Tóm tắt: Đặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam

Đặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ LOAN

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, DI TRUYỀN VÀ PHÒNG CHỐNG

SINH HỌC NẤM Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc)

GÂY BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

Công trình hoàn thành tại:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đức Huy

TS Vũ Đăng Toàn

Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Văn Nam

Trường Đại học Tây Nguyên

Phản biện 2: PGS.TS Trần Đăng Khánh

Viện Di truyền Nông nghiệp

Phản biện 3: TS Nguyễn Huy Chung

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt Nam

Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của ((HVN)

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Chuối thuộc chi Musa spp., họ Musaceae FAOSTAT (2019) đã đưa cây chuối thuộc nhóm cây ăn

quả hỗ trợ sinh kế và an ninh lương thực của hàng triệu người trên toàn cầu

Trên thế giới chuối được trồng ở 150 quốc gia, diện tích khoảng 5,2 triệu ha với sản lượng xấp xỉ

125 triệu tấn (FAOSTAT, 2022) Việt Nam thuộc nhóm 11 nước có diện tích đang cho thu hoạch và sản lượng chuối lớn nhất thế giới (tương ứng bằng 2,2% và 1,76%), đứng thứ 3 ở Đông Nam Á về diện tích thu hoạch (sau Philippines, Thái Lan) và sản lượng (sau Philippines, Indonesia) (FAOSTAT, 2022) Theo Cục trồng trọt (9/2023), diện tích trồng chuối của nước ta trong ba năm qua tăng nhẹ, từ 152,8 nghìn ha năm 2020 lên 154,2 nghìn ha năm 2021 và 157,1 nghìn ha năm 2022 Năng suất và sản lượng chuối cũng tăng, từ 166,0 tạ/ha năm 2020 lên 169,6 tạ/ha và 175,0 tạ/ha năm 2022 cho sản lượng lần lượt là 2,27 triệu tấn, 2,35 triệu tấn và 2,51 triệu tấn Một số giống chuối có diện tích lớn như chuối sứ (Xiêm) chiếm 30,3%, chuối tiêu hồng (14,4%), chuối già hương (11,6%) và một số giống khác như chuối tây, chuối tiêu…

Trong những năm gần đây, bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây

ra đã được phát hiện tại các vùng trồng chuối của Việt Nam như Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Lào Cai với mức gây hại 25 - 30% tùy giống và tùy vùng Bệnh nhiễm trên cảc giống chuối tiêu, chuối tây Triệu chứng của bệnh: mép lá vàng, lá bị gẫy gập treo trên thân giả, mạch xylem chuyển màu từ vàng nhạt, đỏ sẫm đến nâu đen Bệnh xuất hiện và gây hại tập trung tại các vùng chuối trồng từ 2 - 3 năm tuổi trở lên, các vùng trồng lâu năm thì tỷ lệ cây bị bệnh càng cao Nấm gây hại trên tất cả các bộ phận và các giai đoạn sinh trưởng của cây chuối Cây bị nhiễm bệnh cho buồng và quả nhỏ hoặc không ra buồng (Cục BVTV, 2020)

Nguyễn Văn Khiêm (2000) nghiên cứu 60 mẫu nấm FOC tại 7 tỉnh bao gồm Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, và Thừa Thiên Huế đã xác định là nấm gây bệnh vàng lá trên chuối ở nước ta thuộc chủng 1, chưa phát hiện ra bệnh vàng lá trên chuối tiêu

Kết quả nghiên cứu của tác giả Hùng & cs (2016) đã xác đinh chủng Foc-TR4 ảnh hưởng đến chuối

tiêu và các loại chuối khác ở vùng nhiệt đới, là bệnh hại quan trọng ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng chuối, đây là một trong những vấn đề gây trở ngại trong sản xuất chuối của Việt Nam

Kết quả đánh giá hiện trạng bệnh héo vàng chuối của L.T.Loan và cs., giai đoạn 2018 - 2020 (Hội thảo KH-HVNN, 2020), cho thấy bệnh xuất hiện ở hầu hết các tỉnh trồng chuối được điều tra như: Lào Cai, Hưng Yên, Hà Nội, Phú Thọ…, tỷ lệ bệnh gây hại trên chuối tiêu từ 15 - 30% (Vĩnh Phúc, Phú Thọ), thậm chí lên tới 90% (Khoái Châu, Hưng Yên)

Kết quả các cuộc điều tra, đánh giá bệnh héo vàng chuối cho thấy, bệnh đang có xu hướng lây lan, phát triển ra nhiều vùng, gây thiệt hại nặng, đặc biệt trên chuối tiêu bệnh có xu hướng gây hại nặng hơn

trên chuối tây Các nghiên cứu về sự gây hại của nấm Fusarium cho thấy nấm gây bệnh phụ thuộc vào

đặc điểm di truyền của nấm cũng như sự thay đổi các điều kiện trồng trọt, môi trường Mỗi loài nấm có yêu cầu khác nhau về ký chủ, về điều kiện phát sinh gây bệnh cũng như các biện pháp phòng chống Xác định được chính xác nấm gây bệnh, sự đa dạng sinh học, di truyền của nấm sẽ là cơ sở để xây dựng được các biện pháp quản lý bệnh tốt hơn nhằm hạn chế sự lây lan, phát tán cũng như giảm thiều thiệt hại cho nấm bệnh gây ra

Xuất phát từ những lý do trên, thực hiện đề tài: “Đặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học

nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam” là một điều

cần thiết Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần xây dựng chiến lược phòng chống, giảm sự gây hại của nấm trên chuối, tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất chuối và bảo vệ được sự bền vững của môi trường

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Đánh giá được hiện trạng bệnh héo vàng chuối, đánh giá được một số đặc điểm sinh học chủ yếu

của chủng Foc-TR4 và đa dạng loài Fusarium hại chuối ở miền Bắc Việt Nam

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

cứu đặc điểm hình thái, phân tử chủng Foc-TR4 và đánh giá đa dạng loài Fusarium hại chuối ở các tỉnh phía Bắc và Thanh Hóa, Nghệ An Xác định đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Foc-TR4 Đánh giá được hiệu lực phòng chống sinh học chủng Foc-TR4 và Foc-R1 trong điều kiện invitro và trong

điều kiện nhà lưới

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối

1.3.2 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Bộ môn Bệnh cây và Miễn dịch thực vật, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Phòng thí nghiệm hóa sinh thực vật (Laboratory of Plant Biochemistry), Vườn thực vật Meise, Vương Quốc Bỉ

1.3.3 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu sinh thực hiện nghiên cứu từ tháng 12/2018 đến tháng 12/2023

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

1 Kỹ thuật PCR, giải trình tự các đoạn gene rpb1, rpb2 và tef1α của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối

đại diện cho 4 vùng địa lý đã được phân tích kết hợp các VCGs khác nhau trong bộ dữ liệu, đã xác định

được chủng 4 (Foc-TR4) (chiếm 10,5%) được xác định gần VCG 01213 và VCG 01216 gây hại trên cả chuối tây (ABB) và chuối tiêu (AAA) Như vậy, mẫu bệnh héo vàng chuối được xác định chủng 4 (Foc-

TR4) trên chuối tây (ABB) đã khẳng định thêm thuyết tiến hóa hội tụ của FOCS và quan trọng hơn đó là

gợi ý nguồn gốc chủng Foc-TR4 là ở Việt Nam

2 Phân tích đặc điểm hình thái - phân tử kết hợp của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối, đã xác định được

mức độ đa dạng loài Fusarium dựa trên giải trình tự 3 đoạn gene chính rpb1, rpb2 và tef1α, cho thấy 18/19 mẫu thuộc 4 nhóm phả hệ thuộc phức hợp loài FOCS, gồm: F tardichlamydosporum, F odoratissimum, F

duoseptatum và F cugenangense; 1/19 mẫu thuộc phức hợp loài FFCS và được xác định là loài F fujikuroi

Kết quả này khẳng định giả thuyết tiến hóa hội tụ của FOCS (nền di truyền khác nhau) nhưng gây bệnh héo vàng chuối

3 Luận án đã xác định được nhóm F tardichlamydosporum nhiễm trên loài chuối dại Musa lutea,

cho thấy tầm quan trọng của chuối dại như một vật chủ có thể có đối với nấm Foc

4 Cung cấp dẫn liệu mới về phòng chống sinh học một số loài vi sinh vật đối kháng (nấm, vi khuẩn

và xạ khuẩn) có thể ứng dụng để quản lý bệnh héo vàng chuối

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã chứng minh được chuối ở miền Bắc Việt Nam bị nhiễm bệnh héo vàng được đặc trưng

bởi nhiều nhóm Fusarium khác nhau (F cugeneeangeneese, F odoratissimum, F duoseptatum và F

tardichlamydosporum) thuộc phức hợp loài Fusarium oxysporum (FOCS) Trong số này, nhóm F odoratissimum xuất hiện và gây hại nghiêm trọng đến giống chuối tiêu, các nhóm khác gây hại ít nghiêm

trọng hơn Nhóm F tardichlamydosporum cũng xuất hiện ở điều kiện tự nhiên đối với loài chuối dại Musa

lutea

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã bổ sung dữ liệu mới, có giá trị về phân loại, định danh, phân tích

đa dạng loài nấm Fusarium và mức độ gây bệnh héo vàng chuối bằng phương pháp kết hợp đặc điểm hình thái và kỹ thuật phân tử đã đóng góp vào hiểu biết chung về các loài Fusarium gây hại trên

chuối ở miền Bắc Việt Nam

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Hiện nay, bệnh héo vàng chuối là một trong những bệnh quan trọng ảnh hưởng đến sản xuất chuối tại Việt Nam, đặc biệt gây hại nặng trên chuối tiêu, là giống chuối có giá trị xuất khẩu Phòng trừ sinh học được coi là giải pháp chiến lược trong phòng trừ bệnh héo vàng chuối hiệu quả để giảm việc sử dụng thuốc diệt nấm

và giảm thiểu mức độ gây hại của bệnh ngoài sản xuất Vì vậy kết quả của đề tài cũng có giá trị tham khảo để

xây dựng quy trình phòng trừ nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối bằng biện pháp sinh học

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI TRÊN THẾ GIỚI

2.1.1 Nguồn gốc của bệnh héo vàng chuối

Báo cáo và mô tả đầu tiên về bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium gây hại trên thế giới là từ

Australia Năm 1874, Joseph Bancroft phát hiện trên giống chuối Sugar, AAB và Silk subgroup bị bệnh

héo rũ do nấm Fusarium tại Eagle Farm (27°S 431°E) gần Brisbane (Bancroft, 1876) Mô tả của Bancroft

về các triệu chứng cho thấy ông đang đối mặt với bệnh héo Fusarium (Pegg & cs., 1996) Ông nhận ra

mầm bệnh có thể lây lan dễ dàng bằng cách nhân giống sinh dưỡng và đề xuất việc lựa chọn cẩn thận vật liệu trồng sạch bệnh Đây là cuộc điều tra bệnh lý thực vật đầu tiên được ghi nhận ở Queensland Bệnh

héo vàng chuối do nấm Fusarium một lần nữa được công nhận bởi Tryon (1912), người đã ghi nhận tính

nhạy cảm của giống chuối Sugar và Gros Michel và khả năng kháng lại bệnh này của chuối Cavendish

2.1.2 Triệu chứng bệnh héo vàng chuối

Các triệu chứng khác nhau của bệnh héo vàng chuối (hay còn gọi là bệnh Panama) được mô tả bởi Ploetz & Pegg (2000), Pérez-Vicente & cs (2014)

Triệu chứng bên ngoài điển hình của bệnh héo vàng chuối là lá vàng và gẫy gập treo trên thân giả

Ở giai đoạn đầu là một vệt hoặc mảng màu xanh nhạt đến vàng nhạt ở gốc cuống lá của một trong hai lá già nhất Bệnh sau đó có thể tiến triển theo những cách khác nhau Các lá già hơn có thể chuyển sang màu vàng, bắt đầu bằng các mảng ở mép lá Màu vàng tiến triển từ lá già đến lá non cho đến khi chỉ lá ở giữa mới xòe hoặc xòe một phần lá, phần lá còn lại dựng đứng và có màu xanh Các triệu chứng khác bao gồm các mép lá non không đều, nhợt nhạt và lớp lá bị nhăn và biến dạng

Triệu chứng bên trong của bệnh héo vàng chuối được đặc trưng bởi sự đổi màu của mạch xylem: bắt đầu với sự ố vàng của rễ và mô mạch, các sợi vàng, đỏ, nâu phát triển liên tục trong thân giả (Moore

& cs., 1995) Giai đoạn đầu của bệnh là sự đổi màu từ một hoặc hai sợi trong bẹ lá già nhất lớp ngoài cùng của thân giả, dần đến sự đổi màu nặng hơn trên khắp thân giả và cuống quả trong giai đoạn bệnh sau này Sự đổi màu thay đổi từ màu vàng nhạt ở giai đoạn đầu sang màu đỏ sẫm, nâu hoặc gần như đen ở giai đoạn sau Sự đổi màu rõ rệt nhất ở thân rễ trong khu vực có mạch xylem dày đặc ở vùng củ và thân giả

2.1.3 Tác hại của bệnh héo vàng chuối

Bệnh đã lây lan rất rộng ở khắp các vùng trồng chuối tại châu Á, châu Phi, Úc, Nam Mỹ và Trung Mỹ gây ra những thiệt hại nặng nề cho ngành công nghiệp xuất khẩu chuối, phá hủy khoảng 40.000ha chuối trong những năm đầu nửa thế kỷ 20 (Stover, 1962) Chủng 4 đã từng phá hủy 23.000ha chuối Cavendish ở Đài Loan những năm 70 của thế kỷ hai mươi (Su & cs., 1977) và hàng ngàn ha chuối Cavendish của các đồn điền sản xuất thương mại ở các nước như Philippine Indonesia, Malaysia, Australia, Nam Phi, Canary Islands đã

không cho thu hoạch do dịch bệnh trầm trọng của chủng Foc-TR4 (VCG 01213) (Nasdir, 2003), gây thiệt hại

hàng trăm triệu đô la trong sản xuất, kể cả các nông hộ nhỏ Các đồn điền trồng chuối khác ở Kiepersol và Nam KwaZulu-Natal (KZN) - Nam Phi, thiệt hại 30% diện tích trong những năm 1991 - 2000 (Viljoen, 2002)

2.1.4 Nghiên cứu dịch tễ học và sinh thái học nấm Fusarium

Nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) là một loại nấm tồn tại trong đất, Foc xâm nhập vào

hệ thống rễ, từ đó nó di chuyển vào mô mạch dẫn đến thoái hóa dần Khi đến thân củ, bệnh héo rũ xảy ra

cuối cùng, dẫn đến cái chết của cây bị nhiễm bệnh (Stover, 1962a) Fusarium có cơ quan sinh trưởng phân

nhánh, dạng sợi Thể dinh dưỡng của chúng là một tản nấm được tạo thành từ nhiều sợi nấm đơn bào (không có màng ngăn) và đa bào (có màng ngăn) tập hợp lại với nhau Thể sợi của nấm thường không màu hoặc chuyển màu nâu khi già Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ (Iori Inoue & cs., 2002)

Con đường xâm nhập của nấm bệnh gây héo vàng chuối thông qua các bó mạch xylem bắt đầu từ

rễ (Zhang & cs., 2018) Sự lây nhiễm đi qua các rễ cấp 2 hoặc cấp 3 chứ không phải rễ chính (Trujillo, 1963) Ngoài ra, Foc đã được chứng minh là có khả năng lây lan theo nhiều cách khác nhau, thông qua côn trùng chích hút bị nhiễm bệnh là hiệu quả nhất (Stover, 1962) Nấm bệnh gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng và trên hầu hết các bộ phận của cây chuối (Ploetz, 2015) Cây bị nhiễm bệnh không tạo

2.2 NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG LOÀI FUSARIUM GÂY BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI

Trong hệ thống Fusarium, Foc thuộc phức hệ loài Fusarium oxysporum (FOCS) Nghiên cứu phân

loại Foc dựa trên phân tích phân tử được nghiên cứu từ những năm 1990 Nghiên cứu trước đây Foc bao

gồm một số dòng vô tính có thể khác xa về mặt di truyền Nghiên cứu của O’Donnell & cs (1998) với mục tiêu xác định mối quan hệ phát sinh gene giữa các chủng F oxysporum gây bệnh héo vàng chuối và

xác định xem liệu tập hợp các chủng đặc trưng cho chuối có phải là hậu duệ của một tổ tiên chung duy nhất hay không Nghiên cứu đã tập hợp các chủng từ những dòng khác nhau, như được chỉ định bởi dữ

liệu RFLP (Koenig & cs., 1997), đã được chọn để phân tích trình tự DNA trực tiếp cùng với các chủng F

oxysporum phân lập hoặc là tác nhân gây bệnh trên các vật chủ khác hoặc được cho là không gây bệnh

Nghiên cứu thực hiện trên 33 mẫu F oxysporum được thu thập trên chuối Sử dụng phương pháp phân

tích phân tử bằng cách so sánh trình tự DNA (rDNA) của các gene nhân (mtSSU) và ty thể (tef-1α) Kết

quả nghiên cứu này chỉ ra, các chủng F oxysporum gây bệnh ở chuối không phải là loài đơn ngành và

dường như có nhiều nguồn gốc tiến hóa độc lập gây ra, mỗi dòng vô tính có thể được cho là có các đặc tính gây bệnh độc nhất

2.3 PHÒNG CHỐNG SINH HỌC NẤM Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4)

TRÊN CHUỐI

Bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) là một trong những loại

bệnh gây hại nặng nề đối với chuối, ảnh hưởng lớn tới ngành sản xuất chuối toàn cầu Đặc biệt, chủng

Foc-TR4 là mối đe dọa lớn nhất đối với ngành sản xuất chuối, có thể lây nhiễm vào hơn 80% các giống

chuối (Ghag & cs., 2015; Zhang & cs., 2019) Bệnh hại đã được tìm thấy ở các vùng sản xuất chuối lớn ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Ghag & cs., 2015)

Việc quản lý hiệu quả và lâu dài đối với bệnh héo vàng chuối vẫn còn là thách thức, phần lớn do cây ký chủ lâu năm và nấm bệnh tồn tại lâu trong đất (Ploetz & Evans, 2015) Hiện nay phương pháp

kiểm soát sinh học, bao gồm việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng như Trichoderma, Pseudomonas,

Bacillus, Paecilomyces, VAM, v.v., đưa ra một giải pháp thay thế phù hợp và tốt nhất để chống lại bệnh từ

đất như bệnh héo Fusarium trên chuối

2.4 NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI Ở VIỆT NAM

Fusarium là một trong những chi nấm gây bệnh thực vật quan trọng nhất ảnh hưởng đến việc canh

tác nhiều loại cây trồng Tổn thất nông nghiệp do nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) ảnh

hưởng trực tiếp đến thu nhập, sinh kế và dinh dưỡng của nông dân trên toàn thế giới Đối với Việt Nam, những dự đoán về tác động của Foc trong tương lai là rất lớn, với ước tính tổn thất trong diện tích sản xuất chuối là 8% trong vòng 5 năm tới và lên tới 71% trong vòng 25 năm tới (Segura & cs., 2018)

Đã có mộ số kết quả nghiên cứu về bệnh héo vàng chuối của các tác giả Vakili & cs (1968), Mai Văn Trị (1997), Bentley & cs (1998), Vinh & cs (2001), Zheng & cs (2018), Mostert & cs (2017), Trần Ngọc Hùng & cs (2018), Khonesavanh & cs (2022)…

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1) Điều tra, đánh giá hiện trạng, thu thập và phân lập mẫu bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc 2)

Đánh giá đa dạng loài Fusarium gây bệnh héo vàng chuối ở một số tỉnh miền Bắc và Thanh Hóa, Nghệ

An 3) Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Foc-TR4 4) Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện invitro 5) Đánh giá hiệu lực phòng chống của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp điều tra, đánh giá hiện trạng, thu thập và phân lập mẫu bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc

Phương pháp điều tra mức độ phổ biến và hiện trạng của bệnh héo vàng chuối thực hiện theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 01-38: 2010/BNN & PTNT về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây trồng (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010) và theo phương pháp nghiên cứu BVTV (Quyển số 1)

Phương pháp phân lập, xác định đặc điểm hình thái và bảo quản nguồn bệnh theo Moore & cs., 1995; Abd-Elsalam & cs., 2010

Phương pháp nuôi cấy, phân lập, đánh giá đặc điểm hình thái chủng Foc-TR4 theo (Nirenberg,

1981), (Pérez & cs., 2003)

3.2.2 Phương pháp đánh giá đa dạng loài Fusarium bằng giải trình tự đoạn gene rbp1, rbp2 và

tef1α các mẫu bệnh héo vàng chuối

Tách chiết DNA mẫu bệnh héo vàng chuối theo phương pháp của Lin & cs (2008); Dellaporte & cs (1983)

Phản ứng PCR: Khuếch đại vùng gene rpb1, rpb2 được thiết kế bởi O'Donnell K & cs (2010), vùng gene teflα được thiết kế bởi O'Donnell & cs (1998)

Xác định chủng gây bệnh héo vàng chuối và so sánh các mẫu bệnh héo vàng chuối mới được thu thập với các VCGs đã biết theo Ordonez & cs (2015)

Đánh giá đa dạng loài Fusarium bằng giải trình tự các đoạn gene rbp1, rbp2 và tef1α các mẫu bệnh

héo vàng chuối được tiến hành bởi Công ty Macrogene (Macrogene, Seoul, Hàn Quốc) : Mô hình lập dữ liệu nucleotide phù hợp nhất đã được chọn bằng jModelTest 2.1.4 (Posada, 2008) Các phân tích trên ba vùng

dữ liệu riêng lẻ và một ma trận dữ liệu kết hợp được thực hiện với MrBayes v3.2.6 (Ronquist & cs., 2012) Sử dụng cách tiếp cận mô hình hỗn hợp để áp dụng các mô hình tiến hóa khác nhau trên từng vùng DNA của bộ

dữ liệu kết hợp (Ronquist & Huelsenbeck, 2003)

So sánh dựa trên độ phân giải và giá trị hỗ trợ cho từng cấu trúc liên kết gene đơn lẻ bằng cách tiến hành kiểm tra ILD (Farris & cs., 1995) Được thực hiện bằng phần mềm Swofford 2003

Mối quan hệ phát sinh loài được tìm kiếm trong mỗi cấu trúc liên kết được hỗ trợ bởi giá trị hỗ trợ khả năng tối đa (ML> 70%) (Johnson & Soltis, 1998; Pirie, 2015) Các phân tích ML được thực hiện theo thuật toán tìm kiếm RAxML (Stamatakis, 2014)

Sử dụng phương pháp thống kê Bootstrap để đánh giá mức độ tin cậy của cây phát loài

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Fusarium oxysporum

f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4)

Nghiên cứu ảnh hưởng của 6 mức nhiệt độ (15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và 40oC), và 9 công thức

pH tương ứng với 9 mức pH (4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0), được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên (CRD), mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa Petri Chủng nấm Foc-TR4 được nuôi cấy trên

các môi trường PDA trong điều kiện 25o

C ±2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày Theo dõi tốc độ phát triển tản nấm và số lượng bào tử hình thành ở các thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày sau cấy

Xác định tính gây bệnh của chủng Foc-TR4: Các bước lây bệnh được thực hiện theo quy tắc Koch Đánh giá khả năng gây độc của nấm Foc-TR4 theo phương pháp Moore & cs (1995) Chỉ tiêu theo

dõi theo đánh giá của Kristle Grace I & cs (2020)

3.2.4 Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật đối kháng

đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện invitro

Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi khuẩn đối kháng Bacillus velenzesis

đến chủng Foc-TR4: Thí nghiệm gồm 4 công thức với 4 loài vi khuẩn: YB9, ĐTK1, YB4 và YB11 Thí

nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 5 đĩa

Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số nguồn nấm đối kháng Trichoderma

asperellum đến chủng Foc-TR4 gồm 3 công thức

Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số chủng nấm Chaetomium globosum đến chủng Foc-TR4 gồm 4 công thức với các chủng nấm đối kháng (Chae 1, ĐT 13, Chae 15 và C10)

Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis và

Streptomyces misionensis đến chủng Foc-TR4 và Foc-R1

Đánh giá giá hiệu lực phòng chống của một số vi sinh vật đối kháng với 4 công thức (Trichoderma

harzianum, Chaetomium ketomium, SH-BV1 (Trichoderma spp.) + Streptomyces spp + Bacillus subtilis

và vi khuẩn Microtech-1 (NL) (Bacillus subtilis): đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới

3.3 PHƯƠNG PHÁP TÍNH TOÁN VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Kỹ thuật phân tích số liệu thống kê qua các chương trình phần mềm Geneeious Prime (Biomatters, New Zealand)

- Sử dụng phương pháp thống kê Bootstrap để đánh giá mức độ tin cậy của cây phát sinh loài (Zharkikh & Li, 1995)

- Số liệu thí nghiệm được tính toán, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích sai khác giữa các công thức thí nghiệm được xử lý bằng phương pháp so sánh Duncan trong phần mềm IRRISTAT phiên bản 5.0

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐIỀU TRA, ĐÁNH GIÁ HIỆN TRẠNG, THU THẬP VÀ PHÂN LẬP MẪU BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI

4.1.1 Hiện trạng bệnh héo vàng chuối tại các tỉnh miền Bắc

Kết quả điều tra hiện trạng cho thấy, bệnh héo vàng chuối là bệnh phổ biến xuất hiện ở tất cả các vùng điều tra, hiện đang là bệnh nguy hiểm nhất gây hại trên chuối, bệnh hại trên hầu hết các giống chuối được điều tra như chuối tây, chuối tiêu, chuối goong, chuối mốc… thậm chí bệnh xuất hiện cả trên chuối dại

4.1.2 Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối tại một số tỉnh miền Bắc theo vùng địa lý

Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối đều ghi nhận ở hầu hết các vùng địa lý Bệnh xuất hiện

và gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây chuối và được chi nhận, tần xuất bắt gặp bệnh gây hại là rất phổ biến ở tất cả các tỉnh điều tra (10 - 25%) thậm chí (> 35%)

4.1.3 Mức độ gây hại của bệnh héo vàng chuối tại một số tỉnh theo vùng địa lý

Bệnh hại tăng dần theo các năm duy trì vườn chuối, thường gây hại nặng ở ruộng chuối trồng năm thứ 2 - 3 trở đi Phân tích hệ số tương quan (r) để tính chỉ số đo lường mức độ tương quan tuyến tính giữa hai biến tỷ lệ bệnh (%) và cấp bệnh trung bình Kết quả phân tích cho thấy hệ số số tương quan

có giá trị trong khoảng từ -1,0 đến 1,0

Mức độ gây hại ở giai đoạn 2018 - 2019 cho hệ số tương quan r = 0,75, giai đoạn 2020 - 2021 là r =

0,71 Điều này cho thấy mức độ gây hại của bệnh héo vàng Fusarium trên chuối tại một số tỉnh miền Bắc năm

2018 có mối tương quan thuận giữa tỷ lệ bệnh (%) và cấp bệnh trung bình Cả hai chỉ số di chuyển theo cùng một hướng Khi chỉ số tương quan gần +1,0, tương quan chặt, chúng di chuyển song song Có nghĩa là tỷ lệ bệnh tăng (%) thì cấp bệnh trung bình cũng tăng

4.1.4 Kết quả thu thập mẫu bệnh héo vàng chuối tại các tỉnh

Kết quả phân lập các mẫu bệnh cho thấy: trong số 57 mẫu bệnh thu được, thông qua sàng lọc, lấy đại diện 19 mẫu bệnh (chiếm 33,3%) được thu thập tại 10 tỉnh đại diện cho 4 vùng địa lý khác nhau và trên các giống chuối khác nhau Các mẫu bệnh sau khi phân lập đã được làm thuần và bảo quản để phục

vụ cho các nghiên cứu tiếp theo Danh sách các mẫu được trình bày tại bảng 4.1

Bảng 4.1 Danh sách mẫu bệnh héo vàng Fusarium được lựa chọn

Hệ gene

Tuổi vườn chuối

Triệu chứng

1 FOC1 Yên Bình, Quang Bình, Hà Giang Chuối Tây ABB 2 Toàn bộ lá vàng

2 FOC2 Yên Thắng, Lục Yên, Yên Bái Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

3 FOC4 Ngòi A, Văn Yên, Yên Bái Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

4 FOC5 Đại Sơn, Văn Yên, Yên Bái Musa lutea M.lutea - Lá phía dưới vàng

5 FOC6-1 Đại Sơn, Văn Yên, Yên Bái Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

6 FOC7 Lâm Giang, Văn Yên, Yên Bái Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

7 FOC10 Phú Nhuận, Bảo Thắng, Lào Cai Chuối Tây ABB 3 Lá phía dưới vàng

8 FOC11 Khánh Yên, Văn Bàn, Lào Cai Chuối Tây ABB 3 Lá phía dưới vàng

9 FOC16 Hoàng An, Hiệp Hòa, Bắc Giang Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

10 FOC18 Hoàng Thanh, Hiệp Hòa, Bắc Giang Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

11 FOC21 Thịnh Long, Hải Hậu, Nam Định Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

12 FOC23-2 Thành Châu, Phủ Lý, Hà Nam Chuối Tây ABB 3 Lá phía dưới vàng

13 FOC24 Hưng Thanh, Tuyên Quang Chuối Tây ABB 1 Lá phía dưới vàng

14 FOC25-1 Lệ Chi, Gia Lâm, Hà Nội Chuối Tây ABB 3 Lá phía dưới vàng

15 FOC25-2 Lệ Chi, Gia Lâm, Hà Nội Chuối Tây ABB 3 Lá phía dưới vàng

16 FOC38 Nghĩa Tân, Nghĩa Đàn, Nghệ An Chuối Tây ABB 3 Lá phía dưới vàng

17 FOC56 Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

18 FOC58 Minh Tân, Vụ Bản, Nam Định Chuối Tây ABB 2 Lá phía dưới vàng

19 FOC 61 Hồng Châu, Yên Lạc, Vĩnh Phúc Chuối Tiêu AAA 2 Lá phía dưới vàng

4.1.5 Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân tử của nấm Fusarium

4.1.5.1 Nuôi cấy, phân lập các mẫu bệnh héo vàng chuối và phân nhóm dựa vào đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái cho đến nay vẫn là tiêu chí được sử dụng phổ biến nhất để xác định các loài

Fusarium Đặc biệt là sự khác biệt về hình dạng của bào tử lớn, đây là tiêu chí là trọng tâm để nhận dạng

nhiều loài Fusarium (Leslie & Summerell, 2006)

Trong nghiên cứu này, tất cả 19 mẫu bệnh héo vàng thu thập được nuôi cấy và đánh giá trên 4 môi trường dinh dưỡng khác nhau: PDA, SNA, OMA và CLA, nhiệt độ từ 25 - 28oC Được mô tả theo Groenewald & cs (2006) và so sánh với bảng màu của Rayner (1970)

Trên môi trường CLA, tạo ra các bào tử lớn có kích thước và hình dạng đồng nhất Trên môi trường SNA, hình thái của bào tử lớn đôi khi có kích thước kém đồng đều hơn so với CLA Môi trường OMA sản sinh nhiều bào tử nhỏ, kích thước đồng đều, bào tử lớn và bào tử hậu ít, kích thước không đồng đều Trên môi trường PDA, đối với tất cả các mẫu phân lập, quan sát thấy bào tử lớn đều có từ 2 - 5 vách ngăn với kích thước đo được ghi lại ở 38 đến 48 μM × 2 đến 5 μM, phần lớn có 2 - 3 vách ngăn, hình lưỡi liềm, thường được hình thành muộn hơn bào tử nhỏ, thành mỏng Bào tử được hình thành 3 - 4 ngày sau nuôi cấy trên môi trường PDA, đồng thời được hình thành đơn lẻ hoặc hình thành cụm bào tử trên hệ sợi nấm Bào tử nhỏ

có hình bầu dục, hình thận, có 0 - 1 vách ngăn có kích thước từ 5 đến 10 μM × 0 đến 1 μM Bào tử hậu hình tròn và có thành dày (bảng 4.2)

Leslie & Summerell (2006) cho biết thêm một số đặc điểm được sử dụng để nhận dạng các loài

Fusarium Nổi bật nhất trong số các đặc điểm này là sắc tố Trong nghiên cứu này đã sử dụng bảng màu của

Rayner, (1970) để so sánh các màu có thể so sánh được, để phân biệt màu sắc tản nấm và sợi nấm, sử dụng các thuật ngữ chung hơn như “đỏ”, “nâu”, “tím”, “cam”, “vàng”, “xám” và “trắng” như các chất chỉ thị màu

Sự khác biệt đã được quan sát qua hình thái và màu sắc tản nấm Dựa trên đặc điểm hình thái cho thấy

sự khác biệt Đã xác định được 4 nhóm hình thái

4.1.5.2 Phân nhóm mẫu bệnh héo vàng chuối dựa vào đặc điểm hình thái

Dựa vào đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái và sắc tố tản nấm để phân nhóm hình thái Đặc điểm hình thái là đặc điểm quan trọng để khẳng định, các mẫu bệnh héo vàng chuối phân lập được xác định là

loài Fusarium oxysporum Chỉ duy nhất mẫu FOC58 tản nấm có màu tím nhạt ở giữa và dần trở thành

màu trắng phía bên ngoài với bề mặt tản nấm khô, quan sát không có bào tử hậu, mẫu phân lập không

thuộc tổ hợp loài FOCS mà thuộc phức hợp loài FFSC, loài Fusarium fujikuroi (bảng 4.3)

Bảng 4.3 Kết quả phân nhóm hình thái các mẫu bệnh héo vàng chuối đƣợc thu thập

Mẫu bệnh héo vàng chuối

Số lƣợng mẫu

Nhóm hình thái

Tỷ lệ (%)

ABB,

Bào tử lớn (μm)

Số vách ngăn

Bào tử

chuối

1 FOC1 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 38-48 × 2-5 2-5 5-10 × 0-1 Hình tròn, vách dày

2 FOC2 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 40-45 × 2-5 2-5 5-10 × 0-1 Hình tròn, vách dày

4 FOC6-1 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 40-46 × 2-5 2-5 5-8 × 0-1 Hình tròn, vách dày

5 FOC7 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 39-48 × 2-5 2-5 5-10 × 0-1 Hình tròn, vách dày

6 FOC11 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 38-47 × 2-5 2-5 5-10 × 0-1 Hình tròn, vách dày

7 FOC16 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 38-48 × 2-5 2-5 5-8 × 0-1 Hình tròn, vách dày

8 FOC18 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 38-45 × 2-5 2-5 5-7 × 0-1 Hình tròn, vách dày

9 FOC21 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 39-45 × 2-5 2-5 6-8 × 0-1 Hình tròn, vách dày

10 FOC23-2 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 40-47 × 2-5 2-5 5-10 × 0-1 Hình tròn, vách dày

11 FOC24 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 39-46 × 2-5 2-5 6-9 × 0-1 Hình tròn, vách dày

12 FOC25-1 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 38-46 × 2-5 2-5 5-10 × 0-1 Hình tròn, vách dày

13 FOC25-2 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 38-48 × 2-5 2-5 7-8 × 0-1 Hình tròn, vách dày

14 FOC38 Chuối Tây/ABB I Tím ở giữa 38-48 × 2-5 2-5 6-8 × 0-1 Hình tròn, vách dày

15 FOC4 Chuối Tây/ABB II Tím sẫm ở giữa 38-43 × 2-5 2-5 6-8 × 0-1 Hình tròn, vách dày

16 FOC10 Chuối Tây/ABB II Tím sẫm ở giữa 40-45 × 2-5 2-5 5-7 × 0-1 Hình tròn, vách dày

19 FOC58 Chuối Tây/ABB IV Tím nhạt ở giữa 38-46 × 2-5 2-5 5-10 × 0-1 Không xuất hiện

Nhóm hình thái I: gồm 14 mẫu (chiếm 74,0%) là FOC1, FOC2, FOC5, FOC6-1, FOC7, FOC11, FOC16,

FOC18, FOC21, FOC23-2, FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC38 được thu từ 9 tỉnh Hà Giang, Yên Bái, Lào Cai, Bắc Giang, Nam Định, Hà Nam, Tuyên Quang, Hà Nội, Nghệ An, trên giống Chuối Tây (ABB)

và chuối dại M.lutea Nhóm này đặc trưng bởi màu tím ở phần trung tâm, màu trắng xám xung quanh

Nhóm hình thái II: gồm 2 mẫu (chiếm 10,5%) là FOC4 và FOC10 được thu tại hai tỉnh Yên Bái và tỉnh

Lào Cai trên giống Chuối Tây (ABB) Tản nấm có một điểm nhỏ màu tím sẫm ở giữa, chuyển dần sang

màu trắng ở phía ngoài Nhóm hình thái III: gồm 2 mẫu (chiếm 10,5%) là FOC56 và FOC61 được thu

tại Hà Nội và Vĩnh Phúc trên 2 giống Chuối Tây (ABB) và Chuối Tiêu (AAA) Màu sắc tản nấm được

đặc trưng bởi màu trắng, không có sắc tố Nhóm hình thái IV: gồm 1 mẫu FOC58 (chiếm 5,0%) được thu

tại Nam Định trên giống Chuối Tây (ABB) Nhóm này nằm giữa nhóm thứ nhất và thứ hai, tản nấm màu tím nhạt ở giữa dần trở thành màu trắng ở phía ngoài

4.1.6 Kết quả nghiên cứu bệnh héo vàng trên chuối dại

Trong nghiên cứu này, kết quả khi phân lập mẫu FOC5 được thu từ chuối dại M.lutea cho thấy chủng Foc-Race 1 cũng đã được xác định có mặt Phân tích hình thái phân tử mẫu FOC5 thuộc nhóm F

tardichlamydosporum gây ra bên cạnh việc có mặt của loài này trên giống chuối tây ABB Như vậy, F tardichlamydosporum cũng có nguồn gốc từ mẫu nhiễm bệnh héo vàng trên một loài Musa lutea hoang

dại, cho thấy tầm quan trọng của chuối hoang dại như một vật chủ có thể có đối với Foc

4.1.7 Nhận dạng chủng Fusarium (Foc) thông qua nhóm tương thích VCGs

Dựa trên đặc điểm hình thái phân tử, cây phân loại phát sinh loài Maryani & cs (2019a) và sự tương thích của các mẫu cùng với sự có mặt trong cùng một nhánh của các VCG’s (bảng 4.11) Các

chủng phân lập trước đó được xác định là Foc-TR4 sử dụng phân tích hình thái-phân tử đã được bắt

cặp với các VCG 01213, 01216 và 01213/16 Kết quả phân tích gene các mẫu nấm héo vàng

Fusarium chuối được dự đoán 1/19 mẫu (FOC61 - Chuối tiêu) thuộc chủng Foc-TR4

Bảng 4.4 Xác định các chủng Fusarium dựa trên nhóm VCGs

vàng chuối

Hệ gene

Số lượng mẫu

Chủng gây bệnh

diện là mẫu FOC61) cho các nghiên cứu tiếp theo

4.1.8 Sự phát triển của chủng Foc-TR4 trên các môi trường nuôi cấy

Để nghiên cứu hình thái, đặc điểm sợi nấm, đặc điểm bào tử của chủng Fusarium oxysporum f sp cubense

tropical race 4 (Foc-TR4) Chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự phát triển của chủng nấm trên 4 môi trường dinh

dưỡng riêng biệt PDA, SNA, CLA và OMA Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các môi trường tới sự phát triển của nấm Foc-TR4

Môi

trường

PDA 26,00ab 45,83a 63,83a 77,83a 90,00a Tản nấm màu tím nhạt, sợi nấm

Ghi chú: a,b,c,d là chỉ số dùng để so sánh sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức sau các ngày nuôi cấy

Nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sản sinh bản tử lớn và bảo tử nhỏ của nấm Fusarium được

kích thích bởi sự hiện diện của các hợp chất cellulose như trong môi trường CLA, giấy lọc và các mảnh lá cẩm chướng (Fisher & cs., 1983; Leslie & Summerell, 2006; Tiedt & Jooste, 1988) Việc sử dụng carboxymethyl cellulose trong môi trường nuôi cấy cũng có thể có ý nghĩa trong quá trình tạo bào tử vì

các hợp chất xenlulo có thể kích thích quá trình tạo bào tử ở các loài Fusarium (Mansour & cs., 2012;

Ohara & cs., 2004) Quan sát các đặc điểm hình thái như màu sắc tản nấm, số lượng bào tử vô tính (bào

tử lớn, bào tử nhỏ và bào tử hậu) cho kết quả phù hợp với nghiên cứu của (Leslie & Summerell, 2006) Kết quả nghiên cứu được mô tả trong bảng 4.6

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các môi trường đến sự sản sinh bào tử của chủng Foc-TR4

Bào tử nhỏ Bào tử lớn Bào tử hậu

Chú thích: -: không hình thành bào tử , +: Số lượng bào tử ít (<1 x 106 bào tử/ ml), ++: Số lượng bào tử

trung bình (1 - 2 x 106 bào tử/ ml), +++: Số lượng bào tử nhiều (> 2 x 106 bào tử/ ml)

4.2 ĐA DẠNG LOÀI FUSARIUM HẠI CHUỐI TẠI CÁC TỈNH MIỀN BẮC VÀ MỘT SỐ TỈNH 4.2.1 Khuếch đại vùng gene rbp1, rbp2 và tef1α của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối

Xác định chủng bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu cho các gene rbp1, rbp2 và teflα xác định chủng đã được thực hiện Bộ khuếch đại PCR từ sự khuếch đại các đoạn gene rbp1, rbp2 và tef1α có

kích thước gene lần lượt là 1.607bp, 1.700-1.742bp và 639-683bp (hình 4.1), trình tự chất lượng sẽ được

sử dụng để phân tích phát sinh loài

Phản ứng PCR đã được thực hiện trên 19 mẫu bệnh héo vàng chuối được thu thập tại 10 tỉnh thuộc 4 vùng địa lý Đông Bắc, Tây Bắc, Đồng bằng Sông Hồng và Bắc Trung Bộ Sau khi tách chiết DNA tinh sạch từ

các mẫu nấm Fusarium Các mẫu nấm được thực hiện phản ứng PCR trên 3 đoạn gene rbp1, rbp2 và tef1α bằng

các cặp mồi tương ứng Fa/G2F, 5f2/7cr và EF-1/EF-2 Hình ảnh các sản phẩm PCR được thể hiện tại hình 4.1

Hình 4.1 Điện di sản phẩm PCR 3 vùng gene rbp1 (a), rbp2 (b) và tef1α (c) của 19 mẫu bệnh héo

vàng chuối trên agarose 1,5%

4.2.2 Giải trình tự gene các mẫu bệnh héo vàng chuối

Giải trình tự đoạn gene rpb1, rpb2 và teflα của 19 mẫu bệnh héo Fusarium được so sánh với trình

tự toàn bộ hệ gene với dữ liệu trình tự NCBI Trình tự các đoạn gene lần lượt là 1,578, 917 và 797

nucleotid của 19 mẫu bệnh héo Fusarium trên chuối ở miền Bắc và một số tỉnh của Việt Nam Trình tự

này đã được phân tích để tìm khung phân loại phát sinh loài

4.2.3 Đa dạng loài Fusarium dựa trên phân tích phân tử

Mối quan hệ phát sinh loài phân tử được suy ra bằng cách giải trình tự từng phần các gene rpb1,

rpb2 và tef1a Nghiên cứu này áp dụng khái niệm tổ hợp loài FOCS của Maryani & cs (2019a) nhằm

phân định kỹ hơn các mẫu bệnh nhiễm Foc được thu thập Phân tích phát sinh loài của 19 mẫu bệnh héo vàng phân lập được thu thập trên các giống chuối ở 4 vùng địa lý cho thấy mặc dù đặc điểm hình thái

tổng thể chỉ hướng đến F oxysporum f sp cubense, nhưng rõ ràng chúng có nguồn gốc tiến hóa khác nhau, kết quả cho thấy tất cả các mẫu phân tích đều thuộc dạng chuyên hóa (f sp) là cubense Kết quả

thể hiện trong bảng 4.8

Đa dạng loài Fusarium tại Viêt Nam là khá đa dạng Trong số các mẫu được thu thập tại các vùng địa

lý, Đồng bằng Sông Hồng là nơi có sự đa dạng nhất khi có sự xuất hiện của nhóm F tardichlamydosporum,

F odoratissimum thuộc phức hợp loài FOCS và nhóm F fujikuroi thuộc phức hợp FFCS Vùng Tây Bắc

cũng ghi nhận sự xuất hiện của 2 nhóm F tardichlamydosporum và F cugeneangenese Vùng Đông Bắc ghi nhận 100% mẫu thu được thuộc nhóm F tardichlamydosporum và nhóm F douseptatum chỉ được ghi nhận ở vùng Bắc Trung Bộ Trong số 2 nhóm loài được ghi nhận ở 4 vùng địa lý thì nhóm F

tardichlamydosporum xuất hiện ở ba vùng Đông Bắc, Tây Bắc và Đồng bằng Sông Hồng

4.2.4 So sánh độ tương đồng giữa các gene tef1α và rpb2 của các mẫu phân lập

Độ tương đồng của các mẫu nghiên cứu đều được đối chiếu với các trình tự trên Genebank nhằm tìm loài tương đồng, đồng thời đảm bảo rằng đoạn gene nhân lên đúng vùng trình tự quan tâm

4.2.4.1 So sánh trình tự gene tef1α

Phân tích độ tương đồng trình tự của 19 mẫu cho thấy: bao gồm 5 nhóm với mức đồng nhất trình tự 100% trong mỗi nhóm Kết quả thể hiện trong bảng 4.8 Nhóm I gồm 13 mẫu: FOC6, FOC7, FOC23-2, FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC5, FOC21, FOC2, FOC18, FOC16, FOC11 và FOC1 có mức đồng nhất trình tự cao nhất 100% Nhóm II gồm 2 mẫu: FOC10 và FOC4 có mức đồng nhất trình tự từ 98,7% đến 100% Nhóm III gồm 1 mẫu: FOC 38 cho thấy mức đồng nhất trình tự 99% Nhóm IV gồm 2 mẫu: FOC56

và FOC61 có mức đồng nhất trình tự lần lượt là 97,7% và 100% Nhóm V gồm 1 mẫu: FOC58 có mức đồng nhất trình tự rất thấp là 91,5% - 91,9%

4.2.4.2 So sánh trình tự gene rpb2

Phân tích mức đồng nhất trình tự của 19 mẫu cho thấy: bao gồm 6 nhóm với mức đồng nhất trình tự trong mỗi nhóm từ 93,3-100% Kết quả thể hiện trong bảng 4.9 Nhóm I gồm 12 mẫu: FOC6, FOC7, FOC23-2, FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC5, FOC21, FOC18, FOC16, FOC11 và FOC1 có mức đồng nhất trình tự cao nhất 100% Nhóm II gồm 2 mẫu: FOC10 và FOC4 có mức đồng nhất trình tự từ 99,3 - 99,6% Nhóm III gồm 1 mẫu: FOC 38 cho thấy mức đồng nhất trình tự từ 99,6 - 99,7% Nhóm IV gồm 2 mẫu: FOC56 và FOC61 cho thấy mức đồng nhất trình tự từ 99,2 - 99,5% Nhóm V gồm 1 mẫu: FOC58 có mức đồng nhất trình tự thấp nhất từ 93,3 - 93,8% Nhóm VI gồm 1 mẫu: FOC2 có mức đồng nhất trình

tự là 98,8%