Định tính và Chiết xuất saponin từ Cam thảo

Định tính và Chiết xuất saponin từ Cam thảo có cấu trúc giống glycoside tim Saponin là gì? • Saponin còn gọi là saponoside (sapo = xà phòng) là một nhóm glycoside gặp rộng rãi trong thực vật, đôi khi trong động vật (Hải sâm, Sao biển) và thể hiện các tính chất chung sau: • Tạo bọt bền khi lắc với nước • Có tính phá huyết (làm vỡ hồng cầu) • Độc với cá và các động vật có máu lạnh.nên có thể dùng để bắt cá • Có thể tạo phức với cholesterol và các dẫn chất 3-b-hydroxy steroid khác • Có tính kích ứng, gây hắt hơi, đỏ mắt có thể có trong dầu gội bồ kết C Cấu trúc của saponin • Như các glycoside khác, cấu tạo của saponin gồm 2 phần: • Phần không đường = phần aglycone (còn gọi là genin hay sapogenin) • Phần đường (glycone) Phaàn ñöôøng SAPONIN Phaàn aglycone https://doi.org/10.3390/nano12193427 (coù theå coù 30 C hay 27 C) Phân loại saponin • Sự phân loại saponin thường dựa vào cấu trúc của phần aglycone (còn gọi là genin hay sapogenin) SAPONIN SAPONIN SAPONIN SAPONIN TRITERPENE STEROID ALCALOID STEROID 5 VÒNG 4 VÒNG Spirostane Spirosolane Furostane Solanidane Oleane Dammarane Aminofurostane Ursane Lanostane … … Lupane Cucurbitane Hopane Cycloartane … … cam thảo bắc cây 2 lá mầm thường là saponin triterpen Dược liệu sử dụng • Cam thảo (Rhizoma et Radix Glycyrhizae), là thân rễ và rễ của cây Cam thảo (Glycyrrhiza glabra, Fabaceae) có hoạt chất là glycyrrhizyl • Mạch môn (Radix Ophiopogonis japonici) là rễ củ đã phơi hay sấy khô của Mạch môn đông (Ophiopogon japonicus, Convallariaceae) cây 1 lá mầm thường là saponin steroid Soi bột nếu còn mảnh bần thì mảnh bần thường hình vuông, xếp thành dãy mô mềm thì xếp lộn xộn, vách tb cũng mỏng hơn, có hình đa giác, ko rõ vách tb, có nhiều hạt tinh bột (tinh bột có hình tròn và có tể bên trong) Cam thảo soi bột rễ cây có vị ngọt do trispectirine • Màu vàng nhạt đến màu vàng nâu mảnh hình khối bầnvách nha • Soi kính hiển vi thấy: dày tb mạch dày và dài, • các mảnh mô mềm với tế bào có thành mô mềmvách mỏng và bên trong sợi có tinh mỏng chứa nhiều hạt tinh bột có nhiều hạt tb bên thể calci õalat trong • Hạt tinh bột đứng riêng rẽ, hình trứng mạch mạng xếp xen hay hình cầu có đường kính 2 μm đến kẽ 20 μm • Sợi gỗ màu vàng, có thành dày, thường kèm theo tế bào có tinh thể calci oxalat hình lăng trụ • Mảnh mạch điểm màu vàng,là từ libe • mảnh bần màu nâu đỏ hạt tinh bột rất nhiều calci oxalat khối Định tính saponin có 3 phản ứng saponin tan trong cồn 7-% và nước nóng nhưng cồn có tính phá bọt => nếu cô ko hết cồn sẽ ko có bọt => quyết định làm bằng nước nóng cân trực tiếp vào bình nón, lấy giấy A4 lót ở dưới và phải bằng cái đĩa cân để tránh rơi dược liệu ra khó vệ sinh Thử nghiệm tính tạo bọt mạch môn tự cắt nhỏ, ko có xay sẵn vì nó dẻo và là rễ củ • Cho 1,0 g dược liệu (Cam thảo, Mạch môn) Thời gian bọt bền (phút) vào bình nón 50 ml, thêm 20 ml nước cất, 15 phút + đun nhẹ trên cách thủy trong 5 phút rồi lọc 30 phút ++ nóng qua bông tránh để nguội mới lọc 60 phút +++ • Lấy 10 giọt dịch chiết đậm đặc này cho vào một ống nghiệm 1.6 x 16 cm có nắp đã có sẵn 10 ml nước cất • Đậy nắp ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều thẳng đứng của ống nghiệm trong 1 phút (30 lần lắc), để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả chloroform chiết được rất nhiều đường, acid amin, saponin, hc kém phân cực như steroid, tinh dầu Phản ứng Lierbermann – Burchard xác định khung terpen hay steroid • Cho vào ống nghiệm 0.5 g dược liệu, CHCl 1 ml Ac2O thêm 5 ml cồn 70%, đun cách thủy trong 3 5 phút Lọc qua bông vào một chén sứ, bông gòn để lọc cô trên bếp cách thủy đến cắn thật khô, để nguội còn nước thì sẽ ko có phản ứng • Cho vào cắn 1 ml anhydride acetic và 1 ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan Lọc bằng pipet Pasteur bịt bông, cho dịch lọc vào một ống nghiệm khô lớp trên nâu đỏ là triterpen lớp trên xanh là saponin • Thêm từ từ theo thành ống nghiệm steroid khoảng 1 ml acid sulfuric Giữa 2 lớp chất lỏng có vòng ngăn cách màu nâu đỏ, lớp dung dịch phía trên có màu vàng nâu sẫm hoặc xanh lá, xanh rêu… 1 cm Phản ứng hóa học CHCl Ac2O • Phản ứng tạo bọt 3 • Phản ứng Liebermann-Burchart 365 nm Phản ứng với SbCl3 xác định khung terpen hay steroid • Cho vào ống nghiệm 0.5 g dược liệu, thêm 5 ml cồn 70%, đun cách thủy trong 5 phút • Lọc dịch chiết vào chén sứ, cô đến cắn • Nhỏ vào chén sứ 5 giọt SbCl3/CHCl3, soi chén sứ dưới UV 365 nm • Huỳnh quang xanh: saponin triterpene • Huỳnh quang vàng: saponin steroid ĐỊNH TÍNH THÔI NHA CHIẾT XUẤT ACID GLYCYRRHIZIC TỪ CAM THẢO Nguyên tắc saponin dạng acid • Chiết xuất cao toàn phần bằng methanol thu được dịch chiết chứa acid glycyrrhizic ở dạng muối với kali hoặc amoni tan được trong nước • Dùng acid hydrocloric chuyển acid glycyrrhizic ở dạng muối thành dạng acid không tan trong nước từ muối sang phân tử sẽ ko tan trong nước ethanol 96% ko tối ưu hơn 70% nhưng dễ cô hơn Chiết xuất • Cân 50 g bột rễ Cam thảo cho vào bình cầu 500 ml, thêm 200 ml ethanol 96% và đun hồi lưu trong 30 phút (2 nhóm thực hiện chung) • Lọc dịch chiết cho vào becher 1.000 ml, mỗi nhóm lấy khoảng 150 ml dịch chiết cho vào chén sứ 500 ml • Giữ lại 0,5 ml dịch chiết vào eppendorff mẫu thử toàn phần (TP) dùng cho sắc ký lớp mỏng Phần dịch còn lại được cô cách thủy đến cắn A dung giấy chỉ thị cho pH, để giấy quỳ trên đĩa petri m sản phẩm /25 x 100% để tính hiệu suất Tinh chế saponin thô • Cắn A được hòa với 100 ml nước cất và cho vào becher 250 ml, tráng chén sứ với 50 ml nước cất và gộp vào becher trên • Acid hóa dịch chiết bằng cách cho từ từ acid chlorhydric 10 %, vừa rót vừa khuấy đều đến khi đạt pH = 1-2 Acid glycyrrhizic tự do sẽ kết tủa màu nâu lắng thành khối dẻo dưới đáy becher Lọc tủa bằng phễu Buchner thu lấy cắn B (saponin thô) bước này đc dùng giấy lọc cắt sẵn r nè giấy lọc này nhớ cân bì trước • Lấy 0,1 g cắn B hòa vào 1 ml MeOH cho vào ko cần cho eppendorff được mẫu thử 1 (T1) dùng cho dính 1 đầu chính xác sắc ký lớp mỏng tăm là đủ òi càng nhỏ nhiều acid càng đục rồi ngày càng dẻo cho dạng muối amoni thành dạng phân tử chấm đường băng nha má, ko có chấm điểm Định tính acid glycyrrhizic trong Cam thảo • Pha động: Chloroform – Acid acetic – Methanol C1 T1 TP1 – Nước (18 : 9,6 : 3,6 : 2,4) 2 nhóm pha chung 1 bình chuẩn saponin cao toàn phần • Mẫu chuẩn: acid glycyrrhizic trong MeOH (C1) thô • Mẫu thử saponin thô: Mẫu thử T1 • Dịch chiết dược liệu: Mẫu thử TP • Tiến hành: Chấm riêng biệt (2 vạch) các mẫu C1, T1, TP trên bản mỏng Để khô bản mỏng, quan sát dưới UV 254 và nhúng acid sulfuric 10 % trong ethanol và sấy trên bếp điện đến khi vết chuẩn C1 hiện màu để thật khô -> có thể dùng máy sấy rồi mới bỏ vào bình sắc khí chạy sắc ký xong để khô tự nhiên