Thái Nguyên, tháng 09 năm 2021 Tác giả luận văn Trang 5 iii TÀI TRỢ Đề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo mang mã số B2021-TNA-1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ THƠM PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA GEN GmDREB6 TRÊN CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2021 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ THƠM PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN VÀ VAI TRÒ CỦA GEN GmDREB6 TRÊN CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu Tác giả luận văn Trần Thị Thơm XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN GS.TS Chu Hoàng Mậu i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Hồng và các thầy cô Bộ môn Di truyền học & Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa học Tôi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khuyến khích, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn Thái Nguyên, tháng 09 năm 2021 Tác giả luận văn Trần Thị Thơm ii TÀI TRỢ Đề tài nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo mang mã số B2021-TNA-18 với tên đề tài là: “Nghiên cứu bi u hiện gen mã h a nhân tố phiên mã DREB mới định hướng ứng dụng trong cải thiện tính kháng các yếu tố bất lợi phi sinh học của cây đậu tương [Glycine max (L.) Merr.]” do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm Tác giả luận văn Trần Thị Thơm iii MỤC LỤC Trang i LỜI CAM ĐOAN………………………………………………… ii LỜI CẢM ƠN…………………………………………………… TÀI TRỢ……………………………………………………… … iii MỤC LỤC………………………………………………………… iv DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………… vi DANH MỤC BẢNG……………………………………………… vii DANH MỤC HÌNH……………………………………………… viii MỞ ĐẦU…………………………… …………………………… 1 1 Lý do chọn đề tài……………………………………………… 1 2 Mục tiêu nghiên cứu…………………………………………… 2 3 Nội dung nghiên cứu…………………………………………… 2 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn………………………………… 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………… 4 1.1 Nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương……………………… 4 1.1.1 Đặc đi m của nhân tố phiên mã DREB…………………… 4 1.1.2 Nhân tố phiên mã GmDREB6 ở đậu tương………………… 7 1.2 Protein CLC…………………………… …………………… 9 1.3 Phương pháp tạo cây trồng chuy n gen……………………… 12 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 14 2.1 Vật liệu h a chất và thiết bị…………………………………… 14 2.1.1 Vật liệu…………………………… ……………………… 14 2.1.2 H a chất…………………………… ……………………… 14 2.1.3 Thiết bị…………………………… ……………………… 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu…………………………… ……… 17 2.2.1 Phương pháp biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 vào mô lá thuốc lá và tạo cây thuốc lá chuy n gen…………………… 17 2.2.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp…………………………… 17 iv 2.2.1.2 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens…………… 17 2.2.1.3 Biến nạp…………………………… …………………… 18 2.2.1.4 Tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh…………………………… 18 2.2.2 Phân tích sự c mặt và sự bi u hiện ở mức độ phiên mã của gen chuy n GmDREB6 trên cây thuốc lá chuy n gen …………… 19 2.2.3 Phương pháp xử lý mặn nhân tạo…………………………… 22 2.2.4 Phân tích bi u hiện của gen GmDREB6 và CLC bằng kỹ thuật real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) 22 2.3 Thời gian và địa đi m nghiên cứu…………………………… 23 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…… 24 3.1 ết quả chuy n gen GmDREB6 vào thuốc lá thông qua A tumefaciens và tạo cây thuốc lá chuy n gen……………………… 24 3.1.1 Biến nạp cấu trúc mang gen chuy n GmDREB6 vào thuốc lá thông qua A tumefaciens…………………………… ………… 24 3.1.2 Phân tích sự c mặt của gen chuy n GmDREB6 trên cây thuốc lá được biến nạp…………………………………………… 27 3.2 Phân tích sự bi u hiện của gen GmDREB6 liên quan đến mức độ bi u hiện của gen CLC trên cây thuốc lá chuy n gen GmDREB6 28 3.2.1 ết quả xử lý mặn nhân tạo………………………………… 28 3.2.2 Phân tích mức độ bi u hiện GmDREB6 và gen CLC trên cây thuốc lá chuy n gen bằng kỹ thuật real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) …………………………………… 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………… 35 1 ết luận………………………………………………………… 35 2 Đề nghị………………………………………………………… 35 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN… 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 37 v DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ AP2/ERF APETALA2/Ethylene Responsive Factor AS Acetosyringone A.tumefacines Agrobacterium tumefacines BAP 6-Benzyl Amino Purin bp Base pair Cs Cộng sự CLC Chloride channel CT Công thức DNA Deoxyribonucleic Axit ĐC Đối chứng GmDREB6 Glycine max Dehydration responsive element binding protein 6 gr Gram KT Khử trùng MS Murashige - Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RM Môi trường ra rễ RT-PCR Real time-Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) TN Thí nghiệm Vir Virulence region vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS……………… 15 Bảng 2.2 Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá………… 16 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số……… 19 Bảng 2.4 Trình tự nucleotide của cặp mồi PCR khuếch đại đoạn gen GmDREB6…………………………….………………….…… 20 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB6…………………………….………………….…… 21 Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng nhân gen GmDREB6…… 21 Bảng 2.7 Trình tự nucleotide của các mồi được sử dụng trong phân tích Real time RT-PCR (qRT-PCR) ………………………… 23 Bảng 3.1 ết quả biến nạp cấu trúc pBI121-GmDREB6 vào cây thuốc lá…………………………….…………………………….… 26 Bảng 3.2 Sự phản ứng của các cây thuốc lá chuy n gen GmDREB6 với 200 ml NaCl 200 mM hàng ngày trong vòng 4 tuần 30 vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu tương 8 Hình 1.2 Trình tự amino acid của protein GmDREB6 trên Genbank mang mã số ABQ42205………………………….…… 9 Hình 1.3 Quá trình chuy n gen gián tiếp nhờ A tumefaciens…… 13 Hình 2.1 Sơ đồ vectơ pBI121_GmDREB6 được sử dụng biến nạp vào thuốc lá qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium…………… 14 Hình 3.1 Biến nạp gen GmDREB6 vào mô lá thuốc lá in vitro thông qua A.tumefacien và tái sinh cây biến nạp………………… 25 Hình 3.2 Hình ảnh điện di ki m tra sự c mặt của gen chuy n GmDREB6 trên các cây thuốc lá chuy n gen ở thế hệ T0 và cây WT………………………………………………………………… 27 Hình 3.3 ết quả điện di ki m tra sản phẩm RT-PCR trong hai dòng cây thuốc lá chuy n gen T01 và T09………………………… 28 Hình 3.4 Hình thái của các cây chuy n gen và cây WT sau 4 tuần trong điều kiện xử lý bởi NaCl 200 mM và nước………………… 29 Hình 3.5 Hình ảnh các dòng thuốc lá chuy n gen GmDREB6 và cây WT trong điều kiện xử lý NaCl trong 4 tuần.………………… 31 Hình 3.6 Phân tích mức độ bi u hiện của gen GmDREB6 ở hai dòng thuốc lá chuy n gen trong điều kiện xử lý bởi NaCl bằng qRT-PCR… 32 Hình 3.7 Phân tích mức độ bi u hiện của gen NtCLC ở hai dòng thuốc lá chuy n gen trong điều kiện xử lý bởi NaCl bằng qRT- PCR… 33 viii