Nhân giống lan kim tuyến anoectochilus setaceus blume bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN ANOECTOCHILUS Trang 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS

SETACEUS BLUME) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Ngành học Sinh viên thực hiện Nhóm

Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : NHÓM 6

: THỨ 2 CA 3-4 : 2021 – 2025

TP Thủ Đức, 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS

SETACEUS BLUME) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

TP Thủ Đức, 10/2023

KS Trương Quang Toản Lê Ngọc Thế Hoa – 21126346

Nguyễn Ngọc Nhi – 21126442

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

Đặt vấn đề 1

CHƯƠNG 2 NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO 2

2.1 Thiết bị, dụng cụ 2

2.1.1 Nồi hấp tiệt trùng 2

2.1.2 Tủ cấy 2

2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 3

2.2.1 Hóa chất 3

2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 3

2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 3

2.3.1 Giai đoạn vào mẫu tạo mẫu vô trùng và tái sinh mẫu nuôi cấy 3

2.3.2 Nhân nhanh chồi 4

2.3.3 Tái sinh rễ 5

2.3.4 Chuyển cây ra vườn ươm 6

2.3.5 Lưu ý khi nhân giống 7

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN 8

TÀI LIỆU THAM KHẢO 9

i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BAP 6-benzylaminopurin

IBA: indol-3-acetic acid

ND: Nước dừa

αNAA: α-naphthylacetid acid

ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Nồi hấp tiệt trùng 2 Hình 2.2 Tủ cấy 3 Hình 2.3 Mẫu mắt đốt ngang thân sau 15 ngày nuôi cấy 4 Hình 2.4 Mẫu in vitro Lan kim tuyến phối hợp hai nhóm chất auxin và cytokinin sau

12 tuần nuôi cấy 5

Hình 2.5 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến rễ cây sau 8 tuần 6

1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Lan Kim tuyến tên khoa học là Anoectochilus setaceus là một loài thực vật thuộc

họ Orchidoideae Lan Kim tuyến có nguồn gốc từ Hy Lạp, sau đó được phát hiện nhiều

nhất ở các nước như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc… Lan Kim tuyến là một trong những dược thảo quý, giúp dưỡng ẩm, bổ máu Trong y học cổ truyền, lan Kim tuyến giúp chữa trị một số bệnh như đau bụng, đau ruột, sốt cao, hoặc đắp bên ngoài chỗ vết

thương bị rắn cắn, các chỗ sưng, tăng cường sức khỏe, bổ máu,…

Nhưng do số lượng ít, mọc rải rác và bị khai thác quá mức (với hình thức khai thác tận diệt) nên cây lan Kim tuyến trong tự nhiên có nguy cơ bị tuyệt chủng nếu không

có biện pháp bảo tồn hiệu quả Hiện nay, lan Kim tuyến được đưa vào danh mục các loài đang nguy cấp thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và được xếp vào nhóm thực vật rừng đang nguy cấp (EN A1 a,c,d) trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 Lan Kim tuyến là nguồn dược thảo quý, có giá kinh tế

cao, trong đó loài Anoectochilus setaceus Blume thường gặp nhất và có giá trị thương

mại cao nhất, gấp hàng chục lần các loài khác (Trần Thị Hồng Thúy và ctv, 2015)

Lan kim tuyến được trồng bằng các phương pháp truyền thống sinh trưởng phát triển chậm Vì vậy, việc nghiên cứu ra những phương pháp nhân giống mới để thay thế cho phương pháp nhân giống truyền thống là rất cấp thiết

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào

thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau: duy trì và nhân

nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống, nhân nhanh ở điều kiện vô trùng

Từ những cơ sở nêu trên thì đề tài “Nhân giống Lan kim tuyến bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro” được thực hiện nhằm nhân nhanh giống dược liệu quý hiếm có năng suất

cao và sạch bệnh

2

CHƯƠNG 2 NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN BẰNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

2.1 Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, cân điện tử, máy đo pH, máy khuấy từ

Dụng cụ: chai thủy tinh, đèn ethanol, dao cấy, kéo, pence, micropipette, pipet, cốc thủy tinh, ống đong (25 mL, 50 mL, 100 mL), bình định mức (50 mL, 100 mL), đũa thủy tinh, đĩa Petri

2.1.1 Nồi hấp tiệt trùng

Ở nhiệt độ 100°C, các vi sinh vật, bào tử hay vi khuẩn không thể bị tiêu diệt hoàn toàn khi hấp hoặc đun sôi Nguyên lý hoạt động của nồi hấp tiệt trùng: Khi gia nhiệt, nồi hấp sẽ đóng kín các van và tạo áp suất cao trong buồng hấp, làm thay đổi nhiệt độ sôi và bay hơi của nước (thông thường nước sôi và bốc hơi ở 100°C) lên nhiệt độ cài đặt (thường sẽ là 121°C), khi đó sẽ tạo ra hơi nước bão hòa trong buồng hấp giúp tiệt trùng Tiệt trùng tại nhiệt độ khoảng 121°C, trong khoảng thời gian từ 15 - 20 phút, các vi khuẩn và vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt hoàn toàn bởi những sự tác động từ hơi nước bão hòa dưới điều kiện áp suất cao

2.1.2 Tủ cấy

Thiết bị này sẽ tạo ra các điều kiện vô trùng trong khoang làm việc từ đó phục vụ cho các ngành công nghệ sinh học như nuôi cấy mô tế bào, dược phẩm, thao tác PCR, các công nghệ vi sinh, y tế…

Hình 2.1 Nồi hấp tiệt trùng

3

Nguyên lý của tủ cấy vô trùng là cấp không khí vô trùng liên tục vào khoang làm việc qua màng lọc với khả năng lọc lên tới 99.97% Từ đó, tủ giúp bảo vệ mẫu khỏi các tác nhân môi trường trong suốt quá trình làm việc

2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

2.2.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: ethanol, chất khoáng đa lượng, chất khoáng vi lượng, vitamin, Fe-EDTA, đường, chất điều hòa sinh trưởng, agar và than hoạt tính

2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus

setaceus) là môi trường có nguồn gốc Knud*

2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro

2.3.1 Giai đoạn vào mẫu tạo mẫu vô trùng và tái sinh mẫu nuôi cấy

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh

Hình 2.2 Tủ cấy

4

Môi trường dùng khi tạo mẫu vô trùng Lan kim tuyến là môi trường Knud Vật liệu dùng để vô trùng mẫu cấy là mắt đốt ngang thân, mẫu lấy từ cây cây sinh trưởng mạnh, không bị sâu bệnh, đem trồng trong phòng sạch 2-3 ngày trước khi thu hái để vào mẫu

Công thức khử trùng là ngâm mẫu trong cồn 70⁰ trong 10 giây rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh (Phí Thị Cẩm Miện, 2012) Sau đó rửa mẫu bằng nước cất đã hấp Cắt mẫu thành đoạn thân có 2-3 chồi nách và cấy vào môi trường Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Sau 15 ngày, tỷ lệ sống của mẫu mắt đốt ngang thân khi khử trùng là 72,22% và tỷ lệ nhiễm là 16.67%

Mục đích của giai đoạn tái sinh mẫu là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính

2.3.2 Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần

và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt

Hình 2.3 Mẫu mắt đốt ngang thân sau

15 ngày nuôi cấy

5

độ thích hợp là từ 20 – 30C Các mẫu cấy sau thời gian nuôi, chồi nách phát triển thành chồi chùm cứ 35-40 ngày có thể cấy chuyền

Môi trường nền thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A setaceus) là môi

trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây +7g/l agar.

Lấy đốt thân từ cây đã vô trùng mẫu cấy Cắt mẫu thành các đoạn chứa 1 chồi ngọn hay 1-3 đốt thân Cấy mẫu vào môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Sau 8 tuần nuôi cấy, số đốt/chồi là 2,77 đốt, số chồi/mẫu là 6,56 chồi và chiều cao trung bình chồi đạt 3,52 cm

Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma

2.3.3 Tái sinh rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo

rễ Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp Cây nuôi cấy mô in vitro trước khi chuyển ra vườn ươm thường phải có bộ

rễ hoàn chỉnh Nếu rễ kém phát triển sẽ làm cho quá trình hút nước cũng như khả năng bám đất của cây bị ảnh hưởng nhưng ngược lại, bộ rễ phát triển mạnh sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng của các cơ quan khác Do đó cần nghiên cứu để tìm ra môi trường ra rễ thích hợp cho cây

Theo Phí Thị Cẩm Miện (2012), hai loại auxin là IBA và α-NAA đã được tiến hành nghiên cứu và cho kết quả là không có khả năng sản sinh ra rễ bất định đối với lan

Kim tuyến (A setaceus) Lan Kim tuyến là một loại cây có yêu cầu về dinh dưỡng thấp,

Hình 2.4 Mẫu in vitro Lan kim tuyến phối hợp hai nhóm

chất auxin và cytokinin sau 12 tuần nuôi cấy

6

khi sống ở các môi trường nghèo dinh dưỡng thì rễ lan Kim tuyến sẽ kéo dài hơn để lấy dinh dưỡng cho cây Môi trường nghèo dinh dưỡng sẽ kích thích bộ rễ Lan Kim tuyến phát triển mạnh hơn và phát triển theo hướng phát triển chiều dài rễ

Trong nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều

kiện nghèo dinh dưỡng và than hoạt tính đến sự ra rễ ở cây lan Kim tuyến (A setaceus)

Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên

có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006) Môi trường ra

rễ tạo cây hoàn chỉnh là Knud với hàm lượng các chất giảm đi một nửa và có bổ sung 5% than hoạt tính Việc bổ sung 5% than hoạt tính cho kết quả với tỷ lệ chồi tạo rễ là 100%, số rễ/chồi là 4,22 rễ và chiều dài trung bình rễ là 3,5cm sau 8 tuần nuôi cấy và theo dõi

2.3.4 Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm Trong điều kiện in vitro, cây con được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng,

ánh sáng nhân tạo và vô trùng, tức là đã quen sống dị dưỡng Khi đưa cây con ra trồng trên giá thể ở ngoài tự nhiên, cây con phải sống tự dưỡng, xung quanh là môi trường

không vô trùng, ánh sáng tự nhiên Do vậy, huấn luyện cây in vitro cũng giúp cây chuyển

từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, để khi đưa cây ra trồng ngoài vườn ươm cây có thể tự dưỡng ngay mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng Thời gian huấn luyện khác nhau giúp cây có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài bình khác nhau, do đó có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cây con khi đưa ra trồng ngoài vườn ươm

Hình 2.5 Ảnh hưởng của than hoạt tính

đến rễ cây sau 8 tuần

7

Chồi non sau khi ra rễ thành cây con hoàn chỉnh đạt được chiều cao tiêu chuẩn

sẽ đem ra huấn luyện ở điều kiện tự nhiên Trước khi đưa lan Kim tuyến đem trồng lên giá thể nên tiến hành huấn luyện cây trong bình với thời gian là 8 ngày

Một trong những yếu tố có ý nghĩa quyết định và hay được nghiên cứu khi đưa

cây in vitro ra vườn ươm đó là giá thể Các loại giá thể ươm cây sau in vitro cho các loài

Lan thường là Dớn, xơ dừa, bột dừa…được dùng riêng lẻ hay trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp với từng cây Tùy từng đối tượng cây khác nhau mà cần phải có những nghiên cứu cụ thể nhằm tìm ra loại giá thể phù hợp nhất cho sự sống sót và sinh trưởng của cây Dớn và xơ dừa là giá thể phù hợp nhất cho loài lan Kim tuyến

Anoectochilus setaceus Blume

Những ngày đầu đưa cây ra trồng ở nhà lưới/vườn ươm, luống cây được phủ kín nilon để giúp cây con tránh bị mất nước do bay hơi Nếu luống cây không được che kín bằng nilon, cây con sẽ bị mất nước khi trời nắng hoặc gió lùa khiến cho cây bị héo và chết Tuy nhiên, thời gian che kín luống cây bằng nilon kéo dài sẽ khiến cây bị thiếu ánh sáng dẫn đến cây cao nhưng mảnh và lá xanh nhạt làm khả năng quang hợp kém, hay ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây con Khi đưa lan Kim tuyến ra trồng ở vườn ươm thì nên che bóng trong vòng 10 ngày là thích hợp

2.3.5 Lưu ý khi nhân giống

Lưu ý là khi đem cây ra ngoài cần rửa sạch môi trường còn dính trên cây Nếu không cây rất dễ nhiễm nấm và cây sẽ chết

8

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN

Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch thích hợp là rửa sạch bằng xà phòng rồi đem ngâm trong cồn 70o trong 10 giây sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút Cơ quan vào mẫu thích hợp nhất là mắt đốt ngang thân, cho tỷ lệ sống cao đạt khoảng 72%,

tỷ lệ tạo chồi là 100%

Môi trường nền thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A setaceus) là môi trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3 Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar Môi trường phù hợp nhất cho sự ra rễ ở loài Lan kim tuyến là Knud*/2 + 5% than hoạt tính

Giá thể phù hợp nhất với loài Lan Kim tuyến là: 50% Dớn + 50% xơ dừa Thời gian huấn luyện cây trong bình phù hợp nhất là 8 ngày Thời gian che luống cây phù hợp nhất là 10 ngày cho tỷ lệ cây sống là 99%

9

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) (2005) Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội

Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2006) Nghị định số 32/2006/NĐ-CP

Nguyễn Trần Phước Huy và Đỗ Thị Mai Trinh (2023) Nhân giống in vitro lan Kim

tuyến (Anoectochilus sp.) Tạp chí Khoa học Đại học cần Thơ, 59(2): 76-83

Phí Thị Cẩm Miện (2012) Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý