In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS [r]
(1)Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG XÁC ĐỊNH
TÍNH ĐỒNG NHẤT, TÍNH KHÁC BIỆT VÀ TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA LÚA PHỤC VỤ CHO KHẢO NGHIỆM DUS
Lưu Minh Cúc, Lưu Thị Ngọc Huyền, Lê Huy Hàm
Viện Di truyền Nông nghiệp
SUMMARY
(Application of biotechnology in identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing)
This study aimed at developing procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing The collection of 261 lines/varieties, which are abundant about sources, desease resistance, tolerance to biotic and abiotic stresses, were used in screening Using the information from published data about DUS testing on rice in country around the world like China, Brazil, India , walk along 12 rice chromosomes, 557 markers were selected The use of those markers to screen with the large numbers of rice varieties were carried out A strategy of upside down conical in many steps of screening was applied At last, a reference set of DNA markers were selected This set was including 30 markers Procedures for identifying the distinctness, uniformity, stability of rice varieties to aid for DUS testing were developed These procedures are tightly suitable to current DUS testing regulations In addtion, a software namely DUS-DFP, with the DNA fingerprint data of 180 rice varieties base on 30 reference markers, was developed for applying all the results of this study in DUS testing purpose
Keywords: biotechnology, distinctness, uniformity, stability, DUS testing, rice
I ĐẶT VẤN ĐỀ*
Theo tiêu chuẩn Hiệp hội Quốc tế
Bảo vệ Giống trồng (International Union for the Protection of New Varieties of Plants), trồng chọn tạo phải trải qua khâu kiểm nghiệm theo tiêu chí DUS (bao gồm khảo nghiệm tính khác biệt - distinctness, tính đồng - uniformity tính
ổn định - stability) Trong 10 năm gần đây, năm Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm giống, sản phẩm trồng Quốc gia thường gặp phải tình trạng (5 - 10 trường hợp năm) giống
đưa khảo nghiệm có đặc điểm hình thái (thỉnh thoảng đặc điểm hóa sinh) khó phân biệt Trong số trường hợp, giống trồng tác giả khác nhập nội có tên gọi khác nhau, mặt hình thái lại giống nhau, gây tranh cãi khó giải Câu hỏi đặt thực chất chúng thuộc giống hay giống khác nhau? Các tiêu chí khảo nghiệm DUS truyền thống dựa 62
đặc điểm hình thái hóa sinh cho thấy chưa đủ
Người phản biện: TS Lã Tuấn Nghĩa
cơ sởđể phân biệt giống với Điều gây nhiều khó khăn cản trở việc xác minh quyền giống trồng Những tiến gầy công nghệ sinh học nói chung sinh học phân tử thực vật nói riêng có nhiều đóng góp tích cực không việc chọn tạo giống trồng mà giúp phân biệt đặc điểm di truyền
giống chọn tạo giống nhập nội Cho đến nay, nhiều nước giới sử dụng hệ thống khảo nghiệm DUS dựa sở
đặc điểm hình thái hóa sinh Tuy nhiên, số quốc gia bắt đầu áp dụng phương pháp ADN dùng cho khảo nghiệm DUS (Navraj và cs., 2009) Đối với công tác khảo nghiệm DUS
ở nước ta, việc xây dựng qui trình giám
(2)VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
- Tập đoàn 261 giống lúa thu thập - 40 giống lúa đểđánh giá DUS - 180 giống lúa để lập sở liệu
- 19 giống lúa điển hình Trung tâm Khảo nghiệm
- 19 giống lúa giống theo cặp khảo nghiệm DUS năm 2010- 2012
- Tổng số 557 thị phân tử dùng để
khảo sát lập thị tham chiếu
- Các vật tư hoá chất sinh học phân tử
chuyên dụng
2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB cải tiến (của Phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường Đại học Gent, Bỉ)
- Phương pháp PCR (Michael and Simon 2006)
- Điện di gel polyacrylamide biến tính khơng biến tính (PTN IRRI-Phillipine)
- Thí nghiệm đồng ruộng tiến hành theo Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính
đồng tính ổn định giống lúa 10TCN 554-2002
- Các biện pháp kỹ thuật khác tiến hành theo Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác giá trị sử dụng giống lúa 10TCN 558-2002
- Xử lý số liệu thu phân tích phần mềm POPGEN 1.31 NTSYS 2.1, Power Marker 3.0
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu thiết lập thị tham chiếu
Đề tài thu thập tập đồn 261 dịng/giống lúa để sử dụng đề tài nhằm sàng lọc tìm kiếm alen có giống lúa thịđược sử dụng nghiên cứu
Bước đầu tiên, nghiên cứu tiến hành khảo sát 261 giống lúa thu thập từ nhiều nguồn khác
đối với 100 thị gồm 81 thị SSR rải rác 12 NST có số lượng từ 3-8 alen 19 thị
thiết kế nghiên cứu vùng bảo thủ
promoter tập trung vào cis-element trình tự điều khiển để nhân tố phiên mã bám vào điều hòa biểu gene EST lúa Mở rộng phạm vi tìm kiếm, bước
được tiến hành với 152 thị InDel marker thiết kế dựa so sánh trình tự hệ gen giống lúa Indica 93-11và giống lúa Japonica
Nipponbare, xác định sựđa hình từ
các đột biến thêm/bớt (insertion/delection) hệ gen lúa Đây thị đa hình cao hoạt động tốt sàng lọc từ 756 thị
STS nằm toàn hệ gen lúa với khoảng cách 2-3 cM/chỉ thị phân bố tương đối 12 NST lúa Sản phẩm nhân đoạn ADN từ thị chứa 5% đoạn chèn-xóa khác kích thước băng nhận (trong khoảng từ 100-400bp) Những thị phân biệt tốt khác biệt giống lúa tạo lai tạo, đột biến, phân biệt giống lúa thuộc loài phụ Indica và Japonica Để thực tốt công việc sàng lọc tìm kiếm thị đề
tài, chúng tơi tìm kiếm, tiếp cận thêm thơng tin thị phân tử, chọn lọc thông tin, tiến hành thu thập lọc sở liệu, từđó đề
tài sử dụng thêm thị 12 NST, dọc theo đồ genome lúa, chọn thêm 300 thị SSR cho kết hoạt động tốt từ nghiên cứu tham khảo, sử
dụng đểđánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu khác biệt, lập đồ, đánh giá DUS nghiên cứu nước, cho băng ADN rõ ràng để sàng lọc thịđa hình cao cho
thị tham chiếu
Nghiên cứu tiến hành tổng số 557 thị SSR với 261giống để sàng lọc tìm thị
cho đa hình cao tập đoàn giống lúa phong phú Chỉ thị cho băng vạch rõ ràng có dấu hiệu cho đa hình chọn cho bước sàng lọc Kích thước alen thị cho băng vạch ADN rõ nét kích thước băng phù hợp ghi nhận lại để
(3)Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ
polyacrylamide Thứ ba, locus SSR sử
dụng để phân tích phải nằm NST khác đểđảm bảo cho tính độc lập locus Thứ tư, locus SSR nằm vùng liên quan đến hoạt động sống thể Thứ năm, thị cho kết tốt, rõ nét, thuận lợi cho sử dụng, dễ phân biệt gel polyacrylamide Bộ thị tham chiếu chọn lựa hội tụ đầy đủ đặc điểm yêu cầu
Cơ sở khoa học để tính tốn khác biệt việc xác định số lượng thị cho
thị tham chiếu: Mỗi kiểu gen (genotype) nhị
bội mang alen locus Giả sử tần suất xuất tất alen quần thể
ngẫu nhiên nhau, lúa tự
thụ phấn (mỗi cặp alen đồng hợp tử), số tổ hợp cặp alen tích số alen locut khảo sát (Riêng thụ phấn chéo dị hợp tử, số tổ hợp cặp alen lớn gấp nhiều lần so với tự thụ phấn)
Bộ thị sơ gồm locus: RM11: alen; RM21: alen; RM163: 6alen; RM 481: 12 alen; RM3412:11 alen Nếu sử dụng locus số tổ hợp cặp alen 12 11 = 23.760 tổ hợp Hay nói cách khác, sử dụng thị bao gồm locus trên, ta phân biệt 23.760 mẫu lúa, khác cặp alen
Bảng Danh sách thị thị tham chiếu TT Chỉ thị NST Số alen Kích thước alen (số bp)
A Bộ thị sơ bộ
1 RM11 120-125-132-136-140
2 RM21 11 125-128-132-137-150-156
3 RM163 130-135-140-153-160-170
4 RM481 12 124-132-139-149-154-158-172-177-182-192-210-224 RM3412 11 148-150-154-155-160-163-165-167-168-182-190 B Bộ thị tham chiếu thức: bao gồm thị thị sơ 15 thị khác (từ 6-20)
6 RM1 80-89-92-105-122-125
7 RM5 105-110-115-118-122
8 RM6 142-150-156-165
9 RM17 12 150-154-160-175-180-185
10 RM25 128-132-134-140-142-145
11 RM206 125-127-130-135-145-152-160-178
12 RM215 96-100-103-106-109
13 RM333 10 170-175-178-180-189-200 14 RM3252 162-165-167-170-174-200-205
15 RM3843 4 165-170-175-182
16 RM7097 165-167-172-176-179
17 R4M13 4 172-188-200-218
18 MADS3 192-222-238-246
19 SO1160 170-175-187-210
20 S11033 11 162-165-170-175-178-180 C Bộ thị mở rộng: 10 thị
21 RM19 12 190-202-210-225-227
22 RM223 152-154-160-165-172
23 RM341 156-160-166-166-175-192-206 24 RM3486 215-221-225-230-250-253
25 RM5758 10 96-100-103-106-109
26 RM10825 82-87-92-100
27 RM17954 150-162-167-170-175-180-184-195-200 28 RM26063 11 112-122-130-134-138-143
29 MADS8 150-175-200
(4)VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Tổng số alen thị tham chiếu thức 120 alen Nếu sử dụng 20 thị
của thị tham chiếu thức, ta phân biệt 1,32434 1015 mẫu giống khác
bởi cặp alen Nếu tính thêm thị
mở rộng ta có 172 alen, kích thước từ 80-253 bp Khi sử dụng 30 thị phân biệt 1,40169 1022 mẫu giống khác
bởi cặp alen
Số lượng alen locut thay
đổi tùy thuộc vào tập đoàn giống nghiên cứu Trong phạm vi đề tài, tìm xác
định alen bảng Các đồng nghiệp, tác giả khác sử dụng thị tự
cập nhật thêm số liệu
3.2 Thiết lập thử nghiệm qui trình
Quy trình nghiên cứu xây dựng dựa nguyên tắc phù hợp tiêu DUS với kiểm tra thị ADN sau:
- Chỉ tiêu khác biệt: Phân tích số lượng định locus thị ADN cho phép thử
nghiệm kiểu gen quan tâm có khác với kiểu gen biết trước hay không đồng thời xác
định khoảng cách di truyền chúng
- Chỉ tiêu đồng nhất: Kiểu gen đồng di truyền cần phải có phổ ADN giống locus thị ADN
- Chỉ tiêu ổn định: Hạt giống kiểu gen cụ thể thu năm khác phải có phổ ADN locus thị ADN giống hệt ổn định
Việc thử nghiệm, xây dựng quy trình khảo nghiệm DUS thị phân tử phải phù hợp với tiêu chí khảo nghiệm DUS hình thái hóa sinh hành, bao gồm đánh giá tính đồng nhất, tính khác biệt tính ổn định
Đối với quy phạm khảo nghiệm DUS hành, phương pháp chủ yếu đánh giá tính đồng
căn vào tỷ lệ khác dạng tất thí nghiệm
Căn vào báo cáo kết khảo nghiệm DUS Trung tâm Khảo Kiểm nghiệm, giống khảo nghiệm xem đồng có từ 1-3 khác dạng số 1000 thí nghiệm Như phân tích 300-500 giống thị tham chiếu, phát thấy từ 1-2 khác biệt alen có nghĩa biến động alen giống tương
đương với biến động kiểu hình
Để kiểm chứng hài hịa phân tích ADN phân tích tính trạng hình thái,
tiêu sinh hóa, q trình lập quy trình, đề tài
đã tiến hành khảo sát nhóm giống bao gồm: nhóm giống có khác dạng/1000 cây, nhóm giống có từ 2-3 khác dạng/1000 cây; nhóm giống khơng có khác dạng
Mỗi nhóm giống tiến hành phân tích khác biệt alen thị thị tham chiếu Khảo sát từ 2-5 giống nhóm, giống phân tích 480 khác để kiểm chứng sở khoa học phân tích xác suất thống kê, tìm phù hợp kiểm tra kiểu hình đánh giá kiểu gen Các giống lúa
được gieo trồng theo kỹ thuật đánh giá DUS theo thí nghiệm hàng-bơng Trung tâm Khảo nghiệm: Chọn ngẫu nhiên 50 số
100 tác giả gửi đến Mỗi cấy hàng (2 lần nhắc lại), hàng cách hàng 20cm, cách 15cm, hàng 25
Kết khảo sát 480 giống cho thấy, nhóm giống có khác dạng/1000 có sai khác alen lớn khảo sát với thị thị tham chiếu (từ 30-60 5-10 thị) Điều ghi nhận 480 giống Nếp Nhiệt đới và giống
Hương thơm số Phân tích tiêu DUS năm 2012 cho thấy hai giống có khác dạng/1000 quan sát
Bảng Danh sách giống dùng thử nghiệm ADN để lập quy trình
Nhóm Tên giống Số có sai khác alen
Basmati 370 60
HT8 10 Nhóm 1: Giống có nhiều khác
dạng/1000 đánh giá tính trạng
hình thái Hương thơm số 40
Việt thơm 10
Nhóm 2: Giống có khác dạng/1000
cây đánh giá tính trạng hình thái Nếp Nhiệt đới 15
Nếp Lang Liêu
NH92 TB2 Thảo dược Vĩnh Hịa
Nhóm 3: Giống khơng có khác dạng/1000 đánh giá tính trạng hình thái
(5)Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ
Hình Đánh giá lúa giống Nếp Nhiệt đớiđối với thị RM3412, có 10 cho alen khác biệt với khác
A Cây số 1-96; B Cây số 97-192; C Cây số 193-288; D Cây số 289-384 E Cây số 385-480
Kết phân tích 480 giống nhóm giống có từ 2-3 khác dạng/1000 cho thấy có sai khác alen 10-15
đối với 3-7 thị Nhóm giống khơng có khác dạng có từ 1-5 có sai khác alen 1-3 thị thị đem phân tích Như biến động alen
thị phân tử lớn biến động kiểu hình giống Điều giải thích sau: Các thị ADN trung tính, khơng thiết liên quan đến biểu kiểu hình, biến
động alen giống lớn biến động kiểu hình
Từ kết trên, để phù hợp với tiêu chuẩn khảo nghiệm tính đồng khảo nghiệm DUS, với độ nhậy = 0,80 đến 0,90 α = 0,05; nghiên cứu cần tối thiểu 50 đối tượng để ước tính R2 ≥ 0,23; hay tối thiểu 100 đểước tính R2 ≥ 0,12
Khi khảo sát giống trình thử
nghiệm phương pháp, từ kết 261 giống thử
nghiệm ban đầu, đến giống có từ nhiều
đến khơng có khác dạng phân tích ADN thị thị tham chiếu, kết thực nghiệm chứng tỏ mức độ
khác biệt bên giống tối đa nhóm Đối với thị chọn dùng cho
chỉ thị sơ bộ, kết luận đạt độ tin cậy mức α
= 0,05 tương ứng với quy định quy phạm khảo nghiệm
Kết luận tương tự kết luận nhà khoa học Ucraina đưa nguyên tắc để xác định tính đồng độ khác biệt bên giống lúa mì
3.3 Quy trình xác định giống lúa sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS
* Phạm vi áp dụng
Áp dụng sở có điều kiện sở
vật chất, nguồn nhân lực cho phép Nhà nước
* Đối tượng áp dụng
Quy trình áp dụng cho giống lúa nhằm hỗ trợ cho cơng tác khảo nghiệm DUS cách xác hiệu
* Các bước của quy trình
Bước 1: Xác định độđồng giống
1 Tách chiết ADN tổng số 50 cây/giống Làm phản ứng PCR với thị
chỉ thị đánh giá sơ RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412
3 Điện di sản phẩm phản ứng PCR gel polyacrylamide 4,5% 6% - 10% với ladder 25bp 50bp kèm theo
4 Ghi nhận kết
5 Phân tích kết quả: Giống đồng cá thể có đồng alen thị nghiên cứu
Bước Kiểm tra độ khác biệt bên giống
(6)VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
2 Phân tích ADN mẫu nhóm, sử dụng 15 thị lại thị
tham chiếu (RM1, RM5, RM6, RM17, RM25, RM206, RM215, RM333, RM3252, RM3843, RM7097, R4M13, MADS3, SO1160, S11033)
3 Phân tích kết quả: Tổng hợp kết khảo sát 20 thị thị tham chiếu, số nhóm tối đa Nếu nhiều nhóm xem không đồng
Bước Kiểm tra độổn định giống
1 Tách chiết ADN tổng số 30 lúa gieo từ hạt giống ba vụ liên tiếp
2 Làm phản ứng PCR với ADN 30 thị thị tham chiếu
3 Điện di sản phẩm phản ứng PCR gel polyacrylamide 4,5% 6% - 10% với ladder 25bp 50bp kèm theo
4 Ghi nhận kết
5 Phân tích kết quả: Giống ổn định: cá thể có đồng alen thị
của thị tham chiếu
Bước Kiểm tra khác biệt giống
1 Phân tích thành phần alen giống
được tiến hành với số 50 kiểm tra
ở bước 1, chọn ngẫu nhiên
2 Làm phản ứng PCR với ADN cây/giống toàn thị
chỉ thị tham chiếu thức (20 thị)
3 Điện di sản phẩm phản ứng PCR gel polyacrylamide 4,5% 6% - 10% với ladder 25bp 50bp kèm theo
4 Ghi nhận kết Phân tích kết quả:
- So sánh thành phần alen giống với giống có phần mềm DUS-DFP Nếu giống có nhận dạng ADN (DNA fingerprint) không tương đồng với giống có thư viện 95% xem giống
- Nếu giống có nhận dạng ADN tương đồng với giống có thư viện 95% cần phải so sánh hai giống với sử dụng 30 thị thị thức mở rộng (RM19, RM223, RM341, RM3486, RM5758, RM10825, RM17954, RM26063, MADS8, EST20) Giống giống có phổ
ADN khác hoàn toàn với giống lưu giữ thư viện số
thị thị tham chiếu thức số thị thị mở rộng
Bước Kết luận chung
Giống công nhận đạt tất yêu cầu bước kiểm tra nêu Kết luận cuối phải kèm với kết quảđánh giá so sánh mặt hình thái (65 tính trạng) theo quy
định Nhà nước
* Trường hợp đặc biệt:
A - Đánh giá từ giống giống tiêu DUS hình thái
1 Lấy mẫu giống cần kiểm tra theo phương pháp đánh dấu đường chéo điểm ruộng, lấy
2 Tách chiết ADN tổng số cây/mẫu giống Trộn mẫu theo tỉ lệ cân nồng độđểđược mẫu ADN
3 Làm phản ứng PCR ADN mẫu giống tất thị thị
tham chiếu thức (20 thị) mở rộng (10 thị)
4 Điện di sản phẩm phản ứng PCR gel polyacrylamide 4,5% 6% - 10% với ladder 25bp 50bp kèm theo
5 Ghi nhận kết
6 Phân tích kết quả: Nếu nhận dạng ADN giống kiểm tra khác biệt hoàn toàn
đối với 3/30 thịđã sử dụng (khác biệt alen nhiễm sắc thể) Có thể xem giống có
khác biệt hồn tồn
B - Một giống khác biệt với giống gốc 1-2 tính trạng đặc biệt
1 Đánh giá DUS giống gốc giống Phân tích hai giống 30 thị
chỉ thị thức mở rộng
3 Xác định tính trạng phân tích kiểu hình
4 Xác định tính trạng phân tích kiểu gen thơng qua thị phân tử đặc thù cho tính trạng
5 Phân tích kết quả: Giống cơng nhận có khác biệt kiểu gen lẫn kiểu hình tính trạng
3.4 Lập ngân hàng liệu cho giống lúa trồng phổ biến giống địa phương
(7)Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ xây dựng Khi phân tích ADN
giống mới, liệu ADN truy vấn nhập vào thư viện sở liệu ADN lập sẵn 180 giống lúa với tất thị
chỉ thị tham chiếu có sẵn phần mềm DUS-DFP Phương pháp thống kê đa chiều sẽđược sử
dụng phần mềm để phân tích cho ma trận
khoảng cách di truyền độ tương đồng giống
Đề tài sử dụng thị tham chiếu để
lập sở liệu 180 giống lúa Cơ sở liệu
đã ký hiệu hóa nhập vào phần mềm DUS-DFP để sử dụng
Hình Ảnh điện di gel polyacrylamide 8% 48 giống lúa với locus RM6 (L): ladder chuẩn 25bp; ảnh băng tương ứng kích thước 150bp, 175bp 200bp
Dòng cuối ký hiệu alen 1: 142bp; alen 2: 150bp; alen 3: 156p; alen 4: 160bp
Tất kết điện di 180 giống với thị thị tham chiếu thức mở rộng nhập vào phần mềm DUS-DFP 4.1
IV KẾT LUẬN 4.1 Kết luận
- Đã thu thập 261 dòng/giống lúa - Đã sử dụng 557 thị ADN để khảo sát lựa chọn thị tham chiếu bao gồm
thị sau:
1) Bộ thị đánh giá sơ (5 thị): RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412
2) Bộ thị chuẩn (20 thị): Gồm
thị trên: RM11, RM21, RM163, RM481, RM3412 15 thị khác: RM1, RM5, RM6, RM17, RM25, RM206, RM215, RM333, RM3252, RM3843, RM7097, R4M13, MADS3, SO1160, S11033
3) Bộ thị mở rộng (10 thị): RM19, RM223, RM341, RM3486, RM5758, RM10825, RM17954, RM26063, MADS8, EST20
- Đã nghiên cứu, xây dựng quy trình “Xác
định giống lúa sinh học phân tử hỗ trợ
cho khảo nghiệm DUS” phù hợp với tiêu chí tiêu chuẩn đánh giá công tác khảo nghiệm DUS hành
- Đã nghiên cứu xây dựng phần mềm DUS-DFP để lưu trữ thư viện nhận dạng ADN (DNA fingerprinting), phân tích hỗ trợ khảo nghiệm DUS
- Đã lập sở liệu 180 giống lúa thị thị tham chiếu
4.2 Đề nghị
“Quy trình xác định giống lúa sinh học phân tử hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS” với mục đích cung cấp phương tiện để phục vụ
cho công tác quản lý giống thực Đề nghịđưa quy trình vào áp dụng bước cho công tác khảo nghiệm giống lúa
Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bonow S., Von Pinho E.V.R., Vieira M.G.C., Vosman B (2009) Microsatellite markers in and around rice genes: applications in variety identification and DUS testing Crop Sci., vol 49, pp.880-886
2 Сиволап Ю.М., Волкодав В.В., Бальвинская
М.С., Кожухова Н.Е., Солоденко А.С (2004)
Идентификацияирегистрациягенотиповмягкой
пшеницы (Triticum aestivum L.), ячменя (Ноrdеum
vulgаrе L.), кукурузы (Zеа mауs L.),
подсолнечника (Неlіапthus аnnuus L.) спомощью
анализа микросателитных маркepов
Методические рекомендации - Pешения Ученых
СоветовЮжного биотехнологическогоцентра в
растениеводствеУААНиМОНУ; Селекционно
-генетического института Национального центра
семеноводчества и сортоизучения УААН;
Института экспертизы сортов растений
Госслужбы по охране прав на сорта растений
МинагрополитикиУкраины. 17 trang
3 Deniken (2005) Molecular markers and DUS testing, UPOV current situation Report of Proc of Seminar on the Use of Molecular Techniques for Plant Variety Protection, Ottawa, ON, Canada, 16-17 June 2005 Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, ON, Canada