Nghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV

Nghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBVNghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐCPHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

ĐỖ THỊ LỆ QUYÊN

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA cccDNA

TẾ BÀO GAN VỚI HBV DNA, HBV RNA HUYẾT TƯƠNG

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ XƠ GAN DO

HBV

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

TS LÊ VĂN NAM

ĐỖ THỊ LỆ QUYÊN

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA cccDNA

TẾ BÀO GAN VỚI HBV DNA, HBV RNA HUYẾT TƯƠNG

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH VÀ XƠ GAN DO

HÀ NỘI – 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướngdẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn

Các kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố một phầntrong các bài báo khoa học Luận án chưa từng được công bố Nếu có điều gìsai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tác giả

Đỗ Thị Lệ Quyên

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới 3

1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam 4

1.2 Cơ chế bệnh sinh và diễn biến nhiễm HBV mạn 5

1.2.1 Cơ chế bệnh sinh của bệnh do HBV gây ra 5

1.2.2 Tiến trình tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính 7

1.3 Viêm gan virus B mạn tính và xơ gan do HBV 10

1.3.1 Viêm gan virus B mạn tính 10

1.3.2 Xơ gan do HBV 12

1.4 Một số dấu ấn của HBV 13

1.4.1 HBV DNA 13

1.4.2 HBV pgRNA – HBV RNA 15

1.4.3 cccDNA 16

1.5 Các phương pháp định lượng HBV RNA và cccDNA 21

1.5.1 Một số phương pháp định lượng HBV RNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân VGBMT 21

1.5.2 Một số phương pháp định lượng cccDNA trong tế bào gan 22

1.6 Vai trò sinh thiết gan và hình ảnh mô bệnh học trong viêm gan virus 30

1.7 Các nghiên cứu về cccDNA và HBV DNA, HBV RNA ở bệnh nhân

nhiễm HBV mạn trên Thế giới và Việt Nam 31

1.7.1 Các nghiên cứu trên Thế giới 31

1.7.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 35

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 37

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 38

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 38

2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 38

2.2.3 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu 38

2.3 Các chỉ tiêu và nội dung nghiên cứu 39

2.3.1 Các chỉ tiêu nghiên cứu 39

2.3.2 Các nội dung nghiên cứu 40

2.3.3 Phương pháp thu thập số liệu 41

2.4 Kỹ thuật và phương tiện nghiên cứu 41

2.4.1 Quy trình thu thập và bảo quản mẫu 41

2.4.2 Phương pháp thực hiện các chỉ tiêu xét nghiệm cơ bản 42

2.4.3 Phương pháp thực hiện các chỉ tiêu xét nghiệm sinh học phân tử 44

2.4.3 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 60

2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 61

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 63

3.1.1 Tuổi và giới của bệnh nhân nghiên cứu 63

3.1.2 Một số triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng ở hai nhóm bệnh nhân .64

3.2 Nồng độ cccDNA tế bào gan, tải lượng HBV DNA, nồng độ HBV

RNA huyết tương ở các bệnh nhân nghiên cứu 68

3.2.1 Nồng độ cccDNA tế bào gan ở các nhóm bệnh nhân nghiên cứu .68 3.2.2 Nồng độ HBV RNA huyết tương ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu 72

3.2.3 Tải lượng HBV DNA ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu 76

3.3 Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA với HBV DNA và HBV RNA ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu 81

3.3.1 Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA với tải lượng HBV DNA ở các nhóm bệnh nhân 81

3.3.2 Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết tương ở hai nhóm bệnh nhân 84

Chương 4: BÀN LUẬN 90

4.1 Đặc điểm chung của các bệnh nhân nghiên cứu 90

4.1.1 Đặc điểm về tuổi và giới tính 90

4.1.2 Một số biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu 91

4.2 cccDNA tế bào gan, HBV RNA, HBV DNA huyết tương ở các bệnh nhân nghiên cứu 96

4.2.1 Nồng độ cccDNA ở các bệnh nhân nghiên cứu 96

4.2.2 Nồng độ HBV RNA ở các bệnh nhân nghiên cứu 99

4.2.3 Tải lượng HBV DNA ở các bệnh nhân nghiên cứu 104

4.3 Mối liên quan giữa cccDNA với HBV DNA và HBV RNA ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu 108

4.3.1 Mối liên quan giữa cccDNA tế bào với HBV DNA huyết tương 108 4.3.2 Mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết tương 110

4.3.3 Mối tương quan giữa nồng độ HBV RNA với tải lượng HBV DNA

huyết tương 113

KẾT LUẬN 119

HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI 121

KIẾN NGHỊ 122 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 ALT Alanine aminotransferase

2 AFP Alpha-fetoprotein

3 AST Aspartate aminotransferase

4 VGBMT Viêm gan virus B mạn tính

5 cccDNA Covalently closed circular Deoxyribonucleic acid

7 DNA Deoxyribonucleic acid

8 Dsl DNA double-stranded linear DNA: Sợi đôi DNA tuyến tính

9 ddPCR droplet digital Polymerase Chain Reaction

10 EASL European Asscociation for the Study of the Liver

Hiệp hội Gan mật Châu Âu

11 FFPE Formalin-Fixed Paraffin-Embedded: parafin cố định

bằng formalin

12 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

13 HAI Histology Activity Index: chỉ số hoạt động mô bệnh

học

14 HBV Hepatitis B Virus: Virus viêm gan B

15 HBcAb Hepatitis B core antibody: kháng thể kháng kháng

nguyên lõi của virus viêm gan B

16 HBeAb Hepatitis B e antibody

kháng thể kháng kháng nguyên e của virus viêm ganB

17 HBeAg Hepatitis B e antigen

kháng nguyên e của virus viêm gan B

18 HBsAb Hepatitis B surface antibody: kháng thể kháng kháng

nguyên bề mặt của virus viêm gan B

19 HBsAg Hepatitis B surface antigen

kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B

20 HBcrAg Hepatitis B core related Antigen

21 HCC Hepatocellular Carcinoma

Ung thư biểu mô tế bào gan

22 IC Internal control: kiểm soát nội bộ

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

24 LHBs Large Hepatitis B Surface Protein

Protein lớn bề mặt của virus viêm gan B

25 MHBs Middle Hepatitis B Surface Protein

Protein trung bình bề mặt của virus viêm gan B

26 NA Nucleot(s)ide Analogue

27 NTCP Na+/ taurocholate co-transporting polypeptide:

Polypeptide đồng vận chuyển taurocholate phụ thuộc

Na +

28 NK Natural killer cells: các tế bào diệt tự nhiên

29 NKT Natural killer T cells: tế bào T diệt tự nhiên

30 mRNA Messenger RNA: RNA thông tin

31 RCA Rolling Circle Amplification

32 rcDNA Relaxed circular DNA

33 RNA Ribonucleic acid

34 RT Reverse Transcriptase: enzym sao mã ngược

35 SHBs Small Hepatitis B Surface Protein

Protein nhỏ bề mặt của virus viêm gan B

37 PCR Polymerase Chain Reaction

38 qPCR Quantitative PCR

39 qHBsAg Quantitative Hepatitis B surface antigen

40 Pg RNA Pregenomic Ribonucleic: RNA tiền gen

42 PSAD Plasmid Safe ATP-dependent DNAase

DNAase phụ thuộc ATP an toàn Plasmid

43 RACE A rapid amplification of complimentary DNA

(cDNA)-ends: Kỹ thuật khuếch đại nhanh phản ứngchuỗi polymerase thời gian thực (PCR) dựa trênDNA hoặc circle DNA tự do

44 tDNA Total Deoxyribonucleic acid: DNA toàn bộ

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các phương pháp trực tiếp được sử dụng trong định lượng cccDNA 2.1 Giá trị bình thường các xét nghiệm sinh hóa 432.2 Trình tự các mồi của phản ứng RCA như dưới đây 462.3 Trình tự primer và probe của phản ứng real-time PCR định lượng

HBV cccDNA 472.4 Chu trình nhiệt chạy máy Realtime PCR 552.5 Thành phần phản ứng 562.6 Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR 57Y3.1 Tuổi và giới của bệnh nhân nghiên cứu 633.2 Một số triệu chứng lâm sàng thường gặp giữa hai nhóm bệnh nhân 643.3 Tình trạng mang kháng nguyên HBe ở hai nhóm bệnh nhân 643.4 Hoạt độ ALT, AST và nồng độ Bilirubin TP ở 2 nhóm bệnh nhân 65

Bảng Tên bảng Trang

3.5 Đặc điểm về tiểu cầu ở 2 nhóm bệnh nhân 663.6 Mức độ tổn thương và xơ hóa gan nhóm bệnh nhân VGBMT 663.7 Mối liên quan giữa mức độ tổn thương gan với HBeAg ở chung hai

nhóm bệnh nhân 673.8 Mức độ xơ hóa gan theo HBeAg ở chung hai nhóm bệnh nhân 673.9 Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với các chỉ tiêu

nghiên cứu ở nhóm VGBMT 693.10 Mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với một số chỉ tiêu

nghiên cứu ở nhóm xơ gan 703.11 Phân tích hồi quy đa biến các chỉ tiêu nghiên cứu ảnh hưởng đến

cccDNA ở nhóm VGBMT và Xơ gan 713.12 So sánh nồng độ cccDNA tế bào gan theo mức độ tổn thương và xơ

hóa gan ở nhóm VGBMT 713.13 Nồng độ HBV RNA huyết tương ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu

723.14 Nồng độ HBV RNA huyết tương theo tình trạng HBeAg ở chung hai

nhóm 723.15 Mối liên quan giữa nồng độ HBV RNA huyết tương với một số chỉ

tiêu nghiên cứu ở chung hai nhóm 733.16 Mối liên quan giữa nồng độ HBV RNA huyết tương với các chỉ tiêu

nghiên cứu ở nhóm VGBMT 743.17 Phân tích hồi quy đa biến các chỉ tiêu nghiên cứu ảnh hưởng đến

HBV RNA ở nhóm VGBMT và Xơ gan 753.18 Nồng độ HBV RNA theo mức tổn thương gan và mức xơ hóa gan ở

chung hai nhóm bệnh nhân 753.19 Tải lượng HBV DNA ở hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu 763.20 Mối liên quan giữa tải lượng HBV DNA với các chỉ tiêu nghiên cứu

Bảng Tên bảng Trang

chung cả hai nhóm 773.21 Mối liên quan giữa tải lượng HBV DNA với các chỉ tiêu nghiên cứu

ở nhóm VGBMT 783.22 Đặc điểm tải lượng HBV DNA theo mức tổn thương gan và mức xơ

hóa gan ở nhóm VGBMT 793.23 Giá trị của cccDNA, HBV DNA, HBV RNA phân theo tình trạng

HBeAg ở nhóm VGBMT 803.24 Đặc điểm nồng độ cccDNA theo tải lượng HBV DNA huyết tương ở

chung hai nhóm bệnh nhân 813.25 Tương quan giữa cccDNA với HBV DNA theo một số chỉ tiêu

nghiên cứu ở hai nhóm 833.26 Nồng độ cccDNA với mức HBV RNA ở hai nhóm nghiên cứu 843.27 Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết

tương theo các chỉ tiêu nghiên cứuở hai nhóm nghiên cứu 863.28 Mối liên quan giữa tải lượng HBV DNA với nồng độ HBV RNA

huyết tương ở các bệnh nhân nghiên cứu 863.29 Tương quan giữa tải lượng HBV DNA với HBV RNA huyết tương

theo các chỉ tiêu nghiên cứu ở hai nhóm 88

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.1 Nồng độ cccDNA tế bào gan ở các hai nhóm bệnh nhân nghiên cứu 683.2 Giá trị của cccDNA tế bào gan, HBV RNA và HBV DNA huyết tương

với tình trạng HBeAg ở nhóm VGBMT 793.3 Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với tải lượng HBV DNA

huyết tương ở chung hai nhóm 823.4 Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với tải lượng HBV DNA

huyết tương ở nhóm VGBMT và xơ gan 823.5 Tương quan giữa cccDNA với HBV RNA ở chung hai nhóm bệnh nhân

nghiên cứu 853.6 Tương quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với HBV RNA huyết

tương ở nhóm VGBMT và Xơ gan 853.7 Tương quan giữa HBV RNA và HBV DNA ở chung hai nhóm 873.8 Tương quan giữa HBV RNA và HBV DNA ở nhóm VGBMT và xơ

gan 873.9 Tương quan giữa HBV RNA kết hợp với HBV DNA với cccDNA ở

chung hai nhóm 883.10 Tương quan giữa HBV RNA kết hợp với HBV DNA với cccDNA ở

nhóm VGBMT và xơ gan 89

DANH MỤC HÌN

1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới 3

1.2 Vòng đời của HBV và chu trình sinh học của cccDNA 5

1.3 Phân loại giai đoạn nhiễm HBV 8

1.4 Quá trình hình thành cccDNA từ rcDNA 19Y 2.1 Mảnh gan thực tế sinh thiết 43

2.2 Cấu trúc của cccDNA và rcDNA bộ gen của HBV 47

2.3 Bộ kit QIAamp Viral RNA mini kit 51

2.4 Sơ đồ vị trí thiết kế mồi của phản ứng định lượng HBV RNA 53

2.5 Quy trình Onestep-RT PCR phát hiện chọn lọc HBV pgRNA 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, theo Tổ chức Y tế Thế giới ước tính trên toàn cầu có khoảng

296 triệu người nhiễm virus viêm gan B (Heptitis B virus: HBV) mạn tính.Hàng năm có khoảng 820.000 trường hợp tử vong liên quan đến các biếnchứng của bệnh như viêm gan B mạn tính (VGBMT), xơ gan và ung thư biểu

mô tế bào gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) [1] Việt Nam là quốc gia

có tỉ lệ nhiễm HBV cao trong khu vực, chịu hậu quả nặng nề do nhiễm HBVgây ra Dữ liệu từ Bộ Y tế Việt Nam năm 2019 cho thấy tỉ lệ nhiễm HBV mạntính từ 6 – 20% dân số, tương đương với khoảng 8 triệu người Điều đó đặt ramột thách thức lớn cho hệ thống chăm sóc sức khỏe cộng đồng và trong theodõi, quản lý điều trị người nhiễm HBV [2]

Deoxyribonucleic acid dạng vòng khép kín cộng hóa trị của HBV(cccDNA: Covalently closed circular Deoxyribonucleic acid ) đóng vai tròquan trọng trong sự tồn tại dai dẳng, duy trì và nhân lên của virus trong tế bàogan cccDNA, dưới dạng một nhiễm sắc thể nhỏ, bền vững, đồng thời là khuônmẫu sản xuất ra các Ribonucleic acid (RNA) như pgRNA (pregenomic RNA)

và các mRNA mã hóa cho các protein của HBV[3] Bên cạnh đó, hiện tại chưa

có thuốc kháng virus nào có thể điều trị, thải trừ cccDNA ra khỏi người bệnh.HBV DNA vẫn là dấu ấn sinh học thường quy được sử dụng trong thực hànhđiều trị tuy nhiên lại không phản ánh chính xác sự hoạt động của cccDNA [4].Trong khi đó, việc tách chiết và phân tích cccDNA đòi hỏi phải thực hiện sinhthiết gan, một kỹ thuật xâm lấn và thường không được sự hợp tác của nhiềungười bệnh Điều này làm cho quy trình xét nghiệm, phân tích cccDNA trở nênkhó khả thi trong thực tế lâm sàng

Chính vì vậy, việc tìm kiếm một dấu ấn trong huyết tương có khả năng

dự đoán hoặc đại diện cho cccDNA có ý nghĩa quan trọng HBV pgRNA(HBV RNA) là một sản phẩm phiên mã của cccDNA có lưu hành trong huyết

tương, dấu ấn này có tiềm năng phản ánh trung thực tình trạng hoạt động củacccDNA trong tế bào gan [5], [6] Tìm hiểu mối liên quan giữa cccDNA vớiHBV DNA, HBV RNA huyết tương có thể giúp nâng cao hiểu biết về cơ chếbệnh sinh của bệnh và cung cấp thông tin hữu ích cho việc quản lý, điều trịngười bệnh nhiễm HBV, đặc biệt ở Việt Nam, nơi chưa có nghiên cứu nào vềvấn đề này.

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa cccDNA tế bào gan với HBV DNA, HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV” với hai mục tiêu sau:

1 Xác định nồng độ cccDNA tế bào gan, tải lượng HBV DNA và nồng

độ HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV.

2 Đánh giá mối liên quan giữa nồng độ cccDNA tế bào gan với tải lượng HBV DNA và nồng độ HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính và xơ gan do HBV.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới và Việt Nam

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, toàn cầu có khoảng 300 triệungười nhiễm HBV mạn tính và gần 1 triệu người tử vong mỗi năm các nguyênnhân liên quan đến các virus viêm gan trong đó chủ yếu là HBV [1]

Hình 1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế giới

* Nguồn: Theo Yuen M.F và cs (cs) (2018) [7]

Bên cạnh đó, HBV là nguyên nhân của 60 - 80% ca mắc HCC trên toàncầu và là một trong ba nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở châu Phi, châuÁ Tỷ lệ HBsAg dương tính trên Thế giới thay đổi từ 0,1% đến 20%, phụthuộc từng khu vực địa lý và quần thể dân cư Những nơi trên Thế giới được

coi là vùng lưu hành dịch cao khi ít nhất 8% dân số có HBsAg dương tính Tỷ

lệ nhiễm HBsAg thay đổi giữa các nước khác nhau, ở những nước phát triển,

tỷ lệ HBsAg dương tính thường cao hơn ở nhóm người di cư đến từ nhữngnước có tỷ lệ mắc bệnh cao hoặc từ những người có hành vi nguy cơ cao [8],[9]

1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Việt Nam là một trong 10 nước đứng đầu Thế giới về tỷ lệ tử vong doHCC, trong đó 80% ca HCC này liên quan nhiễm HBV mạn tính Theo kếtquả một số công trình nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ HBsAg (+) dao động từ3,1% – 19% dân số tùy theo từng đối tượng nguy cơ, tỷ lệ này thấp nhất ở trẻ

em (3,4% (3,1-3,8%)) và cao nhất ở người trưởng thành, đặc biệt nhóm đốitượng bệnh nhân điều trị nội trú có kèm các tổn thương gan như trong bệnhsốt xuất huyết Dengue, nhiễm khuẩn huyết, sốt rét [2] Theo nghiên cứutổng hợp mới nhất năm 2022, tỷ lệ dương tính HBsAg trong quần thể ngườiViệt Nam dao động quanh 11 -13% [10] HBV là nguyên nhân hàng đầu gâyviêm gan tối cấp, xơ gan và ung thư gan ở Việt Nam Theo báo cáo của Cục Y

tế dự phòng – Bộ Y tế 2019 về tình trạng hiện nhiễm HBV, tỷ lệ hiện nhiễmcao nhất được ghi nhận tại Nam Trung Bộ (11,4%), Tây Nguyên (11,1%) vàTây Bắc (11,1%), trong khi Bắc Trung Bộ có tỷ lệ hiện nhiễm thấp nhất là7,5% Các tỉnh, thành phố có tỷ lệ HBsAg dương tính cao bao gồm: Sơn La(13,5%), Bình Thuận (12,8%), Quảng Nam (11,9%), Kon Tum (11,9%), ĐắkNông (11,8%) [2]

1.2 Cơ chế bệnh sinh và diễn biến nhiễm HBV mạn

1.2.1 Cơ chế bệnh sinh của bệnh do HBV gây ra

- Vòng đời của HBV

Hình 1.2 Vòng đời của HBV và chu trình sinh học của cccDNA

* Nguồn: Theo Wei L và cs (2021) [3].

HBV có bộ gen dài 3,2 kb, được tổ chức thành bốn khung đọc mở cóphần chồng lên nhau Chúng mã hóa bốn sản phẩm gen chính: (1) polymerase(POL) của virus, (2) ba polypeptide kháng nguyên bề mặt (HBs) của HBV, cụthể là các kháng nguyên bề mặt nhỏ (S), trung bình (M) và lớn (L); (3)Protein lõi của HBV (HBc), kháng nguyên e của HBV (HBeAg), protein tiềnlõi và (4) protein X (HBx) Cùng với các yếu tố vật chủ, các protein virus này

thúc đẩy quá trình hoàn thiện vòng đời của HBV, bao gồm sự xâm nhập củavirus, quá trình sinh học của cccDNA, sản xuất nucleocapsid thế hệ con, hìnhthành virion và sự thoát ra của virion [3].

Quá trình sao chép của HBV mở đầu bằng việc gắn virion vào thụ thểđặc hiệu của virus trên bề mặt tế bào gan được gọi là NTCP (NTCP:Na+/taurocholate co-transporting polypeptide) thông qua các protein preS Sau khi

gắn lớp vỏ của virus, hòa màng với màng tế bào, qua đó phóng thích

nucleocapsid virus vào bào tương Từ đây, HBV DNA được vận chuyển vàotrong nhân tế bào gan và chuyển dạng thành cccDNA nhờ các enzyme của tếbào vật chủ Trong quá trình nhiễm HBV mạn tính, cccDNA được dùng làmkhuôn để tổng hợp các RNA thông tin với các kích thước khác nhau 3,5; 2,4;2,1 và 0,7kb Các RNA này được gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất và thựchiện chức năng của mình Sau khi pgRNA được tổng hợp, nó được đóng góitrong vỏ nucleocapsid và chuyển vào bào tương, bắt đầu quá trình sao chép bộ

gen [11], [12], [7]

Trong các phức hợp sao chép này, pgRNA được phiên mã ngược thànhHBV DNA, sau đó trải qua quá trình đóng gói Capsid chứa HBV DNA liênkết với protein bề mặt HBV trên lưới nội chất, được chuyển vào lõi trước khithoát ra khỏi tế bào gan qua con đường bài tiết và sau đó được giải phóngdưới dạng các hạt virus trưởng thành mRNA được phiên mã từ cccDNA cũngtạo ra nhiều kháng nguyên virus khác nhau Ngoại trừ cccDNA, tất cả các sảnphẩm khác của virus như HBV rcDNA, HBV RNA, HBeAg, HBsAg,HBcrAg đều xác định được trong máu Chúng được tạo ra từ quá trình phiên

mã từ các điểm khởi đầu khác nhau codon của gen lõi preC và quá trình xử lýprotein khác biệt sau đó

- Cơ chế bệnh sinh

Bản thân sự sao chép của HBV không gây tổn thương tế bào gan,nhưng phản ứng miễn dịch chống lại HBV nhằm loại bỏ virus có thể dẫn đến

tổn thương tế bào gan Quá trình này có tác động quan trọng đến tiến triểnlâm sàng và kết quả của bệnh viêm gan B Đáp ứng miễn dịch của vật chủchống lại HBV chủ yếu bao gồm hai phần: miễn dịch bẩm sinh và miễn dịchthích ứng Trong số đó, các phản ứng miễn dịch bẩm sinh chính được gây rabởi thụ thể nhận dạng mẫu, tế bào tiêu diệt tự nhiên (tế bào NK), tế bào NKT

và bạch cầu đơn nhân, đại thực bào; các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịchthích ứng chính bao gồm tế bào lympho T CD4, tế bào lympho T CD8 và tếbào lympho B Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh hiệu quả không chỉ có tác dụngkháng virus trực tiếp mà còn có tác động quan trọng đến đáp ứng miễn dịchđặc hiệu với HBV Đáp ứng của tế bào lympho T đặc hiệu với HBV và tế bàolympho B là những yếu tố quyết định trong việc loại bỏ virus tự do, tế bàogan nhiễm virus và đóng vai trò kiểm soát miễn dịch lâu dài đối với HBV.Trong quá trình nhiễm HBV mạn tính, virus sẽ lẩn trốn và ức chế khả năngkháng virus của hệ thống miễn dịch thích ứng và miễn dịch bẩm sinh thôngqua các cơ chế khác nhau, từ đó đạt được sự sao chép liên tục, đồng thời vậtchủ cũng có biểu hiện rối loạn chức năng của các tế bào miễn dịch khác nhau[13]

1.2.2 Tiến trình tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính

Phân chia của Hiệp hội gan mật Châu Âu 2017 so với các phân loại cũ

có nhiều ưu điểm, theo cách phân chia này, bệnh nhân VGBMT được chiathành hai tình trạng: viêm gan B mạn và nhiễm HBV mạn có HBeAg dươngtính hay âm tính [14] Tuy nhiên, ở một số lượng bệnh nhân đáng kể, biểuhiện tăng đơn độc dấu ấn hoạt động của HBV không cho phép phân loại vàomột giai đoạn cụ thể nào, bên cạnh đó cần theo dõi HBeAg, tải lượng HBVDNA và ALT huyết thanh thường xuyên để quyết định việc điều trị Ngay cảsau khi đánh giá đầy đủ, một số trường hợp vẫn rơi vào một khu vực màuxám không xác định, khi đó việc quản lý cần phải được cá nhân hóa Các giaiđoạn của nhiễm HBV mạn tính không nhất thiết phải tuần tự như cách phân

loại trong các nghiên cứu trước đây chỉ ra, việc phân loại này của EASLnhằm giúp ích cho việc điều trị được dễ dàng hơn [7], [14], [15].

Hình 1.3 Phân loại giai đoạn nhiễm HBV

* Nguồn: EASL (2017) [14]

- Giai đoạn 1

Nhiễm HBV mạn tính có HBeAg dương tính tương ứng với “giai đoạndung nạp miễn dịch” đặc trưng bởi sự hiện diện của HBeAg huyết tương, tảilượng HBV DNA rất cao và ALT duy trì ở mức bình thường [16] Ở gan chỉthấy tổn thương viêm hoặc hoại tử tối thiểu mà không thấy tình trạng xơ hóagan, nhưng mức độ tổng hợp HBV DNA cao cho thấy nguy cơ tiến triển thànhung thư gan xuất hiện ngay ở giai đoạn đầu của sự nhiễm trùng [16], [17] Giaiđoạn này thường gặp và tồn tại kéo dài đến tuổi trưởng thành, tỷ lệ mất HBeAg

tự nhiên rất thấp và nguy cơ lây truyền thường cao do tải lượng HBV DNA cao[18]

- Giai đoạn 2

VGBMT, HBeAg dương tính được đặc trưng bởi sự hiện diện củaHBeAg huyết tương, tải lượng HBV DNA cao và ALT tăng, những trường

hợp này thường có tình trạng hoại tử gan vừa hoặc nặng kèm theo sự tiếntriển của xơ hóa xảy ra nhanh chóng [17] Hiện tượng này có thể gặp ở giaiđoạn đầu nhiễm HBV nhưng thường gặp hơn ở các trường hợp nhiễm HBVkhi đã vào tuổi trưởng thành Kết cục của giai đoạn này rất đa dạng, nhiềubệnh nhân có thể đạt HBeAg âm tính do chuyển đảo huyết thanh tự nhiên,giảm tải lượng HBV DNA và bước vào giai đoạn không hoạt động [19]

- Giai đoạn 3

Nhiễm HBV mạn tính HBeAg âm tính, trước đây được gọi là “giai đoạnmang virus không hoạt động”, được đặc trưng bởi sự hiện diện của kháng thểvới kháng nguyên HBe trong huyết tương, tải lượng HBV DNA không thểphát hiện hoặc ở mức thấp (<2.000 IU/ml) và ALT bình thường Những bệnhnhân này có nguy cơ tiến triển thành xơ gan hoặc HCC thấp hơn nhữngtrường hợp khác, tuy nhiên một số trường hợp cũng có thể tiến triển thànhVGBMT [16] Mất HBsAg do điều trị được coi là phương pháp điều trị khỏichức năng và giải quyết tình trạng nhiễm HBV mạn tính Một số nghiên cứu

đã ghi nhận kết quả lâm sàng thuận lợi sau khi mất HBsAg hoặc đảo ngượchuyết thanh ở độ tuổi sớm (dưới 50 tuổi) trong trường hợp không có xơ gan ởnhững người bị nhiễm HBV mạn tính Đạt được việc mất HBsAg hiếm khi xảy

ra ở bệnh nhân châu Á dùng thuốc kháng virus đường uống (<1% mỗi năm),nhưng một khi đã đạt được thì thường duy trì kết quả lâu dài Chuyển đảohuyết thanh và hình thành kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt HBV(Hepatitis B surface antibody: HBsAb) gặp ở một số ít bệnh nhân mất HBsAgsau khi điều trị Tuy nhiên, đối với bệnh nhân dùng NA, mất HBsAg mà khôngxuất hiện HBsAb là tiêu chí điều trị có thể chấp nhận được [20]

- Giai đoạn 4

VGBMT, HBeAg âm tính, được đặc trưng bởi việc mất HBeAg và xuấthiện HBeAb kèm theo là tải lượng HBV ở mức từ trung bình đến cao (thườngthấp hơn ở bệnh nhân HBeAg dương tính), ALT tăng từng đợt hoặc liên tục,

kết quả mô học gan cho thấy tình trạng có biểu hiện viêm, hoại tử và xơ hóa ởcác mức độ trung bình – nặng Hầu hết các trường hợp này xảy ra đột biến Precore/ core của HBV làm mất khả năng biểu hiện của HBeAg Giai đoạn này

có liên quan đến tỷ lệ thuyên giảm bệnh tự nhiên thấp nếu không được canthiệp điều trị [19]

- Giai đoạn 5

Giai đoạn HBsAg âm tính, có hoặc không có HBsAb Mất HBsAg trướckhi bắt đầu xơ gan làm giảm nguy cơ xơ gan, mất bù gan và HCC, từ đó cảithiện khả năng sống sót Tuy nhiên, nếu xơ gan đã phát triển trước khi mấtHBsAg, bệnh nhân vẫn có nguy cơ bị HCC do đó cần tiếp tục theo dõi sát.Sau điều trị liệu pháp kháng virus ở bệnh nhân VGBMT chỉ có khả năng mấtHBsAg với tỷ lệ 1 – 3% [16], [19]

1.3 Viêm gan virus B mạn tính và xơ gan do HBV

1.3.1 Viêm gan virus B mạn tính

VGBMT là tình trạng viêm và hoại tử tế bào gan được gây ra bởi sựtồn tại của HBV kéo dài trên 6 tháng Hầu hết bệnh nhân VGBMT không rõtiền sử viêm gan trước đây Ở các quốc gia nằm trong vùng dịch lưu hànhthấp có khoảng 30-50% bệnh nhân VGBMT là có tiền sử viêm gan B cấp,trong khi đó ở các quốc gia nằm trong vùng dịch lưu hành cao, tỷ lệ này chỉ <30% [21]

Dựa vào xét nghiệm HBeAg, người ta chia VGBMT làm hai nhóm:VGBMT, HBeAg dương tính và VGBMT, HBeAg âm tính

- VGBMT, HBeAg dương tính thường gặp ở người nhiễm HBV từ mẹ

và gặp với tỷ lệ cao ở các quốc gia châu Á Hầu hết các bệnh nhân VGBMT,HBeAg dương tính đều có HBV DNA ≥ 105 copies/ml Tỷ lệ chuyển đảohuyết thanh HBeAg tự nhiên thành công khoảng 10-20%/ năm Quá trìnhchuyển đảo huyết thanh không thường xuyên có mối liên quan với hiện tượngbùng phát về sinh hóa, nhưng ở trường hợp chuyển đảo huyết thanh HBeAg

thành công thì dấu hiệu bùng phát sinh hóa thường rất rõ ràng, một số trườnghợp còn xuất hiện cả IgM-Anti HBc và có khoảng 2,5% bệnh nhân có nồng

độ AFP (Alpha-fetoprotein) tăng cao Các yếu tố ảnh hưởng tích cực đếnchuyển đảo thành công HBeAg là tuổi cao, hoạt độ ALT cao và genotype B

- VGBMT, HBeAg âm tính thường gặp ở người nhiễm HBV trong quátrình trưởng thành, ở tuổi trên 40 và chiếm tỷ lệ cao ở các quốc gia vùng ĐịaTrung Hải Hầu hết bệnh nhân VGBMT, HBeAg âm tính là do đột biến precorehoặc đột biến vùng promotor core Một số trường hợp do tái hoạt động từngười nhiễm HBV mạn không hoạt động Bệnh nhân VGBMT, HBeAg âmtính thường có tải lượng virus HBV DNA ≥ 104 copies/ml và thấp hơn nhómHBeAg dương tính nhưng biến chứng xơ gan, ung thư tế bào gan lại có tần suấtcao hơn [19]

Bệnh VGBMT thường tiến triển âm thầm, xen kẽ giữa những đợt tiếntriển là những đợt ổn định nhưng bệnh thường không tự giới hạn được, hậuquả thường dẫn đến bệnh lý gan mất bù, xơ gan, ung thư tế bào gan và tửvong Theo nhiều số liệu thống kê cho thấy, tỷ lệ sống sót sau 5 năm ở bệnhnhân VGBMT mức độ nhẹ là 97%, mức độ vừa là 86%, bệnh nhân xơ gan sauhoại tử là 55%; và tương tự sau 15 năm lần lượt là 77%; 66%; 40% [22]

Hầu hết bệnh nhân VGBMT có biểu hiện lâm sàng nghèo nàn như chỉmệt mỏi thoáng qua, đôi khi chán ăn, đầy bụng , hoạt độ AST, ALT khôngtăng hoặc tăng nhẹ từ 2-5 lần ngưỡng cao của giá trị bình thường Chẩn đoánxác định VGBMT ở người không có triệu chứng lâm sàng phải dựa vào kết quả

mô bệnh học với những đặc điểm tổn thương viêm và xơ không tương xứngvới lâm sàng

Tuy nhiên, có một số ít bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng giống nhưviêm gan virus cấp và hiện tượng này được gọi là đợt bùng phát của VGBMT.Các triệu chứng lâm sàng thường gặp như sốt nhẹ, mệt mỏi, kém ăn, ngủ kém,gầy sút cân, nôn, buồn nôn, đau tức hạ sườn phải, suy giảm hoạt động tình

dục ở người trưởng thành, tiểu vàng, da vàng, gan to chắc Bên cạnh đó có thểthấy có những biểu hiện ngoài gan như đau mỏi khớp, xuất huyết da do viêmquanh mạch, protein niệu do lắng đọng phức hợp miễn dịch gây viêm cầu thận,viêm nút quanh động mạch, ALT tăng ≥ 5 lần Mô học gan thấy hình ảnhviêm và hoại tử nặng, có thể gặp hoại tử tiểu thùy, hoại tử cầu nối [23], [19].

1.3.2 Xơ gan do HBV

Xơ gan là bệnh lý mạn tính ở gan với các tổn thương đặc trưng như:viêm gan B mạn tính, mô xơ phát triển lan tràn, cấu trúc gan bị đảo lộn khônghồi phục, có nhiều cục tân tạo [24]

Xơ gan do HBV hầu hết xuất phát từ bệnh nhân VGBMT, tuy nhiênmột số trường hợp xơ gan cũng có thể gặp ở người mang HBV không hoạtđộng hoặc sau mắc viêm gan virus B cấp tính nhiều năm Người mang HBVmạn tính lâu dài có nguy cơ dẫn đến xơ gan, HCC và tỷ lệ mắc, tỷ lệ tửvong liên quan đến xơ gan cao hơn so với nhóm chứng có HBsAg âm tính.Tải lượng HBV DNA huyết tương ban đầu trong nhiều nghiên cứu được làmột yếu tố dự báo chính cho sự thanh thải tự nhiên của HBeAg, HBsAg[25] Hiện nay, trên Thế giới có xấp xỉ 300 triệu người nhiễm HBV mạn tính,ước tính sau mỗi 5 năm có khoảng 12 - 20% số bệnh nhân VGBMT sẽ tiếntriển thành xơ gan, 20-23% bệnh nhân xơ gan còn bù tiến triển thành mất bù

và 6 - 15% bệnh nhân xơ gan tiến triển thành ung thư gan nguyên phát Bệnhnhân xơ gan thường có tiên lượng xấu, ở bệnh nhân xơ gan còn bù tỷ lệ sốngsau 5 năm khoảng 85%, trong khi đó bệnh nhân xơ gan mất bù tỷ lệ sốngthêm sau 5 năm chỉ còn 14 -35%, và sau 1 năm là 55-70% [21], [26]

Xơ gan do HBV còn gọi là xơ gan nhu mô hay xơ gan sau hoại tử, tổnthương xơ hóa xuất phát từ khoảng cửa tiến vào nhu mô gan thay thế tổ chức

bị hoại tử Tổ chức gan tăng sinh tạo ra các cục tân tạo đường kính to nhỏkhông đều thường > 3mm nhưng chủ yếu là các cục lớn do vậy còn gọi là xơgan cục tái tạo to

+ Bacon B.R cho rằng xơ gan dựa vào kết quả mô bệnh học và cũng cóthể dựa vào các biểu hiện lâm sàng và biến chứng của bệnh [24].

Lâm sàng của xơ gan được quy vào hai hội chứng chính và những thayđổi về hình thái gan

* Hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa: thể hiện dưới 3 triệu chứng kinhđiển:

+ Tiên lượng: xơ gan do HBV gây ra không tự giới hạn được, bệnh tiếntriển ngày một nặng Bệnh nhân thường tử vong do: hôn mê gan, xuất huyết

do giãn vỡ tĩnh mạch thực quản, bệnh gan mất bù, viêm phúc mạc tự phát,ung thư gan nguyên phát [21]

1.4 Một số dấu ấn của HBV

1.4.1 HBV DNA

Trong thực hành lâm sàng, HBV DNA đóng vai trò quan trọng trongđánh giá sự nhân lên của virus, cũng như đưa ra chỉ định và theo dõi điều trịthuốc kháng virus HBV DNA cao kéo dài có liên quan mật thiết với gia tăngnguy cơ xơ gan, ung thư gan HBV DNA được xem là một trong các tiêu chítrong đánh giá đáp ứng điều trị Ngoài ra, HBV DNA còn giúp xác định viêmgan virus B ở các bệnh nhân có HBsAg âm tính, anti HBc(+) hay còn gọi lànhiễm HBV tiềm ẩn Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị VGBMT củaHiệp hội gan mật Châu Âu (EASL 2017) những trường hợp sau đây cần bắt đầuđiều trị [14]:

- VGBMT, HBeAg dương tính có HBV DNA ≥ 2x105 copies/mL vàALT ≥ 2 lần ngưỡng cao giá trị bình thường

- VGBMT, HBeAg âm tính có HBV DNA ≥ 2x104 copies/ml và ALT ≥ 2lần ngưỡng cao giá trị bình thường

- Có biểu hiện xơ hóa gan mức trung bình đến nặng với bất kỳ mức ALTnào đều được cân nhắc điều trị

- ALT tăng cao hơn 5 lần giá trị bình thường, nguy cơ tiến triển thành viêmgan nặng hoặc mất bù

- Những trường hợp có HBV DNA cao, ALT bình thường kéo dài hoặctăng tối thiểu không nên điều trị mà cần được theo dõi, giám sát mỗi 3-6 tháng.Theo hướng dẫn của Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Hoa Kỳ, giai đoạn khônghoạt động của bệnh, gồm: HBsAg (+) > 6 tháng, HBeAg (-), anti-HBe (+), HBVDNA < 2.000 IU/ml, hoạt độ ALT/AST duy trì bình thường Tuy nhiên một sốnghiên cứu cho thấy, chỉ định lượng HBV DNA không phải luôn xác định được

rõ ràng giai đoạn của bệnh HBV DNA dao động (102 -104 IU/ml) khó phân biệttrạng thái mang virus không hoạt động và người bệnh HBeAg (-) thể hoạt động[27]

Trong viêm gan virus B cấp, nhìn chung, người ta đã nghĩ rằng HBV bịloại bỏ hoàn toàn ở những bệnh nhân sau khỏi bệnh; tuy nhiên, dấu vết của

HBV DNA huyết thanh hoặc trong mô gan có thể được phát hiện với một tỷ

lệ nhỏ bởi những xét nghiệm phân tử có độ nhạy cao Những trường hợp đógọi là nhiễm HBV ẩn (Occult Hepatitis B virus infection) Do đó, khi dùngcác thuốc ức chế miễn dịch sau khi ghép tạng hoặc hóa trị ung thư có thể dẫnđến kích hoạt lại HBV còn lại trong trường hợp lâm sàng đặc biệt này Vì vậy

ở những người bệnh mắc các bệnh lý mà đang được điều trị bằng hóa chất,thuốc ức chế miễn dịch, thuốc sinh học….cần được khảo sát tải lượng HBVDNA huyết thanh, HBcAb dù có HBsAg âm tính, thêm vào đó chỉ định điềutrị thuốc kháng virus có thể được bắt đầu sớm để đề phòng viêm gan bùngphát [28]

1.4.2 HBV pgRNA – HBV RNA

RNA tiền gen (pgRNA) là sản phẩm phiên mã trực của cccDNA vòngkín cộng hóa của virus viêm gan B, đóng vai trò quan trọng trong quá trìnhkhuếch đại và sao chép bộ gen của virus PgRNA có thể bị enzym HBV DNApolymerase phiên mã ngược thành rcDNA để lại tiếp tục một chu kỳ sống mới

Do đó, việc ngăn chặn phiên mã ngược sẽ không làm ảnh hưởng đến việc tạo rapgRNA vào huyết thanh [29] Khác với HBsAg huyết thanh, pgRNA huyếtthanh khối lượng phân tử 3,5 kb chỉ được sản xuất từ cccDNA, do đó, nó có thểphản ánh chính xác tình trạng phiên mã của HBV cccDNA trong nhân tế bàogan [30]

HBV dưới dạng các hạt Dane xâm nhập vào tế bào gan bằng cách gắn

vào vỏ virion nhờ một số yếu tố đặc hiệu trên bề mặt tế bào gan Màng HBVhòa màng với màng tế bào gan để xâm nhập vào tế bào gan Vào tế bào gan,HBV trút bỏ lớp vỏ và vào nhân dưới dạng rcDNA, rcDNA này được chuyểnđổi thành cccDNA nhờ enzym DNA polymerase của virus CccDNA đóng vaitrò như một khuôn mẫu phiên mã cho tất cả các bản sao của virus, bao gồm3,5kb mRNA trước lõi (precore mRNA: pcRNA) và 3,5kb pgRNA, các 2,4kb

và 2,1kb mRNA bề mặt (surface mRNAs) và 0,7kb mRNA (8) PgRNA là

khuôn mẫu cho cả phiên mã ngược và dịch mã của enzym polymerase củavirus (Pol) và các protein lõi [31], [32]

Trước đây người ta cho rằng sự trưởng thành của các nucleocasid và sựđóng vỏ của virus đòi hỏi sự tổng hợp HBV DNA Tuy nhiên, một số nghiêncứu đã chỉ ra sự trưởng thành của nucleocapsid có thể không phụ thuộc vào

sự tổng hợp DNA Việc phát hiện các virion không chứa gen của HBV tronghuyết thanh bệnh nhân VGBMT ủng hộ cho sự tồn tại của con đường đóng góiHBV kèm pgRNA mà không cần thiết phải có sự tổng hợp DNA Các pgRNA

đã đóng gói được bao bọc trong bào tương tế bào gan và giải phóng ra huyếtthanh của bệnh nhân, HBV RNA phát hiện được trong huyết thanh chỉ có dạngpgRNA [33] Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng HBV RNA huyết thanh là pgRNAđược trình bày trong các hạt giống virion và pgRNA huyết thanh được tạo rabởi sự phiên mã của cccDNA bên trong tế bào gan [34] Về lý thuyết, sau khicác pgRNA được đóng gói và xâm nhập vào tế bào gan, chúng tham gia quátrình phiên mã ngược để tạo thành rcDNA và cccDNA và quá trình này cuốicùng dẫn đến tái nhiễm HBV Tuy nhiên, cần có nhiều bằng chứng mạnh mẽhơn để chứng minh khả năng lây nhiễm thông qua các hạt virion chỉ chứa HBVRNA [35]

HBV RNA không chỉ là khuôn mẫu cho cả phiên mã ngược DNA vàtổng hợp protein của virus, mà còn đóng một vai trò quan trọng trong cơ chếbệnh sinh liên quan đến các thể bệnh nhiễm HBV Gần đây, nhiều nghiêncứu cho thấy, bản thân HBV RNA góp phần trực tiếp và gián tiếp vào sự tiếntriển của VGBMT Bên cạnh vai trò trong diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV,HBV RNA còn có vai trò quan trọng trong quá trình theo dõi, điều trịVGBMT bằng các chất tương tự NA [35], [36] Việc điều trị này làm giảmvirus thông qua việc ức chế quá trình phiên mã ngược của HBV từ DNA sợi

âm thành sợi dương mà không tác động vào cccDNA, do đó cccDNA không

bị ảnh hưởng và hoạt động phiên mã vẫn tiếp tục và sản sinh ra HBV RNA

Vì vậy, ở một số bệnh nhân VGBMT, mặc dù HBV DNA được duy trì ở mứcthấp bằng thuốc kháng virus nhưng một số trường hợp vẫn tiến triển đến cácbiến chứng như xơ gan và HCC [37], [38].

1.4.3 cccDNA

- Con đường hình thành cccDNA: Các cơ chế phân tử xác định sự tồn

tại của HBV đã được nghiên cứu từ rất lâu tuy nhiên vẫn có nhiều điểm chưađược hiểu biết đầy đủ cccDNA trong nhân tế bào gan và sự bất lực của hệthống miễn dịch trong việc loại bỏ HBV đều được cho là những cơ chế chínhcủa tình trạng nhiễm HBV mạn tính Việc chữa khỏi HBV thực sự đòi hỏiphải làm sạch cccDNA khỏi tế bào gan bị nhiễm bệnh, hiểu rõ các cơ chế liênquan đến quá trình sinh học, điều hòa và ổn định cccDNA là điều bắt buộc đểđạt được mục tiêu loại trừ HBV

Sau khi xâm nhập vào tế bào gan, các rcDNA được giải phóng vàchuyển vào nhân tế bào gan qua phức bộ các lỗ ở màng nhân, từ đây rcDNAđược biến đổi thành cccDNA của HBV tạo thành một dạng genome DNA ổnđịnh rcDNA của HBV bên trong capsid có cấu trúc đặc biệt chứa bốn trình

tự riêng biệt: (1) POL của HBV polymerase liên kết cộng hóa trị với đầu 5′của chuỗi âm thông qua liên kết tyrosylphosphodiester; (2) một trình tự dựphòng đầu cuối (r) bao gồm một nắp DNA mười nucleotide (nt) trên chuỗiâm; (3) đoạn mồi RNA có đầu 5′; và (4) khoảng trống DNA sợi đơn (ssDNA)trên sợi dương [39] Bản chất không hoàn thiện của rcDNA khiến nó không

đủ khả năng đóng vai trò là khuôn mẫu để tạo ra tất cả các mRNA của virusHBV mà nó cần được chuyển đổi thành cccDNA để thiết lập sự lây nhiễm.Quá trình hình thành cccDNA từ rcDNA trải qua 4 giai đoạn: (1) Loại bỏpolymerase ở đầu 5’ của mạch DNA (-), (2) Cắt bỏ các đoạn khoảng 10 ntDNA lặp lại trên mạch DNA (-), (3) Loại bỏ đoạn RNA primer gắn ở đầu 5’của mạch DNA (+), (4) Hoàn chỉnh chiều dài của mạch DNA (+) và nối cácđầu mạch thẳng DNA thành mạch vòng và tạo ra cccDNA [3] Số lượng của

cccDNA có trong bất kỳ tế bào gan bị nhiễm nào đều biến thiên mạnh nhưngthường trong khoảng từ 10-50 bản sao trên mỗi tế bào gan [40] Cả sự tồntại kéo dài của cccDNA và việc hệ thống miễn dịch không có khả năngtạo ra các phản ứng miễn dịch hiệu quả chống lại HBV được coi lànguyên nhân gây ra sự thất bại trong việc đào thải virus và tái phát saukhi ngừng điều trị Vì vậy, để chữa khỏi nhiễm HBV mạn tính thực sự,

trình sinh học cccDNA thông qua tái nhập nucleocapsid thế hệ con được gọi

là khuếch đại nội bào, qua đó cccDNA được hình thành thông quanucleocapsid từ virion đến trong quá trình lây nhiễm

Ngoài ra cccDNA còn là khuôn mẫu phiên mã cho các RNA, nó là sảnphẩm cần thiết cho việc tạo ra các kháng nguyên virus và hỗ trợ cho sự nhânlên của virus, sau đó diễn ra trong tế bào chất sau khi sao chép ngược củapgRNA trong các nucleocapsid mới hình thành [42] Các nucleocapsid trưởngthành, có chứa rcDNA sau đó được bao bọc và giải phóng vào máu dưới dạngvirus hoàn chỉnh HBV dường như đã phát triển các chiến lược tinh vi cho phépvirus ngụy trang bộ gen của chúng dưới dạng minichromosome, chiếm quyềnđiều khiển bộ máy sao chép tế bào chủ cho nhu cầu sao chép của nó và chegiấu việc sản xuất virion mới bên trong nucleocapsid

Để tránh phải sinh thiết gan, hoạt động phiên mã của cccDNA kỳ vọng

có thể được xác định gián tiếp bằng cách đo nồng độ các thành phần khác củaHBV có lưu hành trong máu như HbsAg, HBV DNA, HBcrAg HBV RNAnhằm mục đích đánh giá tiến triển bệnh hoặc đánh giá đáp ứng điều trị Trong

số đó, HBV RNA đã trở thành ứng cử viên tiềm năng trong những nămqua Ngoài các hạt virus chứa HBV DNA, HBV RNA có trong huyết tươngcủa bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính rất có thể là RNA tiền gen được bao bọctrong các hạt virus pgRNA huyết thanh đã được chứng minh là phản ánh

lượng pgRNA có trong toàn bộ gan và do đó nồng độ của nó trong huyếtthanh có thể đóng vai trò là dấu hiệu thay thế để ước tính sự hiện diện củacccDNA [34].

- Thời gian bán hủy của cccDNA chưa được xác định rõ ràng Tuy nhiên,

các nghiên cứu in vitro khác biệt chỉ ra rằng minichromosome của virus rất ổnđịnh trong các tế bào gan không phân chia ở người, nơi nó dường như tồn tạitrong vòng đời của tế bào Do đó, việc loại bỏ cccDNA khỏi gan bị nhiễmbệnh là một thách thức lớn và dường như cần phải phá hủy tế bào gan bịnhiễm bệnh hoặc gây ra sự mất ổn định đáng kể của cccDNA [41]

Hình 1.4 Quá trình hình thành cccDNA từ rcDNA

* Nguồn: Theo Martinez M.G và cs (2021) [43]

phân tử cccDNA (1-17 phân tử/tế bào ở vịt) và lên tới 50 phân tử/tế bào ởchuột gỗ Ngược lại, các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng so với các virus liênquan đến HBV, sự hình thành cccDNA và khuếch đại cccDNA nội bào kémhiệu quả hơn trong tế bào người Một nghiên cứu thực nghiệm phức tạp liênquan đến các thí nghiệm chuyển gen giữa các loài đã cung cấp bằng chứngcho thấy HBV chuyển đổi rcDNA thành cccDNA kém hiệu quả hơn DHBVtrong cùng nền tế bào người cho thấy rằng không chỉ vật chủ mà cả bản thânvirus cũng kiểm soát động lực học cccDNA và nhóm cccDNA kích thước tếbào gan người bị nhiễm bệnh Điều này cũng có thể phần nào giải thích sốlượng bản sao cccDNA trên mỗi tế bào thường được phát hiện ở bệnh nhânthấp hơn so với chim chuột và vịt Tuy nhiên, việc định lượng chính xác sốlượng bản sao cccDNA trên mỗi tế bào là rất khó khăn vì có thể có nhữngbiến đổi từ tế bào này sang tế bào khác hoặc trong các giai đoạn lây nhiễmkhác nhau Các nghiên cứu trên chuột và vịt thường liên quan đến gan, nơinhiễm trùng không bị hạn chế và mọi tế bào gan đều bị nhiễm bệnh, trong khi

ở bệnh nhân có thể chỉ có một tỷ lệ tế bào gan bị nhiễm bệnh Tuy nhiên, trênchuột nhắt, tinh tinh ở gan bị nhiễm HBV với tình trạng nhiễm trùng khônghạn chế ở mọi tế bào gan, số lượng cccDNA trên mỗi tế bào vẫn ở mức thấp(chủ yếu chỉ từ 1 đến 3 bản sao/tế bào) ngay cả khi nhiễm trùng lâu dài [40]

- Vai trò chức năng của cccDNA

+ cccDNA là một trong những thành phần quan trọng nhất của HBV, cóthể tồn tại trong các tế bào gan bị nhiễm HBV và có vai trò làm khuôn mẫucho sự nhân bản của virus và đóng vai trò chính trong vòng đời của virus.cccDNA được tạo ra từ rcDNA trong nhân tế bào gan, dưới dạng nhiễm sắcthể nhỏ với khoảng 3 đến 50 bản sao trên mỗi tế bào bị nhiễm bệnh, số lượngnày giảm đi khi tế bào gan phân chia do sự phân bố cccDNA giữa các tế bàocon không đồng đều

+ Sự khuếch đại của cccDNA xảy ra trong quá trình quay vòng nội bào

có thể đóng vai trò quan trọng trong nhiễm HBV giai đoạn đầu

+ PgRNA được tạo ra từ cccDNA cũng có thể được phiên mã ngược đểtạo thành rcDNA để nhân bản virus Chức năng cccDNA được điều hòa mộtcách mạnh mẽ bởi protein HBx và việc ức chế protein HBx sẽ làm giảm khảnăng phiên mã của HBV

+ cccDNA cũng đóng một vai trò trong việc nhiễm HBV dai dẳng hoặctái phát viêm gan sau khi ngừng điều trị bằng các thuốc kháng virus vìcccDNA rất bền vững trong tế bào gan người không phân chia Hơn nữa,cccDNA có thể tồn tại trong toàn bộ vòng đời của tế bào gan, do đó nó đượccoi như là một ổ chứa virus dai dẳng

+ Sự dai dẳng kéo dài của HBV cccDNA trong gan cũng đóng một vaitrò chủ yếu trong nhiễm HBV tiềm ẩn (occult HBV infection: OBI), là tìnhtrạng thái HBV DNA có thể phát hiện được hoặc không thể phát hiện đượctrong huyết thanh của những người xét nghiệm âm tính với HBsAg Tronggiai đoạn nhiễm HBV đặc biệt này, cccDNA ở trạng thái nhân bản thấp, trạngthái tiềm ẩn này của HBV là kết quả của sự bất hoạt biểu sinh của cccDNA[40]

1.5 Các phương pháp định lượng HBV RNA và cccDNA

1.5.1 Một số phương pháp định lượng HBV RNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân VGBMT

Các kỹ thuật định lượng HBV RNA được sử dụng hiện nay cơ bản đều dựatrên nền tảng kỹ thuật Polymerase chain reaction – PCR và các kỹ thuật cải tiếndựa trên nguyên lý phản ứng PCR, kết hợp với phản ứng phiên mã ngược(Reverse Trancription – RT) để tổng hợp cDNA, như RT-PCR, RT-qPCR…

Nguyên lý kỹ thuật PCR truyền thống: là phản ứng chuỗi khuếch đại vật

chất di truyền DNA trong ống nghiệm (in-vitro) sử dụng hai mồi (primer)xuôi và ngược Thành phần phản ứng sẽ bao gồm các mồi, DNA khuôn,

enzyme Taq polymerase, dNTP và các chất tạo môi trường đệm kèm các chấtphụ gia khác Chu trình phản ứng sẽ bao gồm 03 bước biến tính, gắn mồi vàkéo dài, các chu kỳ này được lặp đi lặp lại trong hệ thống máy luân nhiệtchuyên dụng Phản ứng chuỗi này cho phép nhân số lượng đoạn gen quan tâmtheo hàm mũ luỹ thừa của 2 sau mỗi chu kỳ (từ một chuỗi thành một tỷ chuỗisau 30 chu kỳ) Sản phẩm của phản ứng PCR truyền thống được pháthiện/phân tích sau khi kết thúc toàn bộ phản ứng Sản phẩm của phản ứngPCR có thể dùng cho nhiều mục đích khác nhau như xác nhận sự có mặt củatác nhân gây bệnh, giải trình tự gen trực tiếp, tạo dòng phân tử [44]

Nguyên lý phương pháp realtime PCR định lượng: Realtime PCR định

lượng dựa trên việc đo tín hiệu quang liên tục sau mỗi chu kỳ trong quá trìnhdiễn biến của phản ứng PCR huỳnh quang, qua đó xác định được nồng độ củalượng DNA khuôn ban đầu Trong phản ứng PCR này, bên cạnh 2 mồi xuôi

và ngược để khuếch đại đoạn gen quan tâm như trong phương pháp PCRthông thường còn có thêm một mẫu dò đặc hiệu có khả năng phát ra tín hiệuhuỳnh quang khi xảy ra phản ứng PCR Mẫu dò đặc hiệu này được khoá đầu3’ để ngăn không cho nó kéo dài chuỗi trong phản ứng PCR Mặc dù, một đầucủa mẫu dò này được gắn với một phân tử phát ra tín hiệu huỳnh quang vớibước sóng xác định, nhưng trong điều kiện bình thường tín hiệu huỳnh quangnày bị hấp thụ hoàn toàn bởi một phân tử khác ở đầu còn lại của mẫu dò.Trong bước kéo dài chuỗi của phản ứng PCR, hoạt tính 5’-3’ exonuclease củaenzym Taq phân cắt làm tách xa 2 đầu của mẫu dò đặc hiệu này, nhờ đó màđầu FAM của mẫu dò này mới có thể phát ra tín hiệu huỳnh quang mà chúng

ta có thể đo lại liên tục sau mỗi chu kỳ phản ứng

Một số kỹ thuật cụ thể đã và đang được ứng dụng trên thế giới trong cáccông bố về HBV RNA, gồm có:

- Kỹ thuật PCR/Realtime PCR dựa trên nguyên lý 3’ RACE

- Kỹ thuật RT-qPCR

- Kỹ thuật Droplet digital PCR

- Một số kỹ thuật khác như QuantiGene, Kỹ thuật định lượng gián tiếp…[44], [31]

1.5.2 Một số phương pháp định lượng cccDNA trong tế bào gan

Sự tồn tại của cccDNA trong tế bào gan vẫn là trở ngại lớn đối với việcphát triển các chiến lược điều trị triệt để nhiễm HBV Bên cạnh đó, việc địnhlượng cccDNA hiện vẫn còn nhiều thách thức lớn: (1) cccDNA có trình tựDNA giống hệt với các dạng DNA HBV nội bào và ngoại bào khác, bao gồmrcDNA, double-stranded linear DNA (dslDNA) và single-stranded DNA(ssDNA) [45] Những dạng cấu trúc khác nhau của HBV DNA gây nên nguy

cơ cao cho kết quả xét nghiệm dương tính giả; (2) Trong một số trường hợp,chỉ có một số lượng nhỏ tế bào bị nhiễm bệnh (ví dụ: bệnh nhân âm tính vớiHBeAg) hoặc có thể do số lượng mô ít (ví dụ: sinh thiết bằng kim nhỏ),cccDNA có thể hiện diện ở mức rất thấp (<1 phân tử cccDNA trên 1000 tếbào), do vậy phương pháp xét nghiệm cần phải có độ nhạy cao [46]; (3) Do cấutrúc cộng hóa trị bền vững khép kín, cccDNA có thể chống lại sự biến tính donhiệt và do đó khó định lượng chính xác bằng phản ứng chuỗi polymerase(PCR) hoặc phương pháp lai [47] Số lượng quy trình định lượng cccDNAHBV và các phương pháp định lượng chúng trong tế bào gan được nghiên cứu

và công bố trên thế giới hiện vẫn còn hạn chế

1.5.2.1 Định lượng cccDNA trực tiếp

Nhiều kỹ thuật hiện nay đã được phát triển để phát hiện và định lượngcccDNA (bao gồm cả dạng không hoạt động phiên mã), làm cho xét nghiệm có

độ nhạy và độ chính xác cao hơn so với các phương pháp gián tiếp Tuy nhiên,những loại xét nghiệm này có tính xâm lấn cao (lấy mẫu mô gan) và tốn nhiềuthời gian hơn để tiến hành

Hình 1.5 Một số phương pháp định lượng trực tiếp cccDNA

* Nguồn: Theo Henrik Z và cs (2022) [48]

Một số phương pháp đã được sử dụng kết hợp để định lượng trực tiếpcccDNA (hình 1.5) Bước đầu tiên là làm giàu cccDNA HBV: tế bào được lygiải và loại bỏ protein, DNA được tách chiết theo phương pháp tủa hoặcphương pháp cột silica DNA được làm giàu sau đó có thể được định lượngbằng phương pháp lai Southern blot (phân tách DNA HBV dựa trên khả năng

di động khác nhau bằng điện di trên gel agarose, sau đó chuyển lên màngnitrocellulose và lai với đầu dò ssDNA) Ngoài ra, qPCR có thể được sử dụng

để định lượng cccDNA trực tiếp từ DNA tổng số, DNA được làm giàu hoặcDNA sau khi xử lý enzyme (plasmid-safe DNase - PSD, exonuclease T5,exonuclease I/III hoặc thông qua cinqPCR) cccDNA cũng có thể được pháthiện trực tiếp bằng phương pháp lai huỳnh quang in situ (FISH): các tế bàomẫu được cố định và gắn kết trước khi xử lý để lai DNA với đầu dò đánh dấuhuỳnh quang, quan sát dưới kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang

Bảng 1.1 Các phương pháp trực tiếp được sử dụng trong định lượng cccDNA.

Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Nguồn

FISH

Có thể quan sát vị trícủa cccDNA

- Tốn thời gian và phức tạp

- Không đặc hiệu với cccDNA (có thể phát hiện

[50],[51]

qPCR + PDS Loại bỏ hiệu quả

dslDNA

Không hiệu quả trongviệc loại bỏ rcDNA vàDNA mạch thẳng

- Có thể tiêu hóa quá mức

và mất cccDNA

- Thiếu DNA bộ genngười để sử dụng cho quátrình chuẩn hóa số bảncopy

- Giữ lại chuỗi rcDNA đãđóng

- Thiếu DNA bộ genngười để sử dụng cho quátrình chuẩn hóa số bảncopy

[51],[52]

cinpPCR Độ nhạy và độ đặc hiệu

cao

Có thể thêm các gentham chiếu tế bào trongcùng phản ứng duplexPCR

Giới hạn trong việc pháthiện chủng HBV trongphòng thí nghiệm

Kỹ thuật hiện đại, giáthành cao, khó ứng dụnglâm sàng

[54]

Làm giàu DNA: Một số kỹ thuật sẽ cần được sử dụng để làm giàu cccDNA của

HBV, qua đó cải thiện tính đặc hiệu khi sử dụng các phương pháp xét nghiệm