Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ lactobacillus fermentum

Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb.. Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố .

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác

Nghiên cứu sinh

Trần Thị Ái Luyến

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU/mL colony-forming unit/Ml số lượng tế bào/mL

COSY Correlated Spectroscopy

1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

từ Lb fermentum TC13

từ Lb fermentum TC16

từ Lb fermentum TC21

từ Lb fermentum MC3

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ

HePS heteropolysaccharide Polysaccharide phức tạp

HMBC Heteronuclear multiple - Bond

Correlation

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSQC Heteronuclear Spectroscopy-

Quantum Coherence

GalNAc N-acetyl-D-galactosamine

1-phosphate-uridyltransferase GC-MS Gas Chromatrography Mass

Spectometry

Sắc ký khí ghép khối phổ

Glc-1-P glucose-6-phosphate

Glc-6-P glucose-1-phosphate

GlcA glucuronic acid

GRAS Generally Recognized As Safe Vi sinh vật an toàn

Man-6-P Mannose-6-Phosphate

Man-1-P Mannose-1-Phosphate

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy

PEP-PTS phosphoenolpyruvate-

phosphotransferase

TCA trichloroacetic acid

pyrophosphorylase

WPC whey protein concentration

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về polysaccharide 3

1.1.1 Giới thiệu chung về polysaccharide 3

1.1.2 Ứng dụng của polysaccharide 4

1.2 Tổng quan về Lactobacillus fermentum 5

1.3 Tổng quan về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic 6

1.3.1 Khái niệm 6

1.3.2 Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa 6

1.3.3 Tính chất chức năng và ứng dụng 14

1.4 Tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide từ LAB 20

1.4.1 Về điều kiện nuôi cấy thu nhận EPS 20

1.4.2 Về quá trình tách chiết và tinh chế EPS 23

1.4.3 Về đặc tính hóa lý: khối lượng phân tử, thành phần, liên kết và cấu trúc

24

1.4.4 Về tính chất công nghệ và các tác dụng về sức khỏe 34

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

3.1 Đối tượng nghiên cứu 37

3.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 37

2.2.1 Hóa chất 37

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 37

3.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) 38

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối [6] 38

2.3.3 Phương pháp thu nhận và tách EPS 39

2.3.4 Sơ đồ tổng thể về phương pháp nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum 40

2.3.5 Xác định hàm lượng EPS bằng phương pháp phenol-sulfuric [37] 43

2.3.6 Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [5] 44

2.3.7 Phương pháp khảo sát một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công

nghệ thực phẩm 45

2.3.8 Phương pháp xác định khối lượng phân tử và đặc điểm cấu trúc của EPS 47

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 52

3.1 Kết quả nghiên cứu cải thiện hiệu suất thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum 52

3.1.1 Kết quả tuyển chọn một số chủng Lb fermentum sinh tổng hợp EPS cao 52

3.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS từ các chủng Lb fermentum tuyển chọn 54

3.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum TC13, TC16, TC21, MC3 66

3.1.4 Kết quả khảo sát điều kiện tách EPS từ dịch lên men 82

3.2.1 Khả năng hòa tan trong nước 89

3.2.2 Khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu 91

3.2.3 Khả năng chống oxy hóa 95

3.3 Kết quả phân tích khối lượng phân tử và một số đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ Lb fermentum MC3 99

3.3.1 Khối lượng phân tử 99

3.3.2 Đặc điểm về cấu trúc của EPS-MC3 103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128

1 Kết luận 128

2 Kiến nghị 130

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 131

TÀI LIỆU THAM KHẢO 133 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tổng quan về một số điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận EPS cao từ các

loài Lactobacillus đã được công bố 22

Bảng 1.2 Thông tin về cấu trúc và các phương pháp NMR tương ứng 27

Bảng 1.3 Tổng quan các nghiên cứu về cấu trúc của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố 29

Bảng 1.4 Tổng quan các nghiên cứu liên quan đến sức khỏe của EPS sinh tổng hợp từ LAB đã được công bố 35

Bảng 2.1 Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký GC-MS 50

Bảng 3.1 Điều kiện thu nhận EPS cao của các chủng Lb fermentum nghiên cứu trong luận án 81

Bảng 3.2 Các điều kiện tách EPS từ dịch nuôi cấy thích hợp của các chủng Lb fermentum trong luận án 89

Bảng 3.3 Độ hòa tan trong nước của EPS từ các chủng Lb fermentum 90

Bảng 3.4 Khả năng giữ nước của các EPS từ các chủng Lb fermentum 92

Bảng 3.5 Khả năng giữ dầu của EPS từ các chủng Lb fermentum 93

Bảng 3.6 Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các EPS thu được từ các chủng Lb fermentum (TC13, TC16, TC21, MC3) 96

Bảng 3.7 Các dẫn xuất monosaccharide thu được từ EPS sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3 103

Bảng 3.8 Tỷ lệ, thành phần (%) các monosaccharide trong cấu trúc EPS sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3 103

Bảng 3.9 Các dẫn xuất methyl alditol acetate monosaccharide thu được và liên kết glycoside tương ứng của EPS sinh tổng hợp bởi Lb fermentum MC3 110

Bảng 3.10 Độ chuyển dịch hóa học 1H –NMR và 13C – NMR của EPS-MC3 đo trong DMSO 118

Bảng 3.11 Các dạng liên kết trong cấu trúc của EPS-MC3 qua phổ NOESY, HMBC 119

Bảng 3.12 Đặc điểm về cấu trúc của các EPS sinh tổng hợp từ chi Lactobacillus đã công bố và của EPS-MC3 của luận án 123

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

(b) của fructose 3

Hình 1.2 Hình dạng khuẩn lạc Lb fermentum 5

Hình 1.3 Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS 7

Hình 1.4 Mô hình về quá trình sinh tổng hợp glucan và fructan 7

Hình 1.5 Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của HoPS sinh tổng hợp từ LAB 9

Hình 1.6 Cấu trúc của dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HePS 10

Hình 1.7 Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp HePS trong tế bào LAB 11

Hình 1.8 Cấu tạo của glucose và TDP-glucose, TDP-rhamnose và UDP-glactose 12

Hình 1.9 Sơ đồ phân loại và đặc điểm cấu tạo của các HePS sinh tổng hợp từ LAB 14

Hình 1.10 Sơ đồ biểu diễn các tính chất tăng cường sức khỏe của EPS từ LAB 15

Hình 2.1 Sơ đồ nuôi cấy thu nhận sinh khối 38

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận và tách EPS 39

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu khảo sát cải thiện hiệu suất thu nhận EPS 40

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 45

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC-MS để xác định liên kết glycoside 48

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu phân tích GC – MS 49

Hình 3-1 Khả năng sinh tổng hợp EPS của một số chủng vi khuẩn lactic 53

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ bổ sung của chúng vào môi trường MRS đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum 55

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn N và nồng độ bổ sung của chúng vào MTTH đến khả năng tổng hợp EPS của các chủng Lb fermentum 61

Hình 3.4 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb fermentum 66

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb fermentum 69

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng Lb fermentum 72

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các

chủng Lb fermentum 77

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC13 83

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC16 83

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum TC21 83

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ TCA bổ sung lên khả năng loại bỏ protein và lượng EPS tách từ dịch lên men Lb fermentum MC3 84

Hình 3.12 Ảnh hưởng của thể tích ethanol so với dịch nổi đến khả năng tách EPS 87

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian tủa bằng ethanol lên khả năng tách EPS 88

Hình 3.14 Sắc kí đồ khối lượng phân tử của EPS-MC3 bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 100

Hình 3.15 Sơ đồ xử lý mẫu cho phân tích NMR 111

Hình 3.16 Phổ 1H-NMR của EPS-MC3 112

Hình 3.17 Phổ 13C-NMR của EPS-MC3 113

Hình 3.18 Phổ HSQC (a, b, c) của EPS-MC3 116

Hình 3.19 Phổ đồ COSY của EPS-MC3 117

Hình 3020 Phổ đồ HMBC của EPS-MC3 118

Hình 3.21 Phổ đồ NOESY của EPS-MC3 119

Hình 3.22 Các đơn vị lặp lại trong cấu trúc của EPS-MC3 đã được thủy phân một phần 120

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khuynh hướng ứng dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnh vực tăng lên đã dẫn đến sự phát triển nghiên cứu thu nhận exopolysaccharide (EPS) từ vi khuẩn Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide (PS) ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường [115] Các PS tách chiết được có sự đa dạng về cấu trúc và các tính chất chức năng Chính vì vậy, nguồn EPS này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm cũng như mỹ phẩm Chúng là những tác nhân làm đặc, ổn định kết cấu, nhũ hóa, tạo gel, Hơn nữa, gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol, hoạt động probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến [88], [125], [139] …

Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng trong công nghiệp và trong y học nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp Đây

là lý do chính khiến khả năng thương mại hóa của EPS từ vi khuẩn nói chung và từ

vi khuẩn lactic (LAB-Lactic acid bacteria) nói riêng còn khá hạn chế Từ khi LAB được "công nhận là vi sinh vật an toàn” (GRAS-Generally Recognized As Safe), việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS đáp ứng phương diện ứng dụng trong thực phẩm [59] Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS – với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat, Bên cạnh đó, nhờ những đặc điểm đa dạng trong cấu trúc cũng như sự an toàn đối với sức khỏe con người mà EPS sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic (LAB) được quan tâm nhiều hơn so với EPS từ các loài khác

Nhiều nghiên cứu đã kết luận rằng, thành phần monosaccharide, vị trí liên kết trong cấu trúc và những tính chất có tiềm năng ứng dụng của các EPS sinh tổng hợp bởi các chủng thuộc LAB khác nhau phụ thuộc vào loại chủng, điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường [74], [102], [104], [126],…

Như vậy, sự đa dạng trong cấu trúc của các loài vi khuẩn khác nhau có thể liên

lên men cũng như điều kiện nuôi cấy và thu nhận Sự đa dạng này sẽ tạo nên những ảnh hưởng không nhỏ đến các hoạt tính sinh học cũng như những tính chất chức năng trong công nghệ thực phẩm Chính vì vậy, để nâng cao hiệu quả thu nhận EPS và đặc biệt là cung cấp một số thông tin chi tiết hơn về các đặc tính cấu trúc của các EPS

sinh tổng hợp từ một trong các chủng LAB nói chung và một số chủng Lactobacillus

fermentum nói riêng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc và tính chất của exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum”

Với đề tài trong luận án này, chúng tôi sẽ xác định được:

1) Điều kiện thu nhận EPS từ một số chủng Lb fermentum hiệu quả nhất;

2) Một số tính chất có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm;

3) Một số thông tin về phân tử lượng, thành phần đường, mối liên kết của một

số EPS mới được tách chiết từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Với những đặc tính mới được phát hiện, chúng có thể là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong y dược, trong thực phẩm thay thế cho các hợp chất được tổng hợp hóa học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về polysaccharide

1.1.1 Giới thiệu chung về polysaccharide

Polysaccharide (PS) là polyme thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate và thường được coi là các polyme sinh học đa năng với các chức năng được biết đến như là nguồn năng lượng dự trữ (tinh bột, glycogen); tạo nên cấu trúc vững chắc cho thực vật hoặc động vật (cellulose, chitin); chất bảo vệ (exopolysaccharide của vi sinh vật), [29]

Trong chuỗi PS, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycoside

Sự khác nhau giữa các PS thường liên quan đến các monosaccharide cấu tạo nên chúng Các PS chỉ chứa một loại monosaccharide được gọi là homopolysaccharide hoặc homoglycan Các PS chứa nhiều hơn một loại monosaccharide được gọi là heteropolysaccharide hoặc heteroglycan

Các monosaccharide có cấu trúc dị vòng được cấu tạo bởi các nguyên tử oxy, hydro, carbon Sự phân loại các monosaccharide dựa vào số lượng nguyên tử carbon dạng vòng 7, 6, 5 cạnh hoặc dạng mạch hở Các PS thường được tạo nên bởi các đơn

vị lặp lại, bao gồm một hoặc nhiều monosaccharide và phổ biến nhất trong tự nhiên thường có cấu trúc vòng 6 cạnh (pyranose) Các monosaccharide này có cấu trúc dạng

α và β Trong đó, dạng β-D-glucopyranose là phổ biến nhất β-D-glucopyranose có

thể chuyển đổi lẫn nhau tạo nên dạng cấu hình ghế (Hình 1.1a) Ngoài ra, vòng 5 cạnh

(furanose) cũng được coi là thành phần có vai trò quan trọng về mặt sinh học (Hình 1.1b) do chúng có mặt trong acid nucleic và một số PS từ vi sinh vật

Hình 1.1 Cấu trúc dạng vòng 6 cạnh -pyranose (a) của glucose và 5 cạnh -furanose

Trong những năm gần đây, nhiều loại PS mới có vai trò quan trọng trong y học

và thương mại đã được thu nhận từ quá trình lên men vi sinh vật Các PS này có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi sinh vật gây bệnh hoặc không gây bệnh Trong đó, các PS được tổng hợp từ các loài vi sinh vật không gây bệnh đã được khai thác vì chúng có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp và trong công nghệ sinh học với những tính chất độc đáo và mới lạ như tạo gel, khả năng tự phân hủy sinh học, tính bám dính sinh học, Một số PS phổ biến đã được thu nhận từ vi sinh vật có thể

kể đến như (i) xanthan, gellan, dextran, alternan, curdlan, exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic (LAB), levan, alginate (từ vi khuẩn); (ii) pullulan, scleroglucan, schizophyllan và lentinan (từ nấm); và (iii) BYG (Beer’ yeast glucan) - các glucan thương mại từ nấm men bia [67]

1.1.2 Ứng dụng của polysaccharide

Với nguồn nguyên liệu thu nhận phổ biến, chi phí thu nhận thấp đã góp phần giúp các hợp chất PS có thêm nhiều phạm vi ứng dụng hơn trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,…

Trong công nghệ thực phẩm: Các PS được sử dụng như những chất phụ gia

được bổ sung vào quá trình chế biến thực phẩm với vai trò giúp hoàn thiện cấu trúc thực phẩm từ đó làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm: tạo gel, làm tăng độ nhớt,

từ đó tạo nên sự ổn định của nhũ tương hoặc giúp ngăn chặn hiện tượng tách nước trong một số sản phẩm có bản chất cấu trúc gel đặc biệt là sữa chua [67]

Trong dược phẩm: PS được coi là những vật liệu sinh học phổ biến Chúng đang

đóng góp vai trò quan trọng cho quá trình phát triển sản phẩm mới trong dược phẩm

và những ứng dụng y tế như các chất kết dính đơn giản hoặc là phương tiện phân phối thuốc tinh vi [67], [114]

Trong công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm: Nhờ các đặc tính tạo màng film,

tạo gel cùng khả năng gắn các ion đã giúp cho các PS được sử dụng như là các công

cụ vô giá trong công nghệ sinh học và trong công tác nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Chẳng hạn như, việc sử dụng agar tạo cho các khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển; sử dụng các PS hòa tan, không hòa tan và dẫn xuất của chúng giúp cố định protein, cố định enzyme và tế bào động vật hoặc sử dụng như dextran hoặc pullulan làm chất