Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má centella asiatica (l ) urban, họ hoa tán (apiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- VÕ THỊ QUỲNH NHƢNGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY

RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN

(APIACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

VÕ THỊ QUỲNH NHƢ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY

RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TSKH Trần Văn Sung và TS Trần Văn Lộc Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án

Võ Thị Quỳnh Như

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và người thân

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến GS TSKH Trần Văn Sung và TS Trần Văn Lộc – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận án

Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo

Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường THPT Gio Linh cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án

Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản của Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 104.01-2012.33 do TS Trần Văn Lộc làm chủ nhiệm

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày tháng năm 2017

Võ Thị Quỳnh Như

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và hoạt tính sinh học của chúng 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân gian 2

1.2 Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban 9

1.3 Hoạt tính sinh học của cây rau má 15

1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 15

1.3.2 Hoạt tính giảm đau và kháng viêm 15

1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa 16

1.3.4 Tác dụng bảo vệ thần kinh 16

1.4.5 Hoạt tính chống xơ vữa động mạch 16

1.4 Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất 17

1.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thư 17

1.4.2 Hoạt tính làm lành vết thương 19

1.4.3 Hoạt tính chống trầm cảm 20

1.4.4 Hoạt tính bảo vệ gan 20

1.4.5 Các hoạt tính khác 20

ii

1.5 Một số chuyển hóa của asiatic acid 21

1.5.1 Một số chuyển hóa hóa học của asiatic acid 21

1.5.2 Chuyển hóa bằng phương pháp sinh học 29

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước 30

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Các phương pháp chiết xuất và phân lập chất 34

2.2 Các phương pháp phổ 34

2.3 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ 34

2.4 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro 35

2.5 Phương pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm 35

2.6 Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp được trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử) 35

Chương 3 THỰC NGHIỆM 37

3.1 Nguyên liệu 37

3.1.1 Mẫu cây rau má 37

3.1.2 Dung môi, hóa chất 37

3.2 Phân lập chất 37

3.2.1 Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh 37

3.2.1.1 Phân lập các chất 37

3.2.1.2 Các số liệu phổ của các chất phân lập được 38

3.2.2 Nghiên cứu định lượng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ 40

3.2.2.1 Xác định hàm lượng asiatic acid bằng phương pháp HPLC 40

3.2.2.2 Xác định hàm lượng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột 42 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi asiatic acid và madecassic acid 42

3.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 42

3.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn 43

3.2.3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 44

iii

3.2.4 Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica

(L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất 44

3.3 Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid 47

3.3.1 Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid 47

3.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid 63

3.4 Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp được 72

3.4.1 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 72

3.4.2 Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) 73

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 75

4.2 Điều kiện chiết xuất cho hiệu suất cao nhất từ mẫu rau má 80

4.3 Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid 80

4.3.1 Chuyển hóa của asiatic acid 80

4.3.1.1 Chuyển hóa nhóm COOH (C-28) 80

4.3.1.2 Chuyển hóa vòng A của asiatic acid 98

4.3.2 Các dẫn xuất của madecassic acid 103

4.4 Thử hoạt tính sinh học 113

4.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào in vitro 113

4.4.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn xuất của asiatic acid 113 4.4.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn xuất của madecassic acid 115

4.5.2 Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) 118

4.6 Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử) 119

iv

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121

5.1 Kết luận 121

5.2 Kiến nghị 122

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 123

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO 125

v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký

HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao qua nhiều liên kết

HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry

Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum

tính bằng phần triệu

vi

Các dòng tế bào

HeLa Human cervical adenocarcinoma Ung thƣ cổ tử cung

carcinoma

Ung thƣ gan

MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thƣ vú MDA-MB-231 Metastatic human breast cancer Ung thƣ vú

12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate

Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên

bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban 3

Hình 1 2 Các monoterpenoid thu được từ tinh dầu cây rau má 5

Hình 1 3 Các sesquiterpenoid thu được từ tinh dầu cây rau má 5

Hình 1 4 Các triterpene và triterpene saponin khung ursane được phân lập từ cây rau má 6

Hình 1 5 Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane được phân lập từ cây rau má 7

Hình 1 6 Công thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má 8

Hình 1 7 Các thành phần hóa học khác được phân lập từ cây rau má 9

Hình 1 8 Các triterpene và triterpene glycoside được Yoshida M phân lập từ cây rau má trồng tại Nhật Bản và hoạt tính kháng tế bào ung thư của chúng 12

Hình 1 9 Các triterpene và triterpene glycoside được Rumalla phân lập từ cây rau má trồng tại Mỹ 13

Hình 1 10 Các triterpene và triterpene glycoside được Weng phân lập từ cây rau má trồng tai Trung Quốc 13

Hình 1 11 Một số sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có chứa rau má 17

Hình 1 12 Một số sản phẩm từ cây rau má Việt Nam 30

Hình 3 1 Đường chuẩn asiatic acid 41

ix

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG

Bảng 3 1 Giá trị HPLC của asiatic acid 41

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết 43

Bảng 3 3 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hiệu quả chiết asiatic acid và madecassic acid 43

Bảng 3 4 Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô 44

Bảng 4 1 Tổng hàm lượng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phương pháp HPLC 79

Bảng 4 2 Tổng hàm lượng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phương pháp CC 79

Bảng 4 3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất tổng hợp của asiatic acid 114

Bảng 4 4 Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn xuất madecassic acid 117

Bảng 4 5 Sự thay đổi các chỉ số AST ( UI/ L) và ALT (UI/L) ở các lô thí nghiệm 118

Bảng 4 6 Khối lượng gan chuột (g/10g cơ thể) ở các lô thí nghiệm 118

Bảng 4 7 Hàm lượng MDA trong gan chuột thí nghiệm 119

Bảng 4 8 Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo phương pháp docking phân tử của asiatic acid 119

Bảng 4 9 Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo phương pháp docking phân tử của madecassic acid 120

x

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 1 Chuyển hóa các dẫn xuất của AA tại vị trí C-2 22

Sơ đồ 1 2 Tổng hợp dẫn xuất C2- oxo của asiatic acid 22

Sơ đồ 1 3 Chuyển hóa ở C2 (khử oxy) của asiatic acid 23

Sơ đồ 1 4 Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23, C-11 và C-28 của asiatic acid 23

Sơ đồ 1 5 Tổng hợp dẫn xuất 3-oxo-23-andehyde và các dẫn xuất 24

Sơ đồ 1 6 Tổng hợp dẫn xuất C2-benzyloxy, C3,23-diacetoxy của acid methyl ester 24

Sơ đồ 1 7 Tổng hợp C11-keto asiatic acid 25

Sơ đồ 1 8 Tổng hợp C28-hydroxymethyl asiatic acid 26

Sơ đồ 1 9 Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23 của asiatic acid 26

Sơ đồ 1 10 Chuyển hóa ở vị trí C2,3,28 của asiatic acid 27

Sơ đồ 1 11 Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amino axit từ asiatic acid 28

Sơ đồ 1 12 Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amide từ asiatic acid 29

Sơ đồ 1 13 Tổng hợp một số dẫn xuất của AA bằng con đường sinh học 30

Sơ đồ 3 1 Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C asiatica (L.) Urban] thu hái tại Thành phố Hồ Chí Minh 38

Sơ đồ 4 1 Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (1) 81

Sơ đồ 4 2 Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (2) 98

Sơ đồ 4 3 Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid 103

1

MỞ ĐẦU

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học lý thú đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y dược, nông nghiệp và đời sống Có nhiều loại thuốc hoàn toàn phải dựa vào thiên nhiên để chữa các bệnh thông thường cũng như các bệnh hiểm nghèo Một trong những hướng nghiên cứu quan trọng hiện nay được các nhà khoa học nước ta và trên thế giới rất quan tâm là: Từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu người ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học của chúng để tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính và tính chất ưu việt hơn những hợp chất ban đầu Cách tiếp cận này có tính kinh tế tốt hơn, phù hợp hơn với cơ thể sống và thân thiện môi trường hơn

Trong số các hợp chất thiên nhiên, các triterpene có khung ursane như nhóm ursolic acid và các dẫn xuất của ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên ngày càng được quan tâm nghiên cứu về mặt hoá học và dược lý học Trong đó hoạt tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, cũng như với tế bào bạch cầu lympho P-388 và L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB và khả năng ức chế phát triển khối u trên da chuột đã được khẳng định [1]

Trong quá trình tìm hiểu về các cây thuốc cổ truyền Việt Nam, chúng tôi

thấy cây rau má, có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán

(Apiaceae), có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane như: asiatic acid, asiaticoside, madecassic acid, madecassoside… với hàm lượng khá cao có hoạt tính độc với tế bào ung thư [2] Để tận dụng nguồn nguyên liệu này và góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các chất mới có hoạt tính cao, chúng tôi đặt mục đích sử dụng các triterpene tách được từ cây rau má để chuyển hóa chúng tạo thành các dãy dẫn xuất mới và thăm dò hoạt tính kháng ung thư của các chất thu được

Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây

rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)” Đề tài được thực

hiện với ba mục tiêu:

1 Nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây

rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam

2 Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập được từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng

3 Thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tương quan cấu trúc – hoạt tính của chúng