Khoa Học Tự Nhiên - Y khoa - Dược - Sư phạm hóa UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ – HÓA – SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Tên đề tài KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CUẨ VI KHUẨN BACILLUS VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE, PROTEASE Sinh viên thực hiện VÕ DUY UY MSSV: 2113012740 CHUYÊN NGÀNH: SƯ PHẠM SINH – KTNN KHÓA 2013 - 2017 Cán bộ hướng dẫn: Ths. PHAN THỊ THANH DIỄM MSCB:………………. Quảng Nam, tháng 05 năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng của bản thân còn nhờ vào sự chỉ dẫn, động viên tận tình từ quý thầy cô cũng như sự ủng hộ của gia đình và bạn bè. Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo trường đại học Quảng Nam đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể sử dụng các thiết bị ở phòng thí nghiệm và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Th.S Phan Thị Thanh Diễm đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Mặc dù đã có nhiều nỗ lực để hoàn thành đề tài nhưng do hạn chế về khả năng của bản thân và thời gian thực hiên nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của quý thầy cô giáo và ý kiến đóng góp của các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Quảng Nam, Tháng 5 năm 2017 Võ Duy Uy MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................................. 1 2. Mục đích của đề tài ......................................................................................................................... 1 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................................................... 2 3.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................................2 3.2. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................................................2 4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................................. 2 PHẦN 2: NỘI DUNG ............................................................................................................................. 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu.............................................................................................................. 3 1.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus ........................................................................................................ 3 1.1.1. Đặc điểm phân loại .................................................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................................................3 1.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên ............................................................................4 1.1.3.1. Bacillus subtilis ...................................................................................................................4 1.1.3.2. Bacillus megaterium ............................................................................................................5 1.1.3.3. Bacillus mensentericus ........................................................................................................6 1.1.3.4. Bacillus cereus ....................................................................................................................6 1.1.3.5. Bacillus pumilus ..................................................................................................................7 1.1.3.6. Bacillus polymyxa ...............................................................................................................7 1.1.3.7. Bacillus brevis .....................................................................................................................7 1.1.3.8. Bacillus simplex...................................................................................................................8 1.1.3.9. Bacillus lincheniformis ........................................................................................................8 1.1.4. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus ............................................................8 1.1.4.1. Cấu tạo bào tử .....................................................................................................................8 1.1.5.2. Khả năng tạo bào tử ............................................................................................................9 1.2. Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật .................................................................................... 9 1.3. Giới thiệu về enzyme amylase ................................................................................................... 11 1.3.1. Amylase từ vi sinh vật ..........................................................................................................11 1.3.2. Đặc tính của amylase............................................................................................................12 1.3.2.1. α-amylase ..........................................................................................................................12 1.3.2.2. β-amylase .........................................................................................................................13 1.3.2.3. Glucoamylase ....................................................................................................................13 1.3.3. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.....................................................................................14 1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật ........................14 1.3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy .................................................................................14 1.3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp amylase .........................15 1.3.5. Ứng dụng amylase sản xuất từ vi sinh vật ............................................................................15 1.4. Giới thiệu về enzyme protease ................................................................................................... 15 1.4.1. Vi sinh vật tạo protease ........................................................................................................15 1.4.2. Đặc tính của protease ...........................................................................................................16 1.4.3. Sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật ....................................................................................17 1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật .......................17 1.4.4.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường .............................................................................17 1.4.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp protease ........................................17 1.4.5. Ứng dụng protease từ vi sinh vật..........................................................................................17 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu............................................................................... 19 2.1. Vật liệu ....................................................................................................................................... 19 2.2. Hóa chất và dụng cụ ................................................................................................................... 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................................ 19 2.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân .........................................................19 2.3.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn .............................................................................19 2.3.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus ..........................................................................19 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập được ....................................................20 2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập được .....................................................21 2.3.3.1. Thử catalase trên lam kính ................................................................................................21 2.3.3.2. Thử phản ứng sinh hóa citrate ...........................................................................................21 2.3.3.3. Thử phản ứng sinh hóa nitrate ...........................................................................................22 2.3.3.4. Thử phản ứng sinh hóa maltose ........................................................................................22 2.3.4. Phương pháp cấy dòng thuần ...............................................................................................22 2.3.5. Phương pháp kiểm tra hoạt độ của enzym amylase (bằng phương pháp Wolhge muth) .....23 2.3.5.1. Nguyên tắc: .......................................................................................................................23 2.3.5.2 Nguyên liệu: .......................................................................................................................23 2.3.5.3. Tiến hành:..........................................................................................................................23 2.3.5.4. Tính kết quả:......................................................................................................................24 2.3.6. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease (bằng phương pháp Gross + Fluld) ...............................24 2.3.6.1. Nguyên tắc: .......................................................................................................................24 2.3.6.2. Nguyên liệu: ......................................................................................................................25 2.3.6.3. Tiến hành:..........................................................................................................................25 2.3.6.4. Tính kết quả.......................................................................................................................27 2.3.7. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .27 2.3.7.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .....27 2.3.7.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .............................27 2.3.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .....................28 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................................. 29 3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus phân lập được ............................................. 29 3.1.1. Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ..................................................29 3.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus .........................................................31 3.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis ...............................34 3.2. Thử hoạt tính enzyme amylase các chủng tuyển chọn ............................................................... 34 3.3. Thử hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn ............................................................................. 37 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .............. 40 3.4.1 . Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .......40 3.4.2. Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của chủng tuyển chọn ...........................41 3.4.3. Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất enzyme của các chủng tuyển chọn..........43 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 46 1. Kết luận ......................................................................................................................................... 46 2. Kiến nghị ....................................................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................................... 47 PHỤ LỤC ................................................................................................................................................... DANH SÁCH CÁC BẢNG STT TÊN CÁC BẢNG Ghi chú 1 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus 29 2 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus 31 3 Bảng 3.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa các chủng nghi ngờ là Bacillus subtilis 34 4 Bảng 3.4 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme amylase chủng tuyển chọn 35 5 Bảng 3.5 Hoạt độ enzyme amylase của chủng tuyển chọn 36 6 Bảng 3.6 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme protease của chủng tuyển chọn 38 7 Bảng 3.7 Hoạt độ enzyme protese của chủng tuyển chọn 39 8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 40 9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của chủng tuyển chọn 42 10 Bảng 3.10 Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất enzyme của các chủng tuyển chọn 44 DANH SÁCH CÁC HÌNH STT TÊN CÁC HÌNH Ghi chú 1 Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 3 2 Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis 9 3 Hình 2.1 Sơ đồ pha loãng vi khuẩn 20 4 Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng để thử hoạt tính enzyme amylase 24 5 Hình 2.3 Sơ đồ pha loãng để thử hoạt tính enzyme protease 26 6 Hình 3.1 Khuẩn lạc B1 30 7 Hình 3.2 Khuẩn lạc B2 30 8 Hình 3.3 Khuẩn lạc B3 30 9 Hình 3.4 Khuẩn lạc B4 30 10 Hình 3.5 Khuẩn lạc B5 30 11 Hình 3.6 Khuẩn lạc B6 30 12 Hình 3.7 Chủng Bacillus B1 32 13 Hình 3.8 Chủng Bacillus B2 32 14 Hình 3.9 Chủng Bacillus B3 32 15 Hình 3.10 Chủng Bacillus B4 33 16 Hình 3.11 Chủng Bacillus B5 33 17 Hình 3.12 Chủng Bacillus B6 33 18 Hình 3.13 Thử hoạt tính enzyme amylase chủng tuyển chọn 36 19 Hình 3.14 Biểu đồ hoạt độ enzyme amylase của các chủng tuyển chọn 37 20 Hình 3.15 Thử hoạt tính enzyme protease chủng tuyển chọn 38 21 Hình 3.16 Biểu đồ hoạt độ enzyme protease của các chủng tuyển chọn 39 22 Hình 3.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đên khả năng sinh enyme của vi khuẩn tuyển chọn 41 23 Hình 3.18 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enyme của vi khuẩn tuyển chọn 43 24 Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enyme của vi khuẩn tuyển chọn 45 1 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nguồn vi khuẩn trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Từ khi những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện đến nay, lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật không ngừng phát triển vượt bậc và mạnh mẽ 9. Người ta đã tìm ra nhiều ứng dụng về vi sinh vật để áp dụng vào đời sống và đạt rất nhiều thành công như: sản xuất thực phẩm cho người và thức ăn cho gia súc, phân giải các chất độc, cải thiện công nghệp thuộc da… Trong đó một trong những ứng dụng quan trọng trong thực tiễn đó là sản xuất enzyme từ vi sinh vật 9. Khi khó thu được enzyme từ các động vật, thực vật đa bào bậc cao, đặc biệt trong điều kiện hiện nay enzyme được ứng dụng rất nhiều trong thực tiễn sản xuất. Vì thế người ta sử dụng những chủng vi sinh vật vốn sản xuất enzyme có hoạt độ cao, thời gian sinh trưởng ngắn để dễ dàng thu được enzyme đồng thời tăng chất lượng của chúng, từ đó giảm giá thành sản phẩm. Ở vi sinh vật, vi khuẩn Bacillus rất phong phú và đa dạng về loài và đặc điểm sinh học. Người ta đã tìm ra nhiều chủng vi khuẩn Bacillus dễ nuôi cấy, có khả năng sinh enzyme cao. Vì vậy vi khuẩn Bacillus luôn đóng vai trò quan trọng trong thực tiễn sản xuất và được nghiên cứu ngày một rộng rãi. Do đó, tận dụng nguồn vi khuẩn Bacillus phong phú trong tự nhiên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩ n Bacillus và tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase, protease” từ đó sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học để ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất, tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 2. Mục đích của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân. 2 - Tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase và protease của vi khuẩn nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu - Vi khuẩn Bacillus - Khả năng sinh enzyme amylase, enzyme protease của vi khuẩn 3.2. Phạm vi nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân. 4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thực nghiệm: Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm trường Đại học Quảng Nam. - Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: đọc, phân tích, so sánh, tổng hợp tài liệu. - Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 3 PHẦN 2: NỘI DUNG Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Đặc điểm phân loại Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus sp. 8 Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis (https:upload.wikimedia.orgwikipediacommons bb9BacillussubtilisGram.jpg) 1.1.2. Đặc điểm sinh học Bacillus là vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường được tìm thấy trong môi trường có độ biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, sử dụng khí oxi làm chất nhận khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao. Phần lớn tế 4 bào có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu có kích thước khác nhau (0,5 - 2,5) x (1,2 – 10) μm. Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu, khi gặp điều kiện lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Vi khuẩn Bacillus có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit giúp chúng có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt 6. Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật, một số gây độc cho côn trùng. Chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào do đó được ứng dụng niều trong công nghệp, nông nghiệp và bảo vệ môi trường… 1.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 1.1.3.1. Bacillus subtilis Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 8. Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis 8. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 μm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi 8. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360 C – 500 C, tối đa 5 khoảng 60 0 C, là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6μm – 0,9μm. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà Bacillus subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) 5. Đặc biệt, Bacillus subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe 7. 1.1.3.2. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis , chiều ngang (1,2 – 1,5) μm có thể đến 2 μm, dài từ 3 – 12 μm, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) 8. Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1) μm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 μm 8. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần them bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự Bacillus subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp. 6 1.1.3.3. Bacillus mensentericus Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó có mặt chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis , mảnh dài hoặc ngắn (3- 10) x (0,5 – 0,6) μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài. Bào từ hình bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 μm, nằm ở vị trí bất kỳ trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử. Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có thể màu Crem, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger (đen), Bacillus mensentericus ruber (hồng). Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450 C tối đa 50 – 550 C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển. Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis , nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một số vi khuẩn khác ( như Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là subtilin hay Irutin A, B 8. 1.1.3.4. Bacillus cereus Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis . Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm 8. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5) μm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 – 1,5) μm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm 3. 7 1.1.3.5. Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Bacillus pumilus có mặt trong đất nhiều hơn Bacilus subtilis. Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế bào Bacillus subtilis. 1.1.3.6. Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1) x (2 – 7)μm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. 3 Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6) μm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. 8 Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. 1.1.3.7. Bacillus brevis Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc. Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)μm. Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1) μm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên 3. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin 8. 8 1.1.3.8. Bacillus simplex Khuẩn lạc giống khuẩn lạc Bacillus cereus , phẳng, khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường 3. Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6 μm, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 μm, nằm lệch tâm. 1.1.3.9. Bacillus lincheniformis Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D – glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác. Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược 8. 1.1.4. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus 1.1.4.1. Cấu tạo bào tử Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm. Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý. 9 Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis 1.1.5.2. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ). Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử. Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử. 1.2. Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật Trước thế kỷ thứ XVII, người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm. Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men. Từ thế kỷ XVII đến thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã bắt đầu tìm hiểu bản chất của các quá trình lên men. Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như 10 là hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men. Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cố gắng tìm hiểu bản chất của quá trình lên men. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Mười chín năm sau (1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz đã chứng minh chất có thể phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Danh từ Diastase là do hai nhà khoa học dùng để gọi cho enzyme amylase ở lúc bấy giờ. Tiếp đó, người ta cũng đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như Pepsin (Emberle và Shwan). Năm 1857, Convisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật. Từ 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn. Tuy nhiên ban đầu protease từ vi sinh vật không được coi trọng. Mãi đến những năm 50 của thế kỷ XX protease mới được sử dụng cực kỳ phổ biến trong các ngành công nghiệp… 6 Giai đoạn từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX, ở giai đoạn này một số lượng lớn các enzyme hòa tan đã được tách chiết. Trong thời kỳ này có hai trường thái đấu tranh với nhau đó là trường phái Pasteur và trường phái Liebig. Trường phái Pasteur cho rằng không thể tách enzyme ra khỏi tế bào, tác dụng và tính chất của enzyme gắn liền với sự sống. Trường phái Liebig chống lại trường phái Pasteur, ông cho rằng không có hoạt động của tế bào vi sinh vật cũng có thể lên men, tức là enzyme có thể tách ra khỏi hoạt động sống của tế bào, cũng là một chất hóa học tương tự như các chất xúc tác. Giai đoạn này, công trình của nhà bác học vĩ đại người đức E. Fisher đã đặt nền móng cho những khái niệm 11 hiện đại về tính đặc hiệu của enzyme về sự tương tác không gian giữa enzyme và cơ chất. Từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay, bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn sau khi kết tinh được enzyme. Công trình của hai nhà khoa học người Mỹ là Summer và Northrop đã khẳng định một cách dứt khoát bản chất hóa học của enzyme là protein. Năm 1981, Cech đã chứng minh được enzyme không nhất thiết phải là Protein bằng các xác định được một ARN có tính chất hoạt hóa như enzyme. Hiện nay, nghiên cứu enzyme phát triển rất mạnh nhờ áp dụng thành quả khoa học hiện đại như điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ đã cho phép nghiên cứu cấu trúc cũng như tác động của nhiều loại enzyme. 1.3. Giới thiệu về enzyme amylase 1.3.1. Amylase từ vi sinh vật Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các giống vi sinh vật sau: + Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus. + Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces . + Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum, Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… 2 Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác. Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370 C. 12 1.3.2. Đặc tính của amylase Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó αamylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α –1,4- glucoside của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine –6- glucanhidrolase, amilopectin -6- glucanhidrolase, oligodexin -6- glucanhidrolase hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối. Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân. 1.3.2.1. α-amylase α-amylase: α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α –1,4- glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α- amylase. 9 α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá). Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose (hoặc glucogen) (nhiều) (ít) α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng, α - amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+ , Ag+ , Hg2+ . So với α-amylase của nấm mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa. α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn 13 hồ tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc. Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25. Mức pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0). Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 500 C. Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92 0 C, trong khi đó amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 70 0 C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao. 1.3.2.2. β-amylase β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào. β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy mầm). Vi khuẩn không có β-amylase. 1.3.2.3. Glucoamylase Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α –1,4 và α –1,6-glucan trong polysaccharide. Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose. Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5 9. Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu etylic, aceton. 14 1.3.3. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân. 1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase củ a vi sinh vật 1.3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6 tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2 tinh bột. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô. Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác. 15 Ca 2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase khỏi tác động của protease. Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Coban kích thích tổng hợp amylase. Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 1. 1.3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợ p amylase Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. Mức pH m...
Trang 1UBND TỈNH QUẢNG NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA LÝ – HÓA – SINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Tên đề tài KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CUẨ VI KHUẨN BACILLUS VÀ KHẢ
NĂNG SINH ENZYME AMYLASE, PROTEASE
Sinh viên thực hiện
VÕ DUY UY
MSSV: 2113012740
CHUYÊN NGÀNH: SƯ PHẠM SINH – KTNN
KHÓA 2013 - 2017 Cán bộ hướng dẫn:
Ths PHAN THỊ THANH DIỄM
MSCB:………
Quảng Nam, tháng 05 năm 2017
Trang 2Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Th.S Phan Thị Thanh Diễm đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này
Mặc dù đã có nhiều nỗ lực để hoàn thành đề tài nhưng do hạn chế về khả năng của bản thân và thời gian thực hiên nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót Kính mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của quý thầy cô giáo và ý kiến đóng góp của các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn
Quảng Nam, Tháng 5 năm 2017
Võ Duy Uy
Trang 3MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1 Lý do chọn đề tài 1
2 Mục đích của đề tài 1
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
3.1 Đối tượng nghiên cứu 2
3.2 Phạm vi nghiên cứu 2
4 Phương pháp nghiên cứu 2
PHẦN 2: NỘI DUNG 3
Chương 1: Tổng quan tài liệu 3
1.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus 3
1.1.1 Đặc điểm phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm sinh học 3
1.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 4
1.1.3.1 Bacillus subtilis 4
1.1.3.2 Bacillus megaterium 5
1.1.3.3 Bacillus mensentericus 6
1.1.3.4 Bacillus cereus 6
1.1.3.5 Bacillus pumilus 7
1.1.3.6 Bacillus polymyxa 7
1.1.3.7 Bacillus brevis 7
1.1.3.8 Bacillus simplex 8
1.1.3.9 Bacillus lincheniformis 8
1.1.4 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus 8
1.1.4.1 Cấu tạo bào tử 8
1.1.5.2 Khả năng tạo bào tử 9
1.2 Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật 9
1.3 Giới thiệu về enzyme amylase 11
1.3.1 Amylase từ vi sinh vật 11
1.3.2 Đặc tính của amylase 12
1.3.2.1 α-amylase 12
1.3.2.2 β-amylase 13
Trang 41.3.2.3 Glucoamylase 13
1.3.3 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật 14
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật 14
1.3.4.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 14
1.3.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp amylase 15
1.3.5 Ứng dụng amylase sản xuất từ vi sinh vật 15
1.4 Giới thiệu về enzyme protease 15
1.4.1 Vi sinh vật tạo protease 15
1.4.2 Đặc tính của protease 16
1.4.3 Sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật 17
1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật 17
1.4.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường 17
1.4.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp protease 17
1.4.5 Ứng dụng protease từ vi sinh vật 17
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19
2.1 Vật liệu 19
2.2 Hóa chất và dụng cụ 19
2.3 Phương pháp nghiên cứu 19
2.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân 19
2.3.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn 19
2.3.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus 19
2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập được 20
2.3.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập được 21
2.3.3.1 Thử catalase trên lam kính 21
2.3.3.2 Thử phản ứng sinh hóa citrate 21
2.3.3.3 Thử phản ứng sinh hóa nitrate 22
2.3.3.4 Thử phản ứng sinh hóa maltose 22
2.3.4 Phương pháp cấy dòng thuần 22
2.3.5 Phương pháp kiểm tra hoạt độ của enzym amylase (bằng phương pháp Wolhge muth) 23
2.3.5.1 Nguyên tắc: 23
2.3.5.2 Nguyên liệu: 23
2.3.5.3 Tiến hành: 23
2.3.5.4 Tính kết quả: 24
2.3.6 Kiểm tra hoạt độ enzyme protease (bằng phương pháp Gross + Fluld) 24
Trang 52.3.6.2 Nguyên liệu: 25
2.3.6.3 Tiến hành: 25
2.3.6.4 Tính kết quả 27
2.3.7 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 27 2.3.7.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 27
2.3.7.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 27
2.3.7.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 28
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus phân lập được 29
3.1.1 Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis 29
3.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus 31
3.1.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 34
3.2 Thử hoạt tính enzyme amylase các chủng tuyển chọn 34
3.3 Thử hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn 37
3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 40
3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn 40
3.4.2 Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của chủng tuyển chọn 41
3.4.3 Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất enzyme của các chủng tuyển chọn 43
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
1 Kết luận 46
2 Kiến nghị 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
PHỤ LỤC
Trang 6DANH SÁCH CÁC BẢNG
1 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus 29
2 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus 31
3 Bảng 3.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa các chủng nghi ngờ là
4 Bảng 3.4 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme
5 Bảng 3.5 Hoạt độ enzyme amylase của chủng tuyển chọn 36
6 Bảng 3.6 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme
7 Bảng 3.7 Hoạt độ enzyme protese của chủng tuyển chọn 39
8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của
10 Bảng 3.10 Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất
Trang 7DANH SÁCH CÁC HÌNH
2 Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis 9
4 Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng để thử hoạt tính enzyme amylase 24
5 Hình 2.3 Sơ đồ pha loãng để thử hoạt tính enzyme protease 26
18 Hình 3.13 Thử hoạt tính enzyme amylase chủng tuyển chọn 36
19 Hình 3.14 Biểu đồ hoạt độ enzyme amylase của các chủng
20 Hình 3.15 Thử hoạt tính enzyme protease chủng tuyển chọn 38
21 Hình 3.16 Biểu đồ hoạt độ enzyme protease của các chủng
22 Hình 3.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đên khả
23 Hình 3.18 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enyme
Trang 824 Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh
Trang 9PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1 Lý do chọn đề tài
Nguồn vi khuẩn trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú Từ khi những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện đến nay, lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật không ngừng phát triển vượt bậc và mạnh mẽ [9]
Người ta đã tìm ra nhiều ứng dụng về vi sinh vật để áp dụng vào đời sống
và đạt rất nhiều thành công như: sản xuất thực phẩm cho người và thức ăn cho gia súc, phân giải các chất độc, cải thiện công nghệp thuộc da… Trong đó một trong những ứng dụng quan trọng trong thực tiễn đó là sản xuất enzyme từ vi sinh vật [9]
Khi khó thu được enzyme từ các động vật, thực vật đa bào bậc cao, đặc biệt trong điều kiện hiện nay enzyme được ứng dụng rất nhiều trong thực tiễn sản xuất Vì thế người ta sử dụng những chủng vi sinh vật vốn sản xuất enzyme có hoạt độ cao, thời gian sinh trưởng ngắn để dễ dàng thu được enzyme đồng thời tăng chất lượng của chúng, từ đó giảm giá thành sản phẩm
Ở vi sinh vật, vi khuẩn Bacillus rất phong phú và đa dạng về loài và đặc điểm sinh học Người ta đã tìm ra nhiều chủng vi khuẩn Bacillus dễ nuôi cấy, có khả năng sinh enzyme cao Vì vậy vi khuẩn Bacillus luôn đóng vai trò quan trọng
trong thực tiễn sản xuất và được nghiên cứu ngày một rộng rãi
Do đó, tận dụng nguồn vi khuẩn Bacillus phong phú trong tự nhiên, chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus và tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase, protease” từ đó sản xuất
thử nghiệm chế phẩm sinh học để ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất, tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi
2 Mục đích của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân
Trang 10- Tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase và protease của vi khuẩn nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1 Đối tượng nghiên cứu
- Vi khuẩn Bacillus
- Khả năng sinh enzyme amylase, enzyme protease của vi khuẩn
3.2 Phạm vi nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân
4 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thực nghiệm: Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm trường Đại học Quảng Nam
- Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: đọc, phân tích, so sánh, tổng hợp tài liệu
- Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
Trang 11PHẦN 2: NỘI DUNG Chương 1: Tổng quan tài liệu
1.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus
1.1.1 Đặc điểm phân loại
Bacillus là vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này
thường được tìm thấy trong môi trường có độ biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, sử dụng khí oxi làm chất nhận khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao Phần lớn tế
Trang 12bào có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu có kích thước khác nhau (0,5 - 2,5) x (1,2 – 10) µm
Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu, khi gặp điều kiện lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng
Vi khuẩn Bacillus có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit
giúp chúng có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt [6]
Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật, một số gây độc
cho côn trùng Chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào do đó được ứng dụng niều trong công nghệp, nông nghiệp và bảo vệ môi trường…
1.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên
1.1.3.1 Bacillus subtilis
Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [8]
Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong
đất và đặc biệt là ở cỏ khô
Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì Phần lớn thông tin chúng ta
có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác
đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [8]
Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 µm
Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi [8] Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt
vào môi trường thạch Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360C – 500C, tối đa
Trang 13khoảng 600C, là loại ưa nhiệt cao Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được
nhiệt khá cao
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6µm – 0,9µm Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát tán rộng rãi Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm [1]
Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những
đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton
lên bề mặt mà Bacillus subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) [5] Đặc biệt, Bacillus subtilis được sử dụng
trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe [7]
1.1.3.2 Bacillus megaterium
Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp
hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 – 1,5) µm có thể đến 2
µm, dài từ 3 – 12 µm, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [8]
Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1) µm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 µm [8] Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần them bất kỳ một yếu tố
sinh trưởng nào Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự Bacillus subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp
Trang 141.1.3.3 Bacillus mensentericus
Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó có mặt chủ yếu trên khoai tây Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis, mảnh dài hoặc
ngắn (3- 10) x (0,5 – 0,6) µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài Bào từ hình
bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 µm, nằm ở vị trí bất kỳ trong tế bào, tế bào Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử Khuẩn lạc bám chặt vào môi
trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có
thể màu Crem, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger (đen), Bacillus mensentericus ruber (hồng) Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát
triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450C tối đa 50 – 550C pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng
phát triển Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn Hai loại trực khuẩn này rất
phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả) đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzyme protease, amylase… Ngoài ra, nó còn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một
số vi khuẩn khác ( như Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là
subtilin hay Irutin A, B [8]
kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm [8]
Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5) µm, có khi dài
hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 – 1,5) µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào
Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép
lồi lõm [3]
Trang 151.1.3.5 Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Bacillus pumilus có mặt trong đất nhiều hơn Bacilus subtilis
Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới Tế bào của nó gần
giống tế bào Bacillus subtilis
1.1.3.6 Bacillus polymyxa
dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy Tế bào của Bacillus polymyxa có kích
thước (0,6 – 1) x (2 – 7)µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh [3]
Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao
Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, nằm giữa tế bào Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây Chúng còn có khả năng cố định đạm [8]
Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược
1.1.3.7 Bacillus brevis
Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm
Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc
Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)µm Chúng
thường đứng riêng rẽ Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1) µm, nằm cuối tế
bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [3] Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần
bổ sung vitamin [8]
Trang 161.1.3.8 Bacillus simplex
Khuẩn lạc giống khuẩn lạc Bacillus cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với
bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm Đặc
biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết
vào môi trường [3]
Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6 µm, thường đứng riêng
1.1.4 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus
1.1.4.1 Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ
Vỏ bào tử có nhiều lớp Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước
Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm
Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý
Trang 17Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo
bào tử trong những điều kiện nhất định
Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự
nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ)
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại
và tạo thành tiền bào tử Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử
1.2 Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật
Trước thế kỷ thứ XVII, người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men
Từ thế kỷ XVII đến thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã bắt đầu tìm hiểu bản chất của các quá trình lên men Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như
Trang 18là hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men
Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cố gắng tìm hiểu bản chất của quá trình lên men Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814 Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường Mười chín năm sau (1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz đã chứng minh chất có thể phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột Danh từ Diastase là do hai nhà khoa học dùng để gọi cho enzyme amylase ở lúc bấy giờ
Tiếp đó, người ta cũng đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như
Pepsin (Emberle và Shwan) Năm 1857, Convisart tách được tripxin từ dịch tụy,
đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm Năm 1879, Wurtz được xem
là người đầu tiên tách được protease thực vật Từ 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn Tuy nhiên ban đầu protease từ vi sinh vật không được coi trọng Mãi đến những năm 50 của thế kỷ XX protease mới được sử dụng cực kỳ phổ biến trong các ngành công nghiệp… [6]
Giai đoạn từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX, ở giai đoạn này một số lượng lớn các enzyme hòa tan đã được tách chiết Trong thời kỳ này
có hai trường thái đấu tranh với nhau đó là trường phái Pasteur và trường phái Liebig Trường phái Pasteur cho rằng không thể tách enzyme ra khỏi tế bào, tác dụng và tính chất của enzyme gắn liền với sự sống Trường phái Liebig chống lại trường phái Pasteur, ông cho rằng không có hoạt động của tế bào vi sinh vật cũng
có thể lên men, tức là enzyme có thể tách ra khỏi hoạt động sống của tế bào, cũng
là một chất hóa học tương tự như các chất xúc tác Giai đoạn này, công trình của nhà bác học vĩ đại người đức E Fisher đã đặt nền móng cho những khái niệm
Trang 19hiện đại về tính đặc hiệu của enzyme về sự tương tác không gian giữa enzyme và
cơ chất
Từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay, bản chất hóa học của enzyme chỉ được xác định đúng đắn sau khi kết tinh được enzyme Công trình của hai nhà khoa học người Mỹ là Summer và Northrop đã khẳng định một cách dứt khoát bản chất hóa học của enzyme là protein Năm 1981, Cech đã chứng minh được enzyme không nhất thiết phải là Protein bằng các xác định được một ARN
có tính chất hoạt hóa như enzyme Hiện nay, nghiên cứu enzyme phát triển rất mạnh nhờ áp dụng thành quả khoa học hiện đại như điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ đã cho phép nghiên cứu cấu trúc cũng như tác động của nhiều loại enzyme
1.3 Giới thiệu về enzyme amylase
1.3.1 Amylase từ vi sinh vật
Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men
và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn Để thu amylase người ta thường dùng các giống vi sinh vật sau:
+ Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus
+ Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces
+ Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B subtilis, B macecassavanum, Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… [2]
Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác
Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được
nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và
hiếu khí này Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370C
Trang 201.3.2 Đặc tính của amylase
Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó αamylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α –1,4- glucoside của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine –6-glucanhidrolase, amilopectin -6- glucanhidrolase, oligodexin -6- glucanhidrolase hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối
Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân
α-amylase: α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α –1,4- glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase [9]
α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột
có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá)
Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose
(hoặc glucogen) (nhiều) (ít) α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng, α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+, Ag+, Hg2+ So với α-amylase của nấm mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn
Trang 21hồ tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971) Amylase của Bacillus subtilis phân giải
tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc
Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn
α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25% Mức pH tối thích cho hoạt động của
α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0) Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là
500C
Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C, trong khi đó amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao
Trang 221.3.3 Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong
tế bào hay ngoài môi trường
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn
đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật
1.3.4.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%) Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột
Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô
Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật
Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme
Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác
Trang 23Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase khỏi tác động của protease
Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase
đặc tính của chủng vi sinh vật Mức pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis
nhằm thu α– amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8 [2]
Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase
Tác động của Oxi: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật
1.3.5 Ứng dụng amylase sản xuất từ vi sinh vật
Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, công nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi
1.4 Giới thiệu về enzyme protease
1.4.1 Vi sinh vật tạo protease
Vi sinh vật tạo enzyme protease gồm nhiều loại thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, một số giống thuộc chi Clotridium, Streptomyces và một số
loại nấm men…
Trang 24Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh enzyme protease
là: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus,…
1.4.2 Đặc tính của protease
Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid [ - CONH-] giữa các loại acid amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptide) Sản phẩm thủy phân là các acid amin, sản phẩm trung gian là các peptide có mạch dài ngắn khác nhau và peptone – sản phẩm thủy phân không hoàn toàn của protein
Protease là một nhóm enzyme phân giải protein (gồm proteinase, peptidase, desaminase…) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống Ngoài chức năng xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành acid amin và các hợp chất có phân tử lượng thấp mà các tế bào có thể dễ dàng hấp thu, protease còn có vai trò quyết định trong thiết lập, duy trì sự cân bằng giữa tổng hợp và phân giải protein Bên cạnh đó chúng còn tham gia vào quá trình hình thành và nảy mầm bào tử của
vi sinh vật, quá trình đông tụ máu, điều chỉnh huyết áp, biến hình các enzyme và điều hòa biểu hiện gen [4]
So với protease động vật và protease thực vật thì protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng
Người ta cũng phân loại protease theo vùng pH hoạt động tối thích: protease acid, trung tính và kiềm tính Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [7]
Vi khuẩn B.subtilis là một trong những nhóm vi sinh vật gây thối rữa tạo
nhiều protease ngoại bào và đây là một enzyme protease kiềm (protease serin) Enzyme này có pH tối ưu trong vùng kiềm (9 – 11) và chứa một nhóm serin quan
Trang 251.4.3 Sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật
Lượng protease sản xuất nhờ vi khuẩn được ước tính khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6]
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa môt loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi sinh vật có khả năng tổng hợp được cả hai loại trên, do đó protease của vi sinh vật có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy đến 80% các liên kết peptit trong phân tử protein [6]
1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật
1.4.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường
Thành phần của môi trường dinh dưỡng có sự ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong môi trường dinh dưỡng phải có đủ thành phần đảm bảo sự sinh trưởng của vi sinh vật và sản xuất enzyme
Môi trường phải cung cấp đủ nguồn Cacbon, nguồn nitơ, các nguyên tố khoáng, các yếu tố kích thích sinh trưởng
1.4.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp protease
Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-300C Trị số pH của môi trường (chủ yếu là môi trường lỏng) cũng có thể ảnh hưởng đến sự hình thành protease
Độ thông khí cũng rất cần thiết cho sự sinh tổng hợp enzyme, vì vậy trong môi trường dịch thể, người ta thường lắc trên máy Vortex để cung cấp đầy đủ dưỡng khí trong quá trình nuôi cấy [7]
1.4.5 Ứng dụng protease từ vi sinh vật
Trong khi cả protease từ động vật, từ thực vật được nghiên cứu và ứng dụng từ khá lâu trong các ngành công nghiệp sản xuất phomat, thuộc da, làm bánh mỳ, làm trong bia tươi, thủy phân các protein, làm mềm thịt…
Trang 26Ngày nay protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược, nông nghiệp…
Ứng dụng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường: protease đã được
sử dụng dưới dạng chế phẩm thô để xử lý các chất protein tồn đọng trong môi trường Vi sinh vật có khả năng sinh protease cũng được ứng dụng trong lĩnh vực phân hủy sinh học [6]
Trang 27Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu
Các chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân
2.2 Hóa chất và dụng cụ
- Thiết bị: Tủ sấy, tủ ấm, buồng cấy vô trùng, nồi hấp thanh trùng, máy ly
tâm, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH, bếp nấu
- Dụng cụ: Ống nghiệm, hộp lồng petri, bình tam giác, ống pipet, micropitpet, lamen, lam kính, nút bông, que cấy, que trang, đèn cồn
- Hóa chất: Cồn, NaCl, HCl, NaOH, pepton, cao thịt, nước cất, xanh methylen, I2, tím gentian, lugol, thạch agar, axit acetic, casein, dung dịch tinh bột, Sodium citrate, K2HPO4, MgSO4, Brothymol blue, Đường, Phenol red,
NH4H2PO4
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân
2.3.1.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn
Đối với đất, dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 – 3 cm, lấy lớp đất ở dưới Cân 10 g mẫu đất, cỏ ủ, phân cho vào bình tam giác có chứa
90 ml nước muối sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1
2.3.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus
Chuẩn bị 6 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ
tự từ 1 đến 6 Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất hoa màu, cỏ ủ, phân phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống 6 Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3,10-4, 10-5, 10-6,…
Dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường thạch thường (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa thạch thường này vào tủ ấm ủ ở 370C trong 24 giờ
Trang 28Sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn
lạc nghi ngờ là vi khuẩn Bacillus, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại
trên môi trường thạch thường nghiêng
Ta có sơ đồ pha loãng:
Hình 2.1: Sơ đồ pha loãng vi khuẩn
2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập được
Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống thạch nghiêng làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi
Cách nhuộm Gram như sau: Đầu tiên, làm tiêu bản mẫu cần nhuộm sau đó
cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím gentian nhuôm mẫu trong 1 phút sau đó rửa nước tối đa 5 giây Tiếp theo thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút sau đó rửa bằng rượu trong 10 giây Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút) Dung dịch này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm mất màu sau đó rửa bằng nước Có thể nhuộm tiếp với
9 ml NaCl 0,9%
9 ml NaCl 0,9%
9 ml NaCl 0,9%
9 ml NaCl 0,9%
Trang 29fuchsin kiềm Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ tía Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất Rửa qua nước, để khô
Nhận dạng Bacillus subtilis (trực khuẩn G+ hai đầu tròn, bắt màu tím,
đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định
2.3.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập được
2.3.3.1 Thử catalase trên lam kính
* Chuẩn bị: Dung dịch H2O2 30%, lam kính, giống vi khuẩn Bacillus subtilis
* Cách làm: Lấy khuẩn lạc 24 giờ tuổi đặt lên lam kính sạch Nhỏ 1 giọt
H2O2 3% phủ lên vi khuẩn và quan sát sự tạo thành bọt khí
* Đọc kết quả: Kết quả tạo thành bọt khí sủi mạnh và nhanh là catalase (+) Một số vi khuẩn không có catalase nhưng có khả năng phân hủy H2O2 tạo thành bọt khí nhỏ và chậm 30 giây, thì không phải là catalase (+) Đối với
Bacillus subtilis có catalase dương tính (+)
2.3.3.2 Thử phản ứng sinh hóa citrate
* Chuẩn bị: Môi trường Citrate, giống vi khuẩn Bacillus subtilis
* Môi trường: Simmons citrate agar
* Thuốc thử: Bromthymol blue – chất chỉ thị pH
* Cách làm: Cấy vi khuẩn vào môi trường citrate nuôi ở nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ
* Đọc kết quả:
Dương tính: Màu xanh dương đậm (kiềm), âm tính: Màu xanh lá mạ non
Đối với Bacillus subtilis có Citrate dương tính (+)
Trang 302.3.3.3 Thử phản ứng sinh hóa nitrate
* Chuẩn bị: Môi trường nitrate, dung dịch thuốc thử Giess A, GiessB,
giống vi khuẩn Bacillus subtilis
* Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vò môi trường dịch nitrate, nuôi ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Sau 24 giờ nhỏ vào môi trường 2 – 3 giọt Giess A, sau đó nhỏ tiếp 2 – 3 giọt Giess B
* Đọc kết quả: Âm tính (-) môi trường có màu vàng, dương tính (+) môi
trường có màu đỏ Đối với Bacillus subtlis có hoạt tính Nitrat dương tính (+)
* Chuẩn bị: Môi trường là đường Maltose, giống là vi khuẩn Bacillus subtilis, Ống nghiệm, ống durham
* Cách làm: Cho vào ống nghiệm đã có sắn môi trường đường một ống durham hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trường ủ ở 370C trong vòng 24 giờ Quan sát sự đổi màu sinh hơi, nếu vi khuẩn
có khả năng lên men đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men tạo thành axit làm pH môi trường giảm dẫn đến chuyển màu môi trường
* Kết quả: Âm tính (-): môi trường có màu hồng đỏ; phản ứng dương tính
(+) môi trường có màu vàng Đối với Bacillus subtilis có hoạt tính Maltose âm
tính (-)
2.3.4 Phương pháp cấy dòng thuần
Sau khi thu được khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc đơn mang đặc điểm đặc
trưng của vi khuẩn Bacillus, cấy dòng thuần trên đĩa petri, sau đó cấy giống vào
ống thạch nghiêng, đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 300 C Sau 2-3 ngày, lấy các ống giống ra và tiến hành thí nghiệm