Nghiên cứu đặc điểm hình thái và dna barcode của loài lưỡi rắn (hedyotis corymbosa (l ) lam)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP LÊ THỊ TÚ LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DNA BARCODE CỦA LOÀI LƯỠI RẮN HEDYOTIS CORYMBOSA L.. Kết quả nghiên cứu về hình thái và giải phẫu học không nhữn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

LÊ THỊ TÚ LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DNA BARCODE

CỦA LOÀI LƯỠI RẮN (HEDYOTIS CORYMBOSA (L.) LAM)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS PHẠM THANH HUYỀN PGS TS VŨ QUANG NAM

Hà Nội, 2023

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Phạm Thanh Huyền và PGS TS Vũ Quang Nam Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận

văn của Hội đồng khoa học

Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2023

Người thực hiện

Lê Thị Tú Linh

LỜI CẢM ƠN

Đề tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm phòng Giải phẫu thực vật, phòng Công nghệ gen và Sinh học phân tử - Trung tâm Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện, lãnh đạo Trung tâm đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài được tiến hành thuận lợi

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Thanh Huyền và PGS.TS Vũ Quang Nam, hai người thầy/cô đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn những góp

ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc trung tâm

Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu nói chung và xin chân thành cảm ơn

TS Nguyễn Thị Lan Hoa, TS Trần Đức Trung, ThS Nguyễn Quỳnh Nga, ThS Đặng Minh Tú, ThS Nguyễn Văn Hiếu, CN Nguyễn Hoàng những người anh/chị đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ của cơ sở đào tạo Sau đại học trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô làm việc và giảng dạy tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 4

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi An điền (Hedyotis L.) 4

1.1.1 Vị trí phân loại của chi An điền (Hedyotis L.) và loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam.) 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi An điền (Hedyotis L.) 5

1.1.3 Lược sử chi An điền (Hedyotis L.) 6

1.2 Khái quát về loài Hedyotis corymbosa (L.) Lam 7

1.2.1 Phân bố 8

1.3 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcodes) 9

1.3.1 Giới thiệu về mã vạch ADN 9

1.3.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch ADN 11

1.3.3 Một số vùng gen được sử dụng làm mã vạch ADN ở thực vật 12

1.4 Ứng dụng mã vạch ADN trong nghiên cứu di truyền các loài trong chi Hedyotis 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2 Đối tượng, phạm vi và hóa chất nghiên cứu 16

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 17

2.2.3 Hóa chất trong nghiên cứu 17

2.2.4 Một số máy móc sử dụng trong nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp kế thừa tài liệu 17

2.3.2 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu vật 18

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu thực vật, giải phẫu 18

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 19

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Xác định tên khoa học của loài Lưỡi rắn thu thập 27

3.2 Đặc điểm hình thái 28

3.3 Đặc điểm vi phẫu 30

3.3.1 Vi phẫu lá 30

3.3.2 Vi phẫu thân 31

3.3.3 Vi phẫu rễ 32

3.4 So sánh đặc điểm của loài Lưỡi rắn và loài cùng chi Hedyotis dễ nhầm lẫn 33

3.5 Kết quả xây dựng dữ liệu DNA barcode cho các mẫu vật Lưỡi rắn thu thập tại các vùng sinh thái 35

3.5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá cây Lưỡi rắn 35

3.5.2 Kết quả khuếch đại vùng gen ITS và ndhD 37

3.5.3 Kết quả giải trình tự 38

3.5.4 Phân tích phát sinh loài bằng ITS 39

3.5.5 Phân tích phát sinh loài bằng ndhD 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Giải nghĩa

ADN Deoxyribonucleic Acid

matK Gen maturase K

ITS-rDNA Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed

Spacer) Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế

ML Maximum Likelihood

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Mật độ quang học (Optical Density)

PCR Polymerase Chain Reaction

bp Cặp bazơ (base pair)

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

rbcL Gen ribulose-bisphosphat carboxylase

CBOL Consortium for the Barcode of Life

CTAB Cetrimonnium bromide

EtOH Ethanol: Cồn

ITS Internal Transcribed Spacer: Vùng đệm trong trình tự

phiên mã

ndhD

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thống kê các mẫu vật trong quá trình nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Thành phần đệm chiết 19

Bảng 2.3 Thành phần đệm rửa I 20

Bảng 2.4 Thành phần đệm rửa II 20

Bảng 2.5 Danh sách và trình tự nucleotide của các cặp mồi 21

Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng PCR nhân bản vùng gen ndhD và ITS 22 Bảng 3.1 So sánh hình thái của loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) và loài Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) 33

Bảng 3.2 So sánh hình thái của loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) và loài Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) 35

Bảng 3.3 Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số các mẫu nghiên cứu 36

Bảng 2.1 Thống kê các mẫu vật trong quá trình nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Thành phần đệm chiết 19

Bảng 2.3 Thành phần đệm rửa I 20

Bảng 2.4 Thành phần đệm rửa II 20

Bảng 2.5 Danh sách và trình tự nucleotide của các cặp mồi 21

Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng PCR nhân bản vùng gen ndhD và ITS 22 Bảng 3.1 So sánh hình thái của loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) và loài Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) 33

Bảng 3.2 So sánh hình thái của loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) và loài Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) 35

Bảng 3.3 Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số các mẫu nghiên cứu 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phân bố loài Hedyotis corymbosa (L.) Lam [49] 8

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật 13

Hình 1.3 Hệ gen lục lạp hoàn chỉnh của loài Hedyotis corymbosa [46] 14

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 22

Hình 2.2 Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm Geneiour 25

Hình 3.1 Cây ngoài tự nhiên loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) 28

Hình 3.2 Hình ảnh tổng thể của loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) 28

Hình 3.3 Hình ảnh chi tiết của cây Lưỡi rắn 29

Hình 3.4 Hình ảnh vi phẫu lá của loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) 30

Hình 3.5 Hình ảnh vi phẫu lát cắt ngang thân của loài Lưỡi rắn 32

(Hedyotis corymbosa (L.) Lam) 32

Hình 3.6 Hình ảnh vi phẫu rễ của loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) 32

Hình 3.7 Ảnh điện di DNA tổng số của 9 mẫu Lưỡi rắn 36

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản vùng ITS của các mẫu nghiên cứu 37

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản vùng ndhD của các mẫu nghiên cứu 37

Hình 3.10 Điện di đồ một đoạn trình tự ITS của các mẫu nghiên cứu 38

Hình 3.11 Điện di đồ một đoạn trình tự ndhD của 9 mẫu nghiên cứu 39

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại dựa trên gen ITS xây dựng theo phương pháp Bayes 39

Hình 3.13 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu Hedyotis corymbosa và các loài cùng chi Hedyotis dựa trên trình tự ITS 40

Hình 3.14 Cây phát sinh chủng loại dựa trên gen ndhD xây dựng theo phương pháp Bayes 41 Hình 3.15 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu nghiên cứu và Hedyotis corymbosa dựa trên trình tự ndhD 42

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong Y học cổ truyền, Lưỡi rắn (H corymbosa) thường được dùng để

chữa sốt cao, sốt cách nhiệt, đau nhức xương, thấp khớp, giải độc, rắn cắn [3] Hiện nay, tại Việt Nam và một số nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật

Bản,…người dân dùng các loại cây thuốc trong chi Hedyotis, trong đó có loài

Lưỡi rắn để chữa rắn cắn, suy nhược thần kinh, đau xương cốt, các bệnh viêm nhiễm,…đặc biệt là dùng chữa bệnh viêm gan và các bệnh về gan [4] [5] [8] Theo các nghiên cứu về hóa học và dược lý, loài này có chứa các hợp chất sterol như stigmasterol, sitosterol và các triterpen như acid ursolic, acid oleanolic và các hợp chất này đã được các nghiên cứu khoa học cho biết có hoạt tính ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau và kể cả HIV [4]

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu

về chi An điền (Hedyotis L.) và loài Lưỡi rắn (H corymbosa) Cho đến nay,

hình thái và giải phẫu học thực vật luôn được coi là một trong những phân ngành khoa học quan trọng trong khoa học thực vật Kết quả nghiên cứu về hình thái và giải phẫu học không những giúp chúng ta hiểu biết thêm về đặc điểm cấu tạo của thực vật mà còn là cơ sở quan trọng cho nhiều lĩnh vực khác của thực vật học, đặc biệt là phân loại học thực vật

Trong những năm gần đây, phương pháp xác định mã vạch ADN (DNA barcode) là một trong các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng phổ biến trên thế giới để phân loại, định loại các loài khó nhận dạng về hình thái hay các mẫu

đã qua chế biến, xử lý Phương pháp dựa trên nguyên tắc so sánh các vùng trình

tự ADN ngắn có tốc độ tiến hóa đủ nhanh để định loại các loài trong cùng chi Trên đối tượng thực vật, các vùng ADN được sử dụng làm mã vạch trong phân loại thường là các trình tự thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen nhân với vùng mã hóa

và vùng không mã hóa như psbA-trnH, matK, rbcL, ITS…

Hiện nay, trên thế giới ghi nhận khoảng gần 600 loài thuộc chi

Hedyotis L Ở Việt Nam, chi này hiện ghi nhận 73 loài, với nhiều công dụng

trong đời sống đặc biệt là công dụng làm thuốc [5] Có thể nói các loài thuộc

chi Hedyotis ở Việt Nam không chỉ có giá trị khoa học, giá trị kinh tế mà còn

có giá trị về dược liệu

Các loài thuộc chi An điền (Hedyotis L.) ở Việt Nam đều là những cây

thảo, hàng năm, thân thường mảnh, lá mọc đối hoặc hiếm khi mọc vòng, lá kèm tồn tại, cụm hoa ở đỉnh cành hoặc nách lá, cấu trúc khá phức tạp, hoa nhiều hoặc thưa thớt, có khi đơn độc, Các loài trong chi có nhiều đặc điểm hình thái khá giống nhau, chỉ khác nhau bởi hình dạng của thân cây, số lượng hoa và kích thước của cuống lá, những đặc điểm này rất khó phân biệt khi nguyên liệu được làm khô khiến cho việc định loại vô cùng khó khăn và cần

thiết phải có sự nhận dạng hết sức cẩn thận Trong thực tế, loài Lưỡi rắn (H

corymbosa), đặc biệt là dược liệu của loài này khi bị phơi hoặc sấy khô và

thái nhỏ, thường bị nhầm lẫn với một số loài khác cùng chi Hedyotis Do vậy,

những nghiên cứu về các đặc điểm hình thái, vi phẫu… chi tiết để nhận dạng

và xác định tính đúng của loài này là cần thiết

Để đánh giá tính đúng, phân biệt các loài cây thuốc dễ nhầm lẫn nói chung, loài Lưỡi rắn nói riêng, các phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu và DNA barcode cần được áp dụng song song Đây là hai phương pháp giúp định danh, khẳng định tên khoa học, xuất xứ loài/dưới loài của các loài

và dược liệu dễ nhầm lẫn Phương pháp hình thái học chi phí thấp, dễ áp dụng nhưng đòi hỏi mẫu kiểm nghiệm phải nguyên vẹn (rễ, thân, lá, hoa, quả,…) Phương pháp DNA barcode có chi phí cao hơn và đòi hỏi người áp dụng phải

có kỹ thuật chuyên môn nhưng lại có thể áp dụng với các mẫu bị cắt vụn, nghiền bột (chưa xử lý nhiệt độ cao), ngâm rượu (nồng độ thấp) Cả hai phương pháp này đều có những ưu, nhược điểm do vậy tùy vào điều kiện, hoàn cảnh, tình trạng mẫu và yêu cầu kiểm nghiệm mà có thể áp dụng từng phương pháp riêng lẻ hoặc kết hợp để bổ trợ nhau nhằm đáp ứng được yêu cầu về phân biệt và chống nhầm lẫn các loài cây thuốc và dược liệu

Vì vậy, để có thể nghiên cứu một cách toàn diện nhất và góp phần cung

cấp dữ liệu cho việc nhận biết chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên

cứu đặc điểm hình thái và DNA barcode của loài Lưỡi rắn (Hedyotis

corymbosa (L.) Lam)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung:

Xây dựng được dữ liệu về hình thái, vi phẫu và DNA barcode (ITS,

ndhD) cho loài Lưỡi rắn (Hedyotis Corymbosa (L.) Lam)

2.2 Mục tiêu cụ thể:

- Xác định được những đặc điểm về hình thái, vi phẫu của loài Lưỡi rắn

(Hedyotis Corymbosa (L.) Lam)

- Xác định trình tự các vùng DNA barcode (ndhD, ITS) của các mẫu Lưỡi rắn (Hedyotis Corymbosa (L.) Lam) thu thập tại vùng sinh thái khác nhau

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định tên khoa học của các mẫu thu thập

Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm hình thái: phân tích mô tả cơ quan

sinh dưỡng, cơ quan sinh sản

Nội dung 3: Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu: vi phẫu bộ phận sinh dưỡng

(thân, lá)

Nội dung 4: Xác nhận chỉ thị ITS và ndhD là chỉ thị hữu ích trong việc

nhận dạng và phân biệt loài

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) là cây thuốc được sử

dụng trong YHCT nhưng chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam Dược liệu Lưỡi rắn thường bị nhầm lẫn với một số dược liệu khác cùng chi như Bạch

hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.), Bòi ngòi hoa đôi (Hedyotis biflora

(L.) Lamk.) …

Xây dựng được bộ dữ liệu chi tiết về các đặc điểm của loài Lưỡi rắn

(Hedyotis corymbosa (L.) Lam) từ cấp độ hình thái, vi phẫu đến ADN

barcode Các kết quả này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, thiết thực cho

công tác kiểm định tính đúng của dược liệu ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi An điền (Hedyotis L.)

1.1.1 Vị trí phân loại của chi An điền (Hedyotis L.) và loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam.)

Chi An điền (Hedyotis L.) là chi thực vật có hoa thuộc họ Cà phê

(Rubiaceae Juss.) Tùy theo quan điểm của một số tác giả, số lượng taxa thuộc chi cũng có sự chênh lệch nhất định Tao & Taylor, (2011) cho rằng chi

Hedyotis L gồm khoảng 500 taxa, trong khi Mabberley (2008) đưa ra con số

thống kê số taxa thuộc chi Hedyotis L là khoảng 250 Tuy nhiên, theo Dutta &

Deb (2004), có khoảng 515 taxa thuộc chi này, trong đó Ấn Độ có phân bố nhiều nhất với khoảng 74 taxa Gần đây, nhiều nghiên cứu về sinh học phân tử

đã được tiến hành trên các đối tượng Hedyotis, nhiều taxon trong chi đã có sự

thay đổi vị trí phân loại [21] Tính đến hiện tại, tổng số taxa ghi nhận thuộc chi

Hedyotis L là khoảng 193 loài Các loài thuộc chi Hedyotis L.phân bố rộng ở

khu vực Nhiệt đới và Cận nhiệt đới, chủ yếu ở Châu Phi và Châu Á, một vài nơi trong vùng Ôn đới có khí hậu ấm áp Ở Việt Nam, theo Trần Ngọc Ninh

(2005), chi Hedyotis L có 65 loài, 7 thứ; phân bố rải rác trên cả nước [9]

Loài Lưỡi rắn (H corymbosa (L.) Lam.) được xếp trong nhóm (section)

Oldenlandia L thuộc chi Hedyotis L Một số tài liệu cũng coi loài H corymbosa (L.) Lam như là tên đồng danh với loài Oldenlandia corymbosa

L Mặc dù, Hedyotis và Oldenlandia được mô tả là hai chi riêng biệt bởi Linnaeus (1753) và Roxburgh (1832), Lamarck (1792) là những tác giả đầu

tiên coi Oldenlandia là một nhóm (section) thuộc chi Hedyotis L Quan điểm

này được củng cố bởi công trình của Dutta & Deb (2004) Trong khi, hai công

trình trước đó của D Don (1825) và Kuntze (1891) đã sắp xếp Hedyotis L như là chi đồng danh của Oldenlandia L [25]

Hiện nay, trong các nghiên cứu về Phân loại học thực vật, nhiều hệ thống phân loại được áp dụng, trong đó mỗi hệ thống đều có những ưu điểm

và những hạn chế riêng Một số hệ thống được các nhà thực vật sử dụng phổ biến như: A Takhtajan (2009) [48], G Bentham & J D Hooker (1876) [13], APG IV (2016) [12],, Qua các công trình nghiên cứ về hệ thống phân loại

họ Cà phê (Rubiaceae Juss.) của các tác giả trên thế giới, nhận thấy mỗi quan điểm đều có lập luận riêng và phù hợp với thời điểm đó và lãnh thổ Ở Việt Nam chủ yếu là các công trình có tính chất kiểm kê các taxon dựa trên các hệ thống nước ngoài; đến nay còn thiếu một công trình đầy đủ và hệ thống Tuy nhiên, trong các hệ thống, có thể thấy hệ thống phân loại của A Takhtajan (2009) là tương đối hợp lý, đồng thời cũng phù hợp với việc sắp xếp các

taxon thuộc họ Cà phê (Rubiaceae Juss.) cũng như chi Hedyotis L ở Việt

Nam Theo hệ thống phân loại thực vật của A Takhtajan (2009) [48], vị trí

phân loại của chi Hedyotis L có thể được sắp xếp như sau:

Họ Cà phê - Rubiaceae Juss

Chi An điền - Hedyotis L

Loài Lưỡi rắn – H corymbosa (L.) Lam

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi An điền (Hedyotis L.)

Cây thảo, nửa bụi, hoặc bụi, hàng năm hoặc lâu năm, mọc bò lan trên mặt đất đến đứng hoặc leo, không có cạnh sắc nhọn Lá đơn, mọc đối hoặc hiếm khi mọc vòng, đôi khi mọc thành cụm ở đầu thân; cuống lá từ dài đến gần như không cuống; phiến lá hình bầu dục, thuôn hẹp, nhẵn hoặc có lông

tơ; gốc lá tù đến tròn hoặc cụt, đầu lá nhọn hoặc có mũi dài; mép lá nguyên hoặc không, có lông hoặc nhẵn; gân bên vài cặp; lá kèm giống như bao quanh thân, hình tam giác, hình tam giác rộng hoặc hẹp, có 2 cánh ở mép Cụm hoa mọc ở ngọn, ở nách lá, dạng xim hoặc chùy ngắn; nhẵn hoặc có lông; lá bắc hình đường-hình mác, hoặc hình bầu dục hẹp đến rộng Hoa có cuống đến gần như không cuống Đài hoa có thùy xẻ nông hay sâu; các thùy hình tam giác đến hình thìa, đôi khi khác thùy đài không bằng nhau Tràng màu trắng hoặc xanh nhạt, dạng hình phễu hoặc hình ống-hình phễu Bao phấn thò ra khỏi ống tràng Vòi nhụy thò ra khỏi ống tràng và cao đến khoảng giữa ống tràng Quả nang, hình cầu đến hình trứng; nhẵn hoặc có lông Hạt ít hoặc nhiều, hạt màu đen nâu, có cạnh

Mùa hoa quả của các taxa Hedyotis L gần như quanh năm Cây mọc

trong rừng, ven nơi đất ẩm ướt gần thung lũng và khe núi,…

1.1.3 Lược sử chi An điền (Hedyotis L.)

1.1.3.1 Trên thế giới

Một số nước lân cận với Việt Nam cũng có các công trình nghiên cứu từng taxon, nhóm taxon hay các công trình thực vật chí riêng biệt Một số các công trình nghiên cứu đáng chú ý ở châu Á và các nước lân cận Việt Nam có thể kể dưới đây

Thực vật chí Trung Quốc (Flora of China) (19: 147–174 2011) theo thực

vật chí Trung Quốc có khoảng 500 loài phân bố thuộc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới, nhiều nhất ở Châu Phi và Châu Á, một số ít ở vùng

ôn đới ấm áp; 67 loài (38 loài đặc hữu) ở Trung Quốc Tác giả đã ghi nhận và

mô tả được 67 loài trong chi Hedyotis, không có hình vẽ minh họa [21]

Thực vật chí Pakistan (Flora of Pakistan): Nhiều nhà thực vật học

(Torrey & Gray in Fl N Amer 2(1): 37-43 1841, Fosberg in Va J Sci 2: 106-111 1941 & in Castanea 19: 25-37 1954, Lewis trong Rhodora 63: 216-

223 1961, v.v.) cho rằng Oldenlandia L và Hedyotis L nên được hợp nhất,

tuy nhiên, theo Verdcourt (ở Polhill, Fl Trop East Afr Rubiaceae-I, 1976),

chúng tôi đã giữ chúng riêng biệt Hơn nữa ở Pakistan Oldenlandia và

Hedyotis có các hình thái riêng biệt mặc dù sự khác biệt trong hai chi thường

không đáng kể Một chi gồm khoảng 150 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á; đại diện ở Pakistan bởi các loài sau đây Đơn vị phân loại thấp

hơn Hedyotis hirsuta (L f.) Sprang [26]

Thực vật chí Thái Lan (Flora of Thailand): Theo các nhà nghiên cứu

học đã phát hiện ra vài trăm loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới; 22 loài được biết đến từ Thái Lan

1.1.3.2 Ở Việt Nam

Nguyễn Tiến Bân, Danh lục các loài thực vật Việt Nam (2003,2005)

đã mô tả các đặc điểm chính của chi Hedyotis L và nêu danh sách 65 loài thuộc chi Hedyotis L ở Việt Nam Đây là tài liệu quan trọng giúp cho việc tra

cứu và nhận biết các chi thuộc họ Rubiaceae nói chung và các loài thuộc chi

Hedyotis L nói riêng ở Việt Nam [2]

Công trình của người Việt Nam đáng chú ý là “Cây cỏ miền Nam Việt Nam (1972)” và “Cây cỏ Việt Nam (1993, 2000)” của Phạm Hoàng Hộ Năm

2000, tác giả đã mô tả 73 loài trong chi Hedyotis trên toàn lãnh thổ Việt Nam

Tác giả không nêu các đặc điểm của chi mà mô tả loài và hình vẽ minh họa còn rất đơn giản [5]

Trong cuốn sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất

Lợi, các loài cây thuốc thuộc chi Hedyotis, học Cà phê (Rubiaceae) để chữa

rắn cắn, suy nhược thần kinh, đau xương cốt, các bệnh viêm nhiễm,…đặc biệt

là dùng chữa bệnh viêm gan, các bệnh về gan và ung thư [8]

Mới đây, theo Trần Ngọc Ninh (2005) trong “Danh lục các loài thực

vật Việt Nam”, chi Hedyotis có 65 loài, 7 thứ Trong quá trình nghiên cứu các

mẫu vật của chi này ở Việt Nam [9]

1.2 Khái quát về loài Hedyotis corymbosa (L.) Lam

Hedyotis corymbosa (Linnaeus) Lamarck, Tabl Encycl 1: 272 1792

Loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam) là synonym của

Oldenlandia corymbosa L., được mô tả lần đầu tiên năm 1753 bởi Linnaeus

Từ cơ sở đó được Lamarck mô tả chi tiết và trích dẫn đầy đủ các thông tin bởi Lamarck vào năm 1792, loài Lưỡi rắn thuộc chi An điền thuộc họ Cà phê

Ở Việt Nam, phần lớn tài liệu vẫn đang sử dụng tên Hedyotis

corymbosa (L.) Lam

1.2.1 Phân bố

Trong số khoảng 73 loài thuộc chi Hedyotis L ở Việt Nam, Lưỡi rắn

thuộc nhóm những loài cây có kích thước nhỏ, phân bố tương đối phổ biến ở vùng đồng bằng, trung du và núi thấp Trên thế giới vùng phân bố của cây cũng bao gồm hầu hết các nước trong khu vực có khí hậu nhiệt đới ở Nam Á

và Đông Nam Á như: Ấn Độ, Xrilanca, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, Campuchia, Lào, và đảo Hải Nam Trung Quốc Cây còn có ở Châu Phi [6]

Lưỡi rắn thuộc loại cây ưa sáng và ưa ẩm, thường mọc thành đám, đôi khi thuần loại trên các bãi hoang, vườn, ruộng cao và nương rẫy Cây có thể sống được trên nhiều loại đất, sinh trưởng phát triển nhanh trong vụ hè – thu

và tàn lụi trước mùa đông Cây ra hoa quả nhiều, khi quả già tự mở để hạt phấn tán ra xung quanh [6]

Hình 1.1 Phân bố loài Hedyotis corymbosa (L.) Lam [49]

1.3 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcodes)

1.3.1 Giới thiệu về mã vạch ADN

Trong quá trình nghiên cứu về giới thực vật thì phương pháp phân loại thực vật dựa trên những đặc điểm hình thái từ lâu đã chứng minh được vai trò quan trọng trong việc làm nền tảng cho các nghiên cứu về sinh thái, tiến hóa và

đa dạng thực vật Phân loại thực vật căn cứ vào đặc điểm hình thái của các cơ quan bộ phận, chủ yếu dựa vào sự khác biệt hình thái của các cơ quan đặc biệt

là cơ quan sinh sản của thực vật, đây là cách thức phân loại truyền thống đã được xây dựng và phát triển từ rất xưa cho tới ngày nay Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy đó chưa phải là phương pháp hiệu quả trong việc phân loại các mẫu đang trong giai đoạn phát triển, các mẫu có đặc điểm giống nhau, hay các mẫu không đủ các bộ phận [7] Bên cạnh đó, hiện nay các phương pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia về hình thái học, việc phân loại cần nhiều năm kinh nghiệm và khó thực hiện đối với những sinh viên

ít kinh nghiệm hoặc những nhà nghiên cứu không chuyên [28] [29]

Một phương pháp phân loại mới dựa trên lĩnh vực sinh học phân tử đã được ra đời từ những năm 1990, đã hỗ trợ đắc lực phương pháp phân loại thực vật truyền thống dựa trên hình thái được gọi với thuật ngữ “ADN mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào những năm 1993 Đó là phương pháp dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân (hay ADN) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen hoặc các vùng gen khác nhau trong hệ gen [40]

Thực tiễn đã chứng minh mã vạch ADN bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ những nghiên cứu của Herbert et al (2003b) Kết quả nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với nhau thuộc

bộ cánh vảy có thể xác định với độ chính xác 100% bằng cách này sử dụng gen ty thể cytochrome coxidase tiểu đơn vị I (COI) (đây là enzyme cuối cùng trong chuỗi vận chuyển hô hấp của ty thể, màng) [29]

Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay đổi theo quá trình tiến hóa [28] [33] Ngoài ra việc lựa chọn một vùng làm trình tự mã vạch ADN còn cần phải mang những đặc điểm sau: có độ dài thích hợp (không quá ngắn để có độ đa hình về trình tự giữa các taxon, không quá dài để có thể giải trình tự theo cách thông thường, thậm chí cả trong khi điều kiện chưa được tối ưu); thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt các nucleotide và không có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài đoạn lặp lại microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [30]

Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém nhiều công sức và kinh phí nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện được Thay vào đó, việc xác định một đoạn ADN đã biết, đặc trưng cho loài là giải pháp hiệu quả trong phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học Vì vậy, hướng nghiên cứu mã vạch ADN đang được phát triển mạnh

mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về

đa dạng sinh vật, giám định loài, giám định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây trồng, vật nuôi, sản phẩm nông - lâm - thủy sản,…) [32]

Mã vạch ADN là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus [17] [28] [29] [34], [38] Việc xác định loài bằng mã vạch ADN có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài [16]

Việc sử dụng ADN mã vạch để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩa ngày càng lớn Cho đến nay, sau hơn 10 năm nghiên cứu đã

có trên 6000 công trình khoa học được công bố với khoảng 5 triệu trình tự

mã vạch ADN ở các loài sinh vật Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc

sử dụng mã vạch ADN, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [31], [35], [45]

1.3.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự mã vạch ADN

Mỗi đoạn mã vạch có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau: chi, họ, loài hay dưới loài Các đoạn mã

vạch ADN có thể là những đoạn nằm trong hệ gen nhân (18S, 5.8S, 26S,

ITS…) [14] [20] [22][37], hệ gen ty thể (Cytb, CO1…) [14] [15] [29], hệ gen

lục lạp (matK, rbcL, trnH – psbA ) [29] Tuy nhiên, chưa có đoạn ADN nào

được sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật, thay vào đó cần lựa chọn, sàng lọc những đoạn ADN đặc trưng và phối hợp các đoạn mã vạch ADN sẽ đem lại hiệu quả cao hơn [24] [27] Tùy vào đối tượng giám định mà các đoạn mã vạch ADN sẽ được sử dụng một cách hợp lý [18] [31] [34]

Khi sử dụng trình tự mã vạch ADN trong nghiên cứu thì đặc điểm quan trọng nhất của chúng là phải phổ biến và đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng sử dụng Điều này có nghĩa là các đoạn gen được sử dụng như một mã vạch nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có sự biến đổi giữa các loài nhưng ổn định và bảo thủ cao bên trong loài hoặc biến đổi không đáng kể Do vậy, ADN lý tưởng là một đoạn ADN có trình tự ngắn, bắt cặp được với cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại bằng PCR Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau: Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự), trình tự có tính đặc hiệu cao và có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [34]

Đối với thực vật thì quá trình tìm kiếm một chỉ thị ADN chung cho tất

cả các loài gặp rất nhiều khó khăn bởi hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp với chỉ thị ADN và hệ gen nhân, vùng ADN nằm giữa các gen hay còn gọi là ITS (Internal Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm chỉ thị ADN trong một số nghiên cứu [38] [41] Trong những năm gần đây, nhiều

vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ thị ADN cho thực vật [19] [33] Mặc dù, chưa có chỉ thị ADN nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [19] [36] Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu cũng

đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng ADN chỉ thị để định danh loài đối với thực vật [19] [33]

1.3.3 Một số vùng gen được sử dụng làm mã vạch ADN ở thực vật

1.3.3.1 Trình tự nucleotide vùng gen nhân

Trình tự mã vạch ADN được nhân bản từ đoạn ADN hệ gen của bố mẹ

dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Bao gồm kết

quả lai giống, cho đến khi phiên mã nội vùng đệm (ITS) của DNA ribosome

(rDNA), ADN nhân đã được kiểm nghiệm như mã vạch trong thực vật Tuy nhiên, khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái chất lượng ADN gennome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng qua các giống quy mô lớn có thể hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong

việc xác định loài bằng phương pháp ADN mã vạch [41] [43]

1.3.3.2 Vùng gen mã hóa ribosome

Gen ADN ribosome (rDNA) là hệ thống đa gen mã hóa cho axit nucleic của ribosome Các gen rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính

đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm vùng mã hóa 18S, 5.8S,

26S và xen giữa các trình tự không mã hoá ITS1 và ITS2 (Internal transcribed

spacers) nằm ở hai bên sườn của vùng 5.8S (Hình 1.1) Vùng mã hoá của ba gen rDNA nói trên được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Thông thường các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và hình thành một khối lớn sắp xếp tập trung trong nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất là các đơn vị riêng lẻ của hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập mà thay vào

đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy nên rDNA đạt mức

ổn định cao hơn trong cùng loài nhưng khác biệt giữa các loài Cho tới hiện

tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công cụ hữu

ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả động vật và thực vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Một

số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính cho thấy

một số mức độ biến đổi nội bộ trong số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2

do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó, với các

locus khác trong thực vật như là mã vạch cho thấy nrITS đạt hiệu quả cao và phổ biến hơn Trên cơ sở này, nrITS có thể được sử dụng để phân định chính

xác và hiệu quả sinh học - thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước,…) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [42][43]

Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật

(a) Vị trí nhiễm sắc thể của các vùng rDNA

(b) Cấu tạo của vùng Intron, Exon liền kề (Poczai and Hyvönen, 2010) [48] 1.3.3.3 Trình tự gen lục lạp

Ở thực vật bậc cao, hệ gen lục lạp gồm phân tử ADN cấu trúc vòng có kích thước 120 - 160 kb chia làm hai bản sao đơn một bản sao đơn lớn LSC (large single - copy region) và bản sao đơn nhỏ SSC (small single - copy

region) Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo ngược nhau (Ira

và Irb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen RNA ribosome - rARN (4 gen ở thực vật bậc cao) và ARN vận chuyển - tARN và các gen khác mã hoá cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng

100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng (Hình 1.2) Hệ gen lục lạp mang tính bảo thủ cao và tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu kiểm nghiệm gần đây, với một

số lượng hạn chế các locus là các đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị mã vạch tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá khác nhau vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [43][44]

Hình 1.3 Hệ gen lục lạp hoàn chỉnh của loài Hedyotis corymbosa [46]

1.4 Ứng dụng mã vạch ADN trong nghiên cứu di truyền các loài trong chi Hedyotis

Hiện nay, tại chi Hedyotis có ba hệ gen lục lạp với kích thước là 153,653bp; 152,327bp; 153,617bp tương ứng với các loài Hedyotis diffusa;

Hedyotis corymbosa; Oldenlandia brachypoda [46]

Hệ gen lục lạp hoàn chỉnh của cả ba loài Hedyotis diffusa; Hedyotis

corymbosa; Oldenlandia brachypoda đã được giải trình tự bằng công nghệ

giải trình tự thế hệ mới (NGS) (Yik và cs., 2021) Hệ gen H diffusa và H

corymbosa có kích thước lần lượt được ghi nhận là 153,653bp và 152,327bp

Thông tin hai hệ gen này đã được công bố trên cổng thông tin NCBI, với số đăng kí lần lượt là (MT767008),(MT767006) và (MT767007) [46]

Bằng cách so sánh hai bộ gen lục lạp hoàn chỉnh, Yik và cs (2021) nhận thấy rằng hai loài có quan hệ họ hàng chặt chẽ với nhau trong phân họ Rubioideae Bên cạnh đó, nhóm tác giả cũng phát hiện có sự khác biệt đáng

kể về số lượng và các mô típ lặp lại Phân tích đa hình đơn nu (SNP) giữa ba loài và các loài gần gũi trong chi cho thấy có 3 vùng trình tự có khả năng

phân tách ba loài này về di truyền, đó là các vùng liên gen: rps16-trnQ, hai vùng gen ndhD và ycf1 Tác giả cho rằng ba vùng gen này có thể dùng để

nhận biết ba loài này với nhau [46]

Mối quan hệ gần gũi giữa các dòng thực vật có thể được làm sáng tỏ thông qua phân tích trình tự bộ gen lục lạp trong nghiên cứu này Mối quan hệ

phát sinh loài của ba loài Hedyotis và các loài khác của họ Rubiaceae cho thấy H diffusa có quan hệ rất gần với H corymbosa Cây phát sinh loài có giá

trị với bootstrap là 100

Sự phát triển của các dấu mã vạch DNA: Do kích thước bộ khuếch đại

ngắn và sự hiện diện của vùng chung trong bộ đệm xen kẽ ndhD và rps16 –

trnQ giữa 3 loài Hedyotis Vùng ycf1 không được chọn làm vùng mã vạch vì

nó quá dài và dễ thay đổi để cho phép thiết kế các đoạn mồi phổ quát [46]

Chính vì vậy trong đề tài nghiên cứu này tôi đã chọn vùng gen nhân

ITS và vùng gen lục lạp ndhD để nghiên cứu định danh cũng như phân loại loài Hedyotis corymbosa với các loài gần gũi cùng chi

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2 Đối tượng, phạm vi và hóa chất nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là loài Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa (L.) Lam)

thuộc Chi An điền (Hedyotis), họ Cà phê (Rubiaceae Juss.) được thu thập tại một số địa điểm tại Việt Nam

Mẫu lá được bảo quản trong túi nilon có chứa hạt silicagel hút ẩm, sau

đó được bảo quản để tách chiết DNA phục vụ nghiên cứu

Bảng 2.1 Thống kê các mẫu vật trong quá trình nghiên cứu

STT Số

hiệu Loài

Thời gian thu mẫu Nơi thu Người thu

mẫu

Hà Nam

Lê Thị Tú Linh

4 HC12 H corymbosa 01/2023 Triệu Sơn -

Thanh Hóa

Lê Thị Tú Linh

5 HC13 H corymbosa 11/2022 Thanh Miện -

Hải Dương

Lê Thị Tú Linh

6 HC14 H corymbosa 02/2023 Quảng Ninh -

Qảng Bình

Nguyễn Hoàng, Phan Văn Trưởng

7 HC15 H corymbosa 03/2023 Kỳ Anh - Hà Tĩnh

Nguyễn Hoàng, Phan Văn Trưởng

8 HC16 H corymbosa 03/2023 Hương Thủy -

TT Huế Hà Anh Tuấn

9 HC17 H corymbosa 02/2023 Chương Mỹ -

Hà Nội

Lê Thị Tú Linh

2.2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Phạm vi về nội dung:

+ Sử dụng và thiết kế các chỉ thị khuếch đại, giải trình tự các vùng

DNA barcode: ndhD, ITS

+ Thu thập mẫu từ các vùng sinh thái khác nhau để làm mẫu vật phục

vụ cho nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học phân tử

- Phạm vi về không gian:

+ Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng Giải phẫu thực vật và phòng Công nghệ gen và Sinh học phân tử - Trung tâm Tài nguyên Dược liệu, Viện dược liệu

+ Thông tin các hệ gen được tham chiếu từ cơ sở dữ liệu NCBI

2.2.3 Hóa chất trong nghiên cứu

Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số: CTAB, NaCl, Tris HCl,

EDTA, NaH2PO4, H2O deion, Isopropanol, Ethanol, Chloroform, Isoamyl alcohol, RNase

Kit tinh sạch DNA của hãng QIAquick (qiagen, Đức)

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: MgCl2, Buffer , Taq-polymerase, dNTP

Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose, TBE (Tris-Boarate-EDTA)

ethidium bromide

2.2.4 Một số máy móc sử dụng trong nghiên cứu

Máy móc, thiết bị dùng trong sinh học phân tử: Cân kỹ thuật điện tử,

máy ly tâm, máy voltex, lò vi sóng, thiết bị chạy điện di, máy nhân gen PCR (…), máy soi gel cùng các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ gen và Sinh học phân tử - Trung tâm Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp kế thừa tài liệu

- Với đề tài này, tôi tập trung tham khảo tài liệu để nắm được các thông tin cơ bản về:

+ Vị trí phân loại và danh pháp của loài;

+ Nguồn gốc và vùng phân bố của loài;

+ Đặc điểm hình thái và sinh thái của loài;

+ Giá trị sử dụng loài;

+ Các kỹ thuật sinh học phân tử: giải trình Sanger, phân tích dữ liệu SNP, phân tích đa dạng di truyền, thiết lập cây phát sinh loài dựa trên dữ liệu trình tự và hình thái

- Kế thừa các số liệu và phương pháp nghiên cứu:

+ Kế thừa số liệu, kết quả từ các bài báo, các nghiên cứu trong và ngoài nước + Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái

+ Các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử

2.3.2 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu vật

- Áp dụng phương pháp điều tra thực địa được Nguyễn Nghĩa Thìn giới thiệu trong “Các phương pháp nghiên cứu thực vật” thu thập thông tin các mẫu tiêu bản sống ngoài tự nhiên [10] Sử dụng máy định vị (GPS) để xác định vị trí thu mẫu ngoài thực địa

- Thu thập các mẫu vật (thu mẫu cả cây) làm tiêu bản và mẫu cây tươi phục vụ nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu

- Mẫu nghiên cứu sinh học phân tử lựa chọn lá hoặc đầu mầm thân rễ Mẫu thu được bảo quản trong silicagel

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu thực vật, giải phẫu

 Xác định tên khoa học, mô tả đặc điểm hình thái:

Xác định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái (Nguyễn

Bá, 2007), trên cơ sở các khóa phân loại và bản mô tả của loài (Hedyotis

corymbosa (L.) Lam) trong các bộ thực vật chí hiện có và các tài liệu có

liên quan [1]

Chụp ảnh chi tiết các bộ phận, sử dụng máy ảnh, máy scan, kính hiển vi soi nổi và thước đo chuyên dụng

 Đặc điểm giải phẫu:

Phương pháp nghiên cứu giải phẫu dựa theo phương pháp nghiên cứu của Nguyễn Bá (2007), Nguyễn Viết Thân (2013) và có cải biến cho phù hợp [1] [11]

 Tiêu bản, phẫu thức cắt, nhuộm:

Bộ phận khảo sát được cố định trên dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay microtom và cắt bằng dao lam Sử dụng phẫu thức cắt ngang; cắt ngang đoạn giữa của thân, rễ với thiết diện phù hợp; lá cắt ngang gân giữa, lá được chọn

là lá bánh tẻ không quá già hoặc quá non, khảo sát trên nhiều lá để ghi nhận,

mô tả đặc điểm chung

 Quy trình làm tiêu bản vi phẫu:

(1) Cắt mẫu và tẩy nội chất

(2) Nhuộm mẫu: Nhuộm màu bằng đỏ carmin 0.5% và xanh methylene 0.02%