiệt trùng và chắc chắn không có sự hiện diện của

Salmonella spp hay bất cứ vi khuẩn nào Đối chứng dương là mẫu thịt đã được tiệt trùng

sau đó ngâm với dịch vi khuẩn Salmonella spp

Chuẩn bị primer

Xét nghiệm LAMP được thực hiện theo mô tả của Notomi và ctv (2000), Savan và ctv

(2004), LAMP yêu cầu một bộ bốn primer để phát hiện gen invA ở Salmonella spp

(Nguyen Pham Truc Phuong và ctv, 2022)

Bảng 2.1 Trình tự bốn đoạn primer được sử dụng trong kỹ thuật LAMP

Bảng 2.2 Các thành phần có trong phản ứng IC-LAMP

Tên Nơi sản xuất Nồng độ ban

Cho lần lượt các chất vào effendoft và ủ ở 65°C trong 60 phút Sau đó tăng nhiệt độ lên 80°C trong 10 phút để kết thúc phản ứng Cho vào effendoft chất nhuộm SYBR Green I (1µl/25µl) mẫu và quan sát phản ứng dương tính nếu chuyển màu từ cam nhạt sang xanh dưới tia UV 310 nm

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ DỰ KIẾN

Sau khi kết thúc phản ứng LAMP và nhuộm mẫu bằng SYBR Greeen I, quan sát dưới tia UV 300 nm ta được kết quả như hình

Hình 3.1 Kết quả của mẫu sau khi quan sát dưới tia UV (Zhang, L và cộng sự, 2020).

(1), (2) Dương tính; (3),(4),(5),(6),(7),(8) Âm tính

Tài liệu tham khảo

1 Nguyen Pham Truc Phuong, Doan Thi Quynh Huong, Nguyen Van Luong (2022) DETECTION OF Salmonella spp IN FOOD BY LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) METHOD TNU Journal of Science and Technology 227(01), 92-101

2 Abd El-Aziz NK, Tartor YH, Gharieb RMA, et al (2021) Extensive Drug-Resistant

Salmonella enterica Isolated From Poultry and Humans: Prevalence and Molecular

Determinants Behind the Co-resistance to Ciprofloxacin and Tigecycline Front

Microbiol 12: 738784

3 Andreoletti O, Budka H, Buncic S, et al (2008) Microbiological risk assessment in feeding stuffs for food-producing animals Scientific Opinion of the Panel on Biological

Hazards European Food Safety Authority 720, 1-84

4 Hara-Kudo, Y., Yoshino, M., Kojima, T., Ikedo, M (2005) Loop-mediated isothermal

amplification for the rapid detection of Salmonella FEMS Microbiol Lett 253(1),

155-161

5 Jiang, K., Lv, Q., Zhang, D., et al (2012) A novel, sensitive, accurate multiplex

loop-mediated isothermal amplification method for detection of Salmonella spp., Shigella spp and Staphylococcus aureus in food J Food Agric Environ 10(3):252-256

6 Kirk MD, Pires SM, Black RE, et al (2015) World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 22 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: a data synthesis PLoS Med 12(12): e1001921 doi:10.1371/journal.pmed.1001921

7 Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., et

al (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Reseach

vol 28 (12): 63 doi: 10.1093/nar/28.12.e63

8 Savan, R., Igarashi, A., Matsuoka, S., and Sakai, M (2004) Sensitive and rapid detection of edwardsiellosis in fish by a loop-mediated isothermal amplification

method Appl Environ Microbiol 70: 621-624 doi: 10.1128/aem.70.1.621-624.2004

9 Zhang, L., Du, X., Chen, C., Han, Q., Chen, Q., Zhang, M., Xia, X., Song, Y., & Zhang,

J (2020) Development of a rapid, one-step-visual method to detect Salmonella based on IC-LAMP method Iranian journal of veterinary research 21(1), 20-25

10 Zhang, L., Wei, Q., Han, Q., Chen, Q., Tai, W., Zhang, J., Song, Y., Xia, X (2018)

Detection of Shigella in Milk and Clinical Samples by Magnetic Immunocaptured-Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay Original Research vol 9: 94

https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00094

11 Zahraei Salehi, T., Mahzounieh, M., and Saeedzadeh, A (2005).Detection of InvA

Gene in Isolated Salmonella from Broilers by PCR Method International Journal of

Poultry Science 4 (8): 557-559

12 Malmarugan, S., Thenmozhi, V., Johnson, R (2011) Inv A gene specific PCR for

detection of Salmonella from broilers Research vol 4(12): 562-564

13 Rahn, K., De Grandis, S A., Clarke, R C., McE en, S A., Galan, J E., Ginocchio, C., Curtiss, R., 3rd, and Gyles, C L (1992) Amplification of an invA gene sequence of

Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection

of Salmonella Molecular and cellular probes 6(4): 271–279 https://doi.org/10.1016/0890-8508(92)90002-f