Tiểu luận trình bày quy trình và hệ thống lênmen lỏng sản xuất peniciline

Phần 1: Lịch sử phát hiện và sản xuất penicilineNăm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra rằng một loại nấm mốc bị nhiễm trong các đĩa petri nuôi Staphylococcus aurecus – loại vi khuẩn gâ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

MỤC LỤC

Phần 1: Lịch sử phát hiện và sản xuất peniciline 3

Phần 2: Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp peniciline nhờ nấm mốc 7

I Cơ chế sinh tổng hợp peniciline ở Penicillium chrysogenum 7

II Các yếu tố ảnh hướng đến quá trình sing tổng hợp peniciline 8

2.1 Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm 8

2.2 Thành phần môi trường lên men 8

2.3 Điều kiện lên men 10

2.4 Sự tích tụ và phân hủy peniciline 11

III Quy trình lên men lỏng trong sản xuất peniciline 11

3.1 Chuẩn bị lên men 13

3.2 Kỹ thuật lên men 13

3.3 Thiết bị lên men lỏng 15

3.4 Xử lý dịch lên men và tinh chế thu peniciline tự nhiên 17

3.5 Sản xuất peniciline bán tổng hợp từ peniciline tự nhiên 19

DANH MỤC BẢNG 20

DANH MỤC HÌNH ẢNH 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

Phần 1: Lịch sử phát hiện và sản xuất peniciline

Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra rằng một loại nấm mốc bị nhiễmtrong các đĩa petri nuôi Staphylococcus aurecus – loại vi khuẩn gây mụn nhọt,viêm họng và áp xe ở người và ngựa bị nhiễm một loại nấm mốc Penicillium

notatum sản sinh ra một loại kháng sinh mạnh mẽ gây chết các vi khuẩn xung

quanh làm xuất hiện hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm,ông gọi loại kháng sinh này là Peniciline (1929) Fleming đã phân lập và nuôi nấmmốc trong môi trường nuôi cấy thuần khiết Ông phát hiện ra rằng P notatum cực

kỳ hiệu quả ngay cả ở nồng độ rất thấp, ngăn chặn sự phát triển của

Staphylococcus ngay cả khi pha loãng 800 lần và ít độc hơn các chất khử trùng

được sử dụng vào thời điểm đó

Hình 1 1 Hình ảnh đĩa petri nuôi cấy Staphylococcus bị nhiễm Penicillium

Nguồn: madeupinbritain.ukNăm 1938 ở đại học Oxford, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh củaFleming và ông đã đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiêncứu này Năm 1940, Florey đã thực hiện các thí nghiệm quan trọng, cho thấypeniciline có thể bảo vệ chuột khỏi bị nhiễm trùng Streptococci chết người

Từ năm 1941 đến 1943, các nhà nghiên cứu tại Viện Carnegie củaWashington đã nghiên cứu phát triển các phương pháp sản xuất peniciline côngnghiệp hóa và phân lập các chủng nấm Penicillium cho năng suất cao bằng cáchcho Penicillium chrysogenum NRRL 1951 – được phát hiện trên một quả dưa lướiđang thối hỏng tại trung tâm nghiên cứu ứng dụng nông nghiệp quốc gia (Illinois)(Rowlands & cs, 1991), tiếp xúc với tia X – 1612 để tạo ra chủng đột biến Kết quả

chủng đột biến tạo ra 300mg peniciline/l nấm mốc, gấp đôi so với NRRL 1951.

Cùng lúc đó, các nhà nghiên cứu tại Đại học Wisconsin đã sử dụng bức xạ cực

tím trên X – 1612 để tạo ra chủng được chỉ định là P chrysogenum Wis Q-176

(chủng này được xem là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sửdụng hiện nay trên toàn thế giới) cho ra lượng peniciline nhiều hơn gấp đôi so với

X – 1612, nhưng ở dạng peniciline K ít được ưa chuộng hơn Để khắc phục điều

đó, Axit phenylacetic đã được thêm vào để chuyển peniciline K sang peniciline G

có hoạt lực cao Chủng này có thể tạo ra 550mg peniciline mỗi lít (Wilson & cs,1976; Hobby & cs, 1985)

Kỹ thuật đã được áp dụng hiệu quả để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp"peniciline chính là các kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn – ghen, xử

lý tia cực tím và tạo đột biến bằng hoá chất, ví dụ như Metylbis - amin (metyl cloetylamin), N-mustar (tris-β-clo-etylamin),

đã được biết hiện nay Giống như tất cả các loại kháng sinh, peniciline là chấtchuyển hóa thứ cấp nên chỉ được sản xuất ở pha tĩnh Chúng tác dụng lên hầu hếtcác vi khuẩn Gram dương và thường được chỉ định điều trị trong các trường hợpviêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ như viêm màng não, viêm tai –mũi – họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu

peniciline được ứng dụng điều trị rất hiệu quả Tuy nhiên, chỉ vài năm sau đã xuấthiện các trường hợp kháng thuốc và hiện tượng này ngày càng phổ biến hơn Năm 1945 bằng việc sử dụng tinh thể học tia X, Dorothy Hodgkin – nhà hóahọc người Anh, đã xác định cấu trúc hóa học của peniciline Mỗi một penicilinebao gồm một vòng thiazolidine gắn với một vòng beta – latam mà bản thân cácpeniciline được thay đổi bởi một mạch nhánh R khác nhau Kết quả của sự thay đổimạch nhánh R, nhóm peniciline chia thành một vài dưới nhóm: các peniciline tựnhiên, các peniciline kháng tụ cầu, các aminopenicline và các peniciline phổ rộng.Tất cả các peniciline đều là dẫn suất của acid 6 – aminopenicillanic (Alan R.Hauser, 2013).

Hình 1 3 Hình ảnh cấu trúc hóa học của peniciline

Nguồn: Alan R Hauser, 2013

Bảng 1 1 Các cấu trúc của Peniciline (Twelfth Edition, 2011)

Năm 1952, peniciline được phát triển ổn định với axit đầu tiên dùng quađường uống, peniciline V Đến năm 1957, các nhà nghiên cứu tại Phòng thí nghiệmnghiên cứu Beecham ở Surrey đã phân lập được 6 – APA từ môi trường nuôicấy P chrysogenum 6 – APA được phát hiện là hạt nhân cốt lõi của peniciline (vàsau đó là nhiều loại kháng sinh β-lactam) và dễ dàng biến đổi về mặt hóa học bằngcách gắn chuỗi bên thông qua các phản ứng hóa học (Hamilton – Miller & cs,2008) Phát hiện này được công bố trên tạp chí Nature vào năm 1959 (Batchelor &

cs 1959) Điều này đã mở đường cho các loại thuốc mới và cải tiến vì tất cả cácpeniciline bán tổng hợp đều được sản xuất từ 6-APA (Rolinson & cs, 2007).Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra được trên 500 chế phẩm peniciline(trong đó chỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là peniciline V và peniciline G) và tiếptục triển khai để sản xuất các chế phẩm peniciline bán tổng hợp khác

Hình 1 4 Sản phẩm Peniciline lên men tự nhiên nhờ P chrysogenum

Nguồn: Nguyễn Văn Cách, 2004

Ở Việt Nam, năm 1946, giáo sư Đặng Văn Ngữ đã thành công trong việc sảnxuất nước lọc peniciline trong môi trường nước ngô góp phần đáng kể vào việc cứuchữa thương bệnh binh và đã được Bác Hồ thưởng Huân chương Lao động hạng bacho thành tựu kỳ diệu chưa từng ai làm được này (Khôi Nguyên, 2012)

Phần 2: Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp peniciline nhờ nấm mốc

I Cơ chế sinh tổng hợp peniciline ở Penicillium chrysogenum

Quá trình sinh tổng hợp peniciline ở nấm mốc P chrysogenum từ ba tiền chấtban đầu là: α – aminoadipic, cystein và valin Sinh tổng hợp Peniciline được mô tảthành ba bước chính như sau:

1 Enzyme ACV synthetase làm ngưng tụ chuỗi bên của cysteine, valine vàalpha aminoadipate thành tripeptide ACV

2 Tripeptide ACV tạo thành vòng hai vòng bằng cách đóng vòng oxyhóa Isopeniciline N synthase tham gia tạo ra isopeniciline N là chất trunggian có hoạt tính sinh học trong con đường này

3.Sự trao đổi L-aminoadipate Acyl-CoA synthetase và Acyl-CoA racemase,một hệ thống hai enzyme có liên quan giúp chuyển đổi isopeniciline N thànhPeniciline N

Hình 2 1 Cơ chế sinh tổng hợp Peniciline nhờ P.chrysogenum

Nguồn: M A Peñalva et al 1998 

Tuy nhiên, cũng có thể nó được giải phóng ra và tích tụ trong môi trường (vìtrong quá trình lên men sản xuất peniciline V bao giờ cũng phát hiện thấy trongdịch lên men lượng lớn α – aminoadipic dạng vòng) Như vậy, quá trình sinh tổnghợp peniciline, phụ thuộc vào điều kiện lên men cụ thể nhất định, có thể xảy ra theosáu đường hướng khác nhau Do đó, hiệu suất chuyển hoá cơ chất – sản phẩm cũngbiến đổi và phụ thuộc vào đường hướng sinh tổng hợp tương ứng Theo lý thuyếtthì hiệu suất lên men sẽ trong khoảng 683 – 1544 UI peniciline/g glucoza; song,trong thực tế, với những chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao nhất cũng mới chỉđạtkhoảng 200 UI/g glucoza (Nguyễn Văn Cách, 2004).

II Các yếu tố ảnh hướng đến quá trình sing tổng hợp peniciline

2.1 Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm

Sự phát triển hệ sợi nấm trong quá trình lên men bao gồm: sự tăng trưởng về kích thước hệ sợi (độ dài sợi, sự lớn lên về kích thước, mức độ phân nhánh của hệ sợi…) và sự biến thiên về số lượng khóm sợi nấm trong môi trường được đánh giá thông qua hai chỉ tiêu là: hàm lượng sinh khối và tốc độ biến thiên hàm lượng sinh khối trong môi trường Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau trong quá trình lên men và sự tích tụ peniciline thường xảy ra mạnh mẽ khi hệsợi phát triển đạt trạng thái cân bằng Trạng thái này có thể xác lập được khi chỉ cung cấp vừa đủ và liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc Thiếu thức ăn, hệsợi nấm sẽ tự phân, còn nếu cung cấp quá nhu cầu trên, hệ sợi sẽ phát triển, nhưng không tích tụ mạnh peniciline mà tích tụ nhiều axit gluconic và axit malic (Nguyễn Văn Cách, 2004)

Hiệu quả chung của quá trình lên men có quan hệ hữu cơ với số lượng, kíchthước và cấu trúc pellet nấm (cấu trúc búi sợi cuộn xoắn) Trong thực tiễn sản xuấtcông nghiệp, người ta thường điều chỉnh các thông số công nghệ theo hướng ưutiên tạo ra dạng pellet đủ nhỏ và mịn (kích thước pellet thích hợp nhất khoảng 0.2 –0.5mm) Điều kiện công nghệ tương ứng với mục tiêu trên thường áp dụng là: tỉ lệcây giống 10%, với mật độ dịch giống (2-10)*1011 bào tử /m , phối hợp điều chỉnh3

giữa sục khí và khuấy trộn để đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầutương ứng với thời điểm lên men (Nguyễn Văn Cách, 2004)

2.2 Thành phần môi trường lên men

Môi trường cơ sở để lên men peniciline, vào thời kỳ đầu trong những năm 40

- 50, là môi trường lactoza - nước chiết ngô

- Nguồn cơ chất chính: là lactoza có thể được thay thế từng phần hoặc toàn bộ

bằng các cơ chất khác như: các loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit,dextrin hay thay thế bằng dầu thực vật Trong các cơ chất nêu trên, hiệu quảcao nhất là glucoza

- Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: có thể sử dụng là bột đậu tương, bột hạt bông,

các loại dầu cám Nhu cầu về thức ăn nitơ cũng có thể được đáp ứng bằngcách cung cấp liên tục (NH4)2SO4, nhưng duy trì ở nồng độ thấp, khoảng 250– 340g/l (nếu dư thừa hiệu quả sinh tổng hợp peniciline sẽ giảm, nếu thiếu sẽxảy ra hiện tượng tự phân hệ sợi)

- Hàm lượng các chất khoáng bổ sung: được tính toán, phụ thuộc vào lượng

dịch chiết ngô sử dụng

- pH môi trường: được điều chỉnh trước khi thanh trùng, sau đó trong suốt quá

trình lên men được giám sát chặt chẽ và điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ

- Tiền chất tạo nhánh: việc kết gắn mạch nhánh của phân tử peniciline không

mang tính đặc hiệu chặt chẽ Nhờ vậy, nếu duy trì nồng độ tiền chất tạo nhánhcần thiết phenylacetat (hoặc phenooxyacetat) (0,47g/gam peniciline G (hoặcphenooxyacetat là 0,50g/gam peniciline V) Mặc khác, tùy thuộc vào từng tiềnchất them vào, loại peniciline được sản xuất có thể được thay đổi, ví dụ:phenyl acetic acid peniciline G; hydroxyl phenyl acetic acid peniciline X; Phenoxy acetic acid peniciline V…)

Bảng 2 1 Thành phần môi trường lên men cơ bản để lên men sản xuất

Peniciline

Nguồn: Nguyễn Văn Cách, 2004

2.3 Điều kiện lên men

- Nhiệt độ: Nấm mốc thường phát triển thuận lợi ở khoảng nhiệt 30 C Tuy0

nhiên, ở ở dải nhiệt độ này tốc độ phân huỷ peniciline cũng xảy ra mạnh mẽ.Trong thực tế, ở giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân ở dảinhiệt độ 30 C, sang giai đoạn lên men thường áp dụng một trong hai chế độ0

- pH môi trường: pH = 6,8 – 7,4 Tuy nhiên ở điều kiện pH cao xu hướng phân

huỷ peniciline cũng tăng lên Vì vậy, trong sản xuất pH môi trường thườngđược khống chế chặt chẽ ở giá trị lựa chọn trong khoảng pH = 6,2 – 6,8

- Nồng độ oxy hoà tan và cường độ khuấy trộn dịch lên men: Nồng độ oxy hòa

tan thuận lợi cho quá trình sinh tổng hợp peniciline khoảng 30% nồng độ oxybão hòa

- Nồng độ CO trong dịch lên men 2 : Ở mức nhất định cũng cần thiết cho quátrình nảy mầm của bào tử nấm mốc; tuy nhiên nếu nồng độ CO quá cao sẽ2

làm cản trở quá trình hấp thu và chuyển hoá cơ chất của chủng, nghĩa làm làmcản trở quá trình sinh tổng hợp peniciline

2.4 Sự tích tụ và phân hủy peniciline

Tùy từng trường hợp cụ thể, trong sản xuất tỷ lệ tổn hao sản phẩm peniciline

do phân hủy thường khoảng 10 – 20% Nhằm giảm tổn thất trên, ngay sau khi kếtthúc quá trình lên men, cần xử lý thu sản phẩm sớm hoặc có giải pháp hạ thấpnhanh nhiệt độ dịch lên men

III Quy trình lên men lỏng trong sản xuất peniciline

Theo công nghệ lên men của hãng Gist – Brocades (Hà Lan), toàn bộ dâychuyển sản xuất thuốc kháng sinh peniciline có thể phân chia làm bốn công đoạnchính:

 Lên men sản xuất peniciline tự nhiên (thường thu peniciline V hoặcpeniciline G)

 Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm peniciline tự nhiên

 Sản xuất các peniciline bán tổng hợp (từ nguyên liệu peniciline tự nhiên)

 Pha chế các loại thuốc kháng sinh peniciline thương mại

*Quy trình sản xuất peniciline (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan):

Giống Penicillium chrysogenum

Nhân giống nhỏ

Lên men sản xuất

Hấp thụ bằng than hoạt tính

Kết tinh peniciline

Lọc tinh thể

Rửa tinh thể

Sản xuất peniciline bán tống hợp Sấy khô

Nhân giống sản xuất

Dung môi

Than

3.1 Chuẩn bị lên men

- Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất:

Giống công nghiệp P.chrysogenum được bảo quản lâu dài ở dạng đông khô,bảo quản siêu lạnh ở - 70 C hoặc bảo quản trong nitơ lỏng Giống từ môi trường0

bảo quản được cấy chuyền ra trên môi trường thạch hộp để hoạt hoá và nuôi thubào tử Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri được cấy chuyển tiếp sang môitrường bình tam giác, rồi sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giốngtrung gian và cuối cùng là trên thiết bị nhân giống sản xuất Trong thực tiễn, đểđảm bảo cho quá trình lên men thuận lợi người ta thường tính toán lượng giống cấpsao cho mật độ giống trong dịch lên men ban đầu khoảng 1 – 5.10 bào tử/m9 3

(Nguyễn Văn Cách, 2004)

- Môi trường lên men:

Cân đong, pha chế riêng các thành phần môi trường lên men trong các thùngchứa phù hợp với thanh trùng gián đoạn ở 121 C ( hoặc thanh trùng liên tục ở0

khoảng 140 – 146 C) hoặc lọc qua các vật liệu siêu lọc rồi mới bơm vào thùng lên0

men Nếu đặc tính công nghệ của thiết bị lên men cho phép, có thể pha chế rồithanh trùng đồng thời dịch lên men trong cùng một thiết bị Tất cả các cấu tử bổsung vào môi trường lên men đều phải được xử lý khử khuẩn trước và sau đó bổsung theo chế độ vận hành vô khuẩn (Nguyễn Văn Cách, 2004)

- Thiết bị lên men:

Phải được vô khuẩn trước khi đưa vào sử dụng Thường thanh trùng bằng hơiquá nhiệt 2,5 – 3,0 at trong thời gian từ 1 – 3h Đồng thời khử khuẩn nghiêm ngặttất cả các hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc và tất cả các thiết bị phụ trợkhác Trong quá trình lên men luôn duy trì áp suất dư trong thiết bị nhằm hạn chếrũi ro do nhiễm tạp (Nguyễn Văn Cách, 2004)

- Không khí:

Thường được khử khuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó qua màng lọc vôkhuẩn hay màng siêu lọc (Nguyễn Văn Cách, 2004)

3.2 Kỹ thuật lên men

Theo Nguyễn Văn Cách năm 2004, quá trình lên men trong môi trường lỏngbằng phương pháp lên men chìm để sản xuất peniciline được vận hành theo phươngpháp lên men hai pha:

 Pha thứ nhất nuôi thu sinh khối trong khoảng 2 – 3 ngày Trong pha này hệsợi phát triển rất mạnh vì các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bàohấp thụ rất mạnh, tốc độ sinh sản của nấm xảy ra rất nhanh, sự tạo thànhpeniciline mới bắt đầu

 Pha thứ hai lên mên thu sản phẩm Ở pha này hệ sợi phát triển chậm lại, pHtăng dần và đạt đến giá trị khoảng 7 – 7,5 Trong pha này peniciline được tạothành với mức độ cực đại

- Nguồn cacbon: khi lên men, người ta thường thay thế phần lớn (hoặc hoàn

toàn) đường lactose bằng đường glucose Tuy nhiên trong thực tiễn, để tránhxảy ra thiếu hụt nhất thời glucose, người ta có thể kết hợp bổ sung một lượngnhỏ đường lactose (khi đó, nếu chưa bổ sung kịp glucose thì nấm mốc sẽ tựđiều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy ra hiện tượng tự phân hệsợi)

- Nguồn nitơ: Ngoài nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp

(NH SO4)2 4 để vừa cung cấp thức ăn N và S, vừa sử dụng để điều chỉnh pHtrong quá trình lên men (pH = 6,5 – 6,8 bằng dung dịch NaOH hoặc H3PO );4

nồng độ NH trong khoảng 0,3 – 0,4 kg/m dịch lên men.4+ 3

- Chất phá bọt: thường sử dụng là các loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương,

dầu vừng, dầu cám…

- Tiền chất tạo nhánh: phenylacetic trong lên men sản xuất peniciline G (hoặc

phenooxyacetic trong lên men sản xuất peniciline V) trong suốt thời gian phalên men peniciline, để duy trì nồng độ trong khoảng 0,1 – 1,0 kg/m dịch.3

- Nhiệt độ lên men: pha đầu khống chế ở 30 C, sau đó sang pha sau giữ ở 22 –o

25o C

- Tốc độ sục khí và khuấy trộn: được điều chỉnh để duy trì nồng độ oxy hòa tan

trong dịch trong khoảng 30%

- Thời gian lên men mỗi mẻ: thường kéo dài khoảng 144 – 180h Kết thúc quá

trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh rồi chuyểnsang công đoạn trích ly và tinh chế thu peniciline