Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Duy Kháng PGS.TS Nguyễn Hữu Ninh HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm2018 Tác giả luận án Nguyễn Giang Thu i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thiện luận án, cho phép tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS.TS Đinh Duy Kháng – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam PGS.TS Nguyễn Hữu Ninh – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, PGS.TS Đồng Văn Quyền – Phó Viện trưởng, Trưởng phịng Vi sinh vật học phân tử, TS Nguyễn Cường – Trưởng phòng Tin sinh học- Viện Công nghệ sinh học, anh chị em phòng giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Văn Sáng, TS Nguyễn Văn Hảo, TS Đặng Tố Vân Cầm, anh chị em cán - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản cung cấp mẫu tôm cho nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo sau đại học tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận án Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Giang Thu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TƠM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NI TÔM SÚ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Giới thiệu tôm sú 1.1.2 Tình hình ni tơm sú giới Việt Nam 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN VÀ HỆ GEN PHIÊN MÃ CỦA TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI 11 1.2.1 Cơng trình nghiên cứu liên quan tới hệ gen phiên mã tôm 12 1.2.2 Xác định gen liên quan tới hệ miễn dịch tôm thơng qua việc phân tích hệ phiên mã 13 1.2.3 Xác định gen có liên quan tới khả sinh sản tôm 14 1.2.4 Xác định gen có liên quan tới giới tính tôm sú 14 1.2.5 Nghiên cứu giải trình tự hệ gen hệ phiên mã tơm sú Thái Lan 15 1.2.6 Nghiên cứu lập đồ gen tôm sú Đài Loan 16 1.2.7 Nghiên cứu giải mã hệ gen hệ phiên mã tôm sú Việt Nam 16 1.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP VÀ MICROSATELLITE 18 1.3.1 Chỉ thị phân tử SNP 18 1.3.2 Chỉ thị phân tử Microsatellite 21 1.4 TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ GEN DỰ ĐOÁN LIÊN QUAN Ở ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC 25 1.4.1 Tính trạng tăng trưởng 25 1.4.2 Các nhóm gen ứng viên liên quan đến tính trạng tăng trưởng cơng bố nhóm giáp xác 26 1.4.3 Các nhóm gen ứng viên trình lột xác 32 1.4.4 Các gen phân giải phát triển hệ trình lột xác 35 1.5 SƠ LƯỢC CÁC PHẦN MỀM LẮP RÁP SỬ DỤNG CHO CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI 38 1.5.1 Phân loại phần mềm lắp ráp 39 1.5.2 Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen 39 1.5.3 Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen phiên mã 41 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 44 2.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 44 2.3 ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 44 2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 47 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.5.1 Phương pháp tách riêng rẽ mô nghiên cứu 48 2.5.2 Tách chiết RNA tổng số từ mô tôm Trizol 48 2.5.3 Tách tinh mRNA 49 2.5.4 Thiết lập thư viện cDNA 50 2.5.5 Phương pháp tiền xử lý liệu 50 2.5.6 Phương pháp lắp ráp de novo hệ gen phiên mã 51 2.5.7 Phương pháp đánh giá chất lượng lắp ráp hệ phiên mã 51 2.5.8 Phương pháp giải chức unigene hệ gen phiên mã ………………………………………………………………………53 2.5.9 Phương pháp phân tích biểu hệ gen phiên mã 54 2.5.10 Xác định SNP ngân hàng unigene 54 2.5.11 Xác định microsatellite ngân hàng unigene 55 2.5.12 Phát SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng 55 2.5.13 Phương pháp định lượng Real-time PCR (qPCR) 56 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 3.1 XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) 57 3.1.1 Sàng lọc mẫu tôm bệnh 57 3.1.2 Chuẩn bị thư viện cDNA 58 3.1.3 Giải trình tự, đánh giá tiền xử lý liệu đọc trình tự thơ 66 3.1.4 Lắp ráp giải chức hệgen phiên mã 70 3.1.5 Xây dựng sở liệu hệ gen phiên mã (transcriptome) tôm sú (Penaeus monodon) 78 3.2 SÀNG LỌC CÁC GEN GIẢ ĐỊNH (UNIGENE) LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TƠM SÚ (PENAEUS MONODON) 85 3.2.1 Sàng lọc unigene 85 3.2.2 Phân tích biểu khác hệ gen phiên mã tôm sú (Penaeus monodon) 90 3.3 SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TƠM SÚ (PENAEUS MONODON)TỪ DỮ LIỆU HỆ PHIÊN MÃ 96 3.4 SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG TỪ NHĨM TƠM SÚ GIA HĨA TĂNG TRƯỞNG NHANH VÀ TĂNG TRƯỞNG CHẬM 99 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101 KẾT LUẬN 101 KIẾN NGHỊ 102 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 PHỤ LỤC 123 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt 3’UTR 3’ untranslated region (trình tự khơng dịch mã đầu 3’) cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung tổng hợp từ mRNA) Contig Contiguous nucleotide sequence DNA deoxyribonucleic acid EC Enzyme commission IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (virus gây gệnh hoại tử quan tạo máu quan tạo biểu mô) MBV Monodon baculovirus (virus gây bệnh còi) Nr-NCBI Non redundant protein database-National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) RNA Ribonucleic acid RNA-seq RNA sequencing (giải trình tự RNA) TSV Taura syndrome virus (virus gây hội chứng Taura) WSSV White spot syndrome virus (virus gây hội chứng đốm trắng) YHV Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng) QC Quality score (Điểm chất lượng đánh giá trình tự) i DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu tôm sú thu từ vùng biển khác Nghệ An-Hà Tĩnh 45 Bảng 2.2: Thông tin 10 mẫu tôm tăng trưởng nhanh 10 mẫu tôm tăng trưởng chậm sử dụng phân tích hệ gen phiên mã (transcriptome) 46 Bảng 2.3: Cặp mồi sử dụng cho qPCR 56 Bảng 3.1: Nồng độ mRNA mô nghiên cứu 61 Bảng 3.2: Nồng độ DNA sử dụng cho giải trình tự transcriptome hệ thống Illumina MiSeq platform 62 Bảng 3.3: Mô tả liệu sau giải trình tự 66 Bảng 3.4: Thống kê số lượng, độ dài trình tự đọc theo mơ 68 Bảng 3.5: Thống kê kết lắp ráp hệ gen phiên mã tinh từ mô tôm sú Penaeus monodon 70 Bảng 3.6: Thống kê kết giải chức tôm sú P.monodon 72 Bảng 3.7: Thống kê kết microsatellite hệ phiên mã tôm sú P.monodon 81 Bảng 3.8: Thống kê miền lặp microsatellite hệ phiên mã tôm sú 82 Bảng 3.9: Thống kê unigene liên quan đến tăng trưởng hệ gen phiên mã tôm sú 87 Bảng 3.10: Sự biểu hệ phiên mã tôm sú 91 Bảng 3.11: Thống kê số SNPs giải số gen liên quan đến tính trạng tăng trưởng 97 ii Weber, J L C Wong (1993) "Mutation of human short tandem repeats." Hum Mol Genet 2: 1123-1128 Williams, J S., J P Der, C W de Pamphilis T H Kao (2014) "Transcriptome analysis reveals the same 17 S-Locus F-Box genes in two haplotypes of the self-incompatibility locus of Petunia inflate." Plant Cell Rep.26(7): 2873–2888 Wilson, K., V Cahill, E Ballment J Benzie (2000) "The Complete Sequence of the Mitochondrial Genome of the Crustacean Penaeus monodon: Are Malacostracan Crustaceans more closely related to Insects than to Branchiopods?" Molecular Biology and Evolution17(6): 863-874 Wilson, K., Y T Li, V Whan, S A Lehnert, K Byrne S S Moore (2002) "Genetic mapping of the black tiger shrimp Penaeus monodon with amplified fragment length polymorphims." Aquaculture204: 297309 Xu, D L., H Long, J J Liang, J Zhang, X Chen J L Li (2012) "De novo assembly and characterization of the root transcriptome of Aegilops variabilis during an interaction with the cereal cyst nematode." BMC Genomics13 Xue, S., Y Liu, Y Zhang, Y Sun, X Geng J Sun (2013) "Sequencing and De Novo Analysis of the Hemocytes Transcriptome in Litopenaeus vannamei Response to White Spot Syndrome Virus Infection." PLoS ONE8(10): e76718 Yamano, K T Unuma (2006) "Expressed sequence tags from eyestalk of kuruma prawn, Marsupenaeus Physiol143A: 155-161 121 japonicus." Comp Biochem Ye, C., Z S Ma, C H Cannon, M Pop D W Yu (2012) "Exploiting sparseness in de novo genome assembly." BMC bioinformatics 13 Ye, J., L Fang, H Zheng, Y Zhang, J Chen, Z Zhang, J Wang, S Li, R Li, L Bolund J Wang (2006) "WEGO: a web tool for plotting GO annotations." Nucleic Acids Research34(suppl 2): 293–297 You, E M., K F Liu, S W Huang, M Chen, M L Groumellec, S J Fann H T Yu (2010) "Construction of integrated genetic linkage maps of the tiger shrimp (Penaeus monodon) using microsatellite and AFLP markers." Animal Genetics41(4): 365–376 Yu, M., Y Cheng M F Rothschild (2006) "SNP analysis of Molting related genes in Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei shrimp (Brief report)." ARCHIV FUR TIERZUCHT49(4): 411 Zerbino, D R E Birney (2008) "Velvet: Algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs." Genome research18(5): 821829 Zhang, W., J Chen, Y Yang, Y Tang J Shang (2011) "A Practical Comparison of De Novo Genome Assembly Software Tools for NextGeneration Sequencing Technologies." PLoS ONE 6(3) Zhao, Z G., L L Tan, C Y Dang, H Zhang, Q B Wu L Z An (2012) "Deep-sequencing transcriptome analysis of chilling tolerance mechanisms of a subnival alpine plant, Chorispora bungeana." BMC Plant Biol.12 122 PHỤ LỤC PHỤ LỤC1:TINH SẠCH VÀ CẮT mRNA Chuẩn bị: a Làm ấm hóa chất sau nhiệt độ phòng Bead Binding Buffer (BBB): hạt bead gắn mồi poli T Bead Washing Buffer (BWB) dung dịch rủa hạt bead Elution Buffer (ELB): dung dich RNA Fragment, Prime, Finish Mix (FPF): Mix chứa enzyme cắt RNA Resuspension Buffer (RSB): dung dịch hòa RNA RNA Purification Beads (RPB): hạt bead tinh RNA b Thiết lập trương trình sau cho máy PCR • 65 ° C phút, ° C ∞ - đặt tên mRNA Denaturation • 80 ° C phút, 25 ° C ∞ - đặt tên mRNA Elution • 94 ° C phút, ° C ∞ - đặt tên Elution - Frag – Prime 1.1 Chuẩn bị RBP: 1.1.1 Đánh dấu ống PCR với ký tự RBP 1.1.2 Trong ống PCR, Pha loãng RNA tổng số với nước tinh khiết Rnase/Dnase free cho thể tích cuối 50 ul 1.1.3 Lắc ống RNA Purification Beads kỹ để đảm bảo hạt bead phân bố với mật độ đồng 1.1.4 Cho 50 ul RNA Purification Beads vao ống RBP, nhẹ nhàng pipet lên xuống lần để trộn 1.1.5 Đóng nắp ống PCR 1.2 Ủ RBP lần 1: 1.2.1 Đặt ống RBP vào máy PCR, chạy chương trình mRNA Denaturation, để biến tính hồn tồn RNA, tạo điều kiện thuận lợi cho đuôi poliA sợi đơn mRNA bám vào poliT hạt bead 1.2.2 Ngay nhiệt độ đạt đến ° C, lấy ống RBP khỏi máy, để nhiệt độ phòng phút sợi mRNA bám vào hạt bead 1.3 Rửa ống RBP: 1.3.1 Mở nắp ống PCR 1.3.2 Đặt ống RBP giá từ nhiệt độ phòng phút để hạt bead gắn mRNA lắng xuống đáy ống 123 1.3.3 Hút bỏ tất dịch dịch 1.3.4 Lấy ống RBP khỏi giá từ 1.3.5 Rửa hạt cách Bổ sung vào 200 ml Bead Washing Buffer vào ống RBP để loại bỏ RNA không bám vào hạt bead Nhẹ nhàng pipet toàn khối lượng lên xuống lần để trộn 1.3.6 Đặt ống RBP giá từ nhiệt độ phòng phút 1.3.7 Ly tâm Elution Buffer với vân tốc 600 xg giây 1.3.8 Hút bỏ tất dịch ống RBP Dịch chứa phần lớn RNA ribosome RNA mRNA 1.3.9 Lấy ống RBP khỏi giá từ 1.3.10 Cho 50 ul Elution Buffer vào ống RBP Nhẹ nhàng pipet lên xuống lần để trộn 1.3.11 Đóng nắp ống RBP 1.3.12 Đưa Elution Buffer vào giữ lạnh ° C 1.4 Ủ RBP lần 2: 1.4.1 Đưa ống RBP vào máy PCR, chọn chương trình mRNA Elution để thơi mRNA số rRNA bám không đặc hiệu với hạt bead 1.4.2 nhiệt độ đạt đến 25 ° C, lấy ống RBP khỏi máy PCR 1.4.3 Mở nắp để ống RBP nhiệt độ phòng 1.5 Chuẩn bị ống RFP: 1.5.1 Ly tâm Bead Binding Buffer với vận tốc 600 xg giây 1.5.2 Cho 50 ul Bead Binding Buffer vào ống RBP Buffer có tác tác dụng lựa chọn mRNA có khả bám đặc hiệu vào hat bead 1.5.3 Tiến hành bước Mix sau: 1.5.4 1.5.5 1.5.6 1.5.7 1.5.8 Đóng nắp ống RBP Lắc ống RBP với vận tốc 1.000 rpm phút Ủ ống RBP nhiệt độ phòng phút Bảo quản ống Bead Binding Buffer ° đến ° C Đặt ống RBP giá từ nhiệt độ phòng phút Mở nắp ống RBP Hút bỏ tất dịch ống RBP 1.5.9 Nhấc ống RBP khỏi giá từ 124 1.5.10 Rửa hạt bead cách Bổ sung vào 200 ul Bead Washing Buffer vào ống RBP 1.5.11 Tiến hành bước Mix sau: Đóng nắp ống RBP Lắc ống RBP với vận tốc 1.000 rpm phút 1.5.12 Ủ ống RBP nhiệt độ phòng phút 1.5.13 Giữ lạnh ống Bead Binding Buffer ° đến ° C 1.5.14 Đặt ống RBP giá từ nhiệt độ phòng phút 1.5.15 Mở nắp ống RBP 1.5.16 Hút bỏ tất dịch ống RBP Dịch chứa toàn rRNA cịn lại tạp chất khác khơng bám vào hạt bead 1.5.17 Nhấc ống RBP khỏi giá từ 1.5.18 Cho 19,5 ul Fragment, Prime, Finish Mix vào ống RBP Elute, Prime, Fragment Mix chứa hexamers ngẫu nhiên cho mồi RT có cơng dụng giống hóa chất tổng hợp cDNA 1.5.19 Tiến hành bước Mix sau: Đóng nắp ống RBP Lắc ống RBP với vận tốc 1.000 rpm phút 1.5.20 Mở nắp ống RBP 1.5.21 Chuyển toàn chất ống RBP sang ống đánh dấu RFP 1.5.22 Đóng nắp ống RFP 1.5.23 Bảo quản ống Fragment, Prime, Finish Mix tube nhiệt độ -15 đến 250C 1.6 Ủ ống RFP: 1.6.1 Đặt ống RFP vào máy PCR, chọn chạy chương trình Elution - Frag – Prime 1.6.2 Lấy ống RFP khỏi máy PCR máy đạt đến ° C 1.6.3 Ly tâm nhanh khoảng 10 giây 1.6.4 Chuyển sang bước 125 PHỤ LỤC 2:CHUẨN BỊ THƯ VIỆN cDNA I Sinh tổng hợp sợi cDNA Chuẩn bị: a Các hóa chất cần thiết: First Strand Synthesis Act D Mix (FSA): mastermix sinh tổng hợp cDNA: đưa nhiệt độ phòng EpiScript™ Reverse Transcriptase: enzyme sinh tổng hợp cDNA Lên chương trình cho máy RCP đặt tên Synthesize 1st Strand sau: Chọn chương trình pre-heat lid option đặt 100°C 25°C: 10 phút 37°C: 20 phút 85°C: phút Hold: 4°C b Chuẩn bị ống PCR mới, đánh dấu CDP 1.1 Chuẩn bị ống CDP 1.1.1 Đặt ống RFP giá từ nhiệt độ phòng phút 1.1.2 Vẫn giữ nguyên ống giá từ, mở nắp, hút 17 ul dịch từ ống RFP sang ống CDP tương ứng 1.1.3 Ly tâm ống First Strand Synthesis Act D Mix với vận tốc 600 xg giây 1.1.4 Bổ sung 50 ul EpiScript™ Reverse Transcriptase vào ống First Strand Synthesis Act D Mix, hút nhà pipet lên xuống nhẹ nhàng, ly tâm khoảng giây Nếu không sử dụng hết ống First Strand Synthesis Act D Mix, bổ sung enzyme EpiScript™ Reverse Transcriptase với First Strand Synthesis Act D Mix theo tỷ lệ enzyme: Mix 1:9, đánh dấu vào ống ống First Strand Synthesis Act D Mix bổ sung enzyme 1.1.5 Cho ul Mastermix First Strand Synthesis Act D Mix bổ sung EpiScript™ Reverse Transcriptase vào ống CDP, 1.1.6 Tiến hành bước mix sau: Đóng nắp ống CDP Lắc ống CDP với vân tốc 1.600 rpm 20 giây 1.1.7 Bảo quản ống First Strand Synthesis Act D Mix nhiệt độ -15 đến 20oC sau sử dụng 126 1.2 Ủ ống CDP: 1.2.1 Đưa ống CDP vào máy PCR, chạy chương trình Synthesize 1st Strand 1.2.2 Lấy ống CDP khỏi máy máy đạt đến nhiệt độ 40C 1.2.3 Tiến hành bước sinh tổng hợp mạch cDNA thứ II Sinh tổng hợp mạch cDNA thứ 2: a Các hóa chất cần thiết: End Repair Control(CTE): đưa nhiệt độ phòng Buffer (RSB): đưa nhiệt độ phòng Second Strand Marking Master Mix (SMM): đưa nhiệt độ phòng AMPure XP beads: để nhiệt độ phịng 30 phút b Thiết lập máy PCR nhiệt độ 160C 2.1 Bổ sung SMM 2.1.1 Mở nắp ống CDP 2.1.2 Thực cách sau: a Nếu sử dụng hóa chất nội kiểm: - Ly tâm ống End Repair Control vận tốc 600 xg giây - Pha loãng ống End Repair Control 1/50 Resuspension Buffer (Ví dụ, ul End Repair Control + 98 ul Resuspension Buffer) trước sử dụng loại bỏ ống End Repair Control sau sử dụng - Bổ sung ul End Repair Control pha loãng vào ống CDP b Nếu khơng sử dụng thuốc thử kiểm sốt in-line, Bổ sung ul Resuspension Buffer cho ống CDP 2.1.3 Ly tâm Second Strand Marking Master Mix với vận tốc 600 xg giây 2.1.4 Bổ sung 20 ul Second Strand Marking Master Mix vào ống CDP 2.1.5 Tiến hành bước mix sau: Đóng nắp ống CDP Lắc ống CDP vận tốc 1.600 rpm 20 giây 2.1.6 bảo quản ống Second Strand Marking Master Mix đến -15 ° đến -25 ° C sau sử dụng 2.2 Ủ ống CDP lần 2: 2.2.1 Đặt ống CDP vào máy PCR, ủ 16 ° C 127 2.2.2 Lấy ống CDP khỏi máy PCR, mở nắp làm ấm đến nhiệt độ phòng 2.3 Tinh ống CDP: 2.3.1 Lắc lọ AMPure XP mật độ hạt bead đồng đều, sau Bổ sung 90 ul Hạt XP AMPure vào ống 1.5 ml đánh dấu CCP 2.3.2 Hút tất dung dịch từ ống CDP sang ống CCP có sẵn AMPure XP bead 2.3.3 Tiến hành bước mix sau: 2.3.4 2.3.5 2.3.6 2.3.7 Đóng nắp ống CCP Lắc ống CCP vận tốc 1.800 rpm vòng phút Ủ ống CCP nhiệt độ phòng 15 phút Đặt ống CCP giá từ nhiệt độ phòng, phút Mở nắp ống CCP Hút bỏ 135 ul dịch từ ống CCP 2.3.8 Với ống CCP giá từ, Bổ sung 200 ul EtOH 80% (mới pha) vào ống 2.3.9 Ủ ống CCP nhiệt độ phịng 30 giây, sau hút bỏ toàn dịch ống 2.3.10 Lặp lại bước 3.37 3.38 lần với EtOH 80% (mới pha) 2.3.11 Để ống giá từ, nhiệt độ phịng 15 phút để khơ 2.3.12 Lấy ống khỏi giá từ 2.3.13 Ly tâm Resuspension Buffer với vận tốc 600 xg giây 2.3.14 Bổ sung 17,5 ul Resuspension Buffer vào ống CCP 2.3.15 Tiến hành bước mix sau: Đóng nắp ống CCP Lắc ống CCP với vận tốc 1.800 rpm vòng phút 2.3.16 Ly tâm ống CCP vận tốc 280 xg phút 2.3.17 Ủ ống CCP nhiệt độ phòng phút 2.3.18 Đặt ống CCP giá từ nhiệt độ phòng phút 2.3.19 Mở nắp ống CCP 2.3.20 Chuyển 15 ul dịch (ds cDNA) từ ống CCP sang ống 1.5 ml đánh dấu ALP III Gắn Adenyle vào đầu 3’ Chuẩn bị: 128 a Các hóa chất cần thiết: A-Tailing Control(CTA): đưa nhiệt độ phòng A-Tailing Mix (ATL): đưa nhiệt độ phòng Resuspension Buffer (RSB):đưa nhiệt độ phòng b Thiết lập máy PCR đặt tên ATAIL70 theo chu trình nhiệt sau: 37°C: 30 phút 70°C: phút Hold at 4°C 3.1 Bổ sung ATL: 3.1.1 Thực cách điều sau: a Nếu sử dụng hóa chất nội kiểm: -Ly tâm ống A-Tailing Control vận tốc 600 xg giây - Pha loãng A-Tailing Control 1/100 Resuspension Buffer (Ví dụ, ul A-Tailing Control + 99 ul Resuspension Buffer) trước sử dụng loại bỏ A-Tailing Control pha loãng sau sử dụng -Bổ sung 2,5 ul A-Tailing Control pha loãng vào ống ALP b Nếu không sử dụng thuốc thử kiểm soát in-line, Bổ sung 2,5 ul Resuspension Buffer vào ống ALP 3.1.2 Bổ sung 12,5 ul A-Tailing Mix vào ống ALP nhẹ nhàng pipet lên xuống 10 lần để trộn 3.1.3 Đóng nắp ống ALP 3.2 Ủ ống ALP lần 1: 3.2.1 Đặt ống ALP vào máy PCR, chạy chương trình ATAIL70 3.2.2 Lấy ống ALP khỏi máy PCR nhiệt độ đạt đến ° C 3.2.3 Tiến hành bước nối Adapters IV.Nối Addapter: Chuẩn bị: Ligation Control(CTL): đưa nhiệt độ phòng RNA Adapter Indices : đưa nhiệt độ phòng, chọn lựa index theo bảng hướng dẫn trang 16 Ligation Mix (LIG): để nhiệt độ âm sử dụng Resuspension Buffer (RSB): đưa nhiệt độ phòng Stop Ligation Buffer (STL): đưa nhiệt độ phòng AMPure XP beads: để nhiệt độ phòng vòng 30 phút 129 Freshly Prepared 80% Ethanol(EtOH) 4.1 Bổ sung LIG: 4.1.1 Ly tâm ống adapter RNA làm ấm nhiệt độ phòng với vận tốc 600 xg giây 4.1.2 Ly tâm Ligation Control (nếu sử dụng Ligation Control) ống Stop Ligation Buffer vận tốc 600 xg giây Lưu ý: lấy cácốngMixThắtở -15°đến -25° Clưu trữ ngaytrước sử dụng Mở nắp ốngALP 4.1.3 Thực mộttrong hai cách sau: a Nếu sử dụnghóa chất nội kiểm: - PhalỗngLigation Control1/100trongResuspensionBuffer(Ví dụ,1 ulThắtControl +99ulResuspensionBuffer)trước sử dụng loại bỏ cácLigation Controlđã pha loãng sau sử dụng - Bổ sung2,5 ulLigation Control pha loãngvào ống ALP b Nếu khơng sử dụnghóa chất nội kiểm: Bổ sung 2,5ulResuspension Buffer vào ốngALP 4.1.4 Bổ sung 2,5 ul Ligation Mix vào ống ALP 4.1.5 Bảo quản ống Ligation Mix -15°đến -25° Cngaysau sử dụng 4.1.6 Bổ sung 2,5ul RNAAdapter Index thích hợpvào ống ALP 4.1.7 Tiến hành bước mix sau: Đóng nắp ống ALP Lắccác ốngALPtại vận tốc 1.800 rpmtrong vòng phút 4.1.8 Ly tâm ống ALP vận tốc 280 xg phút 4.2 Ủ ống ALP lần 2: 4.2.1 Đưa ống ALP vào máy PCR, ủ 30 ° C 10 phút 4.2.2 lấy ống ALP từ máy PCR 4.3 Bổ sung STL: 4.3.1 Mở nắp ống ALP 4.3.2 Bổ sung ul Stop Ligation Buffer vào ống ALP để vô hiệu ligation mix, 4.3.3 Tiến hành bước mix sau: Đóng nắp ống ALP Lắc ống ALP vận tốc 1.800 rpm vòng phút 130 4.3.4 Ly tâm ống ALP vận tốc 280 xg phút 4.4 Tinh ống ALP: 4.4.1 Mở nắp ống ALP 4.4.2 Lắc AMPure XP bead mật độ hạt đồng đều, sau Bổ sung 42 ul hỗn hợp XP AMPure bead vào ống ALP 4.4.3 Tiến hành bước mix sau: Đóng nắp ống ALP Lắc ống ALP vận tốc 1.800 rpm vòng phút 4.4.4 4.4.5 4.4.6 4.4.7 4.4.8 Ủ ống ALP nhiệt độ phòng 15 phút Đặt ống ALP giá từ nhiệt độ phòng phút Mở nắp ống ALP Hút bỏ 79,5 ul dịch từ ống ALP Với ống ALP giữ nguyên giá từ, Bổ sung 200 ul EtOH 80% (mới pha) vào ống 4.4.9 Ủ ống ALP nhiệt độ phòng 30 giây, sau loại bỏ tất dịch từ ống 4.4.10 Lặp lại bước 5.4.8 5.4.9 lần cho tổng cộng 80% rửa EtOH 4.4.11 Trong giữ ống ALP giá từ, để ống tự khơ nhiệt độ phịng 15 phút hịa tancặn với 52,5 ul Buffer Resuspension 4.4.12 Tiến hành bước Mix sau: Đóng nắp ống ALP Lắc ống ALP vận tốc 1.800 rpm vòng phút 4.4.13 Ủ ống ALP nhiệt độ phòng phút 4.4.14 Đặt ống ALP giá từ nhiệt độ phòng phút 4.4.15 Mở nắp ống ALP 4.4.16 Chuyển 50 ul dịch từ ống ALP sang ống 1.5 ml tương ứng đánh dấu CAP 4.4.17 Vortex AMPure XP bead mật độ hạt đồng đều, sau Bổ sung 50 ul hỗn hợp hạt XP AMPure vào ống CAP 4.4.18 Tiến hành bước mix sau: Đóng nắp ống CAP Lắc ống CAP vận tốc 1.800 rpm vòng phút 4.4.19 Ủ ống CAP nhiệt độ phòng 15 phút 131 4.4.20 Đặt ống CAP giá từ nhiệt độ phòng phút 4.4.21 mở nắp ống CAP 4.4.22 Hút bỏ 95 ul dịch từ ống CAP 4.4.23 Với ống CAP giá từ, Bổ sung 200 ml EtOH 80% (mới pha) vào ống 4.4.24 Ủ ống CAP nhiệt độ phòng 30 giây, sau hút bỏ tất dịch từ ống 4.4.25 Lặp lại bước 5.4.23 5.4.241 lần 4.4.26 Với ống CAP giữ nguyên giá từ, để khơng khí mẫu khơ nhiệt độ phịngtrong 15 phút 4.4.27 Hòa tan cặn ống với 22,5 ul ResuspensionBuffer 4.4.28 Hòa trộn kỹ sau: đóng nắp ống CAP Lắc ống CAP vận tốc 1.800 rpm vòng phút 4.4.29 Ủ ống CAP nhiệt độ phòng phút 4.4.30 Đặt ống CAP giá từ nhiệt độ phòng phút 4.4.31 Mở nắp ống CAP 4.4.32 Chuyển 20 ul dịch từ ống CAP sang ống PCR tương ứng đánh dấu PCR V Làm giàu đoạn DNA Chuẩn bị: Các hóa chất cần chuẩn bị: PCR Master Mix (PMM): đưa nhiệt độ phòng, ly tâm nhẹ 600xg giây trước sử dụng PCR Primer Cocktail (PPC): đưa nhiệt độ phòng, ly tâm nhẹ 600xg giây trước sử dụng Resuspension Buffer (RSB): đưa nhiệt độ phòng AMPure XP beads: để nhiệt độ phòng 30 phút trước đưa vào sử dụng Freshly Prepared 80% Ethanol(EtOH) Chuẩn bị máy PCR đặt tên chương trình PCR với điều kiện phản ứng sau: • 98°C: 30 giây • 15 chu kỳ: 98°C: 10 giây 132 60°C: 30 giây 72°C: 30 giây • 72°C: phút • 4°C: ∞ 5.1 Chuẩn bị ống PCR: 5.1.1 Bổ sung ulPCR Primer Cocktail vào ốngPCR 5.1.2 Bổ sung25ul PCR Master Mixvào ốngPCR nhẹ nhàngpipetlên xuống10 lần đểtrộn 5.1.3 Đóng nắp ống PCR 5.2 Chạy PCR: Đặt ống PCR vào máy PCR, chạy chương trình PCR chuẩn bị sẵn 5.3 Tinh sản phẩm PCR: 5.3.1 Mở nắp ốngPCR 5.3.2 VortexAMPureXPbeadcho đến mật độ hạt ống đồng 5.3.3 Bổ sung 50ulhạtAMPureXP bead vàocác ốngPCRcóchứa50ulsản phẩmPCR nhẹ nhàngpipet lên xuốngvà10lần đểtrộn 5.3.4 Ủcác ốngPCRở nhiệt độ phòngtrong 15 phút 5.3.5 Đặtcác ốngPCRtrên giá từở nhiệt độ phòngtrong phút 5.3.6 Hút bỏ95ul dịchnổitừ ốngPCR 5.3.7 Với ốngPCRgiữ nguyêntrên giátừ, Bổ sung200mlEtOH80% (mới pha) vào ống PCR 5.3.8 Ủcác ốngPCRở nhiệt độ phòngtrong 30 giây, sau hút bỏ tồn dịch nổicủa ống 5.3.9 Lặp lại bước7 8một lần 5.3.10 Với ốngPCRgiữ ngun trêngiá từ, đểkhơng khímẫukhơtại nhiệt độphịngtrong 15 phútvà sau đólấy ống khỏi giá từ 5.3.11 Hòa tancặn đáy ống với32,5ul ResuspensionBuffer nhẹ nhàngpipet lên xuống10lần đểtrộn 5.3.12 Ủcác ốngPCRở nhiệt độ phòngtrong phút 5.3.13 Đặtcác ốngPCRtrên giá từở nhiệt độ phòngtrong phút 5.3.14 Chuyển30uldịch nổitừ ốngPCR sang ống0,3mlPCRmớiđược đánh dấuTSP1 133 PHỤ LỤC 3:XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ RNA BẰNG MÁY BIOANALYZER Chuẩn bị RNA ladder Spin Ladder xuống hút ống Eff RNase-free nhỏ Biến tính nhiệt độ 70o C phút Chuyển lên đá lạnh Thêm 90 µl nước RNase-free mix Chuẩn bị lượng vừa đủ sử dụng ống Eff 0,5 ml sử dụng ngày Bảo quản -70o C Sau biến tính, bảo quản lạnh sử dụng khơng phải biến tính lại Trước sử dụng cắm Ladder lên đá khơ Chuẩn bị Gel Hút 550 µl RNA gel matrix (lọ màu đỏ) vào spin filter Ly tâm với tốc độ 1500g 10 phút nhiệt độ phòng Hút 65 µl dịch ống ly tâm vào ống Eff 0,5 ml Sử dụng gel lọc vòng tuần Bảo quản 4o C Chuẩn bị Gel-Dye Mix Để RNA dye (lọ màu xanh dương) nhiệt độ phòng 30 phút Votex RNA dye concentrate (lọ màu xanh dương) 10 giây, spin xuống Hút µl dye bổ sung vào 65 µl Gel filtered Votex dung dịch Ly tâm 13000 g 10 phút nhiệt độ Sử dụng Geldye mix ngày Loading Gel-Dye Mix Đặt chip RNA lên trạm để chip Hút µl hỗn hợp Gel-dye vào giếng chữ G màu trắng Đưa xilanh vị trí 1ml đóng nắp trạm Nhấn xilanh xuống vị trí khóa Chờ xác 30 giây tháo xilanh khỏi vị trí khóa Chờ giây Kéo chậm xilanh lên vị trí 1ml ban đầu Mở nắp trạm chip hút µl hỗn hợp Gel-dye vào giếng G màu đen trừ giếng G màu trắng có Gel-dye Loading Conditioning Solution Marker Hút µl RNA conditioning solution (Lọ màu trắng) vào giếng kí hiệu CS 134 Hút µl RNA marker (Lọ xanh cây) vào 11 giếng chứa mẫu giếng kí hiệu # Loading Diluted Ladder and Samples Hút µl ống Ladder biến tính nhiệt độ 70o C vào giếng kí hiệu # Hút µl mẫu RNA vào 11 giếng chứa mẫu cịn lại Nếu khơng đủ 11 mẫu giếng khơng có mẫu hút µl RNA Marker (Lọ xanh cây) thay mẫu Đặt chip RNA lên máy Votex votex 2400 rpm phút Chạy chip RNA máy Agilent 2100 Bioanalyzer vịng phút Sau máy đưa kết 135