Đặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam

Đặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt NamĐặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ LOAN

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, DI TRUYỀN VÀ PHÒNG CHỐNG

SINH HỌC NẤM Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) GÂY

BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2024

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ LOAN

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, DI TRUYỀN VÀ PHÒNG

CHỐNG SINH HỌC NẤM Fusarium oxysporum f sp.

cubense (Foc) GÂY BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI Ở MIỀN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, không sao chépcủa người khác Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là hoàn toàn trungthực, có nguồn gốc rõ ràng và chưa được công bố trong bất kỳ hình thức nào

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu có sự không trung thực về thông tin sửdụng trong công trình nghiên cứu này

Hà Nội, ngày 29 tháng 01 năm 2024

Tác giả luận án

Lê Thị Loan

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án, cùng với những nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận được

sự giúp đỡ về mọi mặt của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân

Tôi xin cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Đức Huy và TS Vũ ĐăngToàn, những người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốtquá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới GS TS Steven B Janssens đã tạomọi điều kiện tốt nhất để tôi được làm thí nghiệm tại Vườn thực vật Meise, Vương quốc

Bỉ, tham dự Hội nghị thường niên lần thứ 5 về Sinh thái học và Tiến hóa của thực vật.PGS.TS Hà Viết Cường đã tận tình chỉ dạy, dẫn dắt và giúp đỡ để tôi hoàn thành tốtnhất luận án của mình

Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Bộmôn Bệnh cây, Bệnh viện Cây trồng thuộc Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Bộ mônBệnh cây và Miễn dịch thực vật, Viện Bảo vệ Thực vật đã giúp đỡ tôi trong suốt quátrình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp, các bạn sinh viên đãủng hộ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiêncứu để tôi hoàn thành được luận án này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 29 tháng 01 năm 2024

Tác giả luận án

Lê Thị Loan

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt viii

Danh mục bảng ix

Danh mục hình xi

Trích yếu luận án xiii

Disertation abstract xv

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 3

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 3

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 4

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4

Phần 2 Tổng quan tài liệu 5

2.1 Nguồn gốc, phân loại cây chuối 5

2.1.1. Nguồn gốc 5

2.1.2. Phân loại thực vật học 5

2.2 Tình hình sản xuất chuối trên thế giới và Việt Nam 5

2.2.1. Tình hình sản xuất chuối trên thế giới 6

2.2.2. Tình hình sản xuất chuối ở Việt Nam 7

2.3 Nghiên cứu bệnh héo vàng chuối trên thế giới 8

2.3.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh héo vàng chuối 8

2.3.2. Triệu chứng bệnh héo vàng chuối 8

2.3.3. Tác hại của bệnh héo vàng chuối 10

2.4 Nghiên cứu dịch tễ học và sinh thái học của nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối 11

2.4.1. Con đường lan truyền bệnh 11

2.4.2 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối 13

2.4.3 Cơ chế xâm nhiễm của nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối 14

2.4.4 Đặc điểm sinh thái của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối 15

2.4.5 Đặc điểm hình thái của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) 17

2.4.6. Ký chủ 17

2.4.7. Phân bố 18

2.5 Nghiên cứu phân loại nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối 19

2.5.1 Lịch sử nghiên cứu phân loại nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối 19

2.5.2 Cơ sở phân loại nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối 20

2.5.3 Các phương pháp nghiên cứu phân loại nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối 23

2.6 Phòng chống sinh học với nấm Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) Trên cây chuối 30

2.6.1 Trichoderma spp 31

2.6.2 Vi khuẩn Bacillus spp 32

2.6.3 Chaetomium spp 33

2.6.4 Streptomyces spp 34

2.7 Nghiên cứu bệnh héo vàng chuối ở Việt Nam 35

Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 37

3.1 Vật liệu nghiên cứu 37

3.1.1 Mẫu nấm bệnh héo vàng chuối 37

3.1.2 Vi sinh vật đối kháng 37

3.1.3 Các cặp mồi 38

3.1.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu 38

3.1.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 39

3.2 Nội dung nghiên cứu 39

3.2.1 Điều tra, đánh giá hiện trạng, thu thập và phân lập mẫu nấm bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc 39

3.2.2 Đánh giá đa dạng loài Fusarium gây bệnh héo vàng chuối ở một số tỉnh miền Bắc và Thanh Hóa, Nghệ An 40

3.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Foc-TR4 40

3.2.4 Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện invitro 40

3.2.5 Đánh giá hiệu lực phòng chống của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới 41

3.3 Phương pháp nghiên cứu 41

3.3.1 Phương pháp điều tra, đánh giá hiện trạng, thu thập và phân lập mẫu nấm bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc 41

3.3.2 Đánh giá đa dạng loài Fusarium gây bệnh héo vàng chuối ở một số tỉnh miền Bắc và Thanh Hóa, Nghệ An 45

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) 47

3.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện invitro 50

3.3.5 Phương pháp đánh giá hiệu lực phòng chống của một số vi sinh vật đối

kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới 53

3.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 54

Phần 4 Kết quả và thảo luận 55

4.1 Điều tra, đánh giá hiện trạng, thu thập và phân lập mẫu nấm bệnh héo vàng chuối 55

4.1.1. Hiện trạng bệnh héo vàng chuối tại các tỉnh miền Bắc 55

4.1.2. Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối tại một số tỉnh miền Bắc theo vùng địa lý 58

4.1.3. Mức độ gây hại của bệnh héo vàng chuối tại một số tỉnh theo vùng địa lý 60

4.1.4. Kết quả thu thập mẫu nấm bệnh héo vàng chuối tại các tỉnh 66

4.1.5 Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân tử của nấm Fusarium 68

4.1.6. Kết quả nghiên cứu bệnh héo vàng trên chuối dại 76

4.1.7 Nhận dạng chủng Fusarium (Foc) thông qua nhóm tương thích VCGs 77

4.1.8 Sự phát triển của chủng Foc-TR4 trên các môi trường nuôi cấy 79

4.2 Đa dạng loài Fusarium hại chuối tại các tỉnh miền Bắc và một số tỉnh 82

4.2.1 Khuếch đại vùng gene rbp1, rbp2 và tef1α của 19 mẫu nấm bệnh héo vàng chuối 83

4.2.2. Giải trình tự gene các mẫu nấm bệnh héo vàng chuối 84

4.2.3 Đa dạng loài Fusarium dựa trên phân tích phân tử 87

4.2.4 So sánh độ tương đồng giữa các gene tef1α và rpb2 của các mẫu phân lập 89

4.2.5. Tìm kiếm Blast và sơ sở dữ liệu Fusarium-ID.Ver 3.0 93

4.2.6. Phân tích phả hệ 98

4.2.7 Đặc điểm hình thái nấm Fusarium furikuroi 111

4.2.8 Phân bố các nhóm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối tại các vùng địa lý 112

4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) được xác định 115

4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 115

4.3.2 Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của sợi chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 118

4.3.3 Kết quả đánh giá tính gây bệnh của chủng Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) bằng lây bệnh nhân tạo 120

4.4 Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật đối kháng đến nấm Fusarium trong điều kiện In vitro 124

4.4.1 Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số loài vi khuẩn Bacillus velenzesis đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 125

4.4.2 Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của nấm Trichoderma asperellum đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 127

4.4.3 Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số chủng nấm Chaetomium globosum đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 129

4.4.4. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật có ích đến

chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 131

4.4.5. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật có ích đến chủng Foc-R1 trên môi trường PDA 133

4.5 Hiệu lực của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới 135

Phần 5 Kết luận và đề nghị 139

5.1 Kết luận 139

5.2 Đề nghị 140

Danh mục các công trình công bố 141

Tài liệu tham khảo 142

Phụ lục 157

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Chữ đầy đủ

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) là một công cụ tìm kiếm trình tự

tương đồng phổ biến trong đó cung cấp các biến khác nhau cho các trình

tự được đưa và đối với từng cơ sở dữ liệu khác nhau

BS Bootstrap support

BVTV Bảo vệ thực vật

CAGR compound annual growth rate - Tốc độ tăng trưởng hàng năm

CBTB Cấp bệnh trung bình

CLA Carnation Leaf Agar

CRD Completely Randomized design (thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên)

CSB Chỉ số bệnh

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

DNA Deoxyrobonucleic acid

FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực

Liên hiệp Quốc)ITS Internal transcribed spacer

LBNT Lây bệnh nhân tạo

MAFFT A multiple sequence alignment program, MAFFT, has been developed

MAFFT includes two novel techniques (i) Homo logous regions are rapidly identified by the fast Fourier transform (FFT)

ML Maximum Likelihood (Khả năng tối đa)

pb Base pair (cặp bazơ)

PDA Potato Dextrose Agar

PRC Polymerasa chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia

SNA Spezieller Nährstoffarmer Agar

VCG Nhóm tương hợp vô tính (Vegetative Compatibility Groups)

DANH MỤC BẢNG

2.1 Sản lượng diện tích và năng suất chuối của thế giới (năm 2022) 6

2.2 Diện tích và năng suất chuối ở một số tỉnh phía Bắc (năm 2020) 8

2.3 Các loài thuộc FOCS và Foc phân lập từ chuối theo Maryani & cs (2019a) 21

2.4 Các hệ thống phân loại FOCS dựa trên phân tích phân tử 25

3.1 Mồi đặc hiệu sử dụng PCR và trình tự DNA 38

4.1. Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối tại vùng Đông Bắc giai đoạn 2018 - 2021 59

4.2. Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối tại vùng Tây Bắc giai đoạn 2018 - 2021 59

4.3. Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối tại vùng Đồng Bằng Sông Hồng giai đoạn 2018 - 2021 60

4.4. Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối tại vùng Bắc Trung Bộ giai đoạn 2018 - 2021 60

4.5. Mức độ gây hại của bệnh héo vàng chuối tại các vùng năm 2018 - 2019 62

4.6. Mức độ gây hại của bệnh héo vàng chuối tại các vùng năm 2020 - 2021 63

4.7. Kết quả thu thập mẫu nấm bệnh héo vàng chuối tại các tỉnh 67

4.8. Danh sách mẫu nấm bệnh héo vàng chuối đại diện cho các vùng địa lý 69

4.9. Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm bệnh héo vàng chuối được thu thập trên môi trường PDA 71

4.10. Các nhóm hình thái mẫu nấm bệnh héo vàng chuối được thu thập 72

4.11 Xác định các chủng Fusarium dựa trên nhóm VCGs 78

4.12 Ảnh hưởng của các môi trường tới sự phát triển của chủng Foc-TR4 79

4.13. Ảnh hưởng của các môi trường đến sự sản sinh bào tử của chủng Foc-TR4 81

4.14 Đặc điểm trình tự của ba gene rpb1, rpb2 và teflα 85

4.15. Các gene mã vạch được giải trình tự của các mẫu nấm bệnh héo vàng

chuối được phân lập 86

4.16 Đa dạng loài Fusarium dựa trên phân tích phân tử 88

4.17 Ma trận đồng nhất trình tự gene tef1α của 19 mẫu nấm bệnh héo vàng chuối phân lập được 91

4.18 Ma trận đồng nhất trình tự gene rbp2 của 19 mẫu nấm bệnh héo vàng chuối phân lập được 92

4.19a Kết quả tìm kiếm mẫu gần gũi bằng tìm kiếm Blast đối với gene tef1α 95

4.19b Kết quả tìm kiếm mẫu gần gũi bằng tìm kiếm Blast đối với gene tef1α 96

4.20 Kết quả tìm kiếm mẫu gần gũi bằng tìm kiếm Blast đối với gene rpb2 97

4.21. Mười chín mẫu nấm bệnh héo vàng chuối trong phân tích phả hệ 102

4.22 Đặc điểm hình thái của loài nấm Fusarium furikuroi (mẫu FOC58) 112

4.23 Phân bố các nhóm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối tại các vùng địa lý 113

4.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng Foc-TR4 116

4.25 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng Foc-TR4 118

4.26 Kết quả lây nhiễm nhân tạo chủng Foc-TR4 trên một số giống chuối 123

4.27. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số loài vi khuẩn Bacillus velezensis đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 126

4.28. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của nấm đối kháng Trichoderma asperellum đến chủng Foc -TR4 trên môi trường PDA 128

4.29. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số chủng nấm Chaetomium globosum đến chủng Foc -TR4 trên môi trường PDA 130

4.30. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số nguồn vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 132

4.31. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số nguồn vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-R1 trên môi trường PDA 134

4.32 Hiệu lực của một số nguồn vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới 137

DANH MỤC HÌNH

2.1. Triệu chứng cây chuối bị nhiễm bệnh héo vàng 9

2.2 Chu kỳ của Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) trong chuối 12

2.3 Đặc điểm hình thái của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) 17

2.4 Phân bố địa lý của chủng Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) 19

2.5 Phát sinh loài Fusarium sửa đổi trong Geiser & cs (2021) 22

4.1. Triệu chứng bệnh trên chuối Tiêu 57

4.2. Triệu chứng bệnh trên chuối Tây 57

4.3 Triệu chứng bệnh trên thân chuối dại M.lutea 58

4.4. Các nhóm hình thái các mẫu nấm bệnh héo vàng chuối 73

4.5. Các mẫu nấm bệnh héo vàng chuối thuộc nhóm hình thái I (14 mẫu) 74

4.6. Các mẫu nấm bệnh héo vàng chuối thuộc nhóm hình thái II: FOC4 (A) và FOC10 (B) 75

4.7. Các mẫu nấm bệnh héo vàng chuối thuộc nhóm hình thái III: FOC56 (A) và FOC61 (B) 75

4.8. Các mẫu nấm bệnh héo vàng chuối thuộc nhóm hình thái IV: FOC58 (A) và bào tử (B) 75

4.9. Mẫu FOC5 được nuôi cấy trên môi trường PDA (A) và bào tử (B) 76

4.10. Đặc điểm hình thái bào tử lớn (A), bào tử nhỏ (B), sợi nấm (C) và bào tử hậu (D) 80

4.11 Đại diện mẫu chủng Foc-TR4 và bào tử trên các môi trường khác nhau 82

4.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR 3 vùng gene rbp1 (a), rbp2 (b) và tef1α (c) của 19 mẫu nấm bệnh héo vàng chuối trên agarose 1,5% 83

4.13. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự gene teflα được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood 103

4.14. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự gene rbp2 được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood 104

4.15. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự gene rbp1

được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood 105

4.16. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự kết hợp 3 gene tef1α + rbp2 + rbp1 được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood 106

4.17 Phân bố các nhóm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối theo các vùng địa lý 114

4.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng Foc-TR4 117

4.19 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của chủng Foc-TR4 119

4.20 Kết quả lây bệnh nhân tạo chủng Foc-TR4 trên các giống chuối 124

4.21. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số loài vi khuẩn Bacillus velezensis đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 127

4.22. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của nấm đối kháng Trichoderma asperellum đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 129

4.23. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của các chủng nấm đối kháng Chaetomium globosum đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 130

4.24. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số nguồn vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA 133

4.25. Hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số nguồn vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-R1 trên môi trường PDA 135

4.26 Hiệu lực của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới 138

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Lê Thị Loan

Tên luận án: Đặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium

oxysporum f sp cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam.

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9 62 01 12

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Đánh giá được hiện trạng bệnh héo vàng chuối, đánh giá được một số đặc điểm

sinh học chủ yếu của chủng Foc-TR4 và đa dạng loài Fusarium hại chuối ở miền Bắc

Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

* Nội dung nghiên cứu

Luận án thực hiện 4 nội dung nghiên cứu: 1) Điều tra, đánh giá hiện trạng, thu

thập và phân lập mẫu nấm gây bệnh héo vàng chuối 2) Đánh giá đa dạng loài Fusarium

gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc và Thanh Hóa, Nghệ An 3) Nghiên cứu một số

đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Foc-TR4 4) Đánh giá hiệu lực của một

số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện invitro và nhà lưới.

* Phương pháp nghiên cứu

- Phân lập, nuôi cấy nấm theo phương pháp của của Groenewald & cs (2006).Bảo quản nấm theo phương pháp của Abd-Elsalam & cs (2010)

- Tách chiết DNA mẫu nấm bệnh héo vàng chuối theo phương pháp của Lin & cs.(2008); Dellaporte & cs (1983)

- Phản ứng PCR: Khuếch đại vùng gene rpb1, rpb2 được thiết kế bởi O'Donnell

K & cs (2010), vùng gene teflα được thiết kế bởi O'Donnell & cs (1998) Giải trình tự

được tiến hành bởi Công ty Macrogene (Macrogene, Seoul, Hàn Quốc) Các phân tíchtrên ba vùng dữ liệu riêng lẻ và một ma trận dữ liệu kết hợp được thực hiện với MrBayesv3.2.6 (Ronquist & cs., 2012)

- Phân loại loài Fusarium theo phương pháp của Maryani & cs (2019a, 2019b).

- Phân tích phân tử - hình thái phát sinh loài theo phương pháp của O‟Donnell &

Cigelnik (1997) Trình tự được đọc bằng phần mềm Geneeious Prime (Biomatters, New

Zealand)

- Xác định chủng gây bệnh héo vàng chuối và so sánh các mẫu nấm bệnh héovàng chuối mới được thu thập với các VCGs đã biết theo Ordonez & cs (2015)

- Xác định tính gây bệnh của chủng (Foc-TR4) được thực hiện theo phương pháp

của Moore & cs (1995)

- Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong

điều kiện invitro được thực hiện theo phương pháp của Gopinath & cs (2006) vàKumar & cs (2012) Hiệu lực ức chế được tính theo công thức Abbott (1925)

- Các số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp so sánh Duncantrong phần mềm IRRISTAT phiên bản 5.0

Kết quả chính và kết luận

Bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây hại, là

bệnh rất phổ biến gây hại trên cây chuối ở các vùng địa lý Đông Bắc, Tây Bắc, Đồngbằng Sông Hồng và Bắc Trung Bộ với tần xuất phát hiện khu vực bị bệnh ngoài thực địa

>25% Bệnh gây hại trên các giống chuối được điều tra, ở tất cả các giai đoạn sinhtrưởng và trên hầu hết các bộ phận của cây chuối Mức độ gây hại của bệnh thườngđược phát hiện trên các vườn trồng chuối từ năm thứ 2 - 3 trở đi

Kỹ thuật PCR, giải trình tự các đoạn gene rpb1, rpb2 và tef1α của 19 mẫu nấm

bệnh héo vàng chuối đại diện cho 4 vùng địa lý đã được phân tích kết hợp các VCGs

khác nhau trong bộ dữ liệu, đã xác định được chủng 4 (Foc-TR4) (chiếm 10,5%) được

xác định gần VCG 01213 và VCG 01216 gây hại trên cả chuối tây (ABB) và chuối tiêu

(AAA) Như vậy, mẫu nấm bệnh héo vàng chuối được xác định chủng 4 (Foc-TR4) trên

chuối tây (ABB) đã khẳng định thêm thuyết tiến hóa hội tụ của FOCS và quan trọng hơn

đó là gợi ý nguồn gốc chủng Foc-TR4 là ở Việt Nam.

Phân tích đặc điểm hình thái - phân tử kết hợp của 19 mẫu nấm bệnh héo vàng

chuối, đã xác định được mức độ đa dạng loài Fusarium dựa trên giải trình tự 3 đoạn gene chính rpb1, rpb2 và tef1α, cho thấy 18/19 mẫu thuộc 4 nhóm phả hệ thuộc phức hợp loài FOCS, gồm: F tardichlamydosporum, F odoratissimum, F duoseptatum và F.

cugenangense; 1/19 mẫu thuộc phức hợp loài FFCS và được xác định là loài F fujikuroi.

Kết quả này khẳng định giả thuyết tiến hóa hội tụ của FOCS (nền di truyền khác nhau)nhưng gây bệnh héo vàng chuối

Xác định được nhóm F tardichlamydosporum nhiễm trên loài chuối dại Musa

lutea, cho thấy tầm quan trọng của chuối dại như một vật chủ có thể có đối với nấm Foc.

Nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối được nuôi cấy trên môi trường PDA cho tốc độ sinh trưởng tốt nhất Chủng Foc-TR4 phát triển ở nhiệt độ từ 15 - 35oC, nhiệt độtối thích cho nấm phát triển là 25oC Độ pH thích hợp cho chủng Foc-TR4 sinh trưởng

Nấm đối kháng Trichoderma asperellum cho hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm

là cao nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm, hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm đối

với chủng Foc-TR4 đạt (74,52%) và đạt 65,2% đối với chủng Foc-R1.

Hiệu lực phòng trừ chủng Foc-TR4 trong điều kiện phòng và nhà lưới đạt cao nhất đối với nấm đối kháng Trichoderma harzianum Trong điện kiện nhà lưới, sau 60 ngày xử

lý đạt 75,2%, chỉ số bệnh đạt 3,1% Trong điều kiện phòng đạt 70,2%

DISERTATION ABSTRACT

Doctoral candidate: Le Thi Loan

Dissertation title: Biological characteristics, genetics and biological prevention of

Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) causing Fusarium wilt of banana in Northern

Vietnam

Field: Plant Protection Code: 9 62 01 12

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

Evaluating the current status Fusarium wilt of banana, characterize important

biological of Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4) strain and diversity of Fusarium species in Northern Vietnam.

Materials and Methods

Fusarium samples were collected in banana fields Antagonistic microorganisms were

provided by Department of Plant Pathology, Vietnam National University of Agriculture,Plant Pathology and Immumology Division, Plant Protection Rearch Institute Chemicalsused in experiment

* Methods

- Fungal isolation according to the method of Groenewald et al., (2006) Storage of samples according to the method of Abd-Elsalam et al (2010).

- Determining of Foc-TR4 race according to the method of Moore et al (1995).

- DNA extraction according to Lin et al (2008); Dellaporte et al (1983);

- PCR reaction: Amplification of the rpb1, rpb2 gene region designed by O'Donnell K & et al (2010), the teflα gene region designed by O'Donnell et al (1998).

Sequencing was conducted by Macrogene Company (Macrogene, Seoul, Korea).Analysis on three data individual regions and a combined data matrix were performed

with MrBayes v3.2.6 (Ronquist et al., 2012).

- Classification of Fusarium species according to the method of Maryani et al.

(2019a, 2019b)

- Molecular - morphological phylogenetic analysis according to the method ofO'Donnell & Cigelnik (1997) Sequences were read using Geneeious Prime software(Biomatters, New Zealand)

- Identification of Foc-TR4 race base on VCGs (Ordonez et al 2015).

- Determining the pathogenicity of the Foc-TR4 race according to the method of Moore et al (1995).

- Calculation of effectiveness of antagonistic microorganisms on Foc-TR4 race

according to the Abbott formula (1925)

- Statistically processing of other experimental data using the Duncan comparemethod in IRRISTAT 5.0 software

Main results and conclusions

Investigating the current status and collecting samples of Fusarium wilt of banana

on different banana cultivars carried out from 2018 to 2021, has identified Fusarium wilt of

banana caused by Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc), is a very common disease that

damages on banana in the Northern and Thanh Hóa, Nghe An with a frequency of >25%detection in diseased areas in the fields The disease affects the investigated bananavarieties, at all stages of growth and on most parts of the banana The harmful level of thedisease is often detected in banana fields from the 2nd - 3rd year onwards

PCR technique, sequencing gene segments rpb1, rpb2 and tef1α of 19 Fusarium

wilt of banana samples representing 4 geographical regions were analyzed combining

different VCGs in the data set race 4 (Foc-TR4) (accounting for 10.5%) was identified

near VCG 01213 and VCG 01216 causing damage ABB and AAA group both Thus,

the Fusarium wilt of banana sample identified as race 4 (Foc-TR4) on ABB group has

further confirmed the convergent evolution theory of FOCS and more importantly,

suggested the origin of the Foc-TR4 race is in Vietnam.

Combine analyze of morphological - molecular characteristics of 19 Fusarium

wilt of banana samples were determined diversity of Fusarium species based on sequencing of 3 main gene segments rpb1, rpb2 and tef1α, 18/19 samples belonging to

4 genealogical groups of the FOCS species complex, including: F.

tardichlamydosporum, F odoratissimum, F duoseptatum and F cugenangense; 1/19

samples belonged to the FFCS species complex and were identified as F fujikuroi This

result confirms the hypothesis of convergent evolution of FOCS (different geneticbackgrounds) but causes Fusarium wilt of banana

Identification of the F tardichlamydosporum group infecting the wild banana

Musa lutea species, demonstrating the importance of wild bananas as a possible host for

the Foc fungus

Fusarium cultured on PDA medium has the best growth rate Foc-TR4 race grows

at temperatures from 15 - 35oC The optimal temperature for fungal growth is 25oC The

appropriate pH for Foc-TR4 strain to grow and the best from pH 6.0 - 7.0.

The results of assessing the pathogenicity of Foc-TR4 race showed that the infection rate reached 100% The dormancy period of the Foc-TR4 race that causes disease in bananas is 40 - 45 days On banana varieties - Musa paradisiaca L (banana group with AAA genome), symptoms appear earlier than (40 days) On Musa

sapientum L (banana group (ABB genome), symptoms appear after 45 days infection.

The antagonistic fungus Trichoderma asperellum showed the highest inhibitory effect on fungal colony growth under laboratory conditions Foc-TR4 race had the highest inhibitory effect (74.52%) and reached 65.2% for Foc- R1 race The prevention effectiveness for Foc-TR4 race in greenhouse ang room conditions was highest against the antagonist fungus Trichoderma harzianum The greenhouse condition after 60 days

of treatment, reaching 75.2%, with disease index reaching 3.1% and 70,2% in the roomcondition

PHẦN 1 MỞ ĐẦU1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chuối thuộc chi Musa spp., họ Musaceae FAOSTAT (2019) đã đưa cây

chuối thuộc nhóm cây ăn quả hỗ trợ sinh kế và an ninh lương thực của hàng triệungười trên toàn cầu

Trên thế giới chuối được trồng ở 150 quốc gia, diện tích khoảng 5,2 triệu havới sản lượng xấp xỉ 125 triệu tấn (FAOSTAT, 2022) Việt Nam thuộc nhóm 11nước có diện tích đang cho thu hoạch và sản lượng chuối lớn nhất thế giới (tươngứng bằng 2,2% và 1,76%), đứng thứ 3 ở Đông Nam Á về diện tích thu hoạch (sauPhilippines, Thái Lan) và sản lượng (sau Philippines, Indonesia) (FAOSTAT,2022)

Theo Cục trồng trọt (9/2023), diện tích trồng chuối của nước ta trong banăm qua tăng nhẹ, từ 152,8 nghìn ha năm 2020 lên 154,2 nghìn ha năm 2021 và157,1 nghìn ha năm 2022 Năng suất và sản lượng chuối cũng tăng, từ 166,0tạ/ha năm 2020 lên 169,6 tạ/ha và 175,0 tạ/ha năm 2022 cho sản lượng lần lượt là2,27 triệu tấn, 2,35 triệu tấn và 2,51 triệu tấn Một số giống chuối có diện tích lớnnhư chuối sứ (Xiêm) chiếm 30,3%, chuối tiêu hồng (14,4%), chuối già hương(11,6%) và một số giống khác như chuối tây, chuối tiêu…

Trong những năm gần đây, bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium

oxysporum f sp cubense (Foc) gây ra đã được phát hiện tại các vùng trồng chuối

tập trung ở miến Bắc nước ta như Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Thái Nguyên,Lào Cai với mức gây hại 25 - 30% tùy giống và vùng trồng Triệu chứng bênngoài của bệnh: mép lá vàng, lá bị gẫy gập treo trên thân giả Triệu chứng bêntrong mạch xylem chuyển màu từ vàng nhạt, đỏ sẫm đến nâu đen Bệnh xuất hiện

và gây hại ở các vườn chuối trồng từ 2 - 3 năm tuổi trở lên, các vùng trồng lâunăm thì tỷ lệ cây bị bệnh càng cao Nấm gây hại trên tất cả các bộ phận và cácgiai đoạn sinh trưởng của cây chuối Cây bị nhiễm bệnh cho buồng và quả nhỏhoặc không ra buồng (Cục BVTV, 2020)

Nguyễn Văn Khiêm (2000) nghiên cứu 60 mẫu nấm FOC tại 7 tỉnh bao gồm

Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, và Thừa Thiên Huế

đã xác định là nấm gây bệnh vàng lá trên chuối ở nước ta thuộc chủng 1, chưaphát hiện ra bệnh vàng lá trên chuối tiêu

Kết quả nghiên cứu của tác giả Hùng & cs (2018) đã xác đinh chủng

Foc-TR4 ảnh hưởng đến chuối tiêu và các loại chuối khác ở vùng nhiệt đới, là bệnh

hại quan trọng ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng chuối, đây là mộttrong những vấn đề gây trở ngại trong sản xuất chuối của Việt Nam

Kết quả đánh giá hiện trạng bệnh héo vàng chuối của L.T.Loan và cs., giaiđoạn 2018 - 2020 (Hội thảo KH-HVNN, 2020), cho thấy bệnh xuất hiện ở hầuhết các tỉnh trồng chuối được điều tra như: Lào Cai, Hưng Yên, Hà Nội, PhúThọ…, tỷ lệ bệnh gây hại trên chuối tiêu từ 15 - 30% (Vĩnh Phúc, Phú Thọ),thậm chí lên tới 90% (Khoái Châu, Hưng Yên)

Kết quả các cuộc điều tra, đánh giá bệnh héo vàng chuối cho thấy, bệnhđang có xu hướng lây lan, phát triển ra nhiều vùng, gây thiệt hại nặng, đặc biệttrên chuối tiêu bệnh có xu hướng gây hại nặng hơn trên chuối tây Vì vậy cần cóbiện pháp quản lý bệnh hiệu quả Người dân cũng đã áp dụng biện pháp như thaythế giống chuối ở những khu ruộng bị nhiễm nặng, như những khu vực trồngchuối tiêu bị bệnh nặng nên chuyển sang trồng giống chuối tây, sử dụng giốngsạch bệnh, xử lý đất trước khi trồng, bón phân cân đối, quản lý nguồn nước…

Bên cạnh đó, các nghiên cứu về sự gây hại của nấm Fusarium cho thấy nấm gây

bệnh phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của nấm cũng như sự thay đổi các điềukiện trồng trọt, môi trường Mỗi loài nấm có yêu cầu khác nhau về ký chủ, vềđiều kiện phát sinh gây bệnh cũng như các biện pháp phòng chống Xác địnhđược chính xác nấm gây bệnh, đặc điểm sinh học, di truyền của nấm gây bệnhhéo vàng chuối sẽ là cơ sở để xây dựng được các biện pháp quản lý bệnh tốt hơnnhằm hạn chế sự lây lan, phát tán cũng như giảm thiều thiệt hại do nấm bệnh gâyra

Xuất phát từ những lý do trên, thực hiện đề tài: “Đặc điểm sinh học, di

truyền và phòng chống sinh học nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc)

gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam” là cần thiết Kết quả nghiên cứucủa đề tài sẽ góp phần xây dựng chiến lược phòng chống, giảm sự gây hại củanấm gây bệnh trên chuối, tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất chuối và bảo vệđược sự bền vững của môi trường

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Đánh giá được hiện trạng bệnh héo vàng chuối, đánh giá được một số đặc

điểm sinh học chủ yếu của chủng Foc-TR4 và đa dạng loài Fusarium hại chuối ở

miền Bắc Việt Nam

- Xác định được đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Foc-TR4

- Đánh giá được hiệu lực phòng chống sinh học chủng Foc-TR4 và Foc-R1

trong điều kiện invitro và trong điều kiện nhà lưới

1.3 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối.

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu điều tra, đánh giá hiện trạng bệnh héo vàng

chuối Nghiên cứu đặc điểm sinh học, tính gây bệnh, đa dạng loài Fusarium và

phòng chống sinh học trong điều kiện invitro, nhà lưới

Về không gian: Một số tỉnh miền Bắc Việt Nam và Thanh Hóa, Nghệ An

Về thời gian: Từ 2018 - 2023

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

1 Kỹ thuật PCR, giải trình tự các đoạn gene rpb1, rpb2 và tef1α của 19

mẫu nấm bệnh héo vàng chuối đại diện cho 4 vùng địa lý đã được phân tích kết

hợp các VCGs khác nhau trong bộ dữ liệu, đã xác định được chủng 4 (Foc-TR4)

(chiếm 10,5%) được xác định gần VCG 01213 và VCG 01216 gây hại trên cảchuối tây (ABB) và chuối tiêu (AAA) Như vậy, mẫu nấm bệnh héo vàng chuối

được xác định chủng 4 (Foc-TR4) trên chuối tây (ABB) đã khẳng định thêm

thuyết tiến hóa hội tụ của FOCS và quan trọng hơn đó là gợi ý nguồn gốc chủng

Foc-TR4 là ở Việt Nam.

2 Phân tích đặc điểm hình thái - phân tử kết hợp của 19 mẫu nấm bệnh héo

vàng chuối, đã xác định được mức độ đa dạng loài Fusarium dựa trên giải trình tự 3 đoạn gene chính rpb1, rpb2 và tef1α, cho thấy 18/19 mẫu thuộc 4 nhóm phả hệ thuộc phức hợp loài FOCS, gồm: F tardichlamydosporum, F odoratissimum, F.

duoseptatum và F cugenangense; 1/19 mẫu thuộc phức hợp loài FFCS và được

xác

định là loài F fujikuroi Kết quả này khẳng định giả thuyết tiến hóa hội tụ của

FOCS (nền di truyền khác nhau) nhưng gây bệnh héo vàng chuối

3 Luận án đã xác định được nhóm F tardichlamydosporum nhiễm trên loài chuối dại Musa lutea, cho thấy tầm quan trọng của chuối dại như một vật chủ có

thể có đối với nấm Foc

4 Cung cấp dẫn liệu mới về phòng chống sinh học một số loài vi sinh vậtđối kháng (nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn) có thể ứng dụng để quản lý bệnh héovàng chuối

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã chứng minh được chuối ở miền Bắc Việt Nam bị nhiễm

bệnh héo vàng được đặc trưng bởi nhiều nhóm Fusarium khác nhau (F.

cugeneangenese, F odoratissimum, F duoseptatum và F tardichlamydosporum)

thuộc phức hợp loài Fusarium oxysporum (FOCS) Trong số này, nhóm F.

odoratissimum xuất hiện và gây hại nghiêm trọng đến giống chuối tiêu, các nhóm

khác gây hại ít nghiêm trọng hơn Nhóm F tardichlamydosporum cũng xuất hiện

ở điều kiện tự nhiên đối với loài chuối dại Musa lutea.

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã bổ sung dữ liệu mới, có giá trị về phân

loại, định danh, phân tích đa dạng loài nấm Fusarium và mức độ gây bệnh héo

vàng chuối bằng phương pháp kết hợp đặc điểm hình thái và kỹ thuật phân tử,

đóng góp vào hiểu biết chung về các loài Fusarium gây hại trên chuối ở

miền Bắc Việt Nam

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Hiện nay, bệnh héo vàng chuối là một trong những bệnh hại nghiêm trọngảnh hưởng đến sản xuất chuối tại Việt Nam, đặc biệt gây hại nặng trên chuối tiêu,

là giống chuối có giá trị xuất khẩu Phòng chống sinh học được coi là giải phápchiến lược trong phòng trừ bệnh héo vàng chuối hiệu quả để giảm việc sử dụngthuốc diệt nấm và giảm thiểu mức độ gây hại của bệnh ngoài sản xuất Vì vậy kếtquả của đề tài cũng có giá trị tham khảo để xây dựng quy trình phòng trừ nấm

Fusarium gây bệnh héo vàng chuối bằng biện pháp sinh học.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI CÂY CHUỐI

2.1.1 Nguồn gốc

Chuối (Musa spp.) là một trong những loại cây ăn quả cổ xưa nhất được

con người biết đến và sử dụng Nó có nguồn gốc ở Đông Nam Á và khu vực TháiBình Dương và được cho là đã được thuần hóa lần đầu tiên cách đây hơn 7000năm Đông và Trung Phi là trung tâm thuần hóa thứ cấp (ITC News, 2018)

Ngày nay cây chuối đã được phát triển ở hầu khắp các vùng nhiệt đới, ánhiệt đới ẩm trên thế giới, phân bố từ 30o vĩ Nam đến 30o vĩ Bắc Từ Nam Ấn Độkéo dài đến vùng Queensland của châu Úc, đó là các vùng Đông Dương,Indonesia, Philippine, Nhật Bản và các đảo của Thái Bình Dương Sự đa dạng vềnguồn gene cây chuối không chỉ ở nơi phát sinh nguồn gốc mà còn ở khu vựcNam Mỹ, Đông Phi và Tây Phi (Brown & cs., 2017)

2.1.2 Phân loại thực vật học

Các giống chuối trồng đều xuất phát từ 2 loài chuối dại có hạt trong chi

Musa là Musa acuminata và Musa balbisiana Chính sự tái tổ hợp trong điều

kiện tự nhiên và qua nhiều đời giữa 2 loài này đã hình thành rất nhiều nhóm

giống chuối Trong đó, nhóm Cavendish mang kiểu gene AAA với rất nhiều

giống chuối tiêu thương mại đang được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia và vùnglãnh thổ Các nghiên cứu về chọn tạo giống và phát triển sản xuất chuối chủ yếuđược thực hiện đối với nhóm này (Simmond & Shepherd, 1955)

Trong một thời gian dài, chi Musa được tổ chức thành 4 phần dựa trên đặc điểm hình thái và số lượng nhiễm sắc thể: Eumusa và Rhodochlamys với số lượng nhiễm sắc thể 2n = 2x = 22, Australianmusa và Callimusa với 2n = 2x =

20 (Cheesman, 1947; Franchet, 1889; Šimoníková & cs, 2022; Wu, 1978) Đôi

khi, một đoạn thứ năm Ingentimusa được xem xét dựa trên sự hiện diện của số nhiễm sắc thể 2n = 2x = 14 Australianmusa và Callimusa được xác định về mặt

hình thái bằng cách có các lá bắc được mài nhiều và đánh bóng ở mặt trụ Các

loài Australianmusa được phân định từ các loài Callimusa bằng cách có hạt dưới

hình cầu hoặc mặt lưng bị nén với một khoang nhỏ ở đỉnh Ngược lại, hạt

Callimusa có hình trụ hoặc hình thùng và có các khoang đỉnh lớn (Wong & cs.,

2002) Eumusa và Rhodochlamys được đặc trưng bởi có các lá bắc uốn lượn hoặc

hình thoi, hiếm khi hoặc không bao giờ được đánh bóng Các thành viên của

phần Eumusa được đặc trưng bởi có các lá bắc màu xỉn, thường cao hơn ba mét,

tạo ra một số hoa trên mỗi lá bắc, trong khi các thành viên của phần

Rhodochlamys luôn cao dưới ba mét với các cụm hoa thẳng đứng, chỉ có một vài

hoa trên mỗi lá bắc con và lá bắc con màu sáng Cả hai phần Eumusa và

Callimusa đều có đại diện tại Việt Nam Sau đó, (Wong & cs., 2002) lập luận

rằng các phần Eumusa và Rhodochlamys nên được hợp nhất thành một phần (2n

= 2x = 22) và phần Australianmusa nên được đưa vào phần Callimusa phóng to

(2n = 2x = 20) Vào năm 2013, Häkkinen đã tiến hành chỉnh sửa kỹ lưỡng các

phần Musa và quyết định xác nhận việc tổ chức lại này (Häkkinen, 2013) Hơn nữa, Häkkinen (2013) ước tính số lượng loài trong chi Musa vào khoảng 70 trong

đó 33 loài thuộc phần Musa và 37 loài thuộc phần Callimusa mới Tuy nhiên,

danh sách này có nhiều từ đồng nghĩa và đồng âm và cần được tối ưu hóa hơnnữa từ góc độ phân loại và hệ thống

2.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHUỐI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.2.1 Tình hình sản xuất chuối trên thế giới

Có khoảng 1.000 giống chuối được trồng ở 150 quốc gia với diện tích 5,2triệu ha Sản lượng chuối tăng từ khoảng 97 triệu tấn năm 2008 lên gần 125 triệutấn vào năm 2022 (FAOSTAT, 2022)

Bảng 2.1 Sản lƣợng diện tích và năng suất chuối của thế giới (năm 2022)

Năng suất (kg/ha)

chuối lớn nhất thế giới với sản lượng 30.460,000 tấn mỗi năm Trung Quốc đứngthứ hai với sản lượng 11.998,329 tấn hàng năm Với 7.280,659 tấn sản lượng mỗinăm, Indonesia là nước sản xuất chuối lớn thứ ba (FAOSTAT, 2022)

Ấn Độ là nhà sản xuất chuối lớn nhất nhưng phần lớn sản lượng của nướcnày là dành cho tiêu dùng nội địa Vì vậy Ecuador, Philippines và Costa Rica đãtrở thành nước xuất khẩu lớn nhất thế giới, tương ứng 7 triệu tấn, 3,1 triệu tấn và2,6 triệu tấn (UN Comtrade, 2022) Liên minh châu Âu, Hoa Kỳ và Trung Quốc

là những nhà nhập khẩu chuối hàng đầu, tương ứng khoảng 5,2 triệu tấn, 4,7 triệutấn và 1,8 triệu tấn (Tridge, 2021) Mặc dù nguồn cung chuối toàn cầu phụ thuộcnhiều vào thời tiết nhưng sản xuất chuối vẫn có thể đáp ứng nhu cầu ngày càngtăng (Hommel, 2019) Chuối Cavendish đã trở thành giống chuối được tiêu thụnhiều nhất và là giống chiếm gần một nửa số giống chuối xuất khẩu được trồngtrên toàn thế giới (Cross, 2019)

2.2.2 Tình hình sản xuất chuối ở Việt Nam

Theo Cục trồng trọt (9/2023), diện tích trồng chuối của nước ta trong banăm qua tăng nhẹ, từ 152,8 nghìn ha năm 2020 lên 154,2 nghìn ha năm 2021 và157,1 nghìn ha năm 2022 Năng suất và sản lượng chuối cũng tăng, từ 166,0tạ/ha năm 2020 lên 169,6 tạ/ha và 175,0 tạ/ha năm 2022 cho sản lượng lần lượt là2,27 triệu tấn, 2,35 triệu tấn và 2,51 triệu tấn Một số giống chuối có diện tích lớnnhư chuối sứ (Xiêm) chiếm 30,3%, chuối tiêu hồng (14,4%), chuối già hương(11,6%) và một số giống khác như chuối tây, chuối tiêu thường…

Theo Cục BVTV (8/2020), phân theo vùng sản xuất chuối cho thấy: Các tỉnhmiền Bắc: Diện tích ước khoảng 70,316 ha Năng suất trung bình 187,6 tạ/ha, sảnlượng đạt 1,2 triệu tấn Các tỉnh miền Nam, cây chuối có diện tích lớn thứ hai saucây xoài nhưng sản lượng đứng đầu, tốc độ tăng trưởng ổn định: Diện tích toànmiền Nam 83,825 ha, năng suất trung bình 142,1 tạ/ha, sản lượng đạt 1,1 triệu tấn.Hầu hết các tỉnh có diện tích chuối từ 1,000 - 3,000 ha, một số tỉnh có diện tíchkhoảng 4,000 ha trở lên gồm: Lai Châu, Sơn La, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị,Quảng Nam, Khánh Hòa, Đồng Nai, Tiền Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng và Cà Mau.Cây chuối đã được Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đưa vào danh mục làmột trong sáu loài cây trồng chính (Bộ NN&PTNT, 2019) Tại các tỉnh phía Bắc,giống chuối chủ yếu được trồng là nhóm giống chuối tiêu (AAA), nhóm giốngchuối tây (ABB) và các nhóm giống chuối khác

Năng suất (tấn/ha)

Sản lƣợng (nghìn tấn)

Diện tích trồng chuối dao động từ 1.971 - 3.348 ha tương ứng với Lào Cai

và Phú Thọ, năng suất từ 22.625 tấn/ha ở Hưng Yên đến 26.332 tấn/ha ở Hà Nội.Năng suất trung bình ở các tỉnh đạt 25.120 tấn/ha

Trong thời gian tới, Cục trồng trọt định hướng phát triển khoảng 165.000 175.000 ha chuối, sản lượng 2,6 - 3,0 triệu tấn Tăng cường sử dụng các giống cónăng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh vàng lá Panama

-2.3 NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI TRÊN THẾ GIỚI

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo vàng chuối

Báo cáo và mô tả đầu tiên về bệnh héo vàng chuối (bệnh Panama) do nấm

Fusarium gây hại trên thế giới là từ Australia Năm 1874, Joseph Bancroft phát

hiện trên giống chuối Sugar, AAB và Silk subgroup bị bệnh héo vàng do nấm

Fusarium tại Eagle Farm (27°S 431°E) gần Brisbane (Bancroft, 1876) Mô tả của

Bancroft về các triệu chứng cho thấy bệnh héo vàng chuối đã xuất hiện (Pegg &cs., 1996) Ông nhận ra mầm bệnh có thể lây lan dễ dàng bằng cách nhân giốngsinh dưỡng và đề xuất việc lựa chọn cẩn thận vật liệu trồng sạch bệnh Đây làcuộc điều tra bệnh lý thực vật đầu tiên được ghi nhận ở Queensland Bệnh héo

vàng chuối do nấm Fusarium một lần nữa được công nhận bởi Tryon (1912),

người đã ghi nhận tính nhạy cảm của giống chuối Sugar và Gros Michel và khảnăng kháng lại bệnh này của chuối Cavendish

2.3.2 Triệu chứng bệnh héo vàng chuối

Các triệu chứng khác nhau của bệnh héo vàng chuối (hay còn gọi là bệnhPanama) được mô tả bởi Ploetz & Pegg (2000), Pérez-Vicente & cs (2014) (Hình2.1)

Triệu chứng bên ngoài điển hình trên cây chuối là các lá phía dưới chuyểnmàu vàng, lá gẫy gập treo trên thân giả Ở giai đoạn đầu là một vệt hoặc mảngmàu xanh nhạt đến vàng nhạt ở gốc cuống lá của một trong hai lá già nhất Bệnh

sau đó có thể tiến triển theo những cách khác nhau Các lá già hơn có thể chuyểnsang màu vàng, bắt đầu bằng các mảng ở mép lá Màu vàng tiến triển từ lá giàđến lá non cho đến khi chỉ lá ở giữa mới xòe hoặc xòe một phần lá, phần lá cònlại dựng đứng và có màu xanh Quá trình này có thể mất từ 1 đến 3 tuần đối vớigiống 'Gros Michel' Thông thường các lá vàng vẫn đứng thẳng trong 1-2 tuầnhoặc một số lá có thể bị xẹp ở cuống lá và rủ xuống thân giả Ngược lại với 'hộichứng vàng' này, lá có thể vẫn hoàn toàn xanh ngoại trừ một vệt hoặc mảng ởcuống lá nhưng bị xẹp do cuống lá bị gãy gập Các lá già nhất rụng trước, chođến khi toàn bộ lá rủ xuống bám trên thân giả Cuối cùng, tất cả các lá trên cây bịnhiễm bệnh rụng xuống và khô héo Lá non, lá xì gà (lá non trên cùng của câychuối) là những lá cuối cùng gãy gập và thường đứng thẳng một cách bất thường.Triệu chứng trên thân giả phía phần gốc bị tách ra Các triệu chứng khác bao gồmcác mép lá non không đều, nhợt nhạt và lớp lá bị nhăn và biến dạng

Hình 2.1 Triệu chứng cây chuối bị nhiễm bệnh héo vàng

Nguồn: Promusa.org (2019)

Triệu chứng bên trong của bệnh héo vàng chuối được đặc trưng bởi sự đổimàu của mạch xylem: bắt đầu với sự ố vàng của rễ và mô mạch, các sợi vàng, đỏ,

nâu phát triển liên tục trong thân giả (Moore & cs., 1995) Giai đoạn đầu củabệnh là sự đổi màu từ một hoặc hai sợi trong bẹ lá già nhất lớp ngoài cùng củathân giả, dần đến sự đổi màu nặng hơn trên khắp thân giả và cuống quả trong giaiđoạn bệnh sau này Sự đổi màu thay đổi từ màu vàng nhạt ở giai đoạn đầu sangmàu đỏ sẫm, nâu hoặc gần như đen ở giai đoạn sau Sự đổi màu rõ rệt nhất ở thân

rễ trong khu vực có mạch xylem dày đặc ở vùng củ và thân giả

Ở những nơi bệnh héo rũ thành dịch và lây lan nhanh chóng Các bộ phậntrên và dưới mặt đất của cây chịu ảnh hưởng cuối cùng bị thối rữa và chết Nấmbệnh gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng và trên hầu hết các bộ phận củacây chuối (Ploetz, 2015) Cây bị nhiễm bệnh sẽ không ra buồng quả và nếu cóbuồng quả thì quả rất nhỏ, không phát triển (Pushpavathi & cs., 2016)

2.3.3 Tác hại của bệnh héo vàng chuối

Fusarium là một trong những nấm bệnh thực vật quan trọng nhất có tác

động đáng kể đến kinh tế, xã hội và sinh học đối với sinh kế hàng ngày của hàng

triệu người trên toàn thế giới (Dean & cs., 2012) Trong chi nấm Fusarium, loài

F oxysporum là một trong hai loài nấm bệnh nguy hiểm nhất, bên cạnh F gramineum Tổ hợp loài Fusarium oxysporum (FOCS) là nguyên nhân gây bệnh

héo rũ của nhiều loại cây trồng khác nhau (ví dụ: bệnh héo rũ bông và cà chua)

nhưng chủ yếu được biết đến bởi bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium

oxysporum f sp cubense (Foc) gây ra, có tác động lớn đến ngành sản xuất chuối.

Trong hơn 100 năm, loài nấm (Foc) này đã ảnh hưởng đến sản xuất chuối trêntoàn thế giới (Ploetz & Pegg, 2000; Ploetz, 2015a)

Nấm Foc là tác nhân gây bệnh héo vàng chuối, được chia thành 3 chủng và

24 nhóm tương thích sinh dưỡng (VCGs) Những năm đầu của thế kỷ 20, chủng

1 và chủng 2 gây ra những thiệt hại nặng nề trên giống chuối GrosMichel ảnhhưởng tới ngành công nghiệp xuất khẩu chuối ở Nam Mỹ và Trung Mỹ Sau đócác giống chuối tiêu Cavendish có khả năng kháng với chủng 1 và 2 được thaythế Giống đã đóng góp tới 45% tổng sản lượng canh tác toàn cầu (Ploetz, 2015a

2015b) Chủng nhiệt đới Foc 4 (TR4) đặc biệt dễ lây lan trên các giống chuối Cavendish hiện nay (Ho & cs 2015; Li & cs 2019) Mặc dù TR4 đang được giới

hạn ở Châu Phi và Châu Á, nhưng các hoạt động xuất khẩu chuối rất dễ làm bệnhlây lan mặc dù đã có sự hạn chế (Ordonez& cs., 2015; Ploetz, 2015a, 2015b;Zheng & cs., 2018)

Người ta ước tính rằng hơn 80% sản lượng chuối toàn cầu tập trung vào nguồn

gene chuối dễ bị nhiễm TR4 (Pérez-Vicente & cs., 2014)

Bệnh đã lây lan rất rộng ở khắp các vùng trồng chuối Cavendish tại châu

Úc, Nam Mỹ và Trung Mỹ gây ra những thiệt hại nặng nề cho ngành côngnghiệp xuất khẩu chuối Số liệu thống kê của một số quốc gia cho thấy, bệnh đãảnh hưởng đến khoảng 15.700 ha chuối (trong tổng số 440.000 ha) ở Philippines(Ordonez & cs., 2015) và khoảng 70% diện tích trồng chuối ở Quảng Đông vàHải Nam ở Trung Quốc (Pemsl & Staver, 2014; Ordonez & cs., 2015)

2.4 NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC VÀ SINH THÁI HỌC CỦA NẤM FUSARIUM GÂY BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI

2.4.1 Con đường lan truyền bệnh

Nấm Fusarium oxysporum là một loại nấm tồn tại trong đất, Foc xâm nhập

vào hệ thống rễ, từ đó nó di chuyển vào mô mạch dẫn đến thoái hóa dần Khi đếnthân củ, bệnh héo rũ xảy ra cuối cùng, dẫn đến cái chết của cây bị nhiễm bệnh

(Stover, 1962a) Fusarium có cơ quan sinh trưởng phân nhánh, dạng sợi Thể

dinh dưỡng của chúng là một tản nấm được tạo thành từ nhiều sợi nấm đơn bào(không có màng ngăn) và đa bào (có màng ngăn) tập hợp lại với nhau Thể sợicủa nấm thường không màu hoặc chuyển màu nâu khi già Hệ sợi nấm sản sinhđộc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ (Iori Inoue & cs., 2002)

Trong những năm qua, các nghiên cứu về quá trình lây nhiễm và chu kỳbệnh của bệnh héo vàng Fusarium trên chuối đã được thực hiện Kết quả chỉ rasợi nấm và cành bào tử được tạo ra sau 6–8 giờ kể từ khi bào tử hậu nảy mầm,trong khi các bào tử hậu mới sẽ được tạo ra sau 2–3 ngày (Li & cs., 2017; Guo &cs., 2014; Li & cs., 2011) Sự lây nhiễm không được bắt đầu thông qua rễ chính

mà thay vào đó diễn ra thông qua các rễ phụ cấp 2 hoặc cấp 3 (Trujillo, 1963;Zhang & cs., 2018) Theo Beckman, (1987 & 1990), tác nhân gây bệnh lâynhiễm vào rễ của cả giống mẫn cảm và kháng bệnh, nhưng sự lây nhiễm của cácđoạn mạch của thân rễ nổi bật hơn ở các kiểu gene mẫn cảm Để đáp ứng với sựlây nhiễm, gôm và gel được tạo ra trong mạch xylem Hầu hết khi bệnh nhiễmđều bị chặn lại, nhưng một số trong số chúng di chuyển lên toàn bộ cây, đi quathân rễ và lên thân giả Mầm bệnh có thể thông qua nhiều mạch xylem khác nhaubắt đầu từ rễ (Li, 2011; Zhang, 2018) Tuy nhiên, sự xâm nhập của mầm bệnhtrong thân rễ bị nhiễm bệnh được coi là hiệu quả nhất (Li, 2017) Khi bệnh phát

triển, mầm bệnh di chuyển ra khỏi hệ thống mạch xylem đến nhu mô lân cận tạothành bào tử và bào tử phân sinh được giải phóng vào đất khi cây chết Nhữngbào tử này có thể không hoạt động trong đất trong nhiều năm (Stover, 1962;Buddenhagene, 2009) Ploetz (2015) cho rằng khả năng sống sót dai dẳng củamầm bệnh trong đất được góp phần bởi sự hiện diện của vật chủ là cây chuốiđang phát triển

Hình 2.2 Chu kỳ của Fusarium oxysporum f sp cubense

(Foc) trong chuối

Chú thích: (A) Các loại bào tử (bảo tử nhỏ, bào tử lớn và bào tử hậu) nằm trong đất hoặc trên các vật chủ

thay thế như cỏ dại (B) Bào tử hậu (Chlamydospores) nảy mầm được kích thích bởi dịch tiết ra từ rễ và

các ống mầm xâm nhập vào rễ chuối (C) Foc phát triển qua vỏ đến biểu bì và sợi nấm xâm nhập vào hệ

thống mạch dẫn (D) Cành bào tử và Bào tử Chlamydospores liên tục được sinh ra trong các mô mạch

dẫn Cành bào tử di chuyển trong cây thông qua hệ thống thoát hơi nước Sợi nấm và gôm chặn các mô mạch dẫn và các triệu chứng vàng đầu tiên được quan sát thấy ở các lá già (E) Foc xâm chiếm và phá hủy nhiều mô mạch dẫn đến hiện tượng héo rũ (F) Cây bị nhiễm bệnh chết và cây theo sau (cây con) đã bị lây nhiễm bởi cây mẹ thông qua kết nối mạch dẫn, cho thấy các triệu chứng ban đầu Cây mẹ cuối cùng bị

chết và chu kỳ bệnh lại bắt đầu.

Nguồn: Dita & cs (2018)

Ngoài ra, Foc đã được chứng minh là có khả năng lây lan theo nhiều cách

khác nhau, thông qua côn trùng chích hút như loài Cosmopolites sordidus (bộ

Coleoptera; họ Curculionidae) bị nhiễm bệnh là hiệu quả nhất (Stover, 1962a).Trong nhiều trường hợp, các loài chích hút được xử lý bằng thuốc diệt nấm Tuynhiên, ngay cả sau khi đã có thể sản xuất vật liệu nuôi cấy mô, việc gây ô nhiễmthứ cấp cho các đồn điền trồng chuối do Foc vẫn phổ biến Ví dụ, các đồn điền

giống chuối Cavendish bị ảnh hưởng bởi chủng TR4 được trồng bằng cây con

nuôi cấy mô (Ploetz, 2015)

Foc có khả năng lây lan trong đất, gián tiếp gây nhiễm bên trong và xungquanh khu vực trồng chuối (Buddenhagene, 2009) Ngoài ra, Foc còn lây lan quacác dụng cụ bị nhiễm (xẻng, dao rựa, cuốc…), máy móc nông nghiệp, quần áo vàgiày dép (Stover, 1962; Ploetz, 1994) Bất kỳ hoặc tất cả những cách này đều cóthể tạo điều kiện cho sự lây lan của Foc hoặc có thể thông qua các phương tiệnkhác (Ploetz, 2005; Ploetz, 1994)

Bằng phương pháp PCR, nghiên cứu của Meldrum & cs (2013) được tiến

hành ở Úc đã phát hiện sự có mặt bào tử Foc-TR4 trong lớp giáp xác của sâu đục quả chuối Cosmopolites sordidus (bộ Coleoptera; họ Curculionidae) Côn trùng

này được tìm thấy ở bất cứ nơi nào chuối được trồng và nó di chuyển qua đất, ăn

củ và chồi (Gold & cs., 2001)

2.4.2 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc)

gây bệnh héo vàng chuối

Khái niệm chủng nấm gây bệnh đã được sử dụng để phân loại các chủng F.

oxysporum f sp cubense (Foc) từ giữa những năm 1900 (Stover, 1962b) Dựa

theo quan hệ giữa nấm bệnh và ký chủ, Foc được phân thành 4 chủng (races)(Bentley & cs., 1998) Chủng Foc1 và chủng Foc2 gây hại trên giống chuối GrosMichel (AA), Silk (AAB), Lady Finger (AAB), chuối Tây (ABB) và Bluggoe

(ABB); Chủng 3 gây hại ở các loài thuộc chi Heliconia spp nhưng không còn

được coi là thuộc về cấu trúc chủng của Foc (Ploetz, 2005b) và chủng 4 hại trêngiống chuối Cavendish (AAA) và tất cả các giống chuối có khả năng khángchủng 1 và chủng 2 (Bentley & cs., 1998) García-Bastidas & cs., (2014) cho biết

Foc 4 có sự khác biệt về sinh thái và được chia thành Foc 4 nhiệt đới (Foc-TR4)

và Foc 4 cận nhiệt đới (Foc-STR4), Foc-SR4 tấn công các giống chuối thuộc

nhóm „Cavendish‟ ở các vùng cận nhiệt đới như Đài Loan, quần đảo Canary

(Tây Ban Nha), Nam Phi và Úc Các nghiên cứu về việc công nhận TR4 như một

kiểu bệnh Foc khác đã được đề xuất bởi Buddenhagene (2009) và cho thấy các

chủng phân lập TR4 có tính độc cao ngay cả trong các điều kiện môi trường

không có lợi cho sự phát triển của bệnh (ví dụ: khí hậu lạnh) (Ploetz, 2006; Dita

& cs., 2017) Foc-TR4 ảnh hưởng đến các giống chuối thuộc nhóm „Cavendish‟

ở Úc và các vùng nhiệt đới của Đông Nam Á bao gồm Trung Quốc, Indonesia,Malaysia và Philippines (Ploetz & Pegg, 2000; Molina & cs., 2009; Ordoñez &cs., 2014)

2.4.3 Cơ chế xâm nhiễm của nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối

Bệnh héo vàng chuối là một bệnh đa chu kỳ, mầm bệnh tồn tại trong đất từcác vụ trồng trước, gây nhiễm bệnh trong vụ trồng hiện tại (Ploetz, 2015b; Pegg

& cs., 2019) Ba loại bào tử vô tính được tạo ra bởi Foc: Bào tử lớn(macroconidia), bào tử nhỏ (microconidia) và bào tử hậu (chlamydospores).Bào tử hậu là loại bào tử được tạo ra khi cây phân hủy, chúng có khả năngchống chịu cao với các điều kiện bất lợi như khô hạn, bức xạ và nhiệt độ cao, cókhả năng phục hồi trong điều kiện môi trường không thuận lợi (Stover, 1962b).Một khi bào tử hậu được tạo ra, chúng có thể tồn tại trong đất nhiều năm màkhông cần vật chủ (Stover, 1962b; Leslie & Summerell, 2006) Mầm bệnh cũng

có thể phát triển hoại sinh trong các mô xung quanh khi cây bị bệnh chết, tạothành bào tử hậu còn sót lại trong đất Khả năng Foc xâm nhập và phát triển hoạisinh làm tăng sự sản sinh bào tử hậu, do đó làm tăng sự tồn tại của mầm bệnhtrong đất (Stover, 1962b) Bào tử hậu được kích thích bởi dịch tiết ra từ rễ cây,sau đó nảy mầm và lây nhiễm sang rễ của những cây khỏe mạnh gần đó (Ghag &cs., 2015) Bào tử sẽ nảy mầm và bắt đầu chu kỳ lây nhiễm mới khi cây chuối lạiđược trồng trên khu đồng ruộng này (Ploetz, 2015b) Sự lây nhiễm diễn ra thôngqua các rễ phụ cấp 2 hoặc cấp 3, nhưng không thông qua rễ chính (Trujillo &Snyder, 1963)

Bào tử đơn được hình thành bên trong sợi nấm sau 10 - 14 ngày (Viljoen &cs., 2020) Sợi nấm dày lên sau đó phát triển thành thể bào tử bên trong tế bào (Li

& cs., 2011) Các sợi nấm của Foc xâm nhập vào cây qua hệ thống rễ đến các bómạch xylem và phân tán đến mô phía trên nơi nó phát triển sau đó hạn chế sự hấpthụ chất dinh dưỡng và nước của cây (Ploetz, 2015b) Khi hệ thống mạch xylem

bị nhiễm bệnh, Foc sẽ xâm nhập vào thân rễ (hình thức lây nhiễm hiệu quả nhất),cản trở việc huy động chất dinh dưỡng trong các mạch xylem và do đó trở thành

hệ thống và lan đến thân giả (Li & cs., 2017) Mạch xy lem bị đổi màu và tắcnghẽn, làm gián đoạn việc cung cấp nước và dinh dưỡng dẫn đến cây bị héo(Curry, 2020)

Di chuyển ban đầu của mầm bệnh qua rễ có thể chậm, cần khoảng bốn tuần

để tiến được 75 cm, nhưng trong mạch xylem trưởng thành, mầm bệnh có thểtiến lên 30 cm trong hai đến ba ngày, với mỗi thế hệ bào tử mới Sau khi đến thân

rễ, mầm bệnh có thể di chuyển lên thân giả trong vòng chưa đầy hai tuần

(MacHardy & Beckman, 1981) Các nghiên cứu của Beckman & cs (1961) vàTrujillo & Snyder (1963) cho rằng quá trình xâm nhiễm được tạo điều kiện thuậnlợi nhờ sự hình thành của nhiều bào tử hậu bên trong các mạch xylem, các bào tửnày di chuyển tự do trong dòng thoát hơi nước cho đến khi chúng tạm thời bịchặn lại ở cuối mạch xylem Khi bệnh phát triển, mầm bệnh di chuyển ra khỏi hệthống mạch xylem đến nhu mô lân cận tạo thành bào tử hậu và bào tử hậu đượcgiải phóng vào đất khi cây chết (Baimey & cs., 2020)

2.4.4 Đặc điểm sinh thái của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense (Foc)

gây bệnh héo vàng chuối

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến bệnh héo Fusarium của chuối trong điều

kiện đồng ruộng nhưng quan trọng nhất đó là mức độ kháng hay tính mẫn cảmcủa giống chuối Giai đoạn phát triển của cây cũng rất quan trọng, vì cây trưởngthành có sức đề kháng cao hơn cây non (Brake, 1990) Nhân tố thứ hai là sự hiệndiện của nấm Foc Cuối cùng, các nhân tố khác như thoát nước bên trong và bênngoài, điều kiện môi trường như nhiệt độ, sự ẩm ướt hoặc khô hạn kéo dài Điềukiện đất đai (độ pH, thoát nước, tính chất vật lý, tính chất hóa học và vi sinhvật…) Nhiều yếu tố trong số này ảnh hưởng trực tiếp đến cây ký chủ và phảnứng của nó đối với mầm bệnh, trong khi những yếu tố khác có ảnh hưởng trựctiếp đến mầm bệnh (Brake & cs., 1995)

2.4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng đối với sự phát triển của bệnh héo vàngchuối (Rishbeth, 1957) Sự phát triển của bệnh đạt tối đa khi nhiệt độ đạt tối ưucho sự sinh trưởng của cây Thông thường nhiệt độ thích hợp cho sự phát triểncủa bệnh là 25 - 35oC Khi nhiệt độ trên hoặc dưới ngưỡng này, sự phát triển củabệnh chậm lại Trong thời gian mùa đông và ở những vùng có độ cao trên 700m

so với mực nước biển như Jamaica đã ghi nhận bệnh phát triển rất chậm Ngượclại ở những vùng nhiệt đới, áp lực của bệnh cao hơn các vùng khác (Wardlaw,1961)

Trong điều kiện nuôi cấy invitro, nghiên cứu của Cook & Baker (1983);

Peng & cs (1999) cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Fusarium

oxysporum là 25-28°C, sự phát triển bị ức chế khi nhiệt độ gần 33°C và nhiệt độ

dưới 17°C không thuận lợi cho sự phát triển Theo nghiên cứu của Pérez-Vicente

& cs., (2014) Foc phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 9°C đến 38°C trong điềukiện invitro, nhiệt độ tối ưu trong khoảng từ 23°C đến 27°C

Thông thường, bệnh bùng phát mạnh hơn vào những tháng nóng, ẩm trongnăm (Pérez-Vicente & cs., 2014) Tác giả Stover (1962b) cho biết sự tăng trưởngcủa cây bị giảm và sự phát triển của bệnh chậm lại trong mùa đông, có thể là dogiảm sự thoát hơi nước trên cây Brake & cs (1995) đã báo cáo triệu chứng

nghiêm trọng ở những cây nhiễm chủng 1 hoặc chủng STR4 khi nhiệt độ ở 20 và

28°C Một thí nghiệm trong nhà kính của Peng & cs (1999) phát hiện ra mức độnghiêm trọng của bệnh tăng lên khi nhiệt độ tăng từ 24 đến 34°C Ở 14°C (nhiệt

độ không thuận lợi cho sự phát triển của chuối) các triệu chứng không phát triểnnhưng mầm bệnh có thể được phân lập từ cây bệnh

Moore & cs (1995) cho rằng nhiệt độ mùa đông lạnh ở vùng cận nhiệt đới

khiến giống chuối Cavendish bị nhiễm nặng chủng STR4 Nhiệt độ tối ưu cho sự

phát triển của giống Cavendish từ 22 đến 31°C (Turner & Lahav, 1983;Robinson, 1990)

2.4.4.2 Ảnh hưởng của pH

Trong số các yếu tố được đề cập là độ pH, nhận thấy bệnh nhiễm thấp hơn

ở đất có độ pH = 7 hoặc cao hơn (Peng & cs., 1999; Nel & cs., 2006)

Ở Brazil, theo Deltour & cs (2017), loại đất có thể ức chế cao hơn đối với

Foc-R1 được đặc trưng bởi hàm lượng đất sét và độ pH cao, điều này cho thấy

đất có kết cấu nặng có thể ít bị héo vàng chuối hơn so với đất cát có độ pH thấphơn

Sợi nấm F oxysporum phát triển trong khoảng pH = 6 là thích hợp nhất,

đây cũng là khoảng pH phù hợp cho sự phát triển của tất cả các loài, trong khimôi trường có tính axit cao không thích hợp cho sự hình thành bào tử của tất cả

các loài (Srobar, 1978) Đất chua (pH 4,2) hỗ trợ sự phát triển của Fusarium

xuyên qua đất, trong khi độ pH gần trung tính lại ngăn chặn sự phát triển này(Wilson, 1946) Các nghiên cứu in vitro của Marshall & Alexander (1960) chỉ ra

do sự cạnh tranh và kháng lại của vi sinh vật Tác động cạnh tranh của vi khuẩn

và xạ khuẩn phụ thuộc vào độ pH của đất cao hơn đã được chứng minh là nằm ở

sự cạnh tranh về chất dinh dưỡng và ở mức độ thấp hơn trong sản xuất khángsinh Tăng độ pH của đất lên hoặc cao hơn một chút so với mức trung tính dường

như là nền tảng trong việc kiểm soát bệnh héo Fusarium, thường là một bệnh liên

quan đến đất chua, đất cát, chứ không phải là đất nặng hơn với giá trị pH cao hơn(Woltz & Jones, 1981) pH đã được chứng minh là có ảnh hưởng đến sự nảy

mầm bào tử chlamydospores của F oxysporum, mặc dù sự nảy mầm dường như

xảy ra trong một khoảng pH rộng (Chuang, 1991; Peng & cs., 1999)

báo cáo rằng F oxysporum thể hiện hình thái nuôi cấy khác nhau trên môi trường

Potato Dextrose Agar (PDA) Tản nấm lúc đầu có màu trắng và sau đó thay đổi

thành nhiều màu khác nhau, từ tím đến tím đậm, tùy theo chủng F oxysporum.

Hình 2.3 Đặc điểm hình thái của nấm Fusarium oxysporum f sp cubense

tropical race 4 (Foc-TR4)

Chú thích: A Chủng Foc-TR4 trên môi trường PDA B Túi bào tử trên môi trường CLA C Cành bào tử

ban đầu được hình thành D Bào tử lớn E Cành bào tử phân nhánh F Bào tử nhỏ G Bào tử hậu

Nguồn: Maryani & cs (2019b)

Chủng Foc-TR4, tạo ra ba loại bào tử sinh sản vô tính: Bảo tử nhỏ

(microconidia) (5–7 × 2,5–3 µm), là bào tử hình bầu dục và là loại bào tử đượcsản sinh phổ biến nhất trong các cây bị nhiễm bệnh; Bảo tử lớn (maxcroconidia)(22–36 × 4–5 µm), là các bào tử có thành mỏng, lớn hơn, thường được sản sinh ra

nhiều nhất trên bề mặt của cây bị nhiễm bệnh; Bào tử hậu (chladiosporum) (9 × 7 µm), là các bào tử vô tính có thành dày, hình tròn được hình thành trong các tếbào sợi nấm già hơn (đầu mút hoặc xen kẽ) hoặc do sự chuyển đổi của các bào tửlớn (Wardlaw, 1961)

2.4.6 Ký chủ

Ký chủ chính của Fusarium cây trồng hoặc cây dại Ở điều kiện sản xuất,

Foc- TR4 chủ yếu tập trung vào chi Musa, Musa textilis, Musa acuminata, Musa balbisiana Ba loài cỏ Paspalum fasciculatum Willd., Panicum purpurascens Raddi

và Ixophorus unisetus (Presl.) Schlecht và một loài thảo mộc Tại Đài Loan, Su &

cs (1986) đã kiểm tra 25 loài cỏ dại và 8 loài cây luân canh mọc trên ruộng nhiễm

chủng 4 Ba loài cói (Cyperus iria L., Cyperus rotundus L., Fimbristyli

koidzumiana Ohwi) và một loại thảo mộc (Gnaphalium purpureum L.) đã bị nhiễm

bệnh và họ đã xác nhận khả năng gây bệnh của những loài này trên giốngCavendish

2.4.7 Phân bố

Ở Châu Á, Foc-TR4 lần đầu tiên được xác định ở Đài Loan vào năm 1967 (Su

& cs., 1977; Li & cs., 2011) Vào những năm 1990, Foc-TR4 đã được xác định ở

Malaysia (Molina & cs., 2009; Wong & cs., 2019), Indonesia (Hermanto & cs.,

2011; Maryani & cs., 2019) Foc-TR4 sau đó đã lan rộng ra toàn bộ Tiểu vùng sông

Mekong mở rộng ở Lào (Chittarath & cs., 2018), Myanmar, Thái Lan (Zheng & cs.,

2018) và Việt Nam (Hung & cs., 2018; Zheng & cs., 2018) Foc-TR4 cũng được

báo cáo ở Trung Quốc (Qi & cs., 2008; Li & cs., 2011; Wu & cs., 2019),Philippines (Molina & cs., 2009; Solpot & cs., 2016), Pakistan (Ordoñez & cs.,2016) và Ấn Độ (Damodaran & cs., 2019; Thangavelu & cs., 2019)

Ở Trung Đông, Foc-TR4 đã được báo cáo từ Jordan (García-Bastidas & cs.,

2014), Lebanon (Ordoñez & cs., 2016), Israel (Maymon & cs., 2018, 2020;EPPO, 2019), Oman (Dita & cs., 2018) và Thổ Nhĩ Kỳ (Özarslandan và Akgül,2020) Một diện tích canh tác chuối 200 ha thuộc Chính quyền Palestin, bị nhiễm

Foc-TR4 ở Jordan (Maymon & cs., 2020).

Ở Châu Đại Dương, một đợt bùng phát bệnh héo Fusarium xảy ra vào năm

1997 trên 'Cavendish' ở Lãnh thổ phía Bắc của Úc Đây là lần phát hiện Foc-TR4

đầu tiên ở Úc (Conde & Pitkethley, 2001; Daly & Walduck, 2006) Vào tháng 3

năm 2015, Foc-TR4 đã được phát hiện tại vùng sản xuất chuối chính của Úc gần

Tully ở Bắc Queensland (O‟Neill & cs., 2016)

Ở Châu Phi, sự hiện diện của Foc-TR4 đã được báo cáo ở Mozambique

(IPPC, 2013; Dita & cs., 2018; Viljoen & cs., 2020)

Foc-TR4 được xác nhận đã xuất hiện ở Châu Mỹ Latinh với báo cáo đầu

tiên ở Colombia (García-Bastidas & cs., 2020; Martínez-Solórzano & cs., 2020)

và báo cáo thứ hai ở Peru (SENASA, 2021)

Hình 2.4 Phân bố địa lý của chủng Fusarium oxysporum

f sp cubense tropical race 4 (Foc-TR4)

Nguồn: CABI (2021)

2.5 NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM FUSARIUM GÂY BỆNH HÉO

VÀNG CHUỐI

2.5.1 Lịch sử nghiên cứu phân loại nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối

Fusarium là một trong những chi nấm sợi được nghiên cứu rộng rãi nhất,

bao gồm nhiều mầm bệnh thực vật quan trọng về mặt nông học gây ra bệnh héo

rũ, cháy lá, thối rữa và thối rữa trong các hệ sinh thái nông nghiệp và tự nhiêntrên tất cả các vùng khí hậu (Summerell, 2019; Summerell & cs., 2010)

Do tầm quan trọng toàn cầu của Fusarium, việc xác định loài chính xác là

vô cùng quan trọng để phát hiện nhanh độc tố và quản lý bệnh hiệu quả Tuy

nhiên, hệ thống phân loại cấp loài của Fusarium không ổn định về mặt lịch sử

chủ yếu là do thiếu các đặc điểm hình thái để phân biệt một cách đáng tin cậy cácloài khác biệt về mặt tiến hóa Geiser & cs (2004, 2013, 2021); O'Donnell & cs

(2020) Thách thức này trong việc xác định chủng không chỉ giới hạn ở

Fusarium, đó là lý do tại sao nhiều nhà nấm học, nhà vi trùng học và nhà nghiên

cứu bệnh học ngày càng dựa vào tìm kiếm BLAST của cơ sở dữ liệu trình tự cóthể truy cập công khai, như NCBI GeneBank Cách tiếp cận này xác định cácchủng mới được phân lập dựa trên sự tương đồng về trình tự DNA với các chủnghoặc loài đã được đặc trưng trước đó và đặc biệt hữu ích cho các nhà chẩn đoánbệnh và các nhà nghiên cứu sàng lọc số lượng lớn các chủng phân lập (Laraba &cs., 2017) Mặc dù nhận dạng dựa trên trình tự mang lại một số lợi thế so vớinhận dạng dựa trên hình thái, nhưng nó không phải là không có những hạn chế,một trong số đó là dữ liệu sai và không đầy đủ trong cơ sở dữ liệu tham khảo(Kang & cs., 2010; O'Donnell & cs., 2015)

2.5.2 Cơ sở phân loại nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối

Trong hệ thống phân loại Fusarium, Foc thuộc phức hệ loài Fusarium

oxysporum (FOCS) FOCS có hiện trạng phân loại rất phức tạp, dễ gây nhầm lẫn

và vẫn đang được hoàn thiện do chúng có một số các đặc điểm sinh học và sinhsản khác biệt Chúng không có sinh sản hữu tính nhưng có thể trao đổi vật liệu ditruyền thông qua sinh sản đối ứng hay sinh sản cận tính (parasexual) nhờ cơ chếdung hợp vô tính (anastomosis) FOCS có thể tiến hóa hội tụ có nghĩa các mẫunấm Foc có nền di truyền khác nhau có thể cùng gây một bệnh giống nhau trênmột loài cây ký chủ và hậu quả các gene mã vạch và các gene qui định tính gâybệnh có thể giống nhau Cho tới nay, có nhiều hệ thống phân loại đã được ápdụng đối với FOCS (và Foc):

1) Dạng chuyên hóa (forma specialis - f sp.) (Sydney & Hansen, 1940) và

chủng (race) Trên cây trồng, ít nhất có 106 dạng chuyên hóa của F oxysporum

đã được mô tả trên 100 loài cây Một số dạng chuyên hóa được chia thành cácchủng dựa vào tính gây bệnh đặc biệt trên giống cây ký chủ, điển hình là Foc trênchuối gồm ít nhất 4 chủng (race)

2) Nhóm tương hợp vô tính (VCG): có 24 VCGs của FOCS đã được xác định.3) Phân tích phân tử: phân loại FOCS kể cả Foc hiện tại vẫn chưa hoàn

thiện Việc xác định loài Fusarium và các loài khác của chi Fusarium có thể là

một thách thức, do sự biến đổi giữa các chủng phân lập (Gaudet & cs., 1989;Snyder & Hansen, 1940), có tác động của môi trường và di truyền đối với biểuhiện kiểu hình của các đặc điểm hình thái (Nelson, 1991) Ngày nay, trong nghiêncứu phân loại kết hợp hình thái và phân tử, người ta đã sử dụng trình tự DNA chophân tích

phát sinh loài (Sites & Marshall, 2004; Taylor & cs., 2000) Các loài thuộc FOCS

và Foc phân lập từ chuối được trình bày trong bảng 2.3 dưới đây

Bảng 2.3 Các loài thuộc FOCS và Foc phân lập từ chuối

theo Maryani & cs (2019a)

vasinvectum từ bông

1, FOCSnhánh 2 FOCSnhánh 4

chuối, nhiều nước, kể

cả mẫu Foc phân lậptrên chuối Xiêm tạiViệt Nam

F.

tardichlamydosporum

một số f sp kháckhông trên chuối như

pisi, raphanin, conglutinans

FFCS

cubense

Gene tef1α đóng vai trò là dấu hiệu tốt hơn đáng kể để nhận dạng loài thuộc

Fusarium so với dấu hiệu tiêu chuẩn cho tất cả các loại nấm (vùng ITS) 9Schoch

& cs., 2012), không phân biệt đầy đủ giữa các loài Fusarium có quan hệ họ hàng gần (Geiser & cs., 2004; O'Donnell & cs., 2022) Gene tef1 được chọn làm chất đánh dấu chính để nhận dạng Fusarium vì: (i) nó phân giải ở hoặc gần cấp độ

loài do có tỷ lệ cao (~50%) các vùng phức hợp, (ii) nó là gene sao chép đơn ở

Fusarium và (iii) các đoạn mồi tiêu chuẩn (EF1 và EF2) phù hợp với cả quá trình

khuếch đại PCR và giải trình tự Sanger tiếp theo (Geiser & cs., 2004) Locus tef1

đã được tích hợp vào hầu hết các phân tích phát sinh loài của chi và đã được áp

dụng rộng rãi cho các nỗ lực xác định loài, dẫn đến hơn 30.000 trình tự Fusarium

tef1 trong Ngân hàng gene Ngoài ra, có thể sử dụng các trình tự gene các đoạn rpb1 và rpb2 cho phân tích phát sinh loài Trình tự có thể dễ dàng đại diện cho

các dòng, loài hoặc thậm chí phức hợp loài mới

Hình 2.5 Phát sinh loài Fusarium sửa đổi trong Geiser & cs (2021).

Nguồn: Torres-Cruz & cs (2021)

Chú thích: Maximum likelihood được phân vùng được suy ra từ trình tự exon của 19 gene mã hóa

protein có tổng chiều dài 55,1 kb Likelihood bootstrap = 100%, xác suất Bayesian = 1.0) cũng như 23 phức hợp loài (SC) Số lượng loài ước tính hiện tại trong mỗi SC được ghi trong ngoặc đơn Số lượng loài trong mỗi SC và tổng số trình tự từng phần gene tef1 được biểu thị cho mỗi SC trong bộ dữ liệu

FUSARIUM- ID v.3.0 Đối với tổ hợp loài F oxysporum (FOCS), các ký hiệu '?' được sử dụng để truyền

đạt rằng FOCS hiện đang được điều tra về số lượng loài (Achari & cs., 2020; Lombard & cs., 2019;

Maryani & cs., 2019; O'Donnell & cs., 1998b).