Phân tích biểu hiện và vai trò của gen gmdreb6 trên cây thuốc lá chuyển gen

Thái Nguyên, tháng 09 năm 2021 Tác giả luận văn Trang 5 iii TÀI TRỢ Đề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo mang mã số B2021-TNA-1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THƠM

PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA GEN GmDREB6

TRÊN CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THƠM

PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA GEN GmDREB6

TRÊN CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, năm 2021

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên

cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu Mọi

trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả sử dụng

trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và

GS.TS Chu Hoàng Mậu

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Hồng và các thầy cô Bộ môn Di truyền học & Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học

Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa học

Tôi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khuyến khích, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Trần Thị Thơm

iv

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN……… i

LỜI CẢM ƠN……… ii

TÀI TRỢ……… … iii

MỤC LỤC……… iv

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT……… vi

DANH MỤC BẢNG……… vii

DANH MỤC HÌNH……… viii

MỞ ĐẦU……… ……… 1

1 Lý do chọn đề tài……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu……… 2

3 Nội dung nghiên cứu……… 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương……… 4

1.1.1 Đặc đi m của nhân tố phiên mã DREB……… 4

1.1.2 Nhân tố phiên mã GmDREB6 ở đậu tương……… 7

1.2 Protein CLC……… ……… 9

1.3 Phương pháp tạo cây trồng chuy n gen……… 12

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 14 2.1 Vật liệu h a chất và thiết bị……… 14

2.1.1 Vật liệu……… ……… 14

2.1.2 H a chất……… ……… 14

2.1.3 Thiết bị……… ……… 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… ……… 17

2.2.1 Phương pháp biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 vào mô lá thuốc lá và tạo cây thuốc lá chuy n gen……… 17

2.2.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp……… 17

v

2.2.1.2 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens……… 17

2.2.1.3 Biến nạp……… ……… 18

2.2.1.4 Tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh……… 18

2.2.2 Phân tích sự c mặt và sự bi u hiện ở mức độ phiên mã của gen chuy n GmDREB6 trên cây thuốc lá chuy n gen ……… 19

2.2.3 Phương pháp xử lý mặn nhân tạo……… 22

2.2.4 Phân tích bi u hiện của gen GmDREB6 và CLC bằng kỹ thuật real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) 22 2.3 Thời gian và địa đi m nghiên cứu……… 23

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…… 24

3.1 ết quả chuy n gen GmDREB6 vào thuốc lá thông qua A tumefaciens và tạo cây thuốc lá chuy n gen……… 24

3.1.1 Biến nạp cấu trúc mang gen chuy n GmDREB6 vào thuốc lá thông qua A tumefaciens……… ………… 24

3.1.2 Phân tích sự c mặt của gen chuy n GmDREB6 trên cây thuốc lá được biến nạp……… 27

3.2 Phân tích sự bi u hiện của gen GmDREB6 liên quan đến mức độ bi u hiện của gen CLC trên cây thuốc lá chuy n gen GmDREB6 28 3.2.1 ết quả xử lý mặn nhân tạo……… 28

3.2.2 Phân tích mức độ bi u hiện GmDREB6 và gen CLC trên cây thuốc lá chuy n gen bằng kỹ thuật real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) ……… 31

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 35

1 ết luận……… 35

2 Đề nghị……… 35

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN… TÀI LIỆU THAM KHẢO………

36

37

vi

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AP2/ERF APETALA2/Ethylene Responsive Factor

AS Acetosyringone

A.tumefacines Agrobacterium tumefacines

BAP 6-Benzyl Amino Purin

vii

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS……… 15

Bảng 2.2 Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá………… 16

Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số……… 19

Bảng 2.4 Trình tự nucleotide của cặp mồi PCR khuếch đại đoạn

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân

Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng nhân gen GmDREB6…… 21

Bảng 2.7 Trình tự nucleotide của các mồi được sử dụng trong

phân tích Real time RT-PCR (qRT-PCR) ……… 23

Bảng 3.1 ết quả biến nạp cấu trúc pBI121-GmDREB6 vào cây

Bảng 3.2 Sự phản ứng của các cây thuốc lá chuy n gen

GmDREB6 với 200 ml NaCl 200 mM hàng ngày trong vòng 4 tuần 30

Hình 1.2 Trình tự amino acid của protein GmDREB6 trên

Genbank mang mã số ABQ42205……….…… 9

Hình 1.3 Quá trình chuy n gen gián tiếp nhờ A tumefaciens…… 13

Hình 2.1 Sơ đồ vectơ pBI121_GmDREB6 được sử dụng biến nạp

vào thuốc lá qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium……… 14

Hình 3.1 Biến nạp gen GmDREB6 vào mô lá thuốc lá in vitro

thông qua A.tumefacien và tái sinh cây biến nạp……… 25

Hình 3.2 Hình ảnh điện di ki m tra sự c mặt của gen chuy n

GmDREB6 trên các cây thuốc lá chuy n gen ở thế hệ T0 và cây

Hình 3.3 ết quả điện di ki m tra sản phẩm RT-PCR trong hai

dòng cây thuốc lá chuy n gen T01 và T09……… 28

Hình 3.4 Hình thái của các cây chuy n gen và cây WT sau 4 tuần

trong điều kiện xử lý bởi NaCl 200 mM và nước……… 29

Hình 3.5 Hình ảnh các dòng thuốc lá chuy n gen GmDREB6 và

cây WT trong điều kiện xử lý NaCl trong 4 tuần.……… 31

Hình 3.6 Phân tích mức độ bi u hiện của gen GmDREB6 ở hai

dòng thuốc lá chuy n gen trong điều kiện xử lý bởi NaCl bằng

qRT-PCR… 32

Hình 3.7 Phân tích mức độ bi u hiện của gen NtCLC ở hai dòng

thuốc lá chuy n gen trong điều kiện xử lý bởi NaCl bằng

qRT-PCR… 33

Kỹ thuật di truyền là một công cụ mạnh để phát triển các loại cây trồng chịu hạn và mặn, vì nó cho phép sửa đổi biểu hiện gen để đối phó với các áp lực về hạn hán và mặn Trong bối cảnh này, việc xác định các gen liên quan đến các cơ chế nhằm đối phó với tình trạng thiếu nước và độ mặn cao là điều cần thiết cho sự phát triển của cây trồng biến đổi gen có khả năng chịu hạn và chịu mặn Trong số các gen có liên quan đến phản ứng với mặn và hạn, các gen mã hóa các nhân tố phiên mã (Transcription Factor -TF) là những ứng cử viên mong muốn cho công nghệ gen thực vật, vì các TF nhận ra các trình tự DNA cụ thể trong vùng khởi động của các gen mục tiêu và điều chỉnh sự biểu hiện của chúng Theo cách này, các TF điều chỉnh sự biểu hiện của một số gen đáp ứng với hạn hán và mặn Nhân tố phiên mã DREB (Dehydration

Responsive Element Binding) thuộc họ AP2, là nhân tố trans liên kết với trình tự cis trong vùng promoter của các gen mục tiêu, do đó kích hoạt sự biểu

hiện của chúng, đáp ứng với các stress phi sinh học Miền AP2 của protein DREB có khoảng 59 - 60 amino acid, bao gồm 11 amino acid liên kết với yếu

2

tố phản ứng mất nước (DRE) hoặc hộp GCC.DREB là nhân tố phiên mã có nhiều ứng dụng trong việc cải thiện tính kháng các yếu tố bất lợi phi sinh học của thực vật bằng kỹ thuật chuyển gen

Một số gen GmDREB (Glycine max DREB) từ cây đậu tương đã được tách dòng, phân tích biểu hiện, trong đó có gen GmDREB6 Các sản phẩm dịch mã của các gen GmDREB6 được khẳng định có chức năng chịu mặn Sự biểu hiện quá mức của gen GmDREB6 đã làm tăng mức độ phiên mã của gen P5CS, tăng sự tích lũy proline và tăng khả năng chịu muối Gen CLC ở thực

vật liên quan đến tính kháng NaCl Vấn đề đặt ra là có hay không tồn tại mối

liên hệ giữa mức độ biểu hiện gen GmDREB6 và gen CLC ở thực vật trong

điều kiện stress mặn? Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn đề

tài: “Phân tích biểu hiện và vai trò của gen GmDREB6 trên cây thuốc lá chuyển gen” nhằm mục đích làm sáng tỏ mối liên hệ giữa gen GmDREB6 với

gen CLC ở cây thuốc lá trong điều kiện stress muối

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được sự biểu hiện của gen GmDREB6 liên quan đến mức độ biểu hiện của gen CLC trên cây thuốc lá chuyển gen

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển GmDREB6 vào mô lá thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens và tạo cây chuyển gen;

(2) Phân tích mức độ phiên mã của các gen GmDREB6 và gen CLC trên cây

thuốc lá bằng kỹ thuật RT-PCR, qRT-PCR

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả phân tích biểu hiện gen GmDREB6 của đậu tương trên cây thuốc lá đã chứng minh sự biểu hiện mạnh gen GmDREB6 đã làm tăng mức

3

độ phiên mã của gen NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen Kết quả nghiên cứu này đã bổ sung vai trò của nhân tố phiên mã DREB6 của cây đậu tương

Gen GmDREB6 của đậu tương là gen ứng cử viên cho việc sử dụng

trong tạo cây chuyển gen có khả năng kháng mặn để ứng phó với biến đổi khí hậu và nước biển dâng Kết quả nghiên cứu của luận văn có ý nghĩa khoa học

và thực tiễn cao

4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương

1.1.1 Đặc điểm của nhân tố phiên mã DREB

Một thách thức lớn đối với nền nông nghiệp thế giới liên quan đến việc sản xuất thêm 70% cây lương thực để đáp ứng cho khả năng tăng thêm 2,3 tỷ người vào năm 2050 trên toàn thế giới [19] Độ mặn của đất là yếu tố bất lợi lớn làm hạn chế sự gia tăng nhu cầu về sản phẩm của cây trồng Hơn 20% diện tích đất canh tác trên toàn thế giới đang đối mặt với các stress mặn và ngày càng tăng Đa số các loại cây trồng chính loài thuộc nhóm chịu muối kém, trong khi các yếu tố bất lợi phi sinh học từ ngoại cảnh, như hạn, mặn thường xuyên tác động làm giảm khả năng sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây trồng Cây trồng phản ứng với các stress thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào như: Sản xuất protein stress, tăng cường các chất chống oxi hóa, tích lũy các chất tan [23] Các phản ứng sinh hóa khác nhau được kích hoạt trong cây trồng để tích lũy nhiều loại các chất thẩm thấu

để giúp các cây trồng đối phó với mặn, hạn Do vậy để ứng phó với biến đổi khí hậu, nước biển dâng việc tạo ra các cây trồng chịu mặn đang là yêu cầu cấp thiết, đặc biệt ở Việt Nam

Đặc điểm đặc trưng của các nhân tố phiên mã (Transcription factor: TF) là có hai vùng hoạt động: (1) Vùng hoạt hóa các protein chức năng và (2) vùng liên kết với các trật tự DNA đặc hiệu trên promoter TF là các protein có

khả năng nhận biết các trình tự cis – yếu tố điều hòa sự phiên mã đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã Yếu tố cis chứa trình tự hộp GC là

một trình tự dài 11 bp (5’- C/AACACGTGGCA - 3’) nằm ở phía trước của rất nhiều gen mã hóa cho các tiểu đơn vị nhỏ của ribulose biphosphate

5

carboxylase [16], [61] Các protein tham gia điều khiển biểu hiện gen có chức năng trong việc phản ứng với nhờ khả năng gắn với trình tự DNA như bZIP, MYB, MYC

Họ AP2 là mộtnhóm rấtlớn các nhân tổ phiên mã ở thực vật, bao gồm bốn phân họ lớn đó là: AP2, RAV, ERF và DREB [53] Phân họ protein DREB đặc trưng bởi miền bảo thủ AP2 chứa các vị trí liên kết với mạch DNA

ở vùng promoter Nhiều gen trong phân họ DREB đã được phân lập từ các loài thực vật, như cây Arabidopsis, lúa (Ọryza sativa L.), ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum aestivum) Tuy nhiên các công bố về chức năng của một số gen DREBlại chủ yếu ở cây Arabidopsis

Gen mã hóa nhân tố phiên mã chứa miền AP2 liên quan đến nhiều quá trình sinh học của thực vật bao gồm sự tăng trưởng, truyền tín hiệu, phản ứng với mầm bệnh và ứng phó với các stress phi sinh học như hạn hán, muối, Miền AP2 có khoảng 59-60 amino acid, trong đó có một số amino acid liên kết với nhân tố đáp ứng sự mất nước (DRE) hoặc hộp GCC [41], [14]

DREB (Dehydration Responsive Binding protein) là họ gen tổng hợp

protein được tìm thấy trong thực vật khi gặp điều kiện bất lợi như hạn, mặn và

lạnh Các nhà khoa học cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích

cực vào quá trình kích hoạt nhanh hoạt động của các gen tham gia chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường như hạn hán, mặn và lạnh Khi nghiên

cứu cấu trúc protein họ DREB đã cho thấy chúng có chứa vùng bảo thủ duy

nhất để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF Các miền AP2/ERF khá

bảo thủ và có khoảng 60 amino acid [12], [33] DREB đã được các nhà khoa

học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các giống cây trồng như hoa cúc [34], hướng dương [16], ngô [46], lúa [18] và đã thu được nhiều kết quả trong việc cải thiện khả năng chống

6

chịu của thực vật trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường Ngoài ra, các nhà khoa học Trung Quốc, Đức, Pháp, Mỹ đã nghiên cứu giải trình tự gen

DREB trên các đối tượng cây trồng khác nhau như Arabidopsis [36], lúa mì

[27], thuốc lá [37] và so sánh trình tự gen của các loài cây trồng với hoang dại thấy sự sai khác giữa chúng Từ đó, các nhà khoa học nghiên cứu tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao hơn nhờ phương pháp chuyển gen

Ở cây Arabidopsis, trên cơ sở số luợng và sự giống nhau của các miền

gắn vào DNA, 145 nhân tố phiên mã đuợc phân thành 5 nhóm: AP2 (14 gen),

RAV (6 gen), DREB (56 gen), ERF (còn gọi là EREBP, 65 gen) và nhóm gen

khác (4 gen) Trên cơ sở tương tự và đặc tính cấu trúc của chuỗi amino acid,

10 họ gen DREB (kí hiệu từ DREB2 đến DREB11) được phân thành 5 nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB4 và DREB5, nhóm thứ hai gồm

DREB6, DREB7 và DREB1, nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8, nhóm thứ

tư gồm có DREB9 và DREB10, nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và ERF2

[36], [42]

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu

protein DREB ở cây đậu tương và thu được những thành quả nhất định cho khoa học Liu và cộng sự (2005) đã nghiên cứu phân lập gen DREB3 từ

mRNA ở cây đậu tương với kích thước 819 bp, mã hóa cho 272 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 60 amino acid và được công bố trình tự gen trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số DQ055133 [35] Chen và cộng sự (2007)

đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước

là 927 bp [12]; Cao và cộng sự (2008), phân lập và nhận dạng GmGβ1 liên quan tới protein GmDREB5 trong đậu tương [10] Li và cộng sự đã phân lập

ba gen DREB (GmDREBa, GmDREBb và GmDREBc) từ cây đậu tương và

cho rằng mỗi phân tử protein của các gen này chứa một miền AP2 gồm 64

7

amino acid [33] Thực nghiệm đã chứng minh cả 3 protein này đều liên quan

đến sự mất nước và đáp ứng sự mất nước của tế bào Ở nấm men, GmDREBa

và GmDREBb có khả năng kích hoạt quá trình phiên mã còn GmDREBc lại không có khả năng này Các protein GmDREBa và GmDBEBb trong lá của

cây đậu tương được tổng hơp bởi tác động của muối, hạn, mặn và lạnh

1.1.2 Nhân tố phiên mã GmDREB6 ở đậu tương

Các nhân tố phiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều khiển quan trọng của những thay đổi trong biểu hiện gen và phản ứng với các stress phi sinh học từ môi trường Hiện nay, các protein DREB là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất trong điều kiện stress phi sinh học, bởi vì nó kích hoạt sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan [45] Proline là chất thẩm thấu phổ biến tăng lên khi thực vật sống trong điều kiện khô hạn và mặn Sự tích lũy của proline làm tăng áp suất thẩm thấu, do đó cải thiện khả năng chịu mặn của thực vật Zhang và cộng sự

(2013) đã nghiên cứu sự biểu hiện của OsDREB2A và chứng minh rằng sự biểu hiện của gen này làm tăng sự biểu hiện của gen DREB6 và P5CS ở cây

đậu tương [65] Năm 2019, Nguyen Huu Quan và cs đã chứng minh các sự

biểu hiện quá mức gen GmDREB6 đã làm tăng mức độ phiên mã của gen GmP5CS và tăng khả năng chịu muối của cây đậu tương [25]

ỞViệt Nam, vấn đề nghiên cứu các gen DREB ở cây trồng nói chung và

cây đậu tương nói riêng vẫn còn rất mới mẻ, chỉ có một vài công trình công

bố vềđặc điểm của các gen DREB trong, đó là các nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở cây đậu tương của Chu Hoàng Mậu (2011) [5], tách dòng và biểu hiện gen GmDREB2 trên cây thuốc

lá của Tan và cs (2015), của Pham Thi Thanh Nhan và cs (2020)

8

Trong số 18 gen GmDREBcủa đậu tương [4], một số gen đã được làm

rõ chức năng, như gen GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB6 GmDREB1 có chức năng chịu nóng, hạn và lạnh [30], GmDREB2 được xác

nhận làm tăng khả năng chịu hạn, chịu muối của cây chuyển gen [12], [14],

[47], GmDREB3đã làm tăng cường khả năng chịu lạnh, hạn và muối ở cây Arabidopsis biến đổi gen[13], GmDREB5 liên quan đến khả năng chịu muối [48] Tăng cường biểu hiện gen GmDREB6 đã làm tăng sự tích luy proline và

khả năng chịu muối của cây đậu tương biến đổi gen [25] Tuy nhiên, còn một

số thành viên trong phân họ gen DREB ở đậu tương chưa rõ chức năng về đặc

tính chống chịu cụ thể đối với các stress phi sinh học cần tiếp tục làm sáng tỏ

Trên GenBank, gen GmDREB6 được phân lập từ mRNA của đậu tương mang mã số EF551166 có kích thước 693 bp mã hóa protein DREB6 gồm 230 amino acid [40] Ở đậu tương, gen GmDREB6 có một exon và nằm trên NST

số 5 (Hình 1.1) [68]

Hình 1.1 Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu tương [68]

Protein DREB6 chứa vùng AP2 chứa 59 amino acid tứ amnio acid thứ

59 đến 117 (Hình 1.2 A) Vùng AP2 có các vị trí amino acid số thứ tự 60, 61,

63, 65, 67, 73, 75, 82, 84, 87 là những vị trí bám của protein DREB vào sợi DNA (Hình 1.2 B)

9

A

B

Hình 1.2 Trình tự amino acid của protein GmDREB6 trên Genbank mang mã

số ABQ42205 Phần màuở hình 1.2A là các amino acid thuộc vùng AP2, ở hình 1.2B là những điểm liên kết với sợi DNA

1.2 Protein CLC

Độ mặn là một stress phi sinh học ngăn cản sự tăng trưởng, phát triển

và làm giảm năng suất của cây đậu tương [11] Do biến đổi khí hậu, mực nước biển dâng cao, xâm nhập mặn ngày càng gia tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam Sự xâm thực của nước biển vào đất, sử dụng nước tưới chất lượng thấp, sử dụng nhiều phân bón hóa học và thâm canh quanh năm đã đẩy nhanh quá trình tích tụ muối, gây nhiễm mặn đất trồng [55] Các tác động bất lợi của stress muối có thể được quan sát thấy ở cấp độ

tế bào, cơ quan và toàn bộ cây trồng ở các giai đoạn thẩm thấu (sớm/ngắn hạn) và ion (muộn/dài hạn) Độ mặn cao có tác động tiêu cực đến các quá trình sinh học trong thực vật, chẳng hạn như phá vỡ cân bằng thẩm thấu và

10

ion, tổng hợp protein, quang hợp, năng lượng và chuyển hóa lipid [43] Tính chịu mặn của thực vật là khả năng chống lại stress muối liên quan đến các quá trình sinh lý phức tạp, các con đường trao đổi chất và sự biểu hiện của các gen liên quan [20]

Các cơ chế sinh lý và sinh hóa khác nhau trong tế bào đã giúp thực vật tồn tại, sinh trưởng và phát triển trong môi trường có nồng độ muối cao Các

cơ chế bao gồm (1) cân bằng nội môi và ngăn ngừa ion, (2) vận chuyển và hấp thu ion (3) sinh tổng hợp các chất bảo vệ thẩm thấu và các chất hòa tan tương thích, (4) kích hoạt enzym chống oxy hóa và tổng hợp các hợp chất chống oxy hóa, (5) tổng hợp polyamine, (6) tạo oxit nitric (NO), và (7) điều chế hormon [9] Protein vận chuyển clorua (Chloride channel-CLC) là chất vận chuyển anion quan trọng tồn tại ở vi khuẩn, nấm men, thực vật và động vật [56] Các ion Cl-

rất quan trọng đối với một số quá trình sinh học trong tế bào, như khử cực màng, điều chỉnh thể tích tế bào, khả năng chống lại stress mặn, khả năng chịu đựng với kim loại Có thể suy đoán rằng protein CLC có thể tham gia vào quá trình sự di chuyển của Cl-

qua các bào quan trong tế bào [67] Sự biểu hiện của protein CLC đã làm tăng vận chuyển Cl- từ tế bào chất vào không bào và tạo khả năng chống chịu NaCl cho tế bào [32] Ở lúa, xử lý bằng NaCl làm tăng quá trình phiên mã của gen ClC-1, điều này cho thấy gen ClC-1 đã tham gia vào quá trình vận chuyển Cl-[17], [44]

Thực vật sống trong điều kiện strees mặn biểu hiện các triệu chứng hoặc phản ứng sinh lý phổ biến do sự tích tụ mức độ độc hại của các ion (Na+

11

vỡ, làm cho tế bào thực vật chết [54], [49] Áp suất thẩm thấu liên quan đến

sự tích tụ các ion Na+

và Cl- trong dung dịch đất dẫn đến gây độc tế bào và tại

đó các ion này gây trở ngại cho các nguyên tố thiết yếu khác, chẳng hạn như canxi và kali [24]

Schubert và cộng sự đã chứng minh rằng sự giãn nở của thành tế bào đã

ức chế sự phát triển của tế bào trong giai đoạn đầu của stress do muối [51] Thành tế bào hoạt động mở rộng làm lỏng thành tế bào, điều chỉnh sự kéo dài của tế bào ở pH <5 [59].Quá trình thẩm thấu chủ yếu được đáp ứng với sự tích tụ các chất hòa tan trong điều kiện hạn và mặn để hạ thấp tiềm năng nước

mà không làm giảm hàm lượng nước thực tế [52].Đường hòa tan, proline, glycine betaine, axit hữu cơ và đường trehalose là một số chất thẩm thấu chính Kaya và cộng sự (2010) báo cáo rằng sự tích lũy proline đã tăng lên ở cây ngô bị stress mặn [29] Hơn nữa, các gen mã hóa các enzym tổng hợp proline và arginine và một số gen khác có thể có vai trò quan trọng trong khả

năng chịu mặn ở cây S chilense [28]

Con đường sinh tổng hợp proline ở thực vật có sự tham gia của hai enzyme chính: ’-pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR) và ’-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) [15].Sự biểu hiện quá mức của P5CS ở đậu tương làm tăng hàm lượng proline trong cây chuyển gen, dẫn đến một dòng chuyển gen có khả năng chịu mặn cao [25].Sự tích tụ proline là một trong những nguyên nhân chính làm tăng áp suất thẩm thấu, do đó làm tăng khả năng giữ nước của cây [64].Các gen CLC thực vật đầu tiên được nhân bản trên cây thuốc lá [38],[22] và cho đến nay, hầu hết thông tin về gen CLC và protein của nó trong hệ thống thực vật đã được thông báo [67]

Ở đậu tương, Li và cs báo cáo rằng gen GmClC tương đồng 78% với AtClC-a ở cây Arabidopsis Protein CLC được phát hiện khi cây nhận được

1.3 Phương pháp tạo cây trồng chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen ngoại lai đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng

và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật), làm cho gen ngoại lai

có thế gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuẩt hiện các đặc tính mới của

cơ thể chuyển gen [1], [7] Có hai nhóm phương pháp dùng để chuyển gen vào thực vật: đó là phương pháp chuyến trực tiếp và phương pháp chuyển gián tiếp.Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn gồm những bước chính sau: (1) Xác định thông tin về gen liên quan đến đặc tính quan tâm; (2) Phân lập gen; (3) Thiết kế vector chuyển gen; (4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5) Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thẻ biến nạp; (7) Tái sinh cây biến nạp; (8) Phân tích cây chuyển gen [39]

Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen gián

tiếp thông qua Agrobacterium.Agrobacteriumlà loài vi khuẩn đất gram (-) gây

bệnh khối u ở thực vật và có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên từ loài thực vật này sang loài thực vật khác [3] A tumefaciens chủ yếu lây nhiễm

thực vật qua các vết thương Thực vật bị thương sẽ sản sinh ra hợp chất amino acid, trong đó đường và axit vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm

nhiễm bằng cách hóa hướng động Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn A

tumefaciensthể hiện ở hình 1.3 [69]

13

Hình 1.3 Quá trình chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens [69]

Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất có bản chất phenol là acetosyringone và hydroxyacetosyringone Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng vir là

A, B, C, D, E, F, G và tạo ra các protein tương ứng

Vào năm 1980, những thí nghiệm về chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn

A tumefaciens vào cây trồng được thực hiện Đến năm 1986, các thử nghiệm

đầu tiên trồng cây biến đổi gen trên đồng ruộng ở một số quốc gia và năm

2006 được ghi nhận là năm đầu tiên của thập niên thứ hai của việc thương mại hóa cây trồng chuyển gen 2006 - 2015 Ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo cây chuyển gen thành công như Nguyễn Thị Thúy Hường và cs chuyển gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn vào cây đậu tương

[2], Lò Thanh Sơn nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXPl liên quan

đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương [6], …

14

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu hóa chất và thiết bị

Hình 2.1 Sơ đồ vectơ pBI121_GmDREB6 được sử dụng biến nạp vào thuốc

lá qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium [58] LB và RB: vùng biên trái và phải; nptII: neomycin-phospho-transferase II; CaMV35S: promoter 35S của virus khảm súp lơ; GmDREB6_cmyc: Gen DREB6 của đậu tương gắn một trình tự nucleotide mã hóa peptide cmyc Xba I và Sac I: vị trí cắt của các

enzym giới hạn

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất được sử dụng cho chuyển gen bao gồm: Bacto tripton, yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, KC1, Tris HC1, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol, marker DNA 1kb Các loại kháng

15

sinh kanamycin, cefotaxime và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose, ) Các hóa chất chuyển gen được mua ở các hãng có uy tín trên thế giới như hãng Bioneer, Fermentas, Invitrogen Hóa chất thông dụng mua tại các địa chỉ tin cậy

Môi trường MS cơ bản (Bảng 2.1) và môi trường tái sinh cây thuốc lá

(Bảng 2.2) được sử dụng trong biến nạp di truyền gen GmDREB6 vào mô lá

8 MnSO4.4H2O 22,30 18 Nicotinic Acid 0,50

9 ZnSO4.7H2O 8,60 19 Myo- inositol 100,00

(Murashige và Skoog, 1962)

Stock III

H3BO3 6,2mg/l + MnSO4.4H2O 22,3mg/l + CoCl2.6H2O 0,025mg/l + CuSO4.7H2O 0,025mg/l + ZnSO4.7H2O 8,6mg/l + Na2MoO4.2H2O 0,25mg/l + KI 0,83mg/l

Stock IV FeSO4 27,8mg/l + Na2EDTA 37,3mg/l

Stock V Myo-Inositol 100mg/l + Thiamine HCl 0,1mg/l + Pyridoxine

HCl 0,5mg/l + Nicotic acid 0,5mg/l + Glycine 2mg/l

MS 20ml stock I + 10ml/stock (II, III, IV, V)

½MS 10ml stock I + 5ml/stock (II, III, IV, V)

medium (RM) MS + IBA 0,1mg/l + sucrose 30g/l + agar 10g/l

* Ghi chú: Các môi trường đều được chuẩn pH = 5,8 và khử trùng Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25 ± 2 o C, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ngày

17

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cấy, nồi khử trùng, bể ổn nhiệt, máy nuôi lắc, máy đo pH Một số thiết bị dùng trong phân tích sinh học phân tử như: Máy PCR, máy RT-PCR, máy chụp ảnh, máy soi gel, máy ly tâm, cùng với một số trang thiết bị khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp biến nạp nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 vào mô lá thuốc lá và tạo cây thuốc lá chuyển gen

Thí nghiệm chuyển gen vào cây thuốc lá Nicotania tabacnm K326 thông qua vi khuẩn A.tumefaciens được tiến hành theo phương pháp của

Topping (1998) [57], bao gồm các bước: (i) Tạo nguyên liệu chuyển gen (ii) Tạo địch huyền phù vi khuẩn (iii) Biến nạp (iv) tái sinh (v) tạo rễ (vi) ra cây

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Các thí nghiệm của phần nuôi cấy mô cây thuốc lá được thực hiện trong phòng nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng tự động, nhiệt độ phòng 25°C ± 2°C, cường độ chiếu sáng 2000 Lux

2.2.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp

Các mảnh lá thuốc lá của cây thuốc lá in vitro ở giai đoạn 3 - 4 lá thật

được sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen chuyển Sử dụng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thương tạo thành mảnh nhỏ, có hình vuông l cm2

(cắt

bỏ đường gân giữa của lá) Lá bị tổn thương được đặt úp cảm ứng trên môi trường: MS cơ bản + BAP 1,5mg/l + AS 100µl trong 2 ngày

2.2.1.2 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens

Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 20ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc (rifamycine 0,025g/l,

Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, bỏ dịch nổi, thu sinh khối lắng rồi hoà thành dịch huyền phù tế bào trong 50ml (1/2MS + 100µl AS)

2.2.1.3 Biến nạp

Sau 48 giờ cảm ứng, các mảnh lá thuốc lá được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có nồng độ OD600pp đạt 0,6 - 0,8 có lắc nhẹ trong thời gian 20 phút Sau đó, mẫu được đặt ngửa lên môi trường đồng nuôi cấy CCM có bổ sung 200μl AS (MS + agar 10g/l + sucrose 30g/l + BAP 1,5mg/l) Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25°C trong thời gian 2 ngày

2.2.1.4 Tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm tái sinh đa chồi: Tiến hành rửa khuẩn ngoại vi bằng cách ngâm

các mảnh lá biến nạp trong ½MS + cefotaxim 400mg/ltrong 10 phút, thấm khô và chuyển lên môi trường SIM bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim 400mg/l

Thí nghiệmchọn lọc và kéo dài chồi: Sau 3 - 4 tuần, các cụm chồi hình

thành được cắt tách nhỏ và chuyển sang môi trường MS có bổ sung kanamycin 50mg/l và cefotaxim 400mg/l