Luận Án Tiến Sĩ Nông Nghiệp Nghiên Cứu Chuyển Gen Theo Hướng Nâng Cao Năng Suất Hạt Ở Cây Đậu Tương (Glycine Max (L.) Merr.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - án tiế Tài liệu rẻ ận Lu NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG n NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG sĩ (GLYCINE MAX (L.) Merr.) ới m nh ất LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH ận Lu án NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG tiế Tài liệu rẻ NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Mã số : Công nghệ sinh học sĩ Chuyên ngành n (GLYCINE MAX (L.) Merr.) : 9420201 ới m Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: ất nh LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP PGS.TS Khuất Hữu Trung GS.TS Ngơ Xn Bình Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu cá nhân tôi, số liệu kết luận án trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Tôi xin cam đoan r ng, gi p đ , hợp tác cho việc thực luận án đ cảm n thông tin tr ch d n luận án đ u ch d n r ngu n gốc Lu án tiế Tài liệu rẻ ận Nghiên cứu sinh n Nguyễn Trịnh Hoàng Anh sĩ ới m ất nh ii LỜI CẢM ƠN ể hoàn thành luận án này, đ nhận quan tâm, gi p đ nhiệt tình Th y, giáo, tập thể, cá nhân, gia đình c ng b n b đ ng nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết n sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung, GS.TS Ngô Xuân Bình - th y giáo hướng d n khoa học, đ tận tình gi p đ , truy n tải kiến thức kinh nghiệm suốt trình thực đ tài hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm n Ban l nh đ o Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Lu Nam; tập thể cán Ban Thông tin t o; tập thể L nh đ o cán viên ận chức Trung Tâm chuyển giao công nghệ khuyến nông đ giúp đ , hỗ trợ tận tình cho tơi trình học tập thực đ tài án Tôi xin chân thành cảm n Khoa i học Nông Lâm, ông nghệ thực i học Thái Nguyên n i triển khai thực tiế Tài liệu rẻ phẩm, Trường ông nghệ sinh học đ tài, đ t o u kiện thuận lợi v tài liệu khoa học, c sở vật chất, thiết n bị phục vụ nghiên cứu để tơi hồn thành luận án ông nghệ sinh học sĩ đến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa ặc biệt, xin bày tỏ biết n ông nghệ thực phẩm đ chia sẻ kiến thức kinh nghiệm chun mơn để tơi hồn thành nghiên ới m cứu thời gian sớm uối cùng, xin chân thành cảm n b n b , đ ng nghiệp c nh quan người thân gia đình ln hết lịng động viên, kh ch lệ gi p đ suốt q trình thực hồn thành cơng trình trình nghiên cứu ất Tơi xin chân thành cảm n! H N i, ng y th ng năm 2023 Nghiên cứu sinh Nguyễn Trịnh Hoàng Anh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG xi Lu DANH MỤC HÌNH xiv ận MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài án Mục tiêu nghiên cứu tiế Tài liệu rẻ 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể n Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án sĩ 3.1 Ý nghĩa khoa học m 3.2 Ý nghĩa thực tiễn ới Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu nh 4.2 Phạm vi, thời gian nghiên cứu ất Những đóng góp luận án CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 1.2 Tổng quan nghiên cứu chuyển gen đậu tƣơng giới 1.2.1 Nghiên cứu tái sinh in vitro đậu tương iv 1.2.1.1 Vật liệu sử dụng t i sinh in vitro đậu tương 1.2.1.2 Phát sinh phôi soma tái sinh in vitro đậu tương 10 1.2.1.3 Ph t sinh quan thông qua mô sẹo t i sinh in vitro đậu tương 12 1.2.1.4 Ph t sinh quan trực tiếp từ mẫu nuôi (khơng qua việc hình th nh mơ sẹo) 13 Lu 1.2.1.5 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy v điều kiện nuôi cấy đến khả ận t i sinh đậu tương 14 1.2.2 Kết nghiên cứu chuyển gen đậu tương giới 15 án 1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 15 tiế Tài liệu rẻ 1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen súng bắn gen 18 1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen xung điện 19 n sĩ 1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn 19 m 1.2.3 Các tính trạng cải thiện thông qua chuyển gen đậu tương 20 ới 1.2.3.1 Đặc tính kh ng thuốc diệt cỏ 21 1.2.3.2 Đặc tính kh ng trùng 21 nh 1.2.3.3 Chuyển gen nâng cao h m lượng dầu 25 ất 1.2.3.4 Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh 25 1.2.3.5 Chuyển gen nâng cao suất 26 1.2.3.6 Chuyển gen tạo trồng đa tính trạng 26 1.2.4 Thành tựu trồng chuyển gen giới 27 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu nƣớc 31 1.3.1 Chọn tạo giống thông qua tuyển chọn vật liệu nhập nội địa phương 31 1.3.2 Chọn tạo giống đậu tương lai hữu tính 32 v 1.3.3 Chọn tạo giống phương pháp xử lý đột biến 32 1.3.4 Nghiên cứu chuyển gen đậu tương Việt Nam 33 1.3.4.1 Nghiên cứu t i sinh in vitro phục vụ chuyển gen đậu tương 33 1.3.4.2 Nghiên cứu chuyển gen đậu tương 34 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu tính trạng gen có khả nâng cao suất hạt đậu tƣơng 35 1.4.1 Nghiên cứu vai trò gen kìm hãm già hóa 35 Lu 1.4.2 Nghiên cứu gen điều khiển trình tăng cường kích thước hạt ận đậu tương 38 1.5 Một số nhận xét rút từ tổng quan tài liệu 40 án Tài liệu rẻ CHƢƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN tiế CỨU 41 2.1 Vật liệu nghiên cứu 41 n 2.1.1 Vật liệu thực vật 41 sĩ 2.1.2 Vật di truyền 42 m 2.1.3 Hóa chất, thiết bị sử dụng 42 ới 2.2 Nội dung nghiên cứu 43 nh 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 44 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 44 ất 2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả tái sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro khả tiếp nhận gen số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen 44 2.4.1.1 Nghiên cứu khả t i sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro c c giống đậu tương 44 2.4.1.2 Đ nh gi khả tiếp nhận gen c c giống đậu tương 48 vi 2.4.2 Nội dung 2: Tách dòng thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa Ore1 đánh giá biểu Arabidopsis 50 2.4.2.1 Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóa Atore1 50 2.4.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm gi hóa l Atore1 51 2.4.2.3 Đ nh gi khả biểu gen kìm hãm gi hóa l Atore1 mơ hình Arabidopsis thaliana 52 Lu 2.4.3 Nội dung 3: Chuyển gen kìm hãm già hóa Ore1 vào đậu tương đánh giá dòng chuyển gen 55 ận 2.4.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 v o đậu tương thông qua vi khuẩn án Agrobacterium tumefaciens 55 tiế Tài liệu rẻ 2.4.3.2 Chọn lọc v đ nh gi biểu gen Atore1 đậu tương chuyển gen 57 n 2.4.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 v đ nh sĩ gi biểu gen 58 m 2.4.3.4 Đ nh gi khả sinh trưởng, ph t triển c c dòng đậu tương ới chuyển gen 59 nh 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 60 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61 ất 3.1 Kết nghiên cứu khả tái sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro khả tiếp nhận gen số giống đậu tƣơng để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen 61 3.1.1 Kết nghiên cứu khả tái sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro giống đậu tương 61 3.1.1.1 Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng 61 3.1.1.2 Ảnh hưởng BAP đến khả t i sinh chồi từ nốt l mầm 62 vii 3.1.1.3 Ảnh hưởng kinetin đến khả t i sinh chồi từ nốt mầm 68 3.1.1.4 Kết ảnh hưởng h m lượng GA3 đến khả kéo d i chồi m t số giống đậu tương 76 3.1.1.5 T i sinh rễ tạo ho n chỉnh 77 3.1.2 Đánh giá khả tiếp nhận gen giống đậu tương 79 3.2 Kết tách dòng thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa Ore1 đánh giá biểu Arabidopsis 86 Lu 3.2.1 Tách dòng gen kìm hãm già hóa Atore1 86 ận 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa Atore1 90 3.2.2.1 Gắn gen Atore1 vào vector chuyển gen 90 án Tài liệu rẻ 3.2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn E.coli v Agrobacterium tumefaciens mang gen tiế Atore1 92 n 3.2.3 Đánh giá khả biểu gen kìm hãm già hóa Atore1 sĩ mơ hình Arabidopsis thaliana 92 m 3.2.3.1 Chuyển gen Atore1 v o mơ hình Arabidopsis 92 ới 3.2.3.2 Chọn lọc Arabidopsis chuyển gen T1 mang gen Atore1 93 nh 3.2.3.3 Đ nh gi Arabidopsis chuyển gen Atore1 PCR hệ T1 94 3.2.3.4 Đ nh gi biểu gen thơng qua hình th i Arabidopsis ất chuyển gen Atore1 hệ T1 95 3.2.3.5 Đ nh gi Arabidopsis chuyển gen Atore1 PCR hệ T2 96 3.2.3.6 Đ nh gi biểu gen thơng qua hình th i l Arabidopsis chuyển gen Atore1 hệ T2 97 3.3 Kết chuyển gen kìm hãm già hóa Atore1 vào đậu tƣơng đánh giá dòng chuyển gen 100 viii 3.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 100 3.3.1.1 Nuôi cấy hạt đậu tương nảy mầm chuẩn bị để biến nạp gen 100 3.3.1.2 Tạo dung dịch vi khuẩn biến nạp gen Atore1 101 3.3.1.3 Ảnh hưởng nồng đ vi khuẩn đến khả biến nạp 102 3.3.1.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả biến nạp gen 105 Lu 3.3.1.5 Ảnh hưởng nồng đ Acetosyringon (AS) đến khả biến nạp ận gen 106 3.3.1.6 Ảnh hưởng kh ng sinh chọn lọc đến khả chọn lọc sau án chuyển gen đậu tương 108 tiế Tài liệu rẻ 3.3.1.7 T i sinh v chọn lọc chồi chuyển gen Atore1 môi trường kháng sinh 110 n 3.3.1.8 Tạo đậu tương chuyển gen Atore1 ho n chỉnh 111 sĩ 3.3.1.9 Kết đưa đậu tương chuyển gen trồng vườn thí nghiệm 112 m ới 3.3.2 Chọn lọc đánh giá biểu gen Atore1 đậu tương chuyển gen 113 nh 3.3.2.1 Chọn lọc v đ nh gi biểu gen Atore1 đậu tương ất chuyển gen hệ T0 113 3.3.2.2 Chọn lọc v đ nh gi biểu gen Atore1 đậu tương chuyển gen hệ hệ T1 116 3.3.2.3 Chọn lọc đậu tương chuyển gen kìm hãm gi hóa l Atore1 hệ T2 121 3.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 đánh giá biểu gen 126 3.3.3.1 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 126