Kỹ Thuật - Công Nghệ - Báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, luận văn thạc sĩ, nghiên cứu - Khoa học tự nhiên Lê Như Hậu Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-1492007, Nha Trang 333 PHÂN LOẠI LOÀI RONG CÂU THẮT - GRACILARIA FIRMA CHANG ET XIA (RHODOPHYTA) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA AGAR Lê Như Hậu,Trần Thị Thanh Vân Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ, Nha Trang Tóm tắt Rong câu Thắt là một loài trong họ Rong câu hiện đang khai thác tự nhiên và nuôi trồng phổ biến dùng làm nguyên liệu cho công nghiệ p chiết rút agar ở Việt Nam. Chúng phân bố không liên tục dọc ven biể n Việt Nam trong các ao đìa hoặc các bãi triều tự nhiên. Sự biến đổ i hình thái của chúng theo yếu tố môi trường là rất lớn, đường kính thân từ 1 đến 3 mm, từ màu xanh đến màu nâu. Những sự thay đổ i hình thái cùng với việc không quan sát được cơ quan sinh sản đã gây lầm lẫn trong việ c phân loại của các tác giả trước đây. Đặc biệt trong điều kiện nuôi trồ ng, hầu hết các tản rong đều ở dạng bất thụ, vì vậy việc phân loại các đố i tượng này còn gặp nhiều khó khăn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đ ã sử dụng tính chất hình thái, cấu trúc giải phẫu cơ quan sinh sản đự c, cái và cấu trúc hóa học bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 13 C-NMR) để tu chỉnh những tên loài áp dụng nhầm bởi các tác giả trước đ ây cho các quần thể rong Câu ở các địa phương dưới nhữ ng tên khác nhau, rong câu Thắt (Gracilaria blodgettii). IDENTIFICATION OF GRACILARIA FIRMA CHANG ET XIA (GRACILARIALES - RHODOPHYTA) IN VIETNAM BASED ON MORPHOLOGICAL AND AGAR STRUCTURE STUDIES Le Nhu Hau, Tran Thi Thanh Van Institute of Technological Research and Application, 02 Hung Vuong st., Nhatrang city, Vietnam Abstract Gracilaria firma is one of the most common species of the family Gracilariaceae and now it has been harvested and cultured for extracting agar-agar. This species has a discontinuous distribution along the littoral zone and lagoons Its morphology varies with the environmental condition, branches diameter from 1 to 3 mm, color from brown to green. This phenotypic variation and without noting the construction of the reproductive organs resulted in much taxonomic confusion by previous Vietnamese authors. Especially, in the farmed ponds, almost thalli were sterile. So, the taxonomy of this taxon is still difficult. In this study, we used gross morphology, structures of male and female reproductive organs and 13 C-NMR spectroscopy of agar to adjust this species for different populations under names G. blodgettii. Le Nhu Hau Tran Thi Thanh Van, 333-342 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept. 12-14, 2007, Nhatrang 334 I. MỞ ĐẦU Chi rong Câu đã được nhiều tác giả nghiên cứu trong thờ i gian qua (Dawson, 1954; Phạm Hoàng Hộ, 1969, 1985; Nguyễn Hữu Dinh, 1969, 1993). Phần lớ n các tác giả trước đây đã xác định loài qua các đặc trưng hình thái, là mộ t tính chất luôn thay đổi theo các yếu tố sinh thái. Vì vậy có nhiều tên loài đã áp dụ ng nhầm cho các mẫu vật ở Việt Nam. Nhất là những loài khi đưa vào nuôi trồ ng trong các ao đìa, thì đặc tính sinh sản hữu tính mất đi và thay vào đó bằ ng hình thức sinh sản dinh dưỡng, nghĩa là với một cành hoặc nhánh nhỏ có thể phát triển thành một cây rong mới. Vì thế với tiêu chí phân loại hiện nay, dự a vào cấu tạo giải phẫu cơ quan sinh sản đực, cái là túi tinh và tảo quả gặp nhiề u khó khăn. Hỗ trợ cho công tác định loại phải kể đến phươ ng pháp phân tích DNA (Gurgle Fredericq, 2004), phương pháp phân tích cấu trúc, thành phầ n hóa học của polysacarit (Miller 1997, 2002). Mặc dù loài G. firma đã được Ohno và cộng sự (1999) mô tả đầ u tiên cho các mẫu vật có cơ quan sinh sản thu được tại Kiên Giang, tuy nhiên những mẫ u vật thu được trong các ao nuôi tại Hải Phòng và đầm Thị Nại lại không có cơ quan sinh sản và có sự khác nhau về hình thái như kích thước đườ ng kính thân, mức độ thắt ở gốc nhánh và màu sắc nên rất khó phân loại. Để làm sáng tỏ chúng có cùng một loài hay không, chúng tôi đã phân tích các đặc điểm hình thái giải phẫ u và cấu trúc của polysacarit dạng agar tách chiết từ các loài rong kể trên thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Đây là một phương pháp hỗ trợ phân loại tương đối mới đã được các tác giả (Lahay et al., 1989; Miller 1997, 2002) ứng dụ ng trong phân loại các loài rong biển. Do mức độ methyl hóa của các agarobioza chiết từ các loài rong có chứa agar thay đổi theo loài và ít thay đổi theo điều kiệ n sinh thái (Mouradi et al., 1992), là một phương pháp ít tốn kém về thời gian và tiền bạ c so với phương pháp phân tích DNA (Miller, 2002). Chỉ cần thời gian khoả ng 3 giờ để chiết dịch agar là có thể có được kết quả từ phổ cộng hưởng từ hạ t nhân, trong khi phân tích trình tự DNA phải cần 7 ngày. II. MẪU VẬT VÀ PHƯƠ NG PHÁP 1. Mẫu vật 1.1. Mẫu vật bảo tàng Các mẫu vật dưới tên G. blodgettii: 1) Mẫu số IOH65831 (24.4.1967), IOH67019 (20.11.1967), tại Viện Tài nguyên và Môi trường biển Hả i Phòng do Nguyễn Văn Tiến thu tại Hải Phòng; 2) Mẫu số ION670032, ION670036, ION670309, ION670305 (18.11.1967), ION 690635 (24.4. 1969) tại Viện Hả i dương học do Nguyễn Hữu Dinh thu tại Quảng Ninh. Các mẫu vật dưới tên G. fisheri: Mẫu số IMS980712-714 (1.7.1998) Tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công Lê Như Hậu Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-1492007, Nha Trang 335 nghệ Nha Trang do Huỳnh Quang Năng thu tại đầm Thị Nại. Các mẫu vật dưới tên G. verrucosa: Mẫu số PH9610-11 (13.3.1983) tại Hàm Ninh do Phạm Hoàng Hộ thu. 1.2. Mẫu vật bổ sung mới Mẫu số IMS203485-492 (19.4.2003) thu tại Cát Hải, Hải Phòng; Mẫu số IMS203432-438 (22.4.2003) thu tại Quảng Ninh; Mẫu số IMS205441-445 (1.4.2005) thu tại Đầm Thị Nại, Bình Định; Mẫu số IMS 203911-914 (20.9.2003) thu tại Hàm Ninh, Phú Quốc (Hình 1). Hình 1. Các vị trí thu mẫu: Quảng Ninh (1), Hải Phòng (2), Bình Định (3), Phú Quố c (4) Le Nhu Hau Tran Thi Thanh Van, 333-342 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept. 12-14, 2007, Nhatrang 336 1.3. Mẫu vật phân tích agar Mẫu vật phơi khô sau khi thu thập, với số lượng 0,5 kg rong khô cho mỗi quầ n thể ở các địa phương (Bả ng 1). Bảng 1: Vị trí các nơi thu mẫu Các dạng hình thái Địa điểm Sinh thái Ngày thu mẫu Dạng giống G. firma Xóm Giáo, Quả ng Ninh (20 ° 26’ 55’’N, 107 ° 48’32’’E) Quần thể tự nhiên, bám trên đá, vỏ ốc. 22.4.2003 Dạng giống G. blogettii Cát Hải, Hả i Phòng (20 ° 52’05’’ N, 106 ° 45’13’’E) Quần thể đượ c nuôi trồng trên nền đ áy bùn. 19.4.2003 Dạng giống G. fisheri Đầm Thị Nại, Bình Định (13 ° 52’24’’ N, 109 ° 15’27’’E) Quần thể đượ c nuôi trồng trên nền đ áy cát bùn. 1.4.2005 Dạng giống G. verrucosa Hàm Ninh, Phú Quố c (10 ° 10’37’’N, 104 ° 04’48’’E) Quần thể tự nhiên, bám trên vỏ ốc. 20.9.2003 2. Phương pháp Phân tích mẫu vật trong phòng thí nghiệm: Lát cắt được thực hiện bằng tay vớ i dao lam, đặc biệt chú ý đến cấu tạo cơ quan sinh sản đực. Ảnh được chụp bằ ng camera kỹ thuật số OLYMPUS DP12 được gắn với kính hiển vi Leica DMLB. Ảnh minh họa được xử lý bằng phần mềm Adobe Photoshop 7.0. Phân tích agar: Agar chiết theo qui trình của Ohno và cs. (1997). Các polysacarit nhận được đem đo phổ 13 C NMR trên máy Brucker 500 ở nhiệt độ 800 C trong dung môi D 2O tại viện Hoá học-VKH CNVN. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N 1. Về hình thái Tất cả các mẫu vật dưới tên G. firma, G. blodgettii, G. verrucosa và G. fisheri cho thấy có sự thay đổi lớn về hình thái, thân có dạng từ hình trụ cho đến hơ i dẹp, đường kính từ 1 đến 3 mm, từ thắt gốc nhánh thành cuống cho đế n không thắt, từ màu xanh nhạt cho đến màu nâu đậm. Ở mặt cắt ngang thân, sự thay đổi kích thước tế bào từ vỏ vào lõi là từ từ. Tảo quả hình bán cầ u (Hình 3e) hoặc hình nón (Hình 3a), không thắt gốc hoặc hơi thắt gốc, không có mũi, 800- Lê Như Hậu Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-1492007, Nha Trang 337 900 x 600-650μm. Vỏ tảo quả dày 140-150μm, gồm 10-13 lớp tế bào hình tròn cho đến hình bầu dục ngang, sắp xếp theo chiều dọc hoặc không. Túi tinh tử hình cầu, 40-50 x 25-37μm, có sợi dinh dưỡng (Hình 3b) hoặ c không (Hình 3f). Hình 2. Hình thái ngoài của: (a) Dạng giống G. "verrucosa” từ Phú Quốc, (b) Dạ ng giống G. “firma” từ Quảng Ninh, (c) Dạng giống G. “blodgettii” từ Hả i Phòng, (d) Dạng giống G. “fisheri” từ Bình Định Hình 3. Hình thái giải phẫu tảo quả, vỏ tảo quả và túi tinh tử của những mẫu vật dưới tên G. "verrucosa” và G. “blodgettii”. a-d, G. “verrucosa” từ Phú Quố c (PH9610- 11). e-h, G. “blodgettii” từ Quảng Ninh (ION 670309, ION 670305). (a, e) Mặ t cắt ngang tảo quả. (b, f) Một phần gốc tảo quả cho thấy có sợi dinh dưỡng hoặ c không. (c, g) Mặt cắt ngang qua vỏ tảo quả. (d, h) Túi tinh tử Le Nhu Hau Tran Thi Thanh Van, 333-342 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept. 12-14, 2007, Nhatrang 338 Hình 4. Phổ 13 CNMR của các mẫu agar chiết từ các loài rong Câu (ppm: đơn vị độ dịch chuyển hóa họ c) Ký hiệ u: G: D-galactose; LA: 3,6 anhydrogalactose LA 1 '''' : nguyên tử C của monomer liên kết vớ i 2-0-Methyl LA 1: nguyên tử C ở vị trí 1 của monomer liên kết vớ i 3,6 anhydro galacose LA 2 '''' : nguyên tử C ở vị trí 2 của monomer liên kết vớ i 2-0-Methyl LA 2: nguyên tử C ở vị trí 2 của monomer liên kết với 3,6 anhydro galacose G 6 G 6 G6 '''' G 5 '''' LA 2 LA2 '''' LA 1 '''' LA ...
Lê Như Hậu & Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-14/9/2007, Nha Trang PHÂN LOẠI LOÀI RONG CÂU THẮT - GRACILARIA FIRMA CHANG ET XIA (RHODOPHYTA) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA AGAR Lê Như Hậu,Trần Thị Thanh Vân Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ, Nha Trang Tóm tắt Rong câu Thắt là một loài trong họ Rong câu hiện đang khai thác tự nhiên và nuôi trồng phổ biến dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp chiết rút agar ở Việt Nam Chúng phân bố không liên tục dọc ven biển Việt Nam trong các ao đìa hoặc các bãi triều tự nhiên Sự biến đổi hình thái của chúng theo yếu tố môi trường là rất lớn, đường kính thân từ 1 đến 3 mm, từ màu xanh đến màu nâu Những sự thay đổi hình thái cùng với việc không quan sát được cơ quan sinh sản đã gây lầm lẫn trong việc phân loại của các tác giả trước đây Đặc biệt trong điều kiện nuôi trồng, hầu hết các tản rong đều ở dạng bất thụ, vì vậy việc phân loại các đối tượng này còn gặp nhiều khó khăn Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tính chất hình thái, cấu trúc giải phẫu cơ quan sinh sản đực, cái và cấu trúc hóa học bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13C-NMR) để tu chỉnh những tên loài áp dụng nhầm bởi các tác giả trước đây cho các quần thể rong Câu ở các địa phương dưới những tên khác nhau, rong câu Thắt (Gracilaria blodgettii) IDENTIFICATION OF GRACILARIA FIRMA CHANG ET XIA (GRACILARIALES - RHODOPHYTA) IN VIETNAM BASED ON MORPHOLOGICAL AND AGAR STRUCTURE STUDIES Le Nhu Hau, Tran Thi Thanh Van Institute of Technological Research and Application, 02 Hung Vuong st., Nhatrang city, Vietnam Abstract Gracilaria firma is one of the most common species of the family Gracilariaceae and now it has been harvested and cultured for extracting agar-agar This species has a discontinuous distribution along the littoral zone and lagoons Its morphology varies with the environmental condition, branches diameter from 1 to 3 mm, color from brown to green This phenotypic variation and without noting the construction of the reproductive organs resulted in much taxonomic confusion by previous Vietnamese authors Especially, in the farmed ponds, almost thalli were sterile So, the taxonomy of this taxon is still difficult In this study, we used gross morphology, structures of male and female reproductive organs and 13C-NMR spectroscopy of agar to adjust this species for different populations under names G blodgettii 333 Le Nhu Hau & Tran Thi Thanh Van, 333-342 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept 12-14, 2007, Nhatrang I MỞ ĐẦU Chi rong Câu đã được nhiều tác giả nghiên cứu trong thời gian qua (Dawson, 1954; Phạm Hoàng Hộ, 1969, 1985; Nguyễn Hữu Dinh, 1969, 1993) Phần lớn các tác giả trước đây đã xác định loài qua các đặc trưng hình thái, là một tính chất luôn thay đổi theo các yếu tố sinh thái Vì vậy có nhiều tên loài đã áp dụng nhầm cho các mẫu vật ở Việt Nam Nhất là những loài khi đưa vào nuôi trồng trong các ao đìa, thì đặc tính sinh sản hữu tính mất đi và thay vào đó bằng hình thức sinh sản dinh dưỡng, nghĩa là với một cành hoặc nhánh nhỏ có thể phát triển thành một cây rong mới Vì thế với tiêu chí phân loại hiện nay, dựa vào cấu tạo giải phẫu cơ quan sinh sản đực, cái là túi tinh và tảo quả gặp nhiều khó khăn Hỗ trợ cho công tác định loại phải kể đến phương pháp phân tích DNA (Gurgle & Fredericq, 2004), phương pháp phân tích cấu trúc, thành phần hóa học của polysacarit (Miller 1997, 2002) Mặc dù loài G firma đã được Ohno và cộng sự (1999) mô tả đầu tiên cho các mẫu vật có cơ quan sinh sản thu được tại Kiên Giang, tuy nhiên những mẫu vật thu được trong các ao nuôi tại Hải Phòng và đầm Thị Nại lại không có cơ quan sinh sản và có sự khác nhau về hình thái như kích thước đường kính thân, mức độ thắt ở gốc nhánh và màu sắc nên rất khó phân loại Để làm sáng tỏ chúng có cùng một loài hay không, chúng tôi đã phân tích các đặc điểm hình thái giải phẫu và cấu trúc của polysacarit dạng agar tách chiết từ các loài rong kể trên thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân Đây là một phương pháp hỗ trợ phân loại tương đối mới đã được các tác giả (Lahay et al., 1989; Miller 1997, 2002) ứng dụng trong phân loại các loài rong biển Do mức độ methyl hóa của các agarobioza chiết từ các loài rong có chứa agar thay đổi theo loài và ít thay đổi theo điều kiện sinh thái (Mouradi et al., 1992), là một phương pháp ít tốn kém về thời gian và tiền bạc so với phương pháp phân tích DNA (Miller, 2002) Chỉ cần thời gian khoảng 3 giờ để chiết dịch agar là có thể có được kết quả từ phổ cộng hưởng từ hạt nhân, trong khi phân tích trình tự DNA phải cần 7 ngày II MẪU VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 Mẫu vật 1.1 Mẫu vật bảo tàng Các mẫu vật dưới tên G blodgettii: 1) Mẫu số IOH65831 (24.4.1967), IOH67019 (20.11.1967), tại Viện Tài nguyên và Môi trường biển Hải Phòng do Nguyễn Văn Tiến thu tại Hải Phòng; 2) Mẫu số ION670032, ION670036, ION670309, ION670305 (18.11.1967), ION 690635 (24.4 1969) tại Viện Hải dương học do Nguyễn Hữu Dinh thu tại Quảng Ninh Các mẫu vật dưới tên G fisheri: Mẫu số IMS980712-714 (1.7.1998) Tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công 334 Lê Như Hậu & Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-14/9/2007, Nha Trang nghệ Nha Trang do Huỳnh Quang Năng thu tại đầm Thị Nại Các mẫu vật dưới tên G verrucosa: Mẫu số PH9610-11 (13.3.1983) tại Hàm Ninh do Phạm Hoàng Hộ thu 1.2 Mẫu vật bổ sung mới Mẫu số IMS203485-492 (19.4.2003) thu tại Cát Hải, Hải Phòng; Mẫu số IMS203432-438 (22.4.2003) thu tại Quảng Ninh; Mẫu số IMS205441-445 (1.4.2005) thu tại Đầm Thị Nại, Bình Định; Mẫu số IMS 203911-914 (20.9.2003) thu tại Hàm Ninh, Phú Quốc (Hình 1) Hình 1 Các vị trí thu mẫu: Quảng Ninh (1), Hải Phòng (2), Bình Định (3), Phú Quốc (4) 335 Le Nhu Hau & Tran Thi Thanh Van, 333-342 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept 12-14, 2007, Nhatrang 1.3 Mẫu vật phân tích agar Mẫu vật phơi khô sau khi thu thập, với số lượng 0,5 kg rong khô cho mỗi quần thể ở các địa phương (Bảng 1) Bảng 1: Vị trí các nơi thu mẫu Các dạng hình thái Địa điểm Sinh thái Ngày thu mẫu 22.4.2003 Dạng giống Xóm Giáo, Quảng Quần thể tự nhiên, 19.4.2003 G firma Ninh (20°26’ 55’’N, bám trên đá, vỏ ốc 1.4.2005 107°48’32’’E) 20.9.2003 Dạng giống Cát Hải, Hải Phòng Quần thể được nuôi G blogettii (20°52’05’’ N, trồng trên nền đáy 106°45’13’’E) bùn Dạng giống Đầm Thị Nại, Bình G fisheri Định (13°52’24’’ N, Quần thể được nuôi 109°15’27’’E) trồng trên nền đáy Dạng giống Hàm Ninh, Phú Quốc cát bùn G verrucosa (10°10’37’’N, 104°04’48’’E) Quần thể tự nhiên, bám trên vỏ ốc 2 Phương pháp Phân tích mẫu vật trong phòng thí nghiệm: Lát cắt được thực hiện bằng tay với dao lam, đặc biệt chú ý đến cấu tạo cơ quan sinh sản đực Ảnh được chụp bằng camera kỹ thuật số OLYMPUS DP12 được gắn với kính hiển vi Leica DMLB Ảnh minh họa được xử lý bằng phần mềm Adobe Photoshop 7.0 Phân tích agar: Agar chiết theo qui trình của Ohno và cs (1997) Các polysacarit nhận được đem đo phổ 13C NMR trên máy Brucker 500 ở nhiệt độ 800C trong dung môi D2O tại viện Hoá học-VKH & CNVN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 Về hình thái Tất cả các mẫu vật dưới tên G firma, G blodgettii, G verrucosa và G fisheri cho thấy có sự thay đổi lớn về hình thái, thân có dạng từ hình trụ cho đến hơi dẹp, đường kính từ 1 đến 3 mm, từ thắt gốc nhánh thành cuống cho đến không thắt, từ màu xanh nhạt cho đến màu nâu đậm Ở mặt cắt ngang thân, sự thay đổi kích thước tế bào từ vỏ vào lõi là từ từ Tảo quả hình bán cầu (Hình 3e) hoặc hình nón (Hình 3a), không thắt gốc hoặc hơi thắt gốc, không có mũi, 800- 336 Lê Như Hậu & Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-14/9/2007, Nha Trang 900 x 600-650µm Vỏ tảo quả dày 140-150µm, gồm 10-13 lớp tế bào hình tròn cho đến hình bầu dục ngang, sắp xếp theo chiều dọc hoặc không Túi tinh tử hình cầu, 40-50 x 25-37µm, có sợi dinh dưỡng (Hình 3b) hoặc không (Hình 3f) Hình 2 Hình thái ngoài của: (a) Dạng giống G "verrucosa” từ Phú Quốc, (b) Dạng giống G “firma” từ Quảng Ninh, (c) Dạng giống G “blodgettii” từ Hải Phòng, (d) Dạng giống G “fisheri” từ Bình Định Hình 3 Hình thái giải phẫu tảo quả, vỏ tảo quả và túi tinh tử của những mẫu vật dưới tên G "verrucosa” và G “blodgettii” a-d, G “verrucosa” từ Phú Quốc (PH9610- 11) e-h, G “blodgettii” từ Quảng Ninh (ION 670309, ION 670305) (a, e) Mặt cắt ngang tảo quả (b, f) Một phần gốc tảo quả cho thấy có sợi dinh dưỡng hoặc không (c, g) Mặt cắt ngang qua vỏ tảo quả (d, h) Túi tinh tử 337 Le Nhu Hau & Tran Thi Thanh Van, 333-342LA '1 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept 12-14, 2007, NhatrangLA1 LA '2 Hình 4 Phổ 13CNMR của các mẫu agar chiết từ các loài rong Câu (ppm: đơn vị độLA 2 dịch chuyển hóa học) G '5 Ký hiệu: G: D-galactose; LA: 3,6 anhydrogalactoseG '6 LA1': nguyên tử C của monomer liên kết với 2-0-Methyl LA1: nguyên tử C ở vị trí 1 của monomer liên kết với 3,6 anhydro galacoseG 6 LA2': nguyên tử C ở vị trí 2 của monomer liên kết với 2-0-MethylG 6 LA2: nguyên tử C ở vị trí 2 của monomer liên kết với 3,6 anhydro galacoseG '6 338 Lê Như Hậu & Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-14/9/2007, Nha Trang Nhìn chung, những đặc điểm hình thái của các cá thể trong các quần thể khác nhau đều có một đặc điểm chung là thắt nhánh ở gốc, sự chuyển dịch kích thước tế bào từ vỏ vào lõi là từ từ, cấu trúc rong cứng Những tính chất này chỉ giống với loài G blodgettii ở nhánh có thắt gốc nhưng lại khác, do loài G blodgettii có sự chuyển dịch kích thước tế bào từ vỏ vào lõi là đột ngột, có rất nhiều sợi dinh dưỡng, sợi sản bào rất lớn và đặc biệt có túi tinh tử hình chén (textorii-type) (Xia & Zhang, 1999) Ngoài ra chúng còn tương đồng với loài G verrucosa ở túi tinh hình bầu dục (verrucosa-type) (Zhang & Xia, 1985) Tuy nhiên, loài G verrucosa là loài đặc hữu của biển Bắc Đại Tây Dương (Fredericq & Hommersand, 1989) và nhiều tác giả cho rằng tất cả sự mô tả loài này cho các vùng địa lý khác là không đúng (Abbott và cs., 1985, Zhang & Xia, 1985) Trên cơ sở so sánh hình thái và giải phẫu cơ quan sinh sản trong tài liệu gốc của loài G firma (Chang & Xia, 1976) và đồng thời so sánh các mẫu vật bảo tàng và mẫu vật mới thu bổ sung từ xã Đầm Hà, Huyện Đầm Hà, tỉnh Quảng Ninh với mẫu vật chuẩn lưu trữ tại Viện Hải dương Thanh Đảo, Trung Quốc cho thấy chúng là loài rong Câu Thắt, G firma Để làm rõ tên loài cho các cá thể của các quần thể khác ở Việt Nam Đặc biệt trong điều kiện nuôi trồng, tất cả chúng đều ở dạng dinh dưỡng không có cơ quan sinh sản để làm chỉ tiêu so sánh Vì vậy, bên cạnh sử dụng phương pháp hình thái so sánh, chúng tôi kết hợp thêm phương pháp phân tích cấu trúc hóa học dưới dạng phổ cộng hưởng từ hạt nhân để hỗ trợ cho việc định loại các đối tượng này 2 Về cấu trúc agar Tất cả các mẫu vật thu được dù có cơ quan sinh sản hoặc không, theo các địa danh khác nhau, nhưng kết quả cho thấy rằng phổ 13C-NMR (Hình 4) của các mẫu agar chiết từ 4 quần thể G firma, G blodgettii, G verrucosa và G fisheri (Bảng 1) là hoàn toàn tương đương nhau Để làm sáng tỏ hơn về sự khác biệt trên phổ 13C-NMR, chúng tôi tiến hành so sánh chúng với phổ 13C-NMR của các mẫu agar chiết từ các loài Gracilaria tenuistipitata, Gracilariopsis bailiniae và Gelidiella acerosa Trên phổ 13C-NMR của 7 mẫu agar nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả: phổ 13C- NMR của 4 mẫu G firma, G blodgettii, G verrucosa và G fisheri tương đương nhau, chúng rất đơn giản gồm 12 tín hiệu, tưong ứng với 12 nguyên tử Cacbon trong Disacarit cơ bản của phân tử agar.Trong khi phổ 13C-NMR của agar chiết từ G tenuistipitata, Gracilariopsis bailiniae và G acerosa có khác biệt rất rõ so với phổ của 4 loài trên, ngoài 12 tín hiệu đặc trưng cho sự có mặt của Disacarit cơ bản của phân tử agar còn có sự xuất hiện thêm các tín hiệu 339 Le Nhu Hau & Tran Thi Thanh Van, 333-342 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept 12-14, 2007, Nhatrang tương ứng với độ dịch chuyển hóa học 55,71; 59,81; 72,4; 74,2; 79,17; 79,51 và 99,37 Trong đó, 69,6 và 72,4 cho mẫu agar chiết từ G tenuistipitata; 59,7; 69,6; 72,4 và 74,2 cho mẫu agar chiết từ Gracilariopsis bailiniae và thêm các tín hiệu 59,71; 59,81; 72,4; 74,2; 79,17; 79,51 và 99,37 cho mẫu agar chiết từ G acerosa Theo các tác giả Usov và cs (1980) và Lahay và cs (1989) thì sự có thêm các tín hiệu trên đã xác nhận sự có mặt của các nhóm Methoxy (CH3O) ở vị trí Cacbon số 6 trong gốc Galactopyranosyl và Cacbon số 2 trong gốc 3,6 anhydro galactopyranosyl Từ đây chúng tôi đưa ra nhận xét sơ bộ sau: - Agar chiết từ 4 loài G firma, G blodgettii, G verrucosa và G fisheri có cấu trúc giống nhau bao gồm các phân tử cơ bản là agarobioza - Agar chiết từ G tenuistipitata có cấu trúc là các phân tử cơ bản agarobioza được methyl hóa ở vị trí C6 với mức độ methyl hóa 20-30% - Agar chiết từ Gracilariopsis bailiniae có cấu trúc là các phân tử cơ bản agarobioza được methyl hóa ở vị trí C6 với mức độ methyl hóa 10-15% - Agar chiết từ loài G acerosa có cấu trúc là các phân tử cơ bản agarobioza được methyl hóa ở vị trí C2 và C6 với mức độ methyl hóa 40- 60% ở vị trí C2 và 60-80% ở vị trí C6 Hình 5 Sự tương quan hạng, liên kết đơn giữa các tín hiệu trong phổ 13CNMR của các loài rong Câu nghiên cứu (theo chương trình Primer 5.1.2, Primer-E Ltd, England) Điều này phù hợp với nhận định của Mouradi và cs (1992) là ở mức độ methyl hóa của các agarobioza chiết từ các loài rong agarophyte thay đổi theo loài và ít thay đổi theo điều kiện sinh thái Khi so sánh sự tương quan hạng liên kết đơn giữa các yếu tố về mức độ dịch chuyển hóa học và sự có mặt của các nhóm Methoxy, cho thấy các quần thể của các loài G firma, G blodgettii, G verrucosa và G fisheri đều nằm trên một nhánh riêng với chỉ số đồng dạng từ 340 Lê Như Hậu & Trần Thị Thanh Vân, 333-342 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", 12-14/9/2007, Nha Trang 90 đến 95%, phân biệt với các loài G tenuistipitata, Gracilariopsis bailiniae, Gelidiella acerosa (Hình 5) Đều này có thể kết luận rằng chúng đều thuộc cùng một loài G firma Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích trình tự nucleotide trong đoạn gen rbcL (Le Nhu Hau & Lin, 2005) và đoạn gen ITS-1 (Lê Như Hậu & Đặng Diễm Hồng, 2005) IV KẾT LUẬN Trên cơ sở kết hợp phương pháp hình thái so sánh và phân tích cấu trúc agar dưới dạng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13CNMR), cho chúng tôi kết luận: - Đề nghị chỉnh sửa tất cả các tên G verrucosa, G blodgettii, G fisheri của các mẫu lưu trữ tại các phòng bảo tàng thành G firma - Bốn quần thể phân bố không liên tục dọc ven biển Việt Nam ở Quảng Ninh, Hải Phòng, Bình Định, Phú Quốc là của cùng một loài duy nhất G firma - Sự thay đổi hình thái ngoài và phân bố ở các vùng sinh thái khác nhau đều không ảnh hưởng đến cấu trúc agar dưới dạng phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Có thể sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân của agar làm công cụ hỗ trợ cho việc định loại các loài rong Câu TÀI LIỆU THAM KHẢO Abbott I A., Y M Chiang, S Fredricq, J N Norris, X B Tsuda, and H Yamamota, 1985 The red alga Gracilaria Grev (Gracilariaceae, Gigartinales): Introduce Tax Econ Seaweeds Calif USA, Vol I: 67-68 Chang C F and B Xia, 1976 Studies on Chinese species of Gracilaria Stud Mar Sin 11: 91-163 Dawson E Y., 1954 Marine Plants in the Vicinity of the Institute Oceanographique de Nha Trang, Vietnam Pacific Sci Vol.VIII (4): 373- 481 Fredericq S and M H Hommersand, 1989 Proposal of the Gracilariales, Ord Nov (Rhodophyta) based on an analysis of the reproductive development of Gracilaria verrucosa J Phycol 25: 213-227 Gurgel C F D., S Fredericq, 2004 Systematics of the Gracilariaceae (Gracilariales, Rhodophyta): A critical assessment based on rbcL sequence analyses J Phycol 40: 138-159 Huynh Quang Nang, 1999 Status and resource of economic algal group in South Vietnam Proc Nat Conf Mar Sci Techn., IV:1007-1010 341 Le Nhu Hau & Tran Thi Thanh Van, 333-342 Proceedings of National Conference ‘Bien Dong – 2007’, Sept 12-14, 2007, Nhatrang Lahay M., W Yaphe, M T P Viet, C Rochas, 1989 13C-NMR spectroscopic investigation of methylated and charged agarose oligosaccharides and polysaccharides Carbohydrate Resource, 190: 249-265 Le Nhu Hau and S M Lin, 2005 The discontinuous geographic distribution of Gracilaria firma (Gracilariaceae, Rhodophyta) along the coastlines of Vietnam J Biotechnology, 3(3): 373-380 Lê Như Hậu và Đặng Diễm Hồng, 2005 Xác định lại tên các loài rong Câu nuôi trồng tại Đình Vũ và Cát Hải, Hải Phòng dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự nucleotid của đoạn gen ITS-1 Tạp Chí Công Nghệ Sinh Học, 3(2): 245-256 Miller I J., 1997 The chemotaxonomic significance of the water soluble red algal polysaccharide Recent Res Devel in Phytochem., 1: 531-565 Miller I J., 2002 Taxonomic implication of the chemical structure of galactans from two species of the genus Trematocarpus Botanica Marina, 45: 432- 437 Mouradi-Givenaud A., T Givernau, H Morvan, and J Cosson, 1992 Agar from Gelidium latifolium (Rhodophyceae, Gelidiales) Biochemical composition and seasonal variation Botanica Marina, 35: 153-159 Nguyễn Hữu Dinh, 1969 Rau Câu NXB KH & KT, Hà Nội 62 tr Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến, 1993 Rong biển Việt Nam (phần phía Bắc), NXB KH & KT, HCM, 364 tr Ohno M., Q N Huynh, S Hilave, 1997 Biology and agar quality of cultivated Gracilaria from Vietnam Bull Mar Sci., Fish Kochi Univ., 17: 15-21 Ohno M., R Terada, H Yamamoto, 1999 The species of Gracilaria from Vietnam Tax Econ Seaweeds Calif USA, 7, pp 99-111 Phạm Hoàng Hộ, 1969 Rong biển Việt Nam (phần phía Nam), Trung tâm học liệu Sài Gòn, 558 tr Phạm Hoàng Hộ, 1985 Thực vật ở đảo Phú Quốc, NXB Tp Hồ Chí Minh, 183 trang Usov A I., S V Varostky, A S Shashkov, 1980 13C-NMR spectroscopy of red algal galactan Biopolymer 19: 997-999 Xia B and J Zhang, 1999 Flora Algarum marianarum Sinicarum: Ahnfetiales, Gigartinales and Rhodomeniales Sci Press No V: 1-210 Zhang J and B Xia, 1985 On Gracilaria asiatica sp nov and G verrucosa (Huds.) Papenfuss Ocean Limn Sinica, Vol 16 (3): 175-179 342