(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương (glycine max (l ) merr )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) Merr.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - NGUYỄN TRỊNH HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THEO HƢỚNG NÂNG CAO NĂNG SUẤT HẠT Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) Merr.) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9420 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Khuất Hữu Trung GS.TS Ngơ Xn Bình Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu cá nhân tôi, số liệu kết luận án trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị chưa công bố cơng trình nghiên cứu Tơi xin cam đoan r ng, gi p đ , hợp tác cho việc thực luận án đ cảm n thông tin tr ch d n luận án đ u ch d n r ngu n gốc Nghiên cứu sinh Nguyễn Trịnh Hoàng Anh ii LỜI CẢM ƠN ể hoàn thành luận án này, đ nhận quan tâm, gi p đ Th y, nhiệt tình giáo, tập thể, cá nhân, gia đình c ng b n b đ ng nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết n sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung, GS.TS Ngô Xuân Bình - th y giáo hướng d n khoa học, đ tận tình gi p đ , truy n tải kiến thức kinh nghiệm suốt trình thực đ tài hồn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm n Ban l nh đ o Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; tập thể cán Ban Thông tin t o; tập thể L nh đ o cán viên chức Trung Tâm chuyển giao công nghệ khuyến nông đ giúp đ , hỗ trợ tận tình cho tơi q trình học tập thực đ tài Tơi xin chân thành cảm phẩm, Trường đ tài, đ n Khoa ông nghệ sinh học ông nghệ thực i học Nông Lâm,i học Thái Nguyên n i triển khai thực t o u kiện thuận lợi v tài liệu khoa học, c sở vật chất, thiết bị phục vụ nghiên cứu để tơi hồn thành luận án ặc biệt, xin bày tỏ biết n đến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa ông nghệ sinh học ông nghệ thực phẩm đ chia sẻ kiến thức kinh nghiệm chun mơn để tơi hồn thành nghiên cứu thời gian sớm uối cùng, xin chân thành cảm n b n b , đ ng nghiệp c quan người thân gia đình ln hết lịng động viên, kh ch lệ gi p đ suốt trình thực hồn thành cơng trình trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm n! H N i, ng y th ng năm 2023 Nghiên cứu sinh Nguyễn Trịnh Hoàng Anh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG .xi DANH MỤC HÌNH xiv MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án .3 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn .4 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu .4 4.2 Phạm vi, thời gian nghiên cứu .4 Những đóng góp luận án CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 1.2 Tổng quan nghiên cứu chuyển gen đậu tƣơng giới 1.2.1 Nghiên cứu tái sinh in vitro đậu tương iv 1.2.1.1 Vật liệu sử dụng t i sinh in vitro đậu tương 1.2.1.2 Phát sinh phôi soma tái sinh in vitro đậu tương 10 1.2.1.3 Ph t sinh quan thông qua mô sẹo t i sinh in vitro đậu tương 12 1.2.1.4 Ph t sinh quan trực tiếp từ mẫu nuôi (không qua việc hình th nh mơ sẹo) 13 1.2.1.5 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy v điều kiện nuôi cấy đến khả t i sinh đậu tương 14 1.2.2 Kết nghiên cứu chuyển gen đậu tương giới 15 1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 15 1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen súng bắn gen .18 1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen xung điện 19 1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn .19 1.2.3 Các tính trạng cải thiện thơng qua chuyển gen đậu tương 20 1.2.3.1 Đặc tính kh ng thuốc diệt cỏ 21 1.2.3.2 Đặc tính kh ng trùng 21 1.2.3.3 Chuyển gen nâng cao h m lượng dầu .25 1.2.3.4 Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiện ngoại cảnh 25 1.2.3.5 Chuyển gen nâng cao suất 26 1.2.3.6 Chuyển gen tạo trồng đa tính trạng 26 1.2.4 Thành tựu trồng chuyển gen giới .27 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu nƣớc 31 1.3.1 Chọn tạo giống thông qua tuyển chọn vật liệu nhập nội địa phương 31 1.3.2 Chọn tạo giống đậu tương lai hữu tính 32 v 1.3.3 Chọn tạo giống phương pháp xử lý đột biến 32 1.3.4 Nghiên cứu chuyển gen đậu tương Việt Nam 33 1.3.4.1 Nghiên cứu t i sinh in vitro phục vụ chuyển gen đậu tương 33 1.3.4.2 Nghiên cứu chuyển gen đậu tương 34 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu tính trạng gen có khả nâng cao suất hạt đậu tƣơng 35 1.4.1 Nghiên cứu vai trị gen kìm hãm già hóa .35 1.4.2 Nghiên cứu gen điều khiển q trình tăng cường kích thước hạt đậu tương .38 1.5 Một số nhận xét rút từ tổng quan tài liệu 40 CHƢƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Vật liệu nghiên cứu 41 2.1.1 Vật liệu thực vật 41 2.1.2 Vật di truyền .42 2.1.3 Hóa chất, thiết bị sử dụng 42 2.2 Nội dung nghiên cứu 43 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu .44 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 44 2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả tái sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro khả tiếp nhận gen số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen 44 2.4.1.1 Nghiên cứu khả t i sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro c c giống đậu tương 44 2.4.1.2 Đ nh gi khả tiếp nhận gen c c giống đậu tương 48 vi 2.4.2 Nội dung 2: Tách dòng thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa Ore1 đánh giá biểu Arabidopsis .50 2.4.2.1 Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóa Atore1 50 2.4.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm gi hóa l Atore1 51 2.4.2.3 Đ nh gi khả biểu gen kìm hãm gi hóa l Atore1 mơ hình Arabidopsis thaliana 52 2.4.3 Nội dung 3: Chuyển gen kìm hãm già hóa Ore1 vào đậu tương đánh giá dòng chuyển gen 55 2.4.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 v o đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 55 2.4.3.2 Chọn lọc v đ nh gi biểu gen Atore1 đậu tương chuyển gen .57 2.4.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 v đ nh gi biểu gen 58 2.4.3.4 Đ nh gi khả sinh trưởng, ph t triển c c dòng đậu tương chuyển gen .59 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 60 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Kết nghiên cứu khả tái sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro khả tiếp nhận gen số giống đậu tƣơng để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen 61 3.1.1 Kết nghiên cứu khả tái sinh kỹ thuật nuôi cấy in vitro giống đậu tương 61 3.1.1.1 Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng 61 3.1.1.2 Ảnh hưởng BAP đến khả t i sinh chồi từ nốt l mầm 62 vii 3.1.1.3 Ảnh hưởng kinetin đến khả t i sinh chồi từ nốt mầm 68 3.1.1.4 Kết ảnh hưởng h m lượng GA3 đến khả kéo d i chồi m t số giống đậu tương 76 3.1.1.5 T i sinh rễ tạo ho n chỉnh 77 3.1.2 Đánh giá khả tiếp nhận gen giống đậu tương 79 3.2 Kết tách dòng thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa Ore1 đánh giá biểu Arabidopsis 86 3.2.1 Tách dịng gen kìm hãm già hóa Atore1 86 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa Atore1 90 3.2.2.1 Gắn gen Atore1 vào vector chuyển gen 90 3.2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn E.coli v Agrobacterium tumefaciens mang gen Atore1 92 3.2.3 Đánh giá khả biểu gen kìm hãm già hóa Atore1 mơ hình Arabidopsis thaliana .92 3.2.3.1 Chuyển gen Atore1 v o mơ hình Arabidopsis 92 3.2.3.2 Chọn lọc Arabidopsis chuyển gen T1 mang gen Atore1 93 3.2.3.3 Đ nh gi Arabidopsis chuyển gen Atore1 PCR hệ T 94 3.2.3.4 Đ nh gi biểu gen thơng qua hình th i Arabidopsis 95 chuyển gen Atore1 hệ T1 3.2.3.5 Đ nh gi Arabidopsis chuyển gen Atore1 PCR hệ T 96 3.2.3.6 Đ nh gi biểu gen thơng qua hình th i l Arabidopsis 97 chuyển gen Atore1 hệ T2 3.3 Kết chuyển gen kìm hãm già hóa Atore1 vào đậu tƣơng đánh giá dòng chuyển gen 100 viii 3.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 100 3.3.1.1 Nuôi cấy hạt đậu tương nảy mầm chuẩn bị để biến nạp gen 100 3.3.1.2 Tạo dung dịch vi khuẩn biến nạp gen Atore1 101 3.3.1.3 Ảnh hưởng nồng đ vi khuẩn đến khả biến nạp .102 3.3.1.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả biến nạp gen 105 3.3.1.5 Ảnh hưởng nồng đ Acetosyringon (AS) đến khả biến nạp gen .106 3.3.1.6 Ảnh hưởng kh ng sinh chọn lọc đến khả chọn lọc sau chuyển gen đậu tương 108 3.3.1.7 T i sinh v chọn lọc chồi chuyển gen Atore1 môi trường kháng sinh 110 3.3.1.8 Tạo đậu tương chuyển gen Atore1 ho n chỉnh 111 3.3.1.9 Kết đưa đậu tương chuyển gen trồng vườn thí nghiệm 112 3.3.2 Chọn lọc đánh giá biểu gen Atore1 đậu tương chuyển gen 113 3.3.2.1 Chọn lọc v đ nh gi biểu gen Atore1 đậu tương .113 chuyển gen hệ T0 3.3.2.2 Chọn lọc v đ nh gi biểu gen Atore1 đậu tương 116 chuyển gen hệ hệ T1 3.3.2.3 Chọn lọc đậu tương chuyển gen kìm hãm gi hóa l Atore1 121 hệ T2 3.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 đánh giá biểu gen 126 3.3.3.1 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 126