Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN ANOECTOCHILUS Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TR
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NHĨM Nhóm : THỨ CA 3-4 Niên khóa : 2021 – 2025 TP Thủ Đức, 10/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Hướng dẫn khoa học Sinh viên TS Huỳnh Văn Biết Đồn An Bình – 21126019 KS Trương Quang Toản Lê Ngọc Thế Hoa – 21126346 Nguyễn Ngọc Nhi – 21126442 TP Thủ Đức, 10/2023 MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH SÁCH CÁC HÌNH ii CHƯƠNG MỞ ĐẦU Đặt vấn đề CHƯƠNG NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO 2.1 Thiết bị, dụng cụ .2 2.1.1 Nồi hấp tiệt trùng 2.1.2 Tủ cấy 2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 2.2.1 Hóa chất 2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy .3 2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 2.3.1 Giai đoạn vào mẫu tạo mẫu vô trùng tái sinh mẫu nuôi cấy 2.3.2 Nhân nhanh chồi 2.3.3 Tái sinh rễ 2.3.4 Chuyển vườn ươm 2.3.5 Lưu ý nhân giống CHƯƠNG KẾT LUẬN .8 TÀI LIỆU THAM KHẢO .9 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurin IBA: indol-3-acetic acid ND: Nước dừa αNAA: α-naphthylacetid acid i DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Nồi hấp tiệt trùng Hình 2.2 Tủ cấy Hình 2.3 Mẫu mắt đốt ngang thân sau 15 ngày nuôi cấy Hình 2.4 Mẫu in vitro Lan kim tuyến phối hợp hai nhóm chất auxin cytokinin sau 12 tuần nuôi cấy .5 Hình 2.5 Ảnh hưởng than hoạt tính đến rễ sau tuần ii CHƯƠNG MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Lan Kim tuyến tên khoa học Anoectochilus setaceus loài thực vật thuộc họ Orchidoideae Lan Kim tuyến có nguồn gốc từ Hy Lạp, sau phát nhiều nước Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc… Lan Kim tuyến dược thảo quý, giúp dưỡng ẩm, bổ máu Trong y học cổ truyền, lan Kim tuyến giúp chữa trị số bệnh đau bụng, đau ruột, sốt cao, đắp bên chỗ vết thương bị rắn cắn, chỗ sưng, tăng cường sức khỏe, bổ máu,… Nhưng số lượng ít, mọc rải rác bị khai thác mức (với hình thức khai thác tận diệt) nên lan Kim tuyến tự nhiên có nguy bị tuyệt chủng khơng có biện pháp bảo tồn hiệu Hiện nay, lan Kim tuyến đưa vào danh mục loài nguy cấp thuộc nhóm IA Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác mục đích thương mại xếp vào nhóm thực vật rừng nguy cấp (EN A1 a,c,d) Sách Đỏ Việt Nam 2007 Lan Kim tuyến nguồn dược thảo quý, có giá kinh tế cao, lồi Anoectochilus setaceus Blume thường gặp có giá trị thương mại cao nhất, gấp hàng chục lần loài khác (Trần Thị Hồng Thúy ctv, 2015) Lan kim tuyến trồng phương pháp truyền thống sinh trưởng phát triển chậm Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp nhân giống để thay cho phương pháp nhân giống truyền thống cấp thiết Nhân giống in vitro lĩnh vực ứng dụng cơng nghệ tế bào thực vật mang lại hiệu kinh tế lớn (Lê Trần Bình, 1997) Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ mục đích sau: trì nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác tạo giống, nhân nhanh điều kiện vô trùng Từ sở nêu đề tài “Nhân giống Lan kim tuyến kỹ thuật nuôi cấy in vitro” thực nhằm nhân nhanh giống dược liệu quý có suất cao bệnh CHƯƠNG NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO 2.1 Thiết bị, dụng cụ Thiết bị: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, cân điện tử, máy đo pH, máy khuấy từ Dụng cụ: chai thủy tinh, đèn ethanol, dao cấy, kéo, pence, micropipette, pipet, cốc thủy tinh, ống đong (25 mL, 50 mL, 100 mL), bình định mức (50 mL, 100 mL), đũa thủy tinh, đĩa Petri 2.1.1 Nồi hấp tiệt trùng Ở nhiệt độ 100°C, vi sinh vật, bào tử hay vi khuẩn bị tiêu diệt hồn tồn hấp đun sơi Ngun lý hoạt động nồi hấp tiệt trùng: Khi gia nhiệt, nồi hấp đóng kín van tạo áp suất cao buồng hấp, làm thay đổi nhiệt độ sôi bay nước (thông thường nước sôi bốc 100°C) lên nhiệt độ cài đặt (thường 121°C), tạo nước bão hòa buồng hấp giúp tiệt trùng Tiệt trùng nhiệt độ khoảng 121°C, khoảng thời gian từ 15 - 20 phút, vi khuẩn vi sinh vật bị tiêu diệt hoàn toàn tác động từ nước bão hòa điều kiện áp suất cao Hình 2.1 Nồi hấp tiệt trùng 2.1.2 Tủ cấy Thiết bị tạo điều kiện vô trùng khoang làm việc từ phục vụ cho ngành cơng nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào, dược phẩm, thao tác PCR, công nghệ vi sinh, y tế… Nguyên lý tủ cấy vơ trùng cấp khơng khí vô trùng liên tục vào khoang làm việc qua màng lọc với khả lọc lên tới 99.97% Từ đó, tủ giúp bảo vệ mẫu khỏi tác nhân môi trường suốt trình làm việc Hình 2.2 Tủ cấy 2.2 Chuẩn bị mơi trường ni cấy 2.2.1 Hóa chất Các hóa chất sử dụng nghiên cứu bao gồm: ethanol, chất khoáng đa lượng, chất khoáng vi lượng, vitamin, Fe-EDTA, đường, chất điều hòa sinh trưởng, agar than hoạt tính 2.2.2 Chuẩn bị mơi trường ni cấy Mơi trường thích hợp cho ni cấy mơ lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) mơi trường có nguồn gốc Knud* 2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 2.3.1 Giai đoạn vào mẫu tạo mẫu vô trùng tái sinh mẫu nuôi cấy Khử trùng mẫu khâu quan trọng nhằm loại bỏ nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu nguồn mẫu vô trùng cho nghiên cứu Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết khử trùng phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng Sau khử trùng mẫu cấy vào môi trường vào mẫu, sau khoảng thời gian định, thường từ sau 2-3 tuần mẫu bắt đầu tái sinh Môi trường dùng tạo mẫu vô trùng Lan kim tuyến môi trường Knud Vật liệu dùng để vô trùng mẫu cấy mắt đốt ngang thân, mẫu lấy từ cây sinh trưởng mạnh, không bị sâu bệnh, đem trồng phòng 2-3 ngày trước thu hái để vào mẫu Công thức khử trùng ngâm mẫu cồn 70⁰ 10 giây ngâm NaClO 2% 10 phút vừa đủ, vừa có khả tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao kích thích mẫu tái sinh (Phí Thị Cẩm Miện, 2012) Sau rửa mẫu nước cất hấp Cắt mẫu thành đoạn thân có 2-3 chồi nách cấy vào môi trường Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Sau 15 ngày, tỷ lệ sống mẫu mắt đốt ngang thân khử trùng 72,22% tỷ lệ nhiễm 16.67% Hình 2.3 Mẫu mắt đốt ngang thân sau 15 ngày ni cấy Mục đích giai đoạn tái sinh mẫu tái sinh quan từ mẫu nuôi cấy Khả thành công nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi tế bào mẫu nuôi cấy, gần trạng thái phôi sinh khả tái sinh lớn Sau thời gian định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất cụm tế bào quan (chồi, cụm chồi, rễ) phơi vơ tính có đặc tính gần phơi hữu tính 2.3.2 Nhân nhanh chồi Cần tạo tốc độ nhân nhanh cao điều kiện ni cấy, thành phần điều kiện môi trường phải tối ưu nhằm đạt mục tiêu nhân nhanh Môi trường giai đoạn cần bổ sung hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, nhiệt độ thích hợp từ 20 – 30C Các mẫu cấy sau thời gian nuôi, chồi nách phát triển thành chồi chùm 35-40 ngày cấy chuyền Mơi trường thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A setaceus) môi trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây +7g/l agar Lấy đốt thân từ vô trùng mẫu cấy Cắt mẫu thành đoạn chứa chồi hay 1-3 đốt thân Cấy mẫu vào môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Sau tuần nuôi cấy, số đốt/chồi 2,77 đốt, số chồi/mẫu 6,56 chồi chiều cao trung bình chồi đạt 3,52 cm Hình 2.4 Mẫu in vitro Lan kim tuyến phối hợp hai nhóm chất auxin cytokinin sau 12 tuần nuôi cấy Giai đoạn nhân nhanh chồi từ vài chồi ban đầu không nên kéo dài lâu để tránh biến dị soma 2.3.3 Tái sinh rễ Các chồi hình thành q trình ni cấy phát rễ tự sinh, thông thường chồi phải cấy chuyển sang mơi trường khác để kích thích tạo rễ Mơi trường tái sinh rễ thường bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) liều lượng thích hợp Cây nuôi cấy mô in vitro trước chuyển vườn ươm thường phải có rễ hồn chỉnh Nếu rễ phát triển làm cho trình hút nước khả bám đất bị ảnh hưởng ngược lại, rễ phát triển mạnh làm ảnh hưởng tới chất lượng quan khác Do cần nghiên cứu để tìm mơi trường rễ thích hợp cho Theo Phí Thị Cẩm Miện (2012), hai loại auxin IBA α-NAA tiến hành nghiên cứu cho kết khơng có khả sản sinh rễ bất định lan Kim tuyến (A setaceus) Lan Kim tuyến loại có yêu cầu dinh dưỡng thấp, sống môi trường nghèo dinh dưỡng rễ lan Kim tuyến kéo dài để lấy dinh dưỡng cho Môi trường nghèo dinh dưỡng kích thích rễ Lan Kim tuyến phát triển mạnh phát triển theo hướng phát triển chiều dài rễ Trong nghiên cứu tạo hoàn chỉnh, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nghèo dinh dưỡng than hoạt tính đến rễ lan Kim tuyến (A setaceus) Than hoạt tính làm thay đổi mơi trường ánh sáng làm cho mơi trường sẫm màu, nên kích thích hình thành sinh trưởng rễ (Vũ Văn Vụ, 2006) Môi trường rễ tạo hoàn chỉnh Knud với hàm lượng chất giảm nửa có bổ sung 5% than hoạt tính Việc bổ sung 5% than hoạt tính cho kết với tỷ lệ chồi tạo rễ 100%, số rễ/chồi 4,22 rễ chiều dài trung bình rễ 3,5cm sau tuần nuôi cấy theo dõi Hình 2.5 Ảnh hưởng than hoạt tính đến rễ sau tuần 2.3.4 Chuyển vườn ươm Các nuôi cấy in vitro sau tái sinh hoàn chỉnh chuyển vườn ươm Trong điều kiện in vitro, nuôi cấy môi trường dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo vô trùng, tức quen sống dị dưỡng Khi đưa trồng giá thể tự nhiên, phải sống tự dưỡng, xung quanh môi trường không vô trùng, ánh sáng tự nhiên Do vậy, huấn luyện in vitro giúp chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, để đưa trồng vườn ươm tự dưỡng mà khơng ảnh hưởng đến sinh trưởng Thời gian huấn luyện khác giúp có khả thích nghi với điều kiện mơi trường bên ngồi bình khác nhau, có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống đưa trồng vườn ươm Chồi non sau rễ thành hoàn chỉnh đạt chiều cao tiêu chuẩn đem huấn luyện điều kiện tự nhiên Trước đưa lan Kim tuyến đem trồng lên giá thể nên tiến hành huấn luyện bình với thời gian ngày Một yếu tố có ý nghĩa định hay nghiên cứu đưa in vitro vườn ươm giá thể Các loại giá thể ươm sau in vitro cho loài Lan thường Dớn, xơ dừa, bột dừa…được dùng riêng lẻ hay trộn lẫn với theo tỷ lệ phù hợp với Tùy đối tượng khác mà cần phải có nghiên cứu cụ thể nhằm tìm loại giá thể phù hợp cho sống sót sinh trưởng Dớn xơ dừa giá thể phù hợp cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume Những ngày đầu đưa trồng nhà lưới/vườn ươm, luống phủ kín nilon để giúp tránh bị nước bay Nếu luống không che kín nilon, bị nước trời nắng gió lùa khiến cho bị héo chết Tuy nhiên, thời gian che kín luống nilon kéo dài khiến bị thiếu ánh sáng dẫn đến cao mảnh xanh nhạt làm khả quang hợp kém, hay ảnh hưởng đến sinh trưởng Khi đưa lan Kim tuyến trồng vườn ươm nên che bóng vịng 10 ngày thích hợp 2.3.5 Lưu ý nhân giống Lưu ý đem ngồi cần rửa mơi trường cịn dính Nếu không dễ nhiễm nấm chết CHƯƠNG KẾT LUẬN Phương pháp khử trùng tạo mẫu thích hợp rửa xà phòng đem ngâm cồn 70o 10 giây sau ngâm NaClO 2% 10 phút Cơ quan vào mẫu thích hợp mắt đốt ngang thân, cho tỷ lệ sống cao đạt khoảng 72%, tỷ lệ tạo chồi 100% Mơi trường thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A setaceus) môi trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3 Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Môi trường phù hợp cho rễ loài Lan kim tuyến Knud*/2 + 5% than hoạt tính Giá thể phù hợp với lồi Lan Kim tuyến là: 50% Dớn + 50% xơ dừa Thời gian huấn luyện bình phù hợp ngày Thời gian che luống phù hợp 10 ngày cho tỷ lệ sống 99% TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) (2005) Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội Chính Phủ Nước Cộng hịa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2006) Nghị định số 32/2006/NĐ-CP Nguyễn Trần Phước Huy Đỗ Thị Mai Trinh (2023) Nhân giống in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus sp.) Tạp chí Khoa học Đại học cần Thơ, 59(2): 76-83 Phí Thị Cẩm Miện (2012) Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý