Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography hplc)

Yêu cầu: tốc độ dòng một cách chính xác, ổn định để đảm sự ổn định thời gian lưu của chất phân tích.. Sắc ký pha thuận thường Sắc ký pha đảo - Độ phân cực của dung môi thấp - Độ phân cực

1

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC)

Nguyễn Viết Khẩn TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HUẾ

KHOA DƯỢC

1980s 1965-1967

The first commercial HPLC (Waters)

1979

commonly used

4

1 Giới thiệu

HPLC ?

Cho biết các bộ phận: số 1, 2, 3, 4, 5 của máy HPLC trong

sơ đồ sau:

Lọc qua

màng lọc

0,45µm

Loại bọt khí (siêu âm, sục khí trơ…)

8

(1) benzyl alcohol;

(2) phenol;

(3) 3,4-dimethoxyacetophenone; (4) benzoin;

(5) ethyl benzoate;

(6) toluene;

(7) 2,6-dimethoxytoluene;

(8) o-methoxybiphenyl

A: 25 mM KH2PO4 plus 0.1 g/L sodium azide adjusted to pH 3.5 with HCl

B: acetonitrile “90% B” means 10 vol% A and 90 vol% B

Hypersil™ ODS C18 Columns

Nhận xét, tối ưu?

9

A: 25 mM KH2PO4 plus 0.1 g/L sodium azide adjusted to pH 3.5 with HCl

B: acetonitrile “90% B” means 10 vol% A and 90 vol% B

13

Nhiệm vụ: đẩy pha động đi qua cột tách với một tốc độ xác định

Yêu cầu: tốc độ dòng một cách chính xác, ổn định để đảm sự ổn định thời gian lưu của chất phân tích

Piston Bi van vào

3 Hệ thống bơm

Low-pressure gradient

Mixer

3 Hệ thống bơm

4 Hệ tiêm mẫu

5 Cột sắc ký

Chiều dài cột: 5, 10, 15, 25 cm

Đường kính trong: 1 → 10 mm

Kích thước của chất nhồi: 1 → 10 µm

Cột bảo vệ (tiền cột): lọc các hạt rắn lẫn trong dung môi, mẫu

Thép không rỉ

Chất mang Tướng tĩnh

Cột C18

Sắc ký hấp phụ

Sắc ký phân bố

Sắc ký ion ( trao đổi ion)

Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại trừ phân tử)

Cơ chế của quá trình sắc ký

Sắc ký tách đồng phân quang học (chiral separation)

18

hoặc ion hóa rất yếu)

trong dung môi pha đảo

6 Pha động

Dung môi đạt độ tinh khiết cao (HPLC grade)

Đuổi khí oxy hòa tan

Mẫu phân tích phải tan hoàn toàn trong pha động

3 chát hay dùng: methanol, acetronitrine, nuóc

phancuc: Meoh, ACN, H2O, dem, NH3, Acld loãng

Kém PC: Hexan, CH2Cl2

19

axit nucleic, ion vô cơ

càng”, M khác nhau

6 Pha động

Chú ý : Aceton, THF ?

Sắc ký pha thuận (thường) Sắc ký pha đảo

- Độ phân cực của dung môi thấp - Độ phân cực của dung môi cao

- Chất kém phân cực ra trước - Chất phân cực ra trước

- Tăng độ phân cực dung môi:

rửa giải nhanh hơn

- Tăng độ phân cực dung môi: rửa giải chậm hơn

Ví dụ: bản chất chất phân tích

?

?

22

Aspirin Acid benzoic

Caffeine Acetaminophen

Ví dụ: bản chất chất phân tích

?

24

Ví dụ: thành phần pha động

MeOH:Water = 47.5:52.5 ACN:Water = 35:65

ZORBAX Eclipse XDB-CN ; 4.6 x 150 mm, 5 μm; flow Rate: 2.0 ml/min , 25 °C Detector: UV, 210 nm

Cho biết thứ tự rửa giải của các chất sau:

Ví dụ: pH

26

Ví dụ: pH

27

1 Thời gian lưu ( tR ) (retention time)

2 Hệ số phân bố K - (partition coefficient)

3 Hệ số dung lượng k’ - (capacity factor)

4 Hệ số chon lọc α

5 Hệ số đối xứng F và hệ số kéo đuôi As

6 Sự doãng pic - hiệu lực tách - số đĩa lý thuyết

7 Độ phân giải RS (Resolution)

7 Các thông số đặc trưng của sắc ký

Một số detector (bộ phận phát hiện) của HPLC phổ biến:

28

• Detector tử ngọai/khả kiến (ultraviolet/visible - UV/Vis)

• Detector huỳnh quang (fluorescence detector - RF)

• Detector điện hóa (electrochemical detector – ECD)

• Detector chỉ số khúc xạ (refractive index detector - RID)

• Detector tán xạ bay hơi (evaporative light scattering detector

- ELSD)

• Detector khối phổ (mass spectrometry detector - MSD)

8 Detector

8.1 Detector tử ngọai/khả kiến (ultraviolet/visible - UV/Vis)

thuộc tuyến tính vào nồng độ

C của nó theo định luật

Lambert-Beer: A = k.C UV detector cells: (a) traditional design;

(b) light-pipe or internal reflectance design

PDA detector cho phép quét phổ liên tục →

cho đồ thị 3D: tăng độ tin cậy (định tính),

xác định bước sóng tối ưu (định lượng)

Detector mảng diod (Photodiode Array Detector - PDA)

Thời gian

Chọn lọc hơn và nhạy hơn detector UV Đáp ứng với các chất phát huỳnh quang

8.2 Detector huỳnh quang (RF)

Nguyên tắc: tín hiệu đo dựa trên sự khác nhau giữa chỉ số khúc

xạ của giữa pha động không có và có chất phân tích

Đặc điểm: sử dụng rộng rãi cho hợp chất không có nhóm mang màu; độ nhạy kém, không chọn lọc, ít phổ biến; khó sử dụng với chế độ rửa giải gradient

8.3 Detector chỉ số khúc xạ (RID)

33

8.4 Detector tán xạ bay hơi (ELSD)

Nguyên tắc: đốt nóng hỗn hợp gồm dung dịch rửa giải + khí N2

→ dung môi bay hơi (loại bỏ), chất tan → tiểu phân phân tán

thành đám sương mù

Chùm laser chiếu qua các tiểu phân → tán xạ: được ống nhân quang ghi lại

Đặc điểm: Detector vạn năng, là

detector khối lượng (liên quan

đến khối lượng chất phân tích) có

thể phát hiện hợp chất không hấp

thụ/hấp thụ kém UV-Vis và sử

dụng được khi pha động ở chế

độ đẳng dòng hay gradient

34

8.5 Detector khối phổ (MSD)

Nguyên tắc:

Đặc điểm:

Reference cell

5

Detector hấp thụ UV-Vis

Detector mảng diod (DAD hay PDA)

- Dựa vào phổ UV-Vis hoặc

MS của mẫu và chuẩn

Định tính palmatine và berberin trong bài thuốc cổ truyền

Sắc ký đồ HPLC (a): mẫu trắng;

(b): mẫu chuẩn;

(c): mẫu thử dược liệu; (d): mẫu d.liệu thêm chuẩn

38

Định lượng hoạt chất palmatine trong một mẫu cao như sau:

(dung môi methanol) Hút 5,0 ml dung dịch này pha loãng bằng

Đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ (C) palmatine trong khoảng nồng độ 10 - 50 ppm: Y =

Yêu cầu của chuẩn nội:

toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hoá học tương tự như chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

Phương pháp nội chuẩn

Ví dụ:

Hệ số đáp ứng FX :

Mối tương quan của nồng độ (hoặc khối lượng) của chuẩn và chuẩn nội với tỷ số diện tích của 2 pic được thể hiện:

Phương pháp nội chuẩn

* So sánh phương pháp chuẩn ngoại và phương

X

S

S C

Phương pháp nội chuẩn

Phương pháp nội chuẩn 1 điểm:

Thêm chuẩn nội (có nồng độ xác định) vào cả mẫu chuẩn

và mẫu thử

thử được xác định:

Phương pháp nội chuẩn 1 điểm:

Thêm chuẩn nội (có nồng độ xác định) vào cả mẫu chuẩn

Tiến hành sắc ký mẫu chứa chất X 0.0837 M và chất nội chuẩn IS 0.0666 M thu được kết quả: AX = 423 và AIS = 347 Mặt khác, tiến hành sắc ký mẫu phân tích chứa chất X, thêm 10.0 mL dung dịch chuẩn nội IS 0.146 M vào 10.0mL dung dịch X, sau đó định mức 25.0mL thu được kết quả AX = 553 and AIS = 582 Xác định nồng độ chất X trong mẫu

Ví dụ:

trong mau ban dau0,143

Phương pháp nội chuẩn nhiều điểm:

48

Ví dụ: định lượng metoprolol trong huyết tương

Ưu điểm của HPLC

Tiểu luận

49

HepG2 SK-LU-1