NUÔI CẤY MÔ DO XỬ LÝ ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA.TÁC GIẢĐào Thị Tuyết ThanhNguyễn Bảo Toàn Trang 3 NỘI DUNG123GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHỈ THỊ ISSR INTER SIMPLE SEQUENCE REPEAT VẬT LIỆU VÀ PHƯƠ
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC SỬ DỤNG CHỈ THỊ ISSR TRONG VIỆC ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG/GIỐNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) NUÔI CẤY MÔ DO XỬ LÝ ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA Hướng dẫn khoa học: Nhóm sinh viên thực hiện: TS HUỲNH VĂN BIẾT TRƯƠNG THỊ MINH THẠNH ThS TRƯƠNG QUANG TOẢN PHẠM LÊ TƯỜNG VY NGUYỄN LÊ THANH VY TÊN BÀI BÁO SỬ DỤNG CHỈ THỊ ISSR TRONG VIỆC ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÒNG/GIỐNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) NUÔI CẤY MÔ DO XỬ LÝ ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam – Số 6(79)/2017 TÁC GIẢ Đào Thị Tuyết Thanh Nguyễn Bảo Toàn NỘI DUNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHỈ THỊ ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEAT) 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHỈ THỊ ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEAT) • ISSR là các đoạn DNA có kích thước khoảng 100-3000 bp nằm giữa các vùng vi vệ tinh liền kề, có hướng ngược nhau • Khuếch đại bằng PCR sử dụng các chuỗi vi vệ tinh làm mồi với một số nucleotide chọn lọc làm neo vào các vùng lân cận không lặp lại (16-18 bp) • Một mồi duy nhất 2 ƯU ĐIỂM • Không cần biết trước trình tự đoạn mồi • Dựa trên PCR nên chỉ cần một lượng nhỏ ADN mẫu Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn kĩ thuật PCR- NHƯỢC ĐIỂM ISSR • Kỹ thuật đa điểm nên có khả năng không tương đồng của các mảnh có kích thước tương tự • ISSR, giống như RAPD, có thể gặp vấn đề về khả năng tái tạo 3 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Đối chứng: Mẫu lá của giống hoa huệ 6 cánh và 12 cánh từ An Giang Mẫu lá của 2 giống hoa huệ được xử lý đột biến từ giống hoa huệ 12 cánh bằng tia gamma kết hợp với kỹ thuật nuôi cấy mô 22 cánh và 36 cánh a b c d Hình 2.1 Giống hoa huệ địa phương và giống hoa huệ đột biến a) Giống hoa huệ 4 có 6 cánh; b) Giống hoa huệ có 12 cánh; c) Giống hoa huệ có 22 cánh; d) Giống hoa huệ 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu Bảng 2.1 Thể tích các chất được hút Ly trích DNA tổng số vào eppendorf 0,2 ml để thực hiện phản ứng PCR Thực hiện phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) H2O 16,25µl Buffer 2,5µl 2µl dNTPs 0,5µl Mồi xuôi 0,5µl Mồi ngược 0,25µl Taq DNA polymerase 3µl DNA bộ gene 25µl/ 1 phản ứng 6 2.2 Phương pháp nghiên cứu Mẫu lá của từng giống được thu thập Ly trích DNA tổng số riêng rẽ và tách chiết DNA sử dụng 2% dung dịch đệm CTAB 5 2.2 Phương pháp nghiên cứu Sử dụng 14 mồi ISSR do công ty TNHH Sinh Hóa Phù Sa sản xuất và cung cấp Bảng 2.2 Thông tin các mồi ISSR được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền các dòng hoa huệ đột biến STT Tên mồi Trình tự (5’- 3’) STT Tên mồi Trình tự (5’- 3’) 1 3A01 (GA)8TC 8 808 (AG)8C 2 3A07 (AG)7CTT 9 836 (AG)8YA 3 3A21 (TG)7ACC 10 840 (AG)8YT 4 3A39 (CA)7GTA 11 842 (AG)8YG 5 3A42 (GACA)4C 12 855 (AC)8YT 6 3A62 (TG)7ACT 13 857 (AC)8YG 7 UBC873 GACAGACAGACAGACA 14 P23SR1 GGCTGCTTCTAAGC CAAC 7 2.2 Phương pháp nghiên cứu Ly trích DNA tổng số Bảng 2.3 Chương trình nhiệt của các phản ứng Thực hiện phản ứng PCR PCR Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian (phút, Số (℃) giây) chu kỳ Tiền biến tính 92 5 phút Biến tính 92 1 phút 1 Bắt cặp 35 30 giây 45 Kéo dài 72 1 phút 45 72 5 phút 45 Hậu kéo dài 1 8 2.2 Phương pháp nghiên cứu Ly trích DNA tổng số Thực hiện phản ứng PCR Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% Ghi nhận kết quả và xử lí số liệu 9 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN M1 2 3 4 M1 2 3 4 3000bp 3000bp 2000bp Hình 3.1 Ảnh điện di của các mồi ISSR đối 1250bp với các dòng/giống hoa huệ được nghiên 850bp 900bp 600bp cứu a) Mồi UBC 873; b) Mồi P23SR1; c) Mồi 300bp 3A39; d) Mồi 808 1: giống hoa huệ 6 cánh; b 2: dòng hoa huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ a M1 2 3 4 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: 1250bp Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : M1 2 3 4 700bp băng DNA mất 1000bp 600bp c d 10 M12 3 4 MỒI UBC 873 3000bp M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng DNA có kích thước khoảng 200- 1250bp 3000bp 850bp Giếng 2: • Xuất hiện các băng ở vị trí 250bp và 1000 bp 300bp Hình 3.2 Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống hoa huệ được nghiên cứu 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: 11 Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất M12 3 4 MỒI UBC 873 3000bp M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng 1250bp DNA có kích thước khoảng 200- 850bp 3000bp Giếng 2 : 300bp • Xuất hiện các băng ở vị trí 250bp và 1000 bp • Mất các băng ở vị trí 300;350;850;1250;3000bp Hình 3.2 Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống hoa huệ được nghiên cứu 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: 12 Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất MỒI UBC 873 M12 3 4 M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng DNA có kích thước khoảng 200- 3000bp 3000bp 1250bp Giếng 2 : 850bp • Xuất hiện các băng ở vị trí 300bp 250bp và 1000 bp • Mất các băng ở vị trí Hình 3.2 Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống hoa huệ được nghiên cứu 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa 300;350;850;1250;3000bp Giếng 3 : huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: • Xuất hiện các băng ở vị trí Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất 1000bp và 2750 bp 13 MỒI UBC 873 M12 3 4 M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng DNA có kích thước khoảng 200- 3000bp 3000bp 1250bp Giếng 2 : 850bp • Xuất hiện các băng ở vị trí 300bp 250bp và 1000 bp • Mất các băng ở vị trí Hình 3.2 Ảnh điện di của mồi UBC 873 đối với các dòng/giống hoa huệ được nghiên cứu 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa 300;350;850;1250;3000bp Giếng 3 : huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: • Xuất hiện các băng ở vị trí Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất 1000bp và 2750 bp • Mất các băng ở vị trí 300;350;850;1250bp 14 M12 3 4 MỒI P23SR1 3000bp M: Thang chuẩn xuất hiện 23 băng DNA có kích thước khoảng 150- 2000bp 3000bp Giếng 2 và giếng 3 so xuất hiện các 900bp băng ở vị trí 500;600;800;1750 và 2000bp 600bp Hình 3.3 Ảnh điện di của mồi P23SR1 đối với các dòng/giống hoa huệ được nghiên cứu 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: 15 Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất MỒI 3A39 VÀ 808 Cho sản phẩm khuếch đại cũng có sự xuất hiện mới và mất đi các bang DNA nhưng số lượng ít hơn chỉ với 1 băng khác biệt so với đối chứng M 1234 M 1234 1000bp 1250bp 600bp 700bp a b Hình 3.4 Ảnh điện di của mồi 3A39 và 808 đối với các dòng/giống hoa huệ được nghiên cứu a) Mồi 3A39; b) Mồi 808 1: giống hoa huệ 6 cánh; 2: dòng hoa huệ 22 cánh; 3: dòng hoa huệ 36 16 cánh; 4: giống hoa huệ 12 cánh; M: Thang chuẩn 100bp; : băng DNA mới; : băng DNA mất 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hệ số tương đồng Bảng 3.1 Bảng hệ số tương đồng di truyền của các dòng/giống hoa huệ nghiên cứu với 4 cặp mồi ISSR Giống/dòng Giống hoa 6 Dòng đột biến Dòng đột biến Giống hoa 12 hoa cánh 1,000 22 cánh 36 cánh cánh Giống hoa 6 cánh 0,643 1,000 1,000 1,000 0,571 0,500 17 Dòng đột biến 0,786 0,375 22 cánh 0,429 Dòng đột biến 36 cánh Giống hoa 12 cánh 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hệ số tương đồng • Hệ số tương đồng biến thiên trong khoảng 0,375 đến 0,786 • Chỉ số tương đồng thấp nhất là 0,375 được ghi nhận giữa giống hoa huệ gốc 12 cánh và dòng hoa huệ đột biến 22 cánh => Có sự khác biệt lớn về mặt di truyền • Chỉ số tương đồng cao nhất là 0,786 được ghi nhận giữa giống hoa huệ 6 cánh và dòng hoa huệ 36 cánh => Có mối quan hệ di truyền gần nhau 18