Nghiên cứu, tổng hợp, đánh giá tính chất nano vàng cấu trúc lưỡng tháp (gold nanobipyramids) và khảo sát hiệu quả kháng khuẩn của chúng nhằm hướng đến ứng dụng làm vật liệu kháng khuẩn

Tên đề tài: Nghiên cứu, tổng hợp, đánh giá tính chất nano vàng cấu trúc lưỡng tháp gold nanobipyramids và khảo sát hiệu quả kháng khuẩn của chúng nhằm hướng đến ứng dụng làm vật liệu

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ NANO – NANO VÀNG LƯỠNG THÁP

a Giới thiệu về kim loại vàng

Vàng (Au) là một kim loại hiếm thuộc nhóm XI, chu kỳ 6, của bảng tuần hoàn hóa học Là một kim loại quý đã được tìm thấy và đồng hành trong suốt thời gian lịch sử của loài người, dù ở thời điểm, nền văn hóa, quốc gia nào, vàng luôn chiếm một vị trí rất quan trọng đối với loài người Bởi vẻ đẹp, có thể gia công và không bị hoen ố hoặc ăn mòn, nên vàng đã luôn được sự chú ý và nằm một vị trí vô cùng quan trọng đối với con người [3] Theo các nghiên cứu vàng đã gắn bó với lịch sử con người từ ít nhất

4000 năm trước Công nguyên Ngoài ra vàng là một nguyên tố rất hiếm, theo tạp chí PNAS, để hình thành nên vàng trong tự nhiên cần một nguồn năng lượng rất lớn, nhiều giả thuyết cho rằng năng lượng đó có thể liên tưởng đến một vụ nổ trong siêu tân tinh khổng lồ hoặc những cú va chạm từ những ngôi sao có có kết cấu rất dày đặc

Hình 1.1: Những sản phẩm của vàng của các nền văn hóa [3]

❖ Tính chất đáng chú ý của vàng

• Tính chất vật lý

- Vàng là một kim loại quý hiếm, có thể dẫn nhiệt và điện tốt, là kim loại dễ uốn dẻo nhất trong các kim loại

- Là nguyên tố thứ 79 trong bảng tuần hoàn hóa học, có khối lượng nguyên tử

196,96 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 1945 o F, nhiệt độ sôi 5371 o F [4]

• Tính chất hóa học

- Vàng là nguyên tố trơ về mặt hóa học do hiếm trường hợp vàng phản ứng với nguyên tố khác, điều này giải thích cho việc vàng luôn giữ được độ sáng bóng bắt mắt mà không bị hoen ố hay ăn mòn Chính vì tính chất này cộng với độ dẫn điện và nhiệt tốt nên vàng thường được sử dụng trong các bảng mạch hoặc những linh kiện quan trọng để bảo vệ với các tác nhận bên ngoài

- Dạng oxy hóa phổ biến nhất của vàng là Au + (Aurous) và Au 3+ (Auric) [5] b Giới thiệu về nano vàng

❖ Lịch sử về nano vàng

Nano vàng, là một trong những kết quả nghiên cứu về công nghệ khoa học của vàng Được biết đến là những hạt vàng có kích thước nanomet Đã được ghi nhận lần đầu xuất hiện vào cuối thời Trung Cổ khi họ dùng nano vàng để nhuộm màu kính để trang trí [8] Ngày nay khi công nghệ khoa học phát triển, những tính năng mới của nano vàng được tìm ra có thể kể nhưng hiệu ứng plasmon bề mặt, tán xạ Raman (SER) [6]

Hình 1.2: Cửa sổ hoa hồng và Kính màu ghép ở cánh phía bắc Nhà thờ chính tòa Đức

Cho đến nay, các hạt nano có thể phân loại dựa trên hình dáng, kích thước của chúng Với mỗi hình thái, kích thước sẽ có tính plasmon về mặt tương ứng Bên cạnh đó tính tán xạ Raman sẽ phụ thuộc nhiều bởi hình dạng cục bộ của hạt nano vàng được tổng hợp ra [8]

Nhờ những tính chất ưu việt như vậy mà nano vàng được nghiên cứu và cho ra ứng dụng trong nhiều

1.1.2 Giới thiệu về nano vàng dị hướng

Hạt nano vàng dị hướng đã được các nhà khoa học chú ý trong hơn hai thập kỷ qua [9] Được phát hiện ra vào đầu thế kỷ XX, đã có nghiên cứu chỉ ra các hạt vàng dị hướng có thể được tổng hợp ra khi họ đang tổng hợp nano vàng dạng cầu và phát hiện ra có hình thái khác trong dung dịch Sau nhiều sự cố gắng hạt nano vàng dạng tấm, que được ghi nhận đã được tổng hợp ra vào năm 1951 đó là bước ngoặc cho việc nghiên cứu về nano vàng nói chung và nano vàng dị hướng nói riêng

Hình 1.3: Hình tháp khác nhau của nano vàng dị hướng [9]

1.1.3 Giới thiệu về nano vàng lưỡng tháp (GNBPs)

Nano vàng lưỡng tháp là nano vàng dạng 1D, có cấu trúc ngũ điện đôi (pentatwinned)

Hình 1.4: Hình dạng hạt GNBPs [10]

Là hình thái đặc biệt luôn được các nhà khoa học chú ý đến bên cạnh dạng sao, tam giác về ứng dụng mạnh mẽ về kháng khuẩn y học và cảm biến Thường được tổng hợp bằng phương pháp phát triển mầm trung gian Hiện tại ở trong nước có rất nhiều nghiên cứu về hình thái lưỡng tháp của nano vàng theo hai hướng chính gồm nghiên cứu về cách tổng hợp, kiểm soát sự phát triển của hạt vàng và ứng dụng của chúng trong y học [11]

❖ Tính chất quang của nano vàng

Theo bề dày lịch sử của nhân loại, nano vàng đã được biết đến và được đưa vào sử dụng Có thể thấy được những tấm kính màu được dùng để trang trí [12] trong những nhà thời châu Âu vào khoảng thế kỷ thứ 17 Ngày nay, nhờ vào tiến bộ trong khoa học công nghệ nói chung và khoa học và công nghệ nano nói riêng, người ta đã phát hiện ra nhiều đặc tính đặc biệt khác của vật liệu nano vàng khi ở kích thước nanomet (nm) Khi ở kích thước nano hạt vàng sẽ có nhiều mặc sắc khác nhau tùy thuộc vào kích thước và hình dạng, chuyển từ vàng sang đỏ hoặc tím nhạt như hình 1.5

Hình 1.5: Sự thay đổi màu sắc của hạt nano vàng theo kích thước và hình thái học khác nhau[14]

Sự chuyển màu này do hạt nano vàng không hấp thụ ánh sáng có bước sóng nằm trong vùng quang phổ như miếng vàng khối bình thường Lợi dụng đặc tính này của hạt nano vàng mà vào thế kỷ thứ IV sau Công Nguyên, người La Mã đã sử dụng hạt nano vàng để làm màu cho những tấm kính, về sau được người châu Âu sử dụng trong những tấm kính bên trong nhà thờ Hiện tượng đó được giải thích kỹ hơn bởi nhà khoa học người Đức, Gustav Mie, vào năm 1907, ông đã sử dụng phương trình sóng điện từ Maxwell, ông giải thích hiện tưởng thay đổi màu do chính hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt (surface plasmon resonance), SPR tạo ra [14]

Cụ thể hơn, do tác động của điện trường của ánh sáng vào điện tử tự do trên bề mặt của hạt nano Điện trường làm phân cực, tạo ra hai vùng điện tích: vùng mang điện tích dương và vùng mang điện tích âm Vì điện trường dao động khi tiếp xúc với hạt nano vàng dẫn theo đó làm cho sự phân cực bề mặt dao động theo Sự dao động đó được gọi là plasmon Khi đó đám mây điện tích trên bề mặt hạt sẽ giao động biến thiên lúc dương lúc âm tùy theo tần số và cường độ của điện trường Có thể thấy được dao động cộng hướng plasmon của nano vàng hấp thụ mạnh vùng ánh sáng khả kiến Điều này dẫn đến sự thay đổi màu sắc của dụng dịch nano vàng

Số lượng và vị trí của dải plasmon phụ thuộc chủ yếu vào kích thước và hình thái của hạt vàng nano Vì vậy đỉnh cộng hưởng có thể xuất hiện trong vùng khả kiến đến vùng hồng ngoại gần [15,16] Đối với vàng nano dạng cầu, hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt xảy ra ở vùng khả kiến tại bước sóng khoảng 500-550 nm Nếu kích thước hạt tăng lên thì cược đại hấp thụ ứng với SPR sẽ dịch chuyển về vùng có bước sóng dài Tuy nhiên hạt cầu lớn đến một kích thước giới hạn sẽ trở thành dạng khối và hiện tượng SPR sẽ biến mất

Hình 1.6: Hiện tượng SPR của GNBPs [17]

Bên cạnh đó, đối với hạt nano vàng lưỡng tháp, tính chất quang của hạt có đặc điểm đáng chú ý Đó là GNBPs có 2 bước sóng cộng hưởng plasmon như hình 1.5, một nằm trong vùng khả kiến từ 500-550 nm do cộng hưởng plasmon bề mặt theo đường kính của hạt, gọi là transverse plasmon resonance (TSPR); một nằm trong vùng hồng ngoại gần (NIR) từ 650 đến 1200nm do cộng hưởng plasmon bề mặt theo chiều dài của hạt, gọi là longitudinal plasmon resonance (LSPR) Nhờ tính chất đáng chú ý này mà GNBPs được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh học, cảm biến,….Tính chất quang này của GNBPs sẽ thay đổi theo tỷ lệ cạnh của GNBPs [18]

Tỷ lệ cạnh (A.R) được định nghĩa là tỷ số giữa chiều dài hạt trên đường kính hạt vàng lưỡng tháp (hoặc hạt có dạng que) Khi tỷ lệ cạnh tăng thì đỉnh hấp thu của GNBPs sẽ dời về phía NIR Tỷ lệ cạnh có thể được tính theo cộng thức Gan hoặc DDA [19]

❖ Tính kháng khuẩn của nano bạc và vàng

Kim loại đã được sử dụng trong cho vài trò kháng khuẩn từ rất lâu về trước Người Hy Lạp, Ai Cập cổ đã sử dụng bạc để khử trùng nước [22] Từ đó nhận loại đã biết được tính kháng khuẩn của kim loại Từ đó khi nghiên cứu các hạt nano kim loại tính kháng khuẩn của các hạt nano đã được chú ý đến, được hứa hẹn là phương pháp có thể thay thế thuốc kháng sinh Các loại nano kim loại có tính chất kháng khuẩn phổ biến bao gồm vàng, bạc, đồng, TiO2,CuO,… được biết đến với tính kháng khuẩn nhiều hơn là vàng và bạc Cơ chế kháng khuẩn đến nay vẫn chưa được giải thích rõ, tuy nhiên có một vài cơ chế chính sau [20]

Các hạt nano kim loại tiếp xúc thành tế bào, phá hủy màng tế bào vi khuẩn để chui vào trong tế bào vi khuẩn hoặc ngắn cản quá trình tổng hợp ATP, sau khi xâm nhập vào nhân sẽ phá hủy nhân bằng cách biến đổi DNA và các enzyme chống oxi hóa của vi khuẩn [21]

Phương pháp tổng hợp nano vàng

Quy trình tổng hợp nano vàng hiện nay có rất nhiều phương pháp tổng hợp ra nano vàng đẳng hướng Tuy nhiên, cho đến nay việc tổng hợp ra nano vàng dị hướng vẫn xoay quanh hai phương pháp chính đó là phương pháp mầm trung gian, phương pháp phát triển trực tiếp

Vì sự khó khăn trong việc phát triển hạt vàng thành kích thước, hình dạng mong muốn luôn là thử thách lớn cho đến ngày nay Trong nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc tổng hợp nano vàng theo phương pháp mầm trung gian

1.2.1 Phương pháp mầm trung gian

Mầm là một thuật ngữ phổ thông trong tinh thể học Phương pháp này đã được sử dụng từ những năm 1990, nhờ vào ưu điểm trong việc tổng hợp nano vàng với độ đồng đều cao Từ năm 2001, phương pháp này đã được phổ biến nhờ vào việc nhiều nhà khoa học đã tổng hợp nano vàng không chỉ thành công mà còn có thể kiểm soát hình dạng của hạt nano vàng, bạc Phương pháp này thông thường có hai giai đoạn: tạo các hạt mầm và phát triển tinh thể nano từ dung dịch nuôi chứa tiền chất, chất khử và chất định hướng hình dạng hay còn gọi là chất hoạt động bề mặt [28]

Phương pháp mầm trung gian là phương pháp hiệu quả, đơn giản để tạo ra hạt nano kim loại mà có thể kiểm soát hình dạng, kích thước của chúng

1.2.2 Chế tạo nano vàng lưỡng tháp bằng phương pháp mầm trung gian

Quy trình chế tạo vàng lưỡng tháp tương tự quy trình nano vàng dạng que bằng phương pháp mầm trung gian Gồm hai bước chính:

- Bước tạo mầm bằng việc sử dụng muối vàng HAuCl4, chất hoạt động bề mặt ở bài này sử dụng cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), chất khử mạnh tạo mầm là NaBH4

- Bước tạo dung dịch nuôi vẫn xoay quanh các chất muối vàng HAuCl4,chất hoạt động bề mặt bên cạnh đó còn có chất khử yếu Acid ascorbic, AgNO3, điều chỉnh độ pH ho phù hợp

Hiệu suất tạo hạt lưỡng tháp khoảng 30%, các hạt có cấu trúc trung bình khoảng 70nm chiều dài và 20nm đường kính, bước sóng LSPR khoảng 800nm

Về cơ chế của những yếu tố ảnh hưởng đến việc tổng hợp nano vàng Đầu tiên, ion Au 3+ được bao bọc bởi chất hoạt động bề mặt, tiếp theo Acid ascorbic (chất khử yếu) sẽ khử Au 3+ thành Au + Khi cho mầm vào dung dịch nuôi, ion Au + sẽ tương tác với mầm có cấu trúc ngũ diện đôi và lớn lên

Theo lý thuyết, năng lượng bề mặt (100) lớn hơn (111) Tuy nhiên, sự hấp phụ chọn lọc của chất hoạt động bề mặt và sự khử dưới thế của Ag đã làm giảm năng lượng bề mặt của (100) Vì vậy, mặt (111) sẽ có hoạt tính cao hơn (100), vì thế sự phát triển theo bật của mặt (111) sẽ nhanh hơn (100), dẫn đến sự hình thành hạt lưỡng tháp

Hình 1.10: Hạt GNBPs và mạng tinh thể của GNBPs [29]

Phương pháp đánh giá

1.3.1 Phương pháp quang phổ uv-vis

Máy quang phổ UV-Vis tên đầy đủ là máy quang phổ hấp thụ phân tử khả kiến UV-Vis Là thiết bị giúp phân li và ghi nhận lại kết quả phổ của một vùng phổ quang học nhất định Bằng cách chiếu một chùm dải tia của từng bước sóng xác định vào mẫu, mẫu sẽ bị kích thích và bức xạ ra từ đó máy sẽ ghi nhận kết quả bước xạ

Quang phổ UV-Vis của nano vàng lưỡng tháp là kết quả rất hữu ích để theo dõi các diễn biến hình thái và tính quang học vì vàng ở kích thước nano thể hiện sự cộng hưởng plasmon bề mặt phụ thuộc nhiều vào các hình thái và kích thước khác nhau sẽ cho ra kết quả khác nhau a Cấu tạo máy quang phổ UV-Vis

Hình 1.11: Sơ đồ hệ đo quang phổ UV-Vis: 1 Nguồn sáng; 2 Hệ tán sắc; 3 Buồng chứa mẫu; 4 Detector

13 b Nguyên lý hoạt động

Theo hình 1.11, nhìn chung thiết kế của hệ đo quang phổ UV-Vis có 4 bộ phận chính Chức năng lần lượt của từng bộ phận:

- Nguồn sáng: Có vai trò cung cấp nguồn sáng có dải bước sóng rộng, thường

- được sử dụng là đèn halogen và đèn deuterium

- Hệ tán sắc: Có nhiệm vụ chính tách chùm dải bước sóng của nguồn sáng thành những tia sáng đơn sặc

- Buồng chứa mẫu: Để ngăn không cho ánh sáng ngoài hệ tiếp xúc vào mẫu, đống thời tạo khoảng chống để tia sáng đơn sắc từ hệ tán sắc có thể đi qua mẫu

- Bộ dò (detector): Nhận kết quả, xử lý tín hiệu để đưa ra thông tin, thông tin sẽ đươc qua một bộ sử lý và hiển thị trên màn hình của thiết bị [30]

1.3.2 PHƯƠNG PHÁP NHIỄU XẠ TIA X (XRD)

Nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction, XRD) là một kỹ thuật phổ biến với kỹ thuật phân tích không phá hủy, và đồng thời cung cấp thông tin về cấu trúc, trạng thái, định hướng tinh thể, kích thước trung bình hạt và các thông số cấu trúc khác Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu vì bước sóng của tia X (từ 0,2 đến 10nm) khá tương đồng với khoảng cách giữa các nguyên tử của chất rắn kết tinh Trong XRD, một chùm tia X đi qua cấu trúc và chiếu vào bề mặt mẫu, mạng tinh thể của mẫu sẽ phân tán ngược chùm tia X này ngược lại gây ra hiện tượng giao thoa từ đó máy sẽ thu được phổ nhiễu xạ tia X

14 a Cấu tạo máy nhiễu xạ tia X

Hình 1.12: Cấu tạo máy nhiễu xạ tia X (XRD) Máy gồm có 3 bộ phận chính:

- Bộ thu tín hiệu b Nguyên lý hoạt động

- Nguồn phát tia X: Là nguồn phát tia X với nhiều công suất khác nhau từ 300W cho đến 4kW; Điện áp từ 30kV đến 80kV; Dòng điện 10mA đến 80mA, tùy vào mẫu sẽ tương ứng với một thông số của nguồn thích hợp

- Bộ giữ mẫu: Cố định 1 hoặc nhiều mẫu để tia X có thể chiếu qua

- Bộ thu tín hiệu: Nhận tín hiệu sau khi chiếu qua mẫu, xử lý và chuyển thông tin qua bộ sử lý và suất ra kết quả đo

1.3.3 PHƯƠNG PHÁP KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ QUÉT (SEM)

Kính hiển vi điện tử quét SEM có tên tiếng Anh là Scanning Electron Microscopy, được sử dụng một đầu dò là chùm tia điện tử (electron), quét trên bề mặt mẫu, xuống độ phân giải thang nm Nguyên lý hoạt động của SEM dựa trên sự tương tác của chùm tia điện tử với mẫu và tạo ra nhiều loại tín hiệu như điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược và tia X đặc trưng Những tín hiệu đó sẽ được thu thập và xử lý để có được thông tin về cấu hình, thành phần và các đặc tính vật lý khác của mẫu

Kính hiển vi điện tử quét SEM tạo hình ảnh có độ phóng đại lớn, độ phân giải cao Giúp ta có thể dễ dàng tính toán được kích thước, hình dạng,… của cấu trúc tinh thể của vật liệu một cách chính xác [31]

Hình 1.13: Sơ đồ kính viển vi điện tử quét (SEM) a Cấu tạo kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Những bộ phận chính của kính hiển vi điện tử quét (SEM) gồm có:

- Thấu kính điện tử

- Bộ giữ mẫu b Nguyên lý hoạt động

Các electron trong máy sẽ được chuyển đổi thành điện tử thứ cấp dưới dạng tín hiệu (những tín hiệu này gồm điển tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, photon,…) Thấu kính từ để tạo ra dòng nhỏ, hội từ đơn sắc, từ các điện tử thứ cấp Dòng này sẽ được hội tự vào mẫu [32]

Sau khi cô đặc dung dịch Nano vàng sau khi tổng hợp xong, dung dịch sẽ được cho lên một tấm đồng để đưa đi chụp SEM

Kết quả nhận được sẽ được tổng hợp những thông tin về kích thước của hạt, số lượng hạt trung bình trên một mẫu từ đó tính ra được hiệu xuất tổng hợp ra GNBPs Từ đó có thể đánh giá hiệu quả của khảo sát, và chuẩn bị cho những bước tiếp theo

1.3.4 PHƯƠNG PHÁP KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ TRUYỀN QUA (TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn, ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số [33]

Sau khi chọn ra được thông số tối ưu để tổng hợp ra được GNBPs Mẫu sẽ được tinh lọc và cô cặn giúp, sau đó được đưa đi đo TEM Kết quả nhận được sẽ củng cố kết luận của SEM, cho biết chính xác hơn về kích thước và hình thù của GNBPs

1.4 Ứng dụng của nano vàng lưỡng tháp Ở thời điểm thiện tại nano vàng đã có một thời gian dài nghiên cứu đồng nghĩa với đó là rất nhiều thành quả đã được đưa vào ứng dụng có thể kể đến:

- Điện tử: Khi công nghệ phát triển luôn đòi hỏi về độ tinh vi của những linh kiện thì nano vàng sẽ đóng một vai trò quan trọng để làm vật dẫn giữa các linh kiện cộng với ưu điểm kích thước nano là thành phần không thể thiếu trong thiết kế chip

- Áp dụng liệu pháp quang động trong y học: Nhờ vào đặc tính hạt vàng sẽ tạo ra nhiệt khi bị kích thích bởi ánh sáng hồng ngoại sẽ tiêu diệu các tế bào khối u bên trong cơ thể

THỰC NGHIỆM

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của GNBPs

2.2.1 Hóa chất và dụng cụ

- Môi trường Mueller Hinton agar (MH)

- Môi trường Eosin Methylene Blue (EMB)

2.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng các chủng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Đầu tiên ta chuẩn bị môi trường TSA để nuôi cấy vi khuẩn và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 o C Sau đó pha loãng dịch khuẩn sau khi nuôi cấy đến khi đạt nồng độ 10 6 CFU/ml Lấy 100 àl dịch khuẩn sau pha loóng được trải đều mỗi đĩa 6 giếng Bổ sung vào mỗi giếng thạch 100 àl dung dịch nano vàng lưỡng thỏp (Gold NBPs) ở nụ̀ng độ tương ứng (1,26; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 ppm) Có nước cất làm đối chứng âm Dung dịch kháng sinh làm đối chứng dương Ampicillin Sau đó tiếp tục ủ ở nhiệt độ

37 o C trong 24 giờ Quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn Ghi nhận kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn là đường thẳng đi qua tâm giếng và giao với mép vòng Chọn nồng độ nano vàng lưỡng tháp kháng lại các chủng vi khuẩn [26]

2.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng các chủng vi khuẩn theo thời gian

Chuẩn bị vi khuẩn bằng việc nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường TSA và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 o C Dịch khuẩn được pha loãng đến khi đạt nồng độ 10 6 CFU/ml Nano vàng lưỡng tháp được thêm vào môi trường nuôi cấy thích hợp để đạt được nồng độ khảo sát (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 ppm) Sau đó, vi khuẩn được cho vào những ống nghiệm chữa sẵn 2ml môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ 10 6 CFU/ml Các ống nghiệm được ủ ở nhiệt độ 37 o C trong khoảng thời gian 0, 10, 15 phút

Sau khi đạt đến mốc thời gian khảo sỏt, lấy 100 àl dung dịch từ ống nghiệm được

21 dung để nuôi cấy trải trên môi trường thạch thích hợp để xác định mật độ vi khuẩn Cuối cùng ghi nhận kết quả [27]

Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng để xác định khả năng diệt khuẩn của dung dịch nano vàng lưỡng tháp (Gold NBPs) ở nồng độ 6,25; 12,5; 25; 50; 100 ppm sau khi cho tiếp xúc trực tiếp với dịch vi khuẩn ở mật độ 10 6 CFU/ml.Các thời gian khảo sát tiếp xúc trực tiếp giữa dịch vi khuẩn E coli, S aureus với nano vàng lưỡng tháp là 0 phỳt, 5 phỳt,15 phỳt Sau cỏc mốc thời gian trờn, hỳt 100 àl hỗn hợp dung dịch sau tiếp xúc đó cấy trải lên đĩa thạch dinh dưỡng TSA đối với vi khuẩn S aureus, E coli Tiến hành ủ các đĩa trong tủ ủ vi sinh vật ở 37⁰C Sau thời gian 24 giờ ủ, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính hiệu suất diệt khuẩn theo công thức tính như sau: Công thức tính số tế bào vi khuẩn có trong 1 ml mẫu:

𝐕.𝐃𝐟 (2.1) Trong đó: N: số tế bào vi sinh vật trong 1g (CFU/ml);

A: số khuẩn lạc đếm được trong mỗi đĩa petri ở độ pha loãng nhất định;

Df : độ pha loãng mẫu;

V: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (V = 0,1 ml)

Hiệu suất diệt khuẩn (H %) của dung dịch nano vàng lưỡng tháp ở các nồng độ khác nhau sau thời gian khảo sát với dịch vi khuẩn Công thức tính hiệu suất diệt khuẩn (H %)

𝐀 x100 (2.2) Trong đó: H (%): Hiệu suất diệt khuẩn ở mốc thời gian xác định; A (CFU/ml): số tế bào vi khuẩn trong 1ml ở nghiệm thức đối chứng; B (CFU/ml): số tế bào vi khuẩn trong 1 ml ở nghiệm thức thử nghiệm.