Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên GiangNghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật tại tỉnh Kiên Giang
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã ngành: 9440114
HUỲNH KIM YẾN
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ THỰC VẬT
TẠI TỈNH KIÊN GIANG
Cần Thơ, 2024
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: PGS TS Nguyễn Trọng Tuân
Người hướng dẫn phụ: PGS TS Trần Thanh Mến
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại: Phòng Bảo vệ Luận án Tiến sĩ, Tầng 2, Nhà Điều hành, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc……giờ…….ngày…… tháng…… năm………
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
Tạp chí KH thuộc TC ISI-Q3-IF:2.0
1 Huynh, K Y., Tran, T M., Nguyen, T T., & Nguyen, Q C T (2023) Protective
Effect of Syzygium jambos (L.) Leaf Extract and Its Constituents Against induced Oxidative Stress Records of natural products, 17(4), 678-688
LPS-Tạp chí KH thuộc TC Scopus-Q3-IF:1.03
2 Huynh Kim Yen, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Quoc Chau Thanh, Truong Thi Tu
Tran, Tran Thanh Men, 2024 Antioxidant activity and chemical composition of
Spirolobium cambodianum Baill Vietnam Journal of Chemistry, 2024, 1-7.
Tạp chí KH nước ngoài có phản biện
3 Huynh Kim Yen, Nguyen Trong Tuan, Tran Thanh Men, 2021 Antioxidant Activity
of Ethanolic Extracts of Artemisia vulgaris, Pouzolzia zeylanica and Costus speciosus International Journal of Agriculture and Biological Sciences, ISSN
(2522-6584) July & Aug 2021, 1-7
4 Tran Thanh Men, Huynh Kim Yen, Huynh Thi Cam Lan, Nguyen Hoang Son, Đo
Tan Khang, Nguyen Trong Tuan, 2022 Phytochemical Screening and Evaluation of
Antioxidant, Antibacterial Activities of Ethanol Extract from Combretum quadrangulare Collected in Vietnam International Journal of Pharma Medicine and Biological Sciences, 11(3), 59-64.
Tạp chí KH trong nước
5 Huỳnh Kim Yến, Trần Thanh Mến, Nguyễn Trọng Tuân, Nguyễn Thành Tâm, Huỳnh
Thị Cẩm Lan, Phạm Thị Khánh Linh, Trương Thị Tú Trân, 2021 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn của cây Muồng trâu và Mai dương tại Kiên Giang
Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 226(07), 166-174
6 Huỳnh Kim Yến, Ngô Thị Cẩm Tú, Nguyễn Trọng Tuân, Trần Thanh Mến, Nguyễn
Quốc Châu Thanh, Vũ Thị Yến, Lê Bích Tuyền, Nguyễn Thị Yến Phượng, 2022
Một số hợp chất phân lập từ lá cây lý (Eugenia jambos L.) Tạp chí Công Thương,
2, 343-349
7 Huỳnh Kim Yến, Nguyễn Trọng Tuân, Nguyễn Quốc Châu Thanh và Trần Thanh
Mến, 2023 Thành phần hóa học của lá cây Lý (Syzygium jambos (L.)) họ Sim (Myrtaceae) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 59(5A), 88-92
8 Huỳnh Kim Yến, Nguyễn Trọng Tuân, Trần Thanh Mến, Nguyễn Quốc Châu Thanh,
Dương Thị Minh Thơ, Trương Thị Tú Trân, 2023 Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một số thực vật tại tỉnh Kiên
Giang Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 29(2), 33-38, 2023
Trang 4CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề
Thực vật vẫn là mối quan tâm hàng đầu trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt
là thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đang được chú ý, điều này sẽ giúp ích rất nhiều trong việc phát hiện ra các loại thuốc mới trong điều trị bệnh Ngoài ra, thực vật
là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất có hoạt tính kháng oxi hóa có tác dụng quét sạch gốc tự do ROS và RNS Có rất nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng các kỹ thuật thử nghiệm để xác định các chất kháng oxi hóa tự nhiên từ thực vật để nhằm tổng hợp và điều trị các bệnh bởi “stress oxi hóa” gây ra như các bệnh về tim mạch, đái tháo đường, alzheimer, ung thư, [1] Do đó, việc tìm kiếm, nghiên cứu và
sử dụng các hợp chất chiết xuất từ thực vật có khả năng kháng oxi hóa không gây tác dụng phụ cho sức khỏe là lựa chọn hàng đầu Các hợp chất này có thể là alkaloid, terpenoid, steroid, saponin và polyphenol, giúp cơ thể thực vật tự bảo vệ khỏi các tác nhân ô nhiễm môi trường, tia cực tím, stress, hạn hán và sự tấn công của mầm bệnh [2] Ngoài ra, chúng còn có các hoạt tính sinh học quý đối với động vật và con người như kháng oxi hóa, kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm và kích thích hệ thống miễn dịch [3]
Hiện nay, việc nâng cao năng suất kết hợp với điều kiện biến đổi khí hậu đã làm gia tăng tình hình dịch bệnh Vì thế, các nghiên cứu tìm ra các hợp chất kháng oxi hóa, kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật là giải pháp giúp tăng cường hệ miễn dịch là điều cần thiết Bên cạnh đó, thực vật với nhiều ưu điểm như rẻ, dễ chuẩn bị, hiệu quả phòng bệnh cao do dễ hấp thu, ít tác dụng phụ trong quá trình điều trị bệnh và không ảnh hưởng đến môi trường cũng như không nguy hiểm đến đối tượng sử dụng [4] Đồng thời, thực vật chứa các hợp chất chuyển hóa thứ cấp ngăn cản quá trình oxi hóa bằng cách khử các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa Các hợp chất thứ cấp này được tìm thấy trong tất cả các
bộ phận như lá, quả, hạt, rễ, thân và vỏ của các loài thực vật [5]
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng thực vật đã được tiến hành từ rất sớm, với thảm thực vật phong phú và đa dạng trên mọi miền đất nước Kiên Giang được xem như một Việt Nam thu nhỏ có địa hình rất đa dạng với nhiều hệ sinh thái khác nhau Khu dự trữ sinh quyển Kiên Giang chứa đựng sự phong phú, đặc sắc về đa dạng thành phần loài thực vật, có cả những loài đang nằm trong Sách đỏ Việt nam Chúng có giá trị
vô cùng lớn về mặt bảo tồn, nghiên cứu và chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học Một số loài thực vật có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh được nghiên cứu ở Kiên Giang
như Dây mỏ quạ [6], Bí kỳ nam [7], Bên cạnh đó, một số loài như cây Lý (Syzygium jambos), Luân thùy cambot (Spirolobium cambodianum), Chùm đuông (Sphaerocoryne affinis) cũng được sử dụng làm thuốc cho động vật và con người Những kết quả nghiên cứu về cây Lý (Syzygium jambos), Chùm đuông (Sphaerocoryne affinis) trên thế giới
phát hiện nhiều hoạt tính sinh học như kháng oxi hóa, gây độc tế bào ung thư, kháng
Trang 5khuẩn, kháng viêm,… Tuy nhiên, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài này chưa có nhiều công trình nghiên cứu tại Việt Nam Ngoài ra, Luân thùy cambot
(Spirolobium cambodianum) là loài duy nhất trong chi Spirolobium phân bố giới hạn ở
Việt Nam và Campuchia Hiện chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài này
Trên cơ sở đó, đề tài tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng oxi hóa của các loài thực vật bằng phương pháp DPPH, ABTS●+, RP và TAC Bên cạnh đó, đề tài tiếp tục phân lập (phương pháp sắc ký cột), xác định cấu trúc (dựa trên phân tích phổ NMR) và đánh giá hoạt tính chống tress oxi hóa của các hợp chất cô lập, làm cơ sở khoa học cho việc
sử dụng thực vật hoặc phát hiện ra những hoạt tính mới Qua đó, đề tài góp phần nâng cao giá trị và kiến nghị bảo tồn loài thực vật này tại Kiên Giang
Chính vì vậy luận án “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của một số thực vật tại tỉnh Kiên Giang” được thực hiện Các kết quả của luận án sẽ
góp phần giải thích về bản chất hóa học, sinh học và nâng cao giá trị sử dụng, của các loài thực vật được sử dụng làm thuốc cho động vật và con người
1.2 Mục tiêu của luận án
Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật thu hái tại tỉnh Kiên Giang nhằm góp phần tạo cơ sở định hướng cho việc nghiên cứu sâu hơn tạo ra các sản phẩm ứng dụng trong lĩnh vực hóa dược Từ đó cung cấp cơ sở khoa học định hướng cho việc khai thác sử dụng và bảo tồn nguồn tài nguyên thực vật một cách hợp lý
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Sàng lọc một số loài thực vật có hoạt tính kháng oxi hóa in vitro
Đồng thời, các loài thực vật cũng được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn (gây bệnh trên động vật thuỷ sản) và định lượng hàm lượng tổng polyphenol, flavonoid
- Nội dung 2: Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập
được từ cây Lý (S jambos) Đánh giá hoạt tính sinh học của các cao chiết phân đoạn và
một số hợp chất phân lập được với hàm lượng lớn
- Nội dung 3: Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập
được từ Luân thùy cambot (S cambodianum) Đánh giá hoạt tính sinh học của các cao
chiết phân đoạn và một số hợp chất phân lập được với hàm lượng lớn
- Nội dung 4: Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập
được từ Chùm đuông (S affinis) Đánh giá hoạt tính sinh học của các cao chiết phân
đoạn và một số hợp chất phân lập được với hàm lượng lớn
1.4 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu
1.4.1 Đối tượng nghiên cứu
Hai mươi ba loài thực vật được thu hái tại một số huyện An Biên, An Minh, Châu Thành, Gò Quao, Hòn Đất, Phú Quốc, Kiên Lương, U Minh Thượng của tỉnh Kiên Giang
Trang 61.4.2 Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu tập trung xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học của một số loài thực vật (3 loài) được chọn dựa theo hướng sàng lọc hoạt tính kháng oxi
hóa in vitro thu hái tại tỉnh Kiên Giang
1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiển của nghiên cứu
1.5.1 Ý nghĩa khoa học
Cung cấp thêm các thông tin về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây
Lý (Syzygium jambos), Luân thùy cambot (Spirolobium cambodianum) và Chùm đuông (Sphaerocoryne affinis), làm giàu thêm kho tàng hợp chất thiên nhiên của thế giới nói
chung và Việt Nam nói riêng Kết quả của nghiên cứu này là cơ sở cho việc nghiên cứu phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật khác của địa phương
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần vào việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng chữa bệnh từ các loài thực vật sẵn có ở địa phương, là một minh chứng khoa học hướng tới nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên an toàn, hiệu quả
1.6 Tính mới của luận án
Lần đầu tiên ở Việt Nam, lá cây Lý được nghiên cứu về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học Kết quả cho thấy ngoài các thành phần hóa thực vật đặc trưng cho
chi và loài, loài S jambos ở Kiên Giang cũng xuất hiện 3 hợp chất mới trong loài Đồng
thời, lần đầu tiên thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản và hoạt tính chống stress oxi hóa ở mức tế bào RAW264.7 của cao chiết Trong đó, các cao chiết và hợp chất phân lập từ cây Lý có khả năng tăng cường sự biểu hiện của gen kháng oxi hóa, thông qua việc thúc đẩy con đường truyền tín hiệu Nrf2/HO-1
Lần đầu tiên ở Việt Nam và trên thế giới thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học của Luân thùy cambot (S cambodianum) được nghiên cứu Từ lá của cây Luân thùy
cambot đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất tinh khiết, lần đầu tiên được
phân lập trong chi Spirolobium Cao chiết và các hợp chất phân lập từ Luân thùy cambot
có hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản, kháng oxi hóa in vitro và chống stress oxi hóa in vivo trên mô hình ruồi giấm
Lần đầu tiên ở Việt Nam thành phần hóa học và hoạt tính sinh học như kháng oxi
hóa in vitro, chống stress oxi hóa in vivo trên mô hình ruồi giấm của cây Chùm đuông
được nghiên cứu Đã phân lập và xác định cấu trúc của 13 hợp chất, trong đó có 11 hợp chất tinh khiết lần đầu được phân lập từ chi này
Trang 7CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số loài thực vật được sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc
Kiên Giang là nơi có nguồn thực vật rất đa dạng và phong phú, có nhiều loài thực
vật có tác dụng chữa bệnh như Trâm bầu (Comretum quadrangulare), Ngải cứu (Artemisia vulgaris), Chùm đuông (Sphaerocoryne affinis), … Đây chính là nguồn thực
vật có tác dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm của người dân Hai mươi ba loài thực vật được thu hái tại Kiên Giang gồm các bộ phận như lá, thân, vỏ, trái sử dụng trong nghiên cứu thể hiện ở Bảng 2.1
Bảng 2 1: Danh sách 23 loài thực vật được thu hái tại Kiên Giang
mẫu
Bộ phận nghiên cứu
Acorus calamus Thủy xương bồ U Minh thượng Lá
Combretum quadrangulare Trâm bầu Châu Thành Trái
Marsilea quadrifolia Rau bợ U Minh thượng Toàn cây
Pistia stratiotes Bèo cái U Minh thượng Toàn cây
Sphaerocoryne affinis Chùm đuông Phú Quốc Trái, lá
Spirolobium cambodianum Luân thùy cambot Phú Quốc Lá
Stachytarpheta jamaicensis Đuôi chuột Hòn Đất Toàn cây
Volkameria inermis Ngọc nữ biển Kiên Lương Lá
Trang 82.2 Tổng quan về chi Syzygium và loài Syzygium jambos
2.2.1 Giới thiệu về chi Syzygium
2.2.2 Tổng quan về Syzygium jambos
Syzygium jambos (còn gọi là Lý, Mận, Gioi) còn được biết với tên khác là Eugenia jambos hoặc Jambosa [133] Lá được dùng để chữa đau mắt, hạ sốt, tiêu hóa, kiết lỵ [98] Chiết xuất thực vật từ các bộ phận của S jambos đã thể hiện các hoạt tính kháng
viêm, kháng oxi hóa [135], kháng khuẩn [137], bảo vệ gan [134], và gây độc tế bào ung
thư [146] Các nghiên cứu về thành phần hóa học của S jambos đã phân lập được 47
hợp chất thuộc các nhóm chất sau: flavonoid, tannin, triterpenoid, steroid, acid hữu cơ
và các dẫn xuất khác [147‒154]
2.3 Tổng quan về chi Spirolobium và loài Spirolobium cambodianum
2.3.1 Giới thiệu về chi Spirolobium
2.3.2 Tổng quan về Spirolobium cambodianum
Spirolobium cambodianum Baill (Luân thùy cambot) là loài duy nhất của chi Spirolobium S cambodianum là một loài đặc hữu của những vùng nhiệt đới như Việt
nam, Lào, Cambodia, Thái Lan và Indonesia Theo kinh nghiệm dân gian, cây có thể
dùng để trị các bệnh như đau thắt lưng, đau đầu, sưng chân tay hoặc sốt S cambodianum
là một loài thực vật nằm trong sách đỏ Việt Nam, có những đặc tính của một loài thảo dược quý Tuy nhiên, các nghiên cứu và công bố về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của loài này trên thế giới và Việt Nam còn rất hạn chế [156]
2.4 Tổng quan về chi Sphaerocoryne và loài Sphaerocoryne affinis
2.4.1 Giới thiệu về chi Sphaerocoryne
2.4.2 Tổng quan về Sphaerocoryne affinis
Sphaerocoryne affinis (Chùm đuông) là một loài thực vật có hoa thuộc họ Na
Trong y học cổ truyền Thái Lan, hoa được sử dụng làm thuốc giảm đau tim nhẹ và hạ
sốt Ngoài ra, cao chiết từ lá và trái của S affinis có hoạt tính kháng oxi hóa và gây độc
tế bào ung thư [163‒164] Các nghiên cứu hóa thực vật về loài này đã phân lập được 61 hợp chất như terpenoid, flavonoid, heptane và các dẫn xuất khác [167‒173] Qua nghiên
cứu tài liệu cho thấy có rất ít hợp chất được phân lập từ S affinis ở Việt Nam và trên thế
giới
2.5 Ruồi giấm và sử dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu khoa học
2.6 Tổng quan về tình hình sử dụng thực vật trong thủy sản
2.7 Tổng quan về kháng oxi hóa
Trang 9CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
3.1 Phương pháp nghiên cứu
3.1.1 Mẫu thực vật, hóa chất và thiết bị
3.1.2 Phương pháp điều chế cao tổng
3.1.3 Phương pháp định tính, định lượng thành phần hóa học
- Định lượng polyphenol tổng (TPC): Hàm lượng polyphenol tổng được xác định
bằng thuốc thử Folin-Ciocalteu theo mô tả của Singleton et al (1999) và Dewanto et al
(2002) [215‒216]
- Định lượng flavonoid tổng (TFC): Hàm lượng flavonoid tổng trong cao chiết được xác định theo phương pháp so màu nhôm clorua (AlCl3) của Bag et al (2015) [217]
3.1.4 Phương pháp phân lập các hợp chất
3.1.5 Phương pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ
tử ngoại khả kiến, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều đồng thời kết hợp phân tích, so sánh với tài liệu tham khảo
3.1.6 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
3.1.6.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa in vitro
a) Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH
Khả năng kháng oxi hóa của mẫu thử được xác định theo phương pháp DPPH của Sharma & Bhat (2009)
b) Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do ABTS ●+
Hoạt tính kháng oxi hóa của mẫu thử được xác định bởi khả năng loại bỏ gốc tự do ABTS●+ theo mô tả của Nenadis et al (2004) [219]
c) Khảo sát hiệu quả kháng oxi hóa bằng phương pháp khử sắt (reducing power)
Hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết được xác định bởi năng lực khử sắt
(Reducing power – RP) thực hiện theo phương pháp Padma et al (2013) [206]
d) Xác định tổng khả năng kháng oxi hóa (total antioxidant capacity - TAC)
Hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết được thực hiện theo phương pháp Prieto et
al (1999) [220]
3.1.6.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
Phương pháp pha loãng mẫu thử (broth dilution) trên đĩa 96 giếng và chất chỉ thị màu resazurin được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu theo mô tả của Sarkar
et al (2007) [221]
3.1.6.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống stress oxi hóa
a) Mô hình đại thực bào
Trang 10* Đánh giá khả năng gây độc tế bào: Đại thực bào RAW264.7 được tiến hành
nuôi cấy trong môi trường DMEM Tế bào được nuôi trong đĩa elisa 25 cm2, được đặt trong tủ ấm với 5 % CO2 ở 37oC Mẫu thử ở các nồng độ khác nhau hoặc DMSO 1% được ủ với tế bào RAW264.7 trong đĩa 96 giếng (2 x 105 tế bào/giếng) ở 37oC trong 24 giờ Sau đó, tế bào trên tiếp tục được ủ với sự hiện diện của lipopolysaccharide (LPS)
hoặc không có LPS (1 µg/mL) trong thời gian 16 giờ [222]
* Đánh giá khả năng ức chế ROS và NO: Các tế bào được xử lý trước với nồng
độ mẫu thử thích hợp trong môi trường DMEM trong 24 giờ Sau đó, tế bào được rửa với dung dịch đệm phosphate (PBS) và kích thích với LPS 1 µg/mL ở 37oC trong thời gian 16 giờ Cuối cùng, các tế bào được ủ với 10 µM 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate trong 45 phút
* Reverse Transcription Quantitative PCR (RT-qPCR): Các tế bào RAW264.7
được nuôi cấy trên đĩa 6 giếng trong 24 giờ, sau đó được ủ với mẫu thử hoặc hợp chất được chỉ định Sau đó, các tế bào được rửa bằng PBS và được kích thích có hoặc không
có LPS trong 16 giờ nữa Tổng số RNA của từng mẫu được chiết xuất bằng thuốc thử Qiazol, sau đó được tinh chế bằng Qiagen RNeasy Kit Cuối cùng, tác dụng của mẫu thử đối với biểu hiện mRNA được xác định bằng qRT-PCR [223]
* Western Blotting: Các tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trên đĩa 6 giếng trong
24 giờ, sau đó được ủ với các nồng độ mẫu thử đã chọn trong 24 giờ trước khi kích thích LPS (1 µg/mL) trong 16 giờ Tiếp theo, mỗi mẫu được tách thành SDS-PAGE (10%, v/v) và được chuyển sang màng PDVF Màng được loại bỏ bằng dung dịch sữa tách béo 5% trong 1 giờ Sau đó, mẫu được ủ với kháng thể sơ cấp (Nrf2) qua đêm ở nhiệt độ
4oC cho đến khi sử dụng Màng được rửa bằng nước muối đệm Tris và ủ với peroxidase-conjugated trong TBST, bổ sung 3% albumin huyết thanh bò trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, sự biểu hiện của màng được thực hiện bằng phương pháp ECL Western blotting Substrate [223]
horseradish-b) Mô hình ruồi giấm
Khả năng chống stress oxi hóa của mẫu thử được kiểm tra thử nghiệm in vivo bằng
mô hình ruồi giấm theo mô tả của Etuh et al (2019) và Wongchum et al (2021) [207‒
208]
* Trong điều kiện paraquat (PQ): Khả năng chống stress oxi hóa của mẫu thử
được kiểm tra bằng phương pháp paraquat (PQ) ở nồng độ 20 mM
* Trong điều kiện H 2 O 2 : Thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên nhưng thay
paraquat (PQ) bằng H2O2 ở nồng độ 10%
3.1.7 Phương pháp xử lý số liệu
3.2 Thực nghiệm
3.2.1 Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo hướng kháng oxi hóa in vitro
3.2.2 Phân lập tinh chế các chất từ cây Lý
3.2.2.1 Điều chế cao phân đoạn cây Lý
3.2.2.2 Phân lập các hợp chất cây Lý
a) Phân lập các hợp chất từ cao EJH (n-hexane)
Trang 11Hình 3 1: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao SJH (Cao n-hexane)
b) Phân lập các hợp chất từ cao SJE (cao EtOAc)
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao SJE (Cao ethyl acetate)
Cao SJH (150 g)
SJH.I
(10,6 g)
SJH.II (30,1 g)
SJH.III (16,8 g)
SJH.IV (15,6 g)
SJH.V (12,5 g)
SJE.III (35,5 g)
SJE.IV (25,2 g)
SJE.V (24,8 g)
SJ4
(12 mg)
SJ6 (16 mg)
CC silica gel CHCl 3 :MeOH (90:10, v/v)
CC, RP-18 MeOH:H 2 O (50:50, v/v)
CC silica gel CHCl 3 :MeOH (95:5-80:20, v/v)
Trang 123.2.3 Phân lập tinh chế các chất từ cây Luân thùy cambot
3.2.3.1 Điều chế cao phân đoạn cây Luân thùy cambot
3.2.3.2 Phân lập các hợp chất cây Luân thùy cambot
a) Phân lập các hợp chất từ cao SCH (n-hexane)
Hình 3.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao SCH (Cao n-hexane)
b) Phân lập các hợp chất từ cao SCE (cao EtOAc)
Hình 3.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao SCE (Cao ethyl acetate)
Cao SCH (100,15 g)
SCH.I
(15 g)
SCH.II (14 g)
SCH.III (21 g)
SCH.IV (11 g)
SCH.V (10 g)
SCE.III (40 g)
SCE.IV (45 g)
SCE.V (35 g)
SC6 (20 mg)
SC9 (10 mg)
SC8 (14 mg)
CC silica gel
n-hexane:EtOAc
(99:1-70:30, v/v)
CC silica gel CHCl 3 :MeOH (99:1-96:4, v/v)
SC10 (11 mg)
SC5
(17 mg)
SCE.II.2 (15 g)
CC silica gel CHCl 3 :MeOH (100:0-95:5, v/v)
CC silica gel
n-hexane:EtOAc (98:2-60:40, v/v)
SCE.III.2 (12 g)
SCE.III.3 (20 g)
CC silica gel CHCl 3 :MeOH (99:1-90:10, v/v)
Trang 133.2.4 Phân lập tinh chế các chất từ cây Chùm đuông
3.2.4.1 Điều chế cao phân đoạn từ cây Chùm đuông
3.2.4.2 Phân lập các hợp chất từ cây Chùm đuông
a Phân lập các hợp chất từ trái cây Chùm đuông
Hình 3.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao SAE (Cao ethyl acetate)
b Phân lập các hợp chất từ lá cây Chùm đuông
Hình 3.6: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao SALE (Cao ethyl acetate)
CC silica gel n-hexane:EtOAc (100:0-75:25, v/v)
CC silica gel EtOAc:MeOH (80:20, v/v)
CC silica gel EtOAc:MeOH (85:15, v/v)
CC silica gel EtOAc:MeOH 100:0-0:100, v/v)
CC silica gel EtOAc:MeOH (70:30, v/v)
CC silica gel EtOAc:MeOH (100:0-0:100, v/v)