Xác định đồng thời vitamin b1, b6 và b12 trong sữa bột và sữa tươi dielac grow plus và dielac alpha gold bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN GIA HUY XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B6 VÀ B12 TRONG SỮA BỘT VÀ SỮA TƯƠI DIELAC GROW PLUS VÀ DIELAC ALPHA GOLD BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Ngành: Hố Phân tích Mã số: 8.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Giảng viên hướng dẫn khoa học: PGS.TS Mai Xuân Trường THÁI NGUYÊN - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng cơng trình Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Gia Huy i LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường người tận tình giúp đỡ, dẫn em suốt trình nghiên cứu thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học cán phòng thí nghiệm Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho em trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện luận văn Do thời gian có hạn trình độ hạn chế, luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong đóng góp ý kiến thầy để luận văn hoàn thiện Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Người thực Nguyễn Gia Huy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN iv DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN v DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu vitamin B1 1.1.1.Tên gọi 1.1.2 Cơng thức hóa học 1.1.3 Tính chất vật lý 1.1.4 Tính chất hóa học 1.2 Giới thiệu vitamin B6 1.2.1 Tên gọi 1.2.2 Cơng thức hóa học 1.2.3 Tính chất vật lý 1.2.4 Tính chất hóa học 1.3 Giới thiệu vitamin B12 1.3.1 Tên gọi 1.3.2 Cơng thức hóa học 1.3.3 Tính chất vật lý 1.3.4 Tính chất hóa học 1.4 Nhu cầu vitamin B1, B6, B12 nguồn thực phẩm 1.5 Giới thiệu sữa Dielac Grow Plus sữa Dielac Alpha Gold 11 1.6 Tổng quan xác định vitamin B1, B6 B12 theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 12 iii 1.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng cột tách pha đảo RP-LC, detector UV-Vis 12 1.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector huỳnh quang 13 1.6.3 Phương pháp sắc ký lỏng HPLC sử dụng detector PDA 14 Chương 2: THỰC NGHIỆM 16 2.1 Nội dung phương pháp nghiên cứu 16 2.1.1 Nội dung nghiên cứu 16 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2 Thực nghiệm 20 2.2.1 Dụng cụ 20 2.2.2 Hóa chất 20 2.2.3 Các dung dịch tiêm sắc ký 20 2.3 Sơ đồ nghiên cứu phương pháp phân tích 23 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 24 3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng 24 3.1.2 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng chảy 25 3.1.3 Khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha động 26 3.2 Đánh giá phương pháp định lượng 28 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ vitamin B1, B6, B12 28 3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ vitamin B1, B6, B12 theo phương pháp thêm chuẩn 30 3.2.3 Kiểm tra tính thích hợp hệ thống 50 3.3 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa Dielac Grow Plus sữa Dielac Alpha Gold 53 3.3.1 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa bột Dielac Grow Plus sữa bột Dielac Alpha Gold 53 iv 3.3.2 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa tươi Dielac Grow Plus sữa tươi Dielac Alpha Gold 56 3.3.3 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa Dielac Grow Plus sữa Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn 61 KẾT LUẬN 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 74 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Axetonitril HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao PDA Photometric Diode Array Dãy diod quang ReV Recovery Độ thu hồi RSD UV – Vis Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối Ultra Violet – Visble iv Phổ tử ngoại – khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN Bảng 1.1: Tính chất vật lí dạng vitamin B6 Bảng 1.2 Nhu cầu cung cấp vitamin B1, B6 B12 người 10 Bảng 2.1 Các điều kiện tiến hành sắc ký 19 Bảng 3.1 Bước sóng hấp thụ cực đại vitamin B1, B6 B12 25 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính vitamin B1, B6 B12 28 Bảng 3.3 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Alpha Gold 31 Bảng 3.5 Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Alpha Gold 32 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B1 phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Alpha Gold 32 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Alpha Gold 33 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Alpha Gold 34 Bảng 3.9 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Grow Plus 36 Bảng 3.10 Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Grow Plus 36 Bảng 3.11 Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Grow Plus 37 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B1 phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Grow Plus 37 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Grow Plus 38 v Bảng 3.14 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa bột Dielac Grow Plus 39 Bảng 3.15 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Alpha Gold 41 Bảng 3.16 Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Alpha Gold 41 Bảng 3.17 Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Alpha Gold 42 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B1 phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Alpha Gold 42 Bảng 3.19 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Alpha Gold 43 Bảng 3.20 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Alpha Gold 44 Bảng 3.21 Xây dựng đường chuẩn vitamin B1 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Grow Plus 46 Bảng 3.22 Xây dựng đường chuẩn vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Grow Plus 46 Bảng 3.23 Xây dựng đường chuẩn vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Grow Plus 47 Bảng 3.24 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B1 phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Grow Plus 47 Bảng 3.25 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B6 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Grow Plus 48 Bảng 3.26 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B12 theo phương pháp thêm chuẩn sữa tươi Dielac Grow Plus 49 Bảng 3.27 Kết khảo sát thời gian lưu 50 Bảng 3.28 Kết khảo sát diện tích pic 51 vi Bảng 3.29 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 52 Bảng 3.30 Kết phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold 53 Bảng 3.31 Kết phân tích sữa bột Dielac Grow Plus 55 Bảng 3.32 Kết phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus 180 mL 57 Bảng 3.33 Kết phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold 180mL 59 Bảng 3.34 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa bột Dielac Alpha Gold 61 Bảng 3.35 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa bột Dielac Alpha Gold 61 Bảng 3.36 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa bột Dielac Alpha Gold 62 Bảng 3.37 Kết phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn 62 Bảng 3.38 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa bột Dielac Grow Plus 63 Bảng 3.39 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa bột Dielac Grow Plus 63 Bảng 3.40 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa bột Dielac Grow Plus 64 Bảng 3.41 Kết phân tích sữa bột Dielac Grow Plus theo phương pháp thêm chuẩn 64 Bảng 3.42 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa tươi Dielac Alpha Gold 65 Bảng 3.43 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa tươi Dielac Alpha Gold 66 Bảng 3.44 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa tươi Dielac Alpha Gold 66 Bảng 3.45 Kết phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn 67 Bảng 3.46 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa tươi Dielac Grow Plus 68 Bảng 3.47 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa tươi Dielac Grow Plus 68 Bảng 3.48 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa tươi Dielac Grow Plus 69 Bảng 3.49 Kết phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus theo phương pháp thêm chuẩn 69 vii Hình 3.29 Biểu đồ thể chênh lệch hàm lượng lí thuyết thực tế vitamin sữa tươi Dielac Alpha Gold 180 mL Nhận xét: Kết phân tích cho thấy hàm lượng nhà sản xuất công bố hàm lượng vitamin B1, B6 B12 xác định khác không đáng kể Riêng với vitamin B12 sữa có hàm lượng nhỏ giới hạn phát phương pháp Kết cho thấy độ lệch chuẩn tương đối %RSD vitamin B1 B6 2,07% 2,31% Điều chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có đủ tin cậy để phân tích sữa tươi Dielac Grow Gold 180 mL thực tế Các kết phân tích cho thấy hàm lượng nhà sản xuất công bố hàm lượng vitamin B1, B6 B12 xác định khác không đáng kể Riêng với vitamin B12 sữa có hàm lượng nhỏ giới hạn phát phương pháp Kết cho thấy độ lệch chuẩn tương đối %RSD chất phân tích hầu hết nhỏ Điều chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có đủ tin cậy để phân tích mẫu thực tế Đối với vitamin B12, hàm lượng sữa nhỏ, giới hạn phát phương pháp nên xác định phương pháp HPLC 60 3.3.3 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa Dielac Grow Plus sữa Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn 3.3.3.1 Xác định vitamin B1, B6 B12 sữa bột Dielac Alpha Gold phương pháp thêm chuẩn Cân xác 5,000 gam sữa bột Dielac Alpha Gold ứng với 0,0315 mg vitamin B1; 0,0375 mg vitamin B6 0,0750 μg vitamin B12 Hút xác mL vitamin B1, B6 B12 chuẩn với nồng độ gốc bảng 3.34; 3.35; 3.36 thêm vào ống tương ứng, thêm dung mơi pha mẫu cho tổng thể tích 25 mL Hòa tan rung siêu âm sau đem li tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc màng lọc có kích thước 0,45 μm Bảng 3.34 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa bột Dielac Alpha Gold Mẫu Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B1 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B1 thêm vào (ppm) - 4,00 8,00 10,00 14,00 Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B1 sau pha (ppm) 1,26 2,06 2,86 3,26 4,06 Bảng 3.35 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa bột Dielac Alpha Gold Mẫu Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B6 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B6 thêm vào (ppm) - 4,00 8,00 10,00 14,00 Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B6 sau pha (ppm) 1,50 2,30 3,10 3,50 4,30 61 Bảng 3.36 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa bột Dielac Alpha Gold Mẫu 10 11 12 13 Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B12 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B12 thêm vào (ppm) - Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) 25,0 Nồng độ vitamin B12 sau pha (ppm) 4,000 8,000 10,000 14,000 20,0 20,0 20,0 20,0 0,003 0,803 1,603 2,003 2,803 Tiến hành chạy sắc ký dung dịch theo điều kiện sắc ký chọn thu kết bảng 3.37 Bảng 3.37 Kết phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn Nồng độ vitamin Nồng độ vitamin Nồng độ xác định sau trước thêm chuẩn vitamin thêm thêm chuẩn theo thực STT theo lí thuyết (ppm) vào mẫu (ppm) nghiệm (ppm) B1 B6 B12 B1 B6 1,26 1,5 0,003 - - 1,26 1,5 1,26 B1 B6 B12 - 1,281 1,512 DGH 0,003 0,80 - - 2,021 1,512 DGH 92,50 1,5 0,003 1,60 - - 2,861 1,512 DGH 98,75 1,26 1,5 0,003 2,00 - - 3,151 1,512 DGH 93,50 1,26 1,5 0,003 2,80 - - 3,861 1,512 DGH 92,14 1,26 1,5 0,003 - 0,80 - 1,281 2,302 DGH 98,82 1,26 1,5 0,003 - 1,60 - 1,281 3,092 DGH 98,36 1,26 1,5 0,003 - 2,00 - 1,281 3,492 DGH 99,12 1,26 1,5 0,003 - 2,80 - 1,281 4,272 DGH 98,74 10 1,26 1,5 0,003 - - 0,80 1,281 1,512 0,705 87,75 11 1,26 1,5 0,003 - - 1,60 1,281 1,512 1,412 88,06 12 1,26 1,5 0,003 - - 2,00 1,281 1,512 1,858 92,75 13 1,26 1,5 0,003 - - 2,80 1,281 1,512 2,452 62 B12 ReV (%) 86,50 Nhận xét: Kết phân tích bàng 3.37 cho thấy hàm lượng nhà sản xuất công bố hàm lượng vitamin B1, B6 B12 xác định khác không đáng kể Kết cho thấy thu hồi B1 từ 92,14% đến 98,75%, B6 từ 98,36% đến 99,12%; B12 từ 86,50% đến 92,75% Điều chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có đủ tin cậy để phân tích sữa bột Dielac Alpha Gold thực tế 3.3.3.2 Xác định vitamin B1, B6 B12 sữa bột Dielac Grow Plus phương pháp thêm chuẩn Cân xác 5,000 gam sữa bột Dielac Grow Plus ứng với 0,0550 mg vitamin B1; 0,0550 mg vitamin B6 0,1100 μg vitamin B12 Hút xác mL vitamin B1, B6 B12 chuẩn với nồng độ gốc bảng 3.38; 3.39; 3.40 thêm vào ống tương ứng, thêm dung môi pha mẫu cho tổng thể tích 25 mL Hòa tan rung siêu âm sau đem li tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc màng lọc có kích thước 0,45 μm Bảng 3.38 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa bột Dielac Grow Plus Mẫu Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B1 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B1 thêm vào (ppm) - 4,00 8,00 10,00 14,00 Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B1 sau pha (ppm) 2,20 3,00 3,80 4,20 5,00 Bảng 3.39 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa bột Dielac Grow Plus Mẫu Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B6 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B6 thêm vào (ppm) - 4,00 8,00 10,00 14,00 Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) 25,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B6 sau pha (ppm) 2,20 3,00 3,80 4,20 5,00 63 Bảng 3.40 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa bột Dielac Grow Plus Mẫu 10 11 12 13 Khối lượng sữa bột (g) 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 5,0000 Thể tích vitamin B12 thêm vào (mL) - 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B12 thêm vào (ppm) - Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) 25,0 4,000 8,000 10,000 14,000 20,0 20,0 20,0 20,0 Nồng độ vitamin B12 sau pha (ppm) 0,004 0,804 1,604 2,004 2,804 Tiến hành chạy sắc ký dung dịch theo điều kiện sắc ký chọn thu kết bảng 3.41 Bảng 3.41 Kết phân tích sữa bột Dielac Grow Plus theo phương pháp thêm chuẩn Nồng độ vitamin Nồng độ trước thêm vitamin thêm STT chuẩn theo lí thuyết vào mẫu (ppm) (ppm) B1 B6 B12 B1 B6 B12 Nồng độ vitamin xác định sau thêm chuẩn theo thực nghiệm (ppm) B1 B6 ReV (%) B12 2,200 2,200 0,004 - - - 2,261 2,252 2,200 2,200 0,004 0,80 - - 2,990 2,252 DGH 91,35 2,200 2,200 0,004 1,60 - - 3,745 2,252 DGH 92,86 2,200 2,200 0,004 2,00 - - 4,055 2,252 DGH 89,77 2,200 2,200 0,004 2,80 - - 4.802 2,252 DGH 90,81 2,200 2,200 0,004 - 0,80 - 2,26 3,024 DGH 96,54 2,200 2,200 0,004 - 1,60 - 2,26 3,817 DGH 97,81 2,200 2,200 0,004 - 2,00 - 2,26 4,116 DGH 93,22 2,200 2,200 0,004 - 2,80 - 2,26 4,075 DGH 91,17 10 2,200 2,200 0,004 - - 0,80 2,26 2,252 0,703 87,38 11 2,200 2,200 0,004 - - 1,60 2,26 2,252 1,416 88,25 12 2,200 2,200 0,004 - - 2,00 2,26 2,252 1,861 92,85 13 2,200 2,200 0,004 - - 2,80 2,26 2,252 2,614 93,21 64 DGH - Nhận xét: Kết phân tích bàng 3.41 cho thấy hàm lượng nhà sản xuất công bố hàm lượng vitamin B1, B6 B12 xác định khác không đáng kể Kết cho thấy thu hồi B1 từ 89,77% đến 92,86%, B6 từ 91,17% đến 97,81%, B12 từ 87,38% đến 93,21% Điều chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có đủ tin cậy để phân tích sữa bột Dielac Grow Plus thực tế 3.3.3.3 Xác định vitamin B1, B6 B12 sữa tươi Dielac Alpha Gold 180 mL phương pháp thêm chuẩn Hút xác 15 mL sữa tươi Dielac Alpha Gold ứng với 0,0117 mg vitamin B1; 0,0167 mg vitamin B6 0,0483 μg vitamin B12 cho vào ống nhựa li tâm (50 mL) Hút xác mL vitamin B1, B6 B12 chuẩn với nồng độ gốc bảng 3.42; 3.43; 3.44 thêm vào ống nhựa li tâm (50mL) chứa mẫu sữa tươi, thêm dung môi pha mẫu cho tổng thể tích 25 mL Hòa tan rung siêu âm sau đem li tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc màng lọc có kích thước 0,45 μm Bảng 3.42 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa tươi Dielac Alpha Gold Mẫu Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B1 thêm vào - 5,0 5,0 5,0 5,0 - 4,000 8,000 10,000 14,000 10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 0,668 1,468 2,268 2,668 2,468 (mL) Nồng độ vitamin B1 thêm vào (ppm) Thể tích dung môi pha mẫu (mL) Nồng độ vitamin B1 sau pha (ppm) 65 Bảng 3.43 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa tươi Dielac Alpha Gold Mẫu Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B6 thêm vào - 5,0 5,0 5,0 5,0 - 4,000 8,000 10,000 14,000 10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 1,200 2,000 2,800 4,000 4,800 (mL) Nồng độ vitamin B6 thêm vào (ppm) Thể tích dung môi pha mẫu (mL) Nồng độ vitamin B6 sau pha (ppm) Bảng 3.44 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa tươi Dielac Alpha Gold Mẫu 10 11 12 13 Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B12 thêm vào - 5,0 5,0 5,0 5,0 - 4,000 8,000 10,000 14,000 10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 0,002 0,802 1,602 2,002 2,802 (mL) Nồng độ vitamin B12 thêm vào (ppm) Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) Nồng độ vitamin B12 sau pha (ppm) Tiến hành chạy sắc ký dung dịch theo điều kiện sắc ký chọn thu kết bảng 3.45 66 Bảng 3.45 Kết phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold theo phương pháp thêm chuẩn Nồng độ vitamin Nồng độ trước thêm vitamin thêm STT chuẩn theo lí thuyết vào mẫu (ppm) (ppm) 10 11 12 13 B1 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 B6 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 1,200 B12 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 B1 0,80 1,60 2,00 2,80 - B6 0,80 1,60 2,00 2,80 - B12 0,80 1,60 2,00 2,80 Nồng độ vitamin xác định sau thêm chuẩn theo thực nghiệm (ppm) B1 B6 B12 0,684 1,247 DGH 1,382 1,247 DGH 2,189 1,247 DGH 2,457 1,247 DGH 3,013 1,247 DGH 0,684 1,948 DGH 0,684 2,661 DGH 0,684 3,069 DGH 0,684 3,780 DGH 0,684 1,247 0,712 0,684 1,247 1,537 0,684 1,247 1,928 0,684 1,247 2,541 ReV (%) 87,25 91,54 88,65 93,18 87,71 88,38 91,22 90,44 88,75 95,94 96,30 90,68 Nhận xét: Kết phân tích bàng 3.45 cho thấy hàm lượng nhà sản xuất công bố hàm lượng vitamin B1, B6 B12 xác định khác không đáng kể Kết cho thấy thu hồi B1 từ 87,25% đến 91,18%, B6 từ 87,71% đến 91,22%, B12 từ 88,75% đến 96,30% Điều chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có đủ tin cậy để phân tích sữa tươi Dielac Alpha Gold thực tế 3.3.3.4 Xác định vitamin B1, B6 B12 sữa tươi Dielac Grow Plus 180 mL phương pháp thêm chuẩn Hút xác 15 mL sữa tươi Dielac Grow Plus ứng với 0,0167 mg vitamin B1; 0,0300 mg vitamin B6 0,0558 μg vitamin B12 cho vào ống 67 nhựa li tâm (50 mL) Hút xác mL vitamin B1, B6 B12 chuẩn với nồng độ gốc bảng 3.46; 3.47; 3.48 thêm vào ống nhựa li tâm (50mL) chứa mẫu sữa tươi, thêm dung môi pha mẫu cho tổng thể tích 25 mL Hòa tan rung siêu âm sau đem li tâm gạn lấy dung dịch đem lọc qua giấy lọc màng lọc có kích thước 0,45 μm Bảng 3.46 Bảng thêm chuẩn vitamin B1 sữa tươi Dielac Grow Plus Mẫu Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B1 thêm vào - 5,0 5,0 5,0 5,0 - 4,000 8,000 10,000 14,000 10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 0,468 1,268 2,068 2,468 3,268 (mL) Nồng độ vitamin B1 thêm vào (ppm) Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) Nồng độ vitamin B1 sau pha (ppm) Bảng 3.47 Bảng thêm chuẩn vitamin B6 sữa tươi Dielac Grow Plus Mẫu Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 Thể tích vitamin B6 thêm vào - 5,0 5,0 5,0 5,0 - 4,000 8,000 10,000 14,000 10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 0,668 1,468 2,268 3,668 3,468 (mL) Nồng độ vitamin B6 thêm vào (ppm) Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) Nồng độ vitamin B6 sau pha (ppm) 68 Bảng 3.48 Bảng thêm chuẩn vitamin B12 sữa tươi Dielac Grow Plus Mẫu 10 11 12 13 Thể tích sữa tươi (mL) 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 - 5,0 5,0 5,0 5,0 Nồng độ vitamin B12 thêm vào (ppm) - 4,000 8,000 10,000 14,000 Thể tích dung mơi pha mẫu (mL) 10,0 5,0 5,0 5,0 5,0 0,002 0,802 1,602 2,002 2,802 Thể tích vitamin B12 thêm vào (mL) Nồng độ vitamin B12 sau pha (ppm) Tiến hành chạy sắc ký dung dịch theo điều kiện sắc ký chọn thu kết bảng 3.49 Bảng 3.49 Kết phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus theo phương pháp thêm chuẩn STT 10 11 12 13 Nồng độ vitamin trước thêm chuẩn theo lí thuyết (ppm) Nồng độ vitamin thêm vào mẫu (ppm) B1 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 0,468 B1 0,80 1,60 2,00 2,80 - B6 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 0,668 B12 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 B6 0,80 1,60 2,00 2,80 - 69 B12 0,80 1,60 2,00 2,80 Nồng độ vitamin xác định sau ReV thêm chuẩn theo thực (%) nghiệm (ppm) B1 B6 B12 0,472 0,681 DGH 1,180 0,681 DGH 88,52 1,842 0,681 DGH 85,65 2,374 0,681 DGH 95,14 3,069 0,681 DGH 92,75 0,472 1,371 DGH 86,31 0,472 2,029 DGH 84,27 0,472 2,525 DGH 92,72 0,472 3,245 DGH 91,56 0,472 0,681 0,741 92,38 0,472 0,681 1,425 88,94 0,472 0,681 1,743 87,05 0,472 0,681 2,652 94,64 Nhận xét: Kết phân tích bàng 3.49 cho thấy hàm lượng nhà sản xuất công bố hàm lượng vitamin B1, B6 B12 xác định khác không đáng kể Kết cho thấy thu hồi B1 từ 85,65% đến 95,14%, B6 từ 84,27% đến 92,72%; B12 từ 87,05% đến 94,64% Điều chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có đủ tin cậy để phân tích sữa tươi Dielac Grow Plus thực tế 70 KẾT LUẬN  Đã khảo sát chọn thông số tối ưu cho q trình phân tích sắc ký như:  Cột tách: cột C18  Detector PDA bước sóng chọn lọc vitamin: B1 (246 nm); B6 (291 nm); B12( 361 nm)  Tốc độ dòng chảy: mL/phút  Nhiệt độ phân tích: 400C  Pha động: kênh A: dung dịch đệm photphat (pH=3) + kênh B: dung dịch axetonitril tỉ lệ 80:20 thể tích  Dung mơi pha mẫu: hỗn hợp dung dịch đệm đệm photphat (pH=3) dung dịch axetonitril tỉ lệ 80:20 thể tích  Đã xây dựng đường chuẩn vitamin B1, B6 B12 với khoảng tuyến tính vitamin B1, B6 B12 từ 0,4 (ppm) đến 2,8 (ppm) Với phương trình đường chuẩn vitamin B1 58779x+47083 ; vitamin B6 58276x+35206 vitamin B12 58860x-14962  Đã xây dựng đường thêm chuẩn mẫu thực Từ kết thu cho thấy, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng điều kiện tiến hành phân tích đạt yêu cầu độ có đủ tin cậy để phân tích mẫu thực tế 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị An "Vitamin B6 - vi lượng thiếu thể" Báo sức khỏe đời sống, ngày 18 tháng năm 2016 Nguyễn Bá Hoài Anh (2000)"Đại cương sắc ký lỏng", Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Dương Thị Tú Anh (2014) "Các phương pháp phân tích cơng cụ", Nhà xuất giáo dục Việt Nam Trần Quốc Chính (2015) "Định lượng đồng thời axetaminophen, codein photphat thuốc actadol codein phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)" Luận văn thạc sĩ khoa học vật chất, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên Chu Ngọc Châu, Nguyễn Thị Cúc, Vũ Thị Thu Hương, Tạ Thị Thảo (2009) “Nghiên cứu tối ưu hoá điều kiện để tách xác định số vitamin B phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Đinh Thị Trường Giang (2015) “Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B1 B6 số loại nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” Trường Đại học Vinh Minh Phát "Thiếu Vitamin B1:"sát thủ" nguy hiểm" Báo sức khỏe đời sống, ngày tháng 12 năm 2008 Phạm Thị Thanh Thủy (2013) "Nghiên cứu xác định hàm lượng số kim loại vitamin B1, B6 phương pháp hấp thụ nguyên tử sắc ký lỏng hiệu cao nấm Linh chi nuôi trồng Thừa Thiên Huế" Luận văn thạc sĩ hóa học, Trường Đại học Vinh Trần Xuân Thuyết "Vitamin B12 quan trọng nào?" Báo sức khỏe đời sống, ngày 17 tháng năm 2012 72 10 TCVN 5162 - 2008: Thực phẩm - Xác định vitamin B1 sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 11 TCVN 9513 - 2012: Thực phẩm - Xác định vitamin B6 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 12 TCVN 9514 - 2012: Thực phẩm - Xác định vitamin B12 phương pháp sắc lý lỏng hiệu cao (HPLC) Tài liệu tiếng Anh 13 Dilwar hossain noor chandan (2008) "Vitamin and Hormones" 14 Sandie Lindsay (1992) "High performance liquid chromatography" Newham community college 15 R.B Toma and M.M Tabekhina (1979) “Journal of Food Science and Technology” 16 Aberto Zafra-Gomez, Antonio Garballo, Juan c Morales, Luis E Garcia Ayuso (2006) “Simultaneous Determination of Eight Water - soluble vitamins in Supplemented food by Liquid Chromatography” 17 Pilar Vinas , CarmenLospez - Erroz , NuriaBalsalobre Manuel Hamandez Córdoba (2003) “Reversed - phase liquid chromatography on amide srationary phase for the determination of the B group vitamins in baby foods ” 18 M Bergaentzle, A Arella, J.B Bourguignon, C Hasselmann (1995) "Determination of vitamin B6 in foods by HPLC - a collaborative study’' 19 F Arella, S Lahély, J.B Bourguignon, C Hasselmann (1996) “Liquid chromatographic determination of vitamins B1 & B2 in food Acollabora tive study” 20 Soledad Albalá - Hurtado, M Teresa Veciana - Nogués , Maria Izquierdo - Pulido, Abel Mariné - Font (1997) “ Determination of water - soluble vitamins in infant milk by high - performance liquid chromatography" 21 Rada Amidzic, Jasmina Brboric, Olivera Cudina and Sote Vladimirov (2005) “RP-HPLC Determination of vitamins B1, B3, B6, folic acid and B12 in multivitamin tablets 73 PHỤ LỤC Hình Sắc đồ mẫu thêm chuẩn vitamin B1, B6, B12 mẫu thực sữa bột dielac alpha gold Hình Sắc đồ mẫu thêm chuẩn vitamin B1, B6, B12 mẫu thực sữa bột dielac grow plus Hình Sắc đồ mẫu thêm chuẩn vitamin B1, B6, B12 mẫu thực sữa tươi dielac alpha gold Hình Sắc đồ mẫu thêm chuẩn vitamin B1, B6, B12 mẫu thực sữa tươi dielac grow plus ... 3.3.2 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa tươi Dielac Grow Plus sữa tươi Dielac Alpha Gold 56 3.3.3 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa Dielac Grow Plus sữa Dielac Alpha Gold theo phương pháp. .. 50 3.3 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa Dielac Grow Plus sữa Dielac Alpha Gold 53 3.3.1 Xác định vitamin B1, B6, B12 sữa bột Dielac Grow Plus sữa bột Dielac Alpha Gold ... Giới thiệu sữa Dielac Grow Plus sữa Dielac Alpha Gold 11 1.6 Tổng quan xác định vitamin B1, B6 B12 theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 12 iii 1.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng