Luận án tạo dòng hoa huệ (polianthes tuberosa l ) đột biến bằng tia gamma (60co) trong điều kiện in vitro

Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy, PGS.TS Nguyễn Bảo Tồn, tận tình hƣớng dẫn khoa học, tƣ vấn thiết kế thí nghiệm, hƣớng dẫn cách tiếp cận kiến thức khoa học lĩnh vực nghiên cứu, từ giúp tơi hồn thành luận án nghiên cứu sinh Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trại Nghiên cứu & Thực nghiệm Nông nghiệp thuộc Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại Học tạo điều kiện thuận lợi thực thủ tục, hỗ trợ hóa chất trang thiết bị cho nghiên cứu Luận án Chân thành cảm ơn quý thầy cô, anh chị, bạn đồng nghiệp thuộc Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Nguyễn Thƣợng Hiền hỗ trợ nguồn giống hoa huệ Đồng thời, chân thành gửi lời cảm ơn đến em học viên cao học cộng tác suốt thời gian thực luận án Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung Tâm Dạy nghề & Hỗ trợ Nông dân tỉnh Tiền Giang, anh chị em đồng nghiệp hỗ trợ cơng tác để tơi có thời gian hồn thành đƣợc khóa học Sau tơi xin đƣợc cảm ơn ngƣời thân u gia đình ln động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Đào Thị Tuyết Thanh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ TĨM TẮT Nghiên cứu “Tạo dịng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro” đƣợc thực nhằm (1) xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy để tạo vật liệu cho thí nghiệm; (2) xác định đƣợc hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) mô sẹo cụm chồi hoa huệ thông qua liều gây chết LD50; (3) xác định đa dạng mặt hình thái giai đoạn dƣỡng; (4) chọn đƣợc đến hai giống hoa huệ tăng số lƣợng cánh hoa, kích thƣớc hoa hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống Nghiên cứu bao gồm tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm hai giống/dịng hoa huệ đơn hoa huệ kép; xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) liều khác nhau; xác định giá trị tổn thƣơng LD50; đánh giá sinh trƣởng mô sẹo cụm chồi in vitro; dƣỡng đánh giá thay đổi mặt hình thái hoa chọn hai dịng có kiểu hình trội Kết thí nghiệm cho thấy mơi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l NAA 4,0 mg/l BA thích hợp cho tạo mơ sẹo cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) Liều gây chết LD50 giống/dòng hoa huệ đơn xử lý tia gamma (60Co) khoảng 10-15 Gy (giá trị tính 10,96 ± 2,96 Gy) LD50 giống/dịng hoa huệ kép khoảng 20-25 Gy (giá trị tính 22,91 ± 4,01 Gy) Theo dõi sinh trƣởng chồi in vitro, xử lý liều chiếu xạ cao số chồi, chiều cao chồi số giảm hai giống dòng hoa huệ Giai đoạn ghi nhận đƣợc dạng bất thƣờng hình thái chồi Giai đoạn dƣỡng, nhỏ, khác biệt hình thái chồi khơng nhận thấy rõ ràng Ở giai đoạn đồng, tiêu sinh trƣởng bị ảnh hƣởng liều chiếu xạ dịng hoa huệ Có xuất dạng bất thƣờng hình thái lá, thân số cánh hoa Đặc biệt, phát hoa huệ đơn có gia tăng số lƣợng cánh hoa lên cánh (thay hoa có cánh) Hầu hết dòng hoa huệ đơn đƣợc xử lý tia gamma (60Co) có mùi thơm, trừ dịng hoa huệ với liều xử lý Gy với đặc điểm hoa khơng nở hồn tồn Ở hoa huệ kép chọn đƣợc dòng đột biến tiềm đặc điểm hoa to có mùi thơm với 22 36 cánh Từ khóa: cánh hoa, chiếu xạ, đột biến, hoa huệ, in vitro, LD50, gamma Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT The study on "Inducing of mutation tuberose (Polianthes tuberosa L.) lines by irradiating with 60Co gamma rays in vitro" was carried out (1) to determine culture medium to create materials for experiments on two tuberoses, single petals and double petals; (2) to determine the effects of different irradiated doses on calli and shoot clumps of tuberose through LD50; (3) to determine morphological diversities at acclimatization stage; (4) to select two new tuberose lines having bigger flower size, larger number of petals and aromatic odour The obtained results included producing materials for experiments on two tuberose cultivars; treating irradiation of 60Co gamma rays at different doses and determining LD50values; evaluating the growth of calli and shoot clumps in vitro; acclimatizing and evaluating changes on morphologies and petals, and selecting, at least, two lines with better phenotypes The implemented experiments showed that the base medium supplemented with 1.0 mg/l NAA and 4.0 mg/l BA was very suitable for inducing calli and shoot clumps as experimental materials The LD50 value of single petal tuberose variety was obtained about 10-15 Gy (the counting value was 10.96±2.96 Gy), whereas that of double petal oneabout 20-25 Gy (the counting value was 22.91±4.01 Gy) At the in vitro stage, the higher radiation doses were, the lower number of shoot got, shoot height and the number of leaves were the same as in all varieties/lines There were also appearances of the abnormal structures or disappearance of the chlorophyll in leaves At the acclimatization stage, the lethal rates of plantlets were significantly different from each other for the irradiation doses, and the variations of leaves and shoots were not clearly recognized At the field stage, the growth parameters such as the number and diameter of bulbs, the height of inflorescences, the number of flowers and the days to flowering in all varieties/lines were affected by irradiated doses There were appearances of variability of leaves, trunks and petal number In single petal tuberose, there was an increase of petal number (up to or 8) in each inflorescence Almost single petal tuberose cultivars irradiated with 60Co gamma were fragrant lines, except for the tuberose lines irradiated at Gy In double petal tuberoses, among the variations of phenotypes were the two fragrant mutant lines with 22 and 36 petals, having the most potential ability for production Key words: gamma, in vitro, irradiation, LD50, mutation, petal, tuberose Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro” đƣợc hoàn thành dựa kết nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Bảo Tồn Các kết cơng trình nghiên cứu chƣa đƣợc dùng cho luận án cấp khác Tác giả luận án Đào Thị Tuyết Thanh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv CAM KẾT KẾT QUẢ v MỤC LỤC vi DANH SÁCH BẢNG xii DANH SÁCH HÌNH xiv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT xvi CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.5 Điểm luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu hoa huệ 2.1.1 Nguồn gốc phân loại thực vật hoa huệ 2.1.2 Đặc điểm thực vật hoa huệ 2.1.3 Tình hình sản xuất hoa huệ giới Việt Nam Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.3.1 Trên giới 2.1.3.2 Ở Việt Nam 2.1.4 Tầm quan trọng mục đích sử dụng hoa huệ 2.1.5 Đặc điểm sinh trƣởng phát triển 2.1.6 Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển 2.1.6.1 Nhiệt độ 2.1.6.2 Độ sâu trồng 10 2.1.6.3 Các chất dinh dƣỡng 10 2.2 Kỹ thuật trồng chăm sóc hoa huệ 11 2.2.1 Chuẩn bị giống 11 2.2.2 Chuẩn bị đất 12 2.2.3 Chăm sóc 12 2.2.4 Sâu bệnh hoa huệ 12 2.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro chọn tạo giống trồng đột biến 13 2.3.1 Các giai đoạn nuôi cấy thực vật in vitro 13 2.3.2 Các loại mẫu cấy nuôi cấy in vitro hoa huệ 13 2.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (meristem culture) 14 2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy thực vật in vitro 15 2.3.4.1 Dinh dƣỡng khoáng vitamin nuôi cấy thực vật in vitro 15 2.3.4.2 Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật nuôi cấy thực vật in vitro 16 2.3.4.3 Các chất bổ sung khác nuôi cấy thực vật in vitro 17 2.3.5 Sự hình thành mơ sẹo chồi (cụm chồi) nuôi cấy thực vật in vitro 17 2.3.5.1 Sự hình thành mơ sẹo ni cấy in vitro 17 2.3.5.2 Sự hình thành chồi ni cấy in vitro 18 2.4 Phƣơng pháp xử lý đột biến kỹ thuật chiếu xạ chọn tạo giống trồng 19 2.4.1 Sơ lƣợc đột biến kỹ thuật chiếu xạ 19 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.2 Đặc điểm tia phóng xạ gamma 19 2.4.2.1 Cơ chế tạo đột biến tia gamma (60Co) 19 2.4.2.2 Hiệu tia gamma chọn giống trồng 20 2.4.2.3 Liều chiếu xạ 20 2.4.2.4 Liều gây chết LD50 21 2.4.2.5 Tần số đột biến in vitro 21 2.4.3 Ý nghĩa phƣơng pháp chọn giống đột biến 22 2.4.4 Tình hình tạo giống hoa huệ giới Việt Nam 22 2.4.4.1 Trên giới 22 2.4.4.2 Ở Việt Nam 23 2.5 Sự kết hợp chọn giống đột biến nuôi cấy thực vật in vitro chiếu xạ tia gamma 23 2.5.1 Nguồn vật liệu để tạo đột biến in vitro 23 2.5.2 Ƣu điểm khuyết điểm phƣơng pháp chọn giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro xử lý đột biến tia gamma 23 2.5.3 Một số kết nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy thực vật in vitro xử lý đột biến tia gamma loại trồng 24 2.5.4 Một số nghiên cứu xử lý đột biến nuôi cấy thực vật in vitro chiếu xạ tia gamma hoa huệ giới Việt Nam 25 2.6 Ứng dụng thị di truyền để chọn lọc dòng đột biến chọn giống trồng hoa huệ xử lý tác nhân vật lý 25 2.6.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp 26 2.6.2 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản (Inter Simple Sequence RepeatISSR) 26 2.6.3 Một số nghiên cứu sử dụng PCR-ISSR chọn giống trồng xử lý đột biến 27 2.6.4 Một số nghiên cứu hoa huệ sử dụng phƣơng pháp PCR-ISSR 27 2.6.5 Phân tích đa hình trình tự ADN gen ITS (Internal Transcribed Spacer) 28 2.7 Địa lý điều kiện tự nhiên số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long 29 2.7.1 Tiền Giang 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.7.2 Cần Thơ 30 2.7.3 An Giang 30 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 31 3.1.1 Thời gian địa điểm 31 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 31 3.1.3 Trang thiết bị hóa chất 32 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 3.2.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) điều kiện in vitro 34 3.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hoa huệ 34 3.2.1.2 Tạo mô sẹo cụm chồi hoa huệ cho xử lý chiếu xạ 35 3.2.2 Nội dung 2: Xác định hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) hai giống/dòng hoa huệ liều gây chết 50% (LD50) in vitro 36 3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng liều lƣợng tia (60Co) gamma đến sinh trƣởng phát triển cụm mô sẹo giống/dịng hoa huệ đơn 37 3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 38 3.2.2.3 Nhân chồi tạo rễ thành hoa huệ hoàn chỉnh 39 3.2.3 Nội dung 3: Xác định đa dạng mặt hình thái giai đoạn dƣỡng nhà lƣới 39 3.2.4 Nội dung 4: Chọn dòng hoa huệ tăng số cánh hoa, kích thƣớc hoa hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống 40 3.2.4.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát sinh trƣởng phát triển giống/dòng hoa huệ đơn sau xử lý tia gamma (60Co) đồng 40 3.2.4.2 Thí nghiệm 4: Khảo sát sinh trƣởng phát triển giống/dòng hoa huệ kép sau xử lý tia gamma (60Co) đồng 42 3.2.4.3 Đánh giá đa dạng ADN giống/dòng hoa huệ đột biến 43 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 45 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 4.1 Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) điều kiện in vitro 47 4.1.1 Tỷ lệ sống nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (ĐST) hai giống hoa huệ 47 4.1.2 Nhân cụm mô sẹo (callus) cụm chồi 47 4.2 Xác định hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) hai giống/dòng hoa huệ liều gây chết 50% (LD50) in vitro 48 4.2.1 Hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển mơ sẹo giống/dịng hoa huệ đơn 48 4.2.1.1 Tỷ lệ tái sinh chồi cụm mơ sẹo giống/dịng hoa huệ đơn 48 4.2.1.2 Tỷ lệ chết cụm mơ sẹo/chồi giống/dịng hoa huệ đơn 49 4.2.1.3 Liều gây chết LD50 cụm mô sẹo/chồi giống/dòng hoa huệ đơn 50 4.2.1.4 Số chồi, chiều cao chồi số giống/dòng hoa huệ đơn 52 4.2.1.5 Tác động liều chiếu xạ tia gamma (60Co) cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ đơn 53 4.2.2 Hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 54 4.2.2.1 Tỷ lệ chết cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 54 4.2.2.2 Liều gây chết LD50 cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 55 4.2.2.3 Số chồi, chiều cao chồi số giống/dòng hoa huệ kép 57 4.2.2.4 Tác động liều chiếu xạ tia gamma (60Co) cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ kép 59 4.2.3 Nhân chồi tạo rễ thành hoa huệ hoàn chỉnh 61 4.3 Xác định đa dạng mặt hình thái giai đoạn dƣỡng nhà lƣới 62 4.3.1 Tỷ lệ chết giống/dòng hoa huệ đơn giai đoạn dƣỡng 62 4.3.2 Tỷ lệ chết giống/dòng huệ kép giai đoạn dƣỡng 63 4.3.3 Các dạng bất thƣờng kiểu hình giống/dịng hoa huệ đơn kép giai đoạn dƣỡng 64 4.4 Chọn dòng hoa huệ tăng số cánh hoa, kích thƣớc hoa hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống 64 4.4.1 Trồng lần (M1) 64 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 4.4.1.1 Các đặc điểm sinh trƣởng hoa giống/dòng hoa huệ đơn 64 4.4.1.2 Các đặc điểm sinh trƣởng hoa giống/dòng hoa huệ kép 75 4.4.2 Trồng lần (M2) 90 4.4.3 Đánh giá đa dạng di truyền giống/dòng hoa huệ bất thƣờng chọn đƣợc 92 4.4.3.1 Đánh giá đa dạng di truyền phƣơng pháp đánh dấu phân tử ISSR-PCR 92 4.4.3.2 Giải trình tự vùng ITS giống/dịng hoa huệ 96 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101 5.1 Kết luận 101 5.2 Đề nghị 103 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 PHỤ LỤC BẢNG 131 PHỤ LỤC HÌNH 140 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xi Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Watako, A O and K Ngamau, 2013 Effect of subsequent storage of tuberose (Polianthes tuberosa L.) bulbs after low temperature pretreatment improves growth, percent sprouting and cut flower quality Journal of Agriculture, Science and Technology 15 (1) Weimin, W., Z Mizhen Z., W Zhuangei, Q Yaming and Y Ji, 2009 The Study of the Irradiation Effect on Runner Plant of Strawberry with 60Co gamma ray In: VI International Strawberry Symposium Acta Horticulturae 842: 597-600 White, P R., 1963 The Cultivation of Animal and Plant Cells In: Ronald Press New York (2 nd Eds ) 239 p White, T J., T Bruns, S Lee, and J W Taylor, 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Eds Innis, M A., D H Gelfand, J J Sninsky, and T J White Academic Press, Inc., New York 315-322 Wi, S G., B Y Chung, J Kim, J Kim, M Baek, J Lee and Y.S Kim, 2007 Effects of gamma irradiation on morphological changes and biological responses in plants Micron 38: 553-564 Wilfert, G J., 1980 Gladiolus In “Introduction to floriculture” (Larson R A Ed.) Academic Press, Inc New York pp 165-181 Xi, M., L Sun, S Qui J Liu, J Xu and J Shi, 2012 In vitro mutagenesis and identification of mutans via ISSR in lily (Lilium longiflorum) Plant Cell Reports 31: 1043-1051 Xu, L., U Najeeb, M S Naeem, G L Wan, Z L Jin, F Khan and W J Zhou, 2012 In: In vitro mutagenesis and genetic improvement S.K Gupta (Ed.): Technological innovations in major world oil crops (2): 151-173 Yamaguchi, H., S Nagatomi, T Morishita, K Degi, A Tanaka, N Shikazono and Y Hase, 2003 Mutation induced with ion beam irradiation in rose Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 206: 561- 564 Yang, H and H Schmidt, 1994 Selection of mutants from adventitious shoots formed in X-ray treated cherry leaves and differentiation of standard and mutant with RAPDs Euphytica 77: 89-92 Yanofsky, M F., H Ma, J L Bowman, G N Drews, K.A Feldmann and E.M Meyerowitz, 1990 The protein encoded by the Arabidopsis Chuyên ngành Công nghệ sinh học 128 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ homeotic gene agamous resembles transcription factors Nature 346: 3540 Yanshan, S., L Jianxia, Z.Guofang, Q Guiping and L Xueen, 2003 Search for proper dose of 60Coγ ray in tuberose (Polianthes tuberosa L.) radiation breeding Acta Horticulturae Sinica Younis, S E and J H Borham, 1975 The effects of gamma radiation on Polianthes tuberosa Egyptian Journal of Botany 18: 205-217 Yuri, T., Y Oshima, T Yamamura, M Sugiyama, N Mitsuda, N Ohtsubo, M Ohme-Takagi and T Terakawa, 2013 Multi-petal cyclamen flowers produced by AGAMOUS chimeric repressor expression Scientific reports 3: 1-6 Zagaja, S W., A Przyfyla and B Machnik, 1982 Development of compact mutants in apple and sour cherry IAEA 37-47 Zhang J., C Li, C Wu, L Xiong, G Chen, Q Zhang and S Wang, 2006 RMD: a rice mutant database for functional analysis of the rice genome Nucleic Acids Research 34: 745-748 Zheng, H and H R Zheng, 2001 Induction of mutant plant in sweet potato (Ipomoea batatas) by gamma ray irradiation on calli Acta Agriculturae Shanghai 17: 27-33 Zhou, L B., W J Li, S Ma, X C Dong, L X Yu, Q Li, G M Zhou and Q X Gao, 2006 Effects of ion beam irradiation on ddventitious shoot regeneration from in vitro leaf explants of Saintpaulia ionahta Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 244: 349-353 Zhou, L., Z Jinzhu, L Zhen and C Daidi, 2009 Genetic diversity of different roses revealed by ISSR Genomics and Applied Biology 28: 311- 315 Zykov, K I and Z K Klimenko, 1989 Prospects of shortening the time to breed new garden rose cultivars Botanicheskii Saad 108: 172-137 Tài liệu website : http://hocvalam.vn/vung/dong-bang-song-cuu-long Truy cập ngày 17/1/2018 :https://lima.osu.edu/assets/lima/uploads/Departments/Biology/unsorted/coleu s2.jpg Chuyên ngành Công nghệ sinh học 129 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ :http://www.tiengiang.gov.vn/vPortal/4/625/1259/31072/Tiem-nang-phattrien/V 7883 tri -273 -7883-a-ly 273-i 7873-u-ki 7879-n-t-7921 nhien hanh-chinh.aspx Truy cập ngày 17/1/2018 :http://www.canthotoday.com/new/news/Can-Tho-Thu-phu-mien-Tay/Vi-tridi-a-ly-10/ :http://timhieuvietnam.com/danh-lam-thang-canh/dieu-kien-tu-nhien-va-tainguyen-thien-nhien-tinh-giang.html Truy cập ngày 17/1/2018 : http://blast.ncbi.nlm.nih.gov Chuyên ngành Công nghệ sinh học 130 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần mơi trƣờng MS (Murashige and Skoog, 1962) Hóa chất Đa lƣợng MS (mg/l) NH4NO3 1.650 KNO3 1.900 CaCl2 2H2O 330 MgSO4 7H2O 370 KH2PO4 170 FeSO4 7H2O 27,8 Na2 EDTA 37,3 MnSO4 H2O 22,3 ZnSO4 7H2O 11,5 H3BO3 Vi lƣợng Vitamins 6,2 KI 0,83 Na2MoO4 2H2O 0,25 CuSO4 5H2O 0,025 CoCl2 6H2O 0,025 Myo-inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine CHCl 0,4 Glycine 0,2 Carbohydrate Sucrose Chuyên ngành Công nghệ sinh học 131 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 2: Bảng biến đổi % chết sang giá trị xác suất (Finney, 1952) % 0 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 Bảng 3: Quy trình trồng hoa huệ giai đoạn ngồi đồng (Lê Lý Vũ Vi ctv., 2014) Giai đoạn Chuẩn bị đất Nội dung, cơng việc Lơ đất thí nghiệm có diện tích 500m2 đất vƣờn đƣợc sửa thành liếp đơn Liếp rộng 1,5m, cao 0,25m, đào rảnh rộng 0,5m, sâu 0,25m Bón lót (10 ngày trƣớc trồng) 10 kg phân DAP + 3m3 phân chuồng (phân bò hoai mục)/1.000 m2 Trồng lần (M1) Mỗi liếp trồng hàng, bụi hàng cách 25,0cm x 40,0cm (đối với giống huệ đơn) 25,0cm x 25,0cm (đối với giống huệ kép) Trồng củ sâu khoảng 2,0-3,0cm Tƣới ƣớt đẫm sau trồng Tƣới nƣớc Trong 30 ngày đầu, tƣới ngày lần vào sáng sớm chiều mát, sau tƣới ƣớt đẫm ngày lần vào buổi chiều Khi tƣới tránh làm dập huệ 30 ngày sau trồng Bón thúc lần 1: 30 kg phân DAP + 30 kg phân urea/1.000m2 Chuyên ngành Công nghệ sinh học 132 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 60 ngày sau trồng Bón thúc lần 2:15 kg urea + phân KNO3/1.000 m2 Định kì hàng tháng Làm cỏ xới đất Bón sau làm cỏ xới đất hàng tháng Bón phân giai đoạn cho hoa Rãi mặt liếp: kg DAP + 3kg urê + kg NPK 20-20-15 (cho 1.000 m2) Kỹ thuật thu hoa Thu vào sáng sớm chiều mát Dùng dao bén cắt gần sát củ, để nƣớc không đọng cọng hoa nên dễ làm thối củ Lần trở dùng chân đạp giữ gốc huệ, tay nắm cọng dặt mạnh ngang mặt đất rời khớp Bón 15 kg phân DAP + 15 kg urê (cho 1.000 m2) Sau thu hoạch đợt Khi có 70% hoa, tiến hành dỡ cũ, phân loại củ theo kích cỡ, sữa đất để trồng có dạng bất thƣờng mong muốn lần (M2) (Quy trình canh tác đƣợc thực tƣơng tự nhƣ trồng lần 1) Phòng trừ sâu bệnh + Phòng trừ loại thuốc trị nhện đỏ, rệp sáp nhƣ: Pegasus, Ortus, Nissorun, Kelthan 20EC, Comite, Basudin 10H (liều lƣợng theo hƣớng dẫn bao bì) + Phòng trừ bệnh thối lá, thối củ loại thuốc sau đây: Anvil, Topsin, Ridomil, Rorval, Alliette… Thí nghiệm 1: Bảng 4: Số chồi giống/dòng HĐ 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 579,517 64,391 Trong nhóm 301,580 300 1,005 881,09 309 Tổng F Sig 64,054 0,000 Bảng 5: Chiều cao chồi giống/dòng HĐ 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 1656,872 184,097 Trong nhóm 942,212 300 3,141 2599,084 309 Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học 133 F Sig 58,616 0,000 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 6: Số giống/dịng HĐ 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 14088,300 1565,367 Trong nhóm 4979,894 300 16,6 19068,194 309 Tổng F Sig 94,301 0,000 Thí nghiệm 2: Bảng 7: Số chồi giống/dòng HK ngày Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 14088,300 1565,367 Trong nhóm 4979,894 300 16,6 19068,194 309 Tổng F Sig 94,301 0,000 Bảng 8: Chiều cao chồi giống/dòng HK ngày Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 0,011 0,001 Trong nhóm 3,719 305 0,012 Tổng 3,730 314 F Sig 0,101 1,000 Bảng 9: Số giống/dòng HK ngày Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 1,145 0,127 Trong nhóm 80,043 305 0,262 Tổng 81,187 314 F Sig 0,485 0,885 Bảng 10: Số chồi giống/dịng HK 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 530,299 58,922 Trong nhóm 121,276 300 0,404 Tổng 651,575 309 F Sig 145,755 0,000 Bảng 11: Chiều cao chồi giống/dịng HK 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Giữa nhóm Chun ngành Cơng nghệ sinh học Độ tự 152,052 134 TB bình phƣơng 16,895 F Sig 107,335 0,000 Viện NC & PT Cơng nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trong nhóm Tổng Trường Đại học Cần Thơ 47,220 300 199,272 309 0,157 Bảng 12: Số giống/dòng HK 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 1,145 0,127 Trong nhóm 80,043 305 0,262 Tổng 81,187 314 F Sig 0,485 0,885 Bảng 13: Số chồi HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 75,892 10,842 15,768 0,000 Lặp lại 3,167 1,584 2,303 0,137 Sai số 9,626 14 0,688 Độ tự TB bình phƣơng Tổng 917,060 Bảng 14: Số HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Lặp lại Sai số Tổng 15526,986 8,363 4,182 973,510 14 69,536 F Sig 2218,141 31,899 0,000 0,060 0,942 219111,610 Bảng 15: Số củ HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng 159,807 Lặp lại 1,908 0,954 Sai số 8,506 14 0,608 Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học F 22,830 37,576 0,000 1,570 0,243 3047,880 135 Sig Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 16: Đƣờng kính củ HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 5,353 0,765 33,028 0,000 Lặp lại 0,016 0,008 Sai số 0,324 14 0,023 Tổng 0,342 0,716 285,860 Bảng 17: Thời gian hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng 3527,833 503,976 5,382 0,004 Lặp lại 173,083 86,542 0,924 0,420 Sai số 1310,917 14 93,637 Nghiệm thức Tổng F Sig 665692,000 Bảng 18: Chiều cao phát hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Lặp lại Sai số Tổng Độ tự TB bình phƣơng F Sig 467,833 66,833 4,831 0,006 1,000 0,500 0,036 0,965 193,667 14 13,833 29644,000 Bảng 19: Số hoa/phát hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Lặp lại Sai số Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học Độ tự TB bình phƣơng F Sig 467,833 66,833 4,831 0,006 1,000 0,500 0,036 0,965 193,667 14 13,833 29644,000 136 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 20: Đƣờng kính hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 6,680 0,954 22,360 0,000 Lặp lại 0,002 0,001 Sai số 0,598 14 0,043 Tổng 0,029 0,971 230,540 Bảng 21: Số chồi HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 24,736 3,534 10,703 0,000 Lặp lại 0,023 0,011 Sai số 4,622 14 0,330 Tổng 0,034 0,966 674,913 Bảng 22: Số HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 1253,651 179,093 3,117 0,033 Lặp lại 180,635 90,317 1,572 0,242 Sai số 804,347 14 57,453 Tổng 23078,048 Bảng 23: Số củ HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến Tổng bình phƣơng động Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 150,392 21,485 27,991 0,000 Lặp lại 2,208 1,104 1,438 0,270 Sai số 10,746 14 0,768 Tổng 3133,720 Chuyên ngành Công nghệ sinh học 137 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 24: Đƣờng kính củ HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến Tổng bình phƣơng động Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 0,640 0,035 1,310 0,315 Lặp lại 0,070 0,091 0,502 0,616 Sai số 0,977 14 0,070 Tổng 364,390 Bảng 25: Thời gian hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 2685,625 383,661 7,816 0,001 Lặp lại 232,750 57,500 2,371 0,130 Sai số 687,250 14 Tổng 49,089 686031,000 Bảng 26: Chiều cao phát hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng 4124,792 Lặp lại 74,813 37,406 Sai số 752,521 14 53,751 Tổng F Sig 589,256 10,963 0,000 0,696 0,515 208640,500 Bảng 27: Số hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 630,500 90,071 2,623 0,00 Lặp lại 72,583 36,292 1,057 0,374 Sai số 480,750 14 Tổng 34,339 51052,000 Bảng 28: Đƣờng kính hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 7,028 1,004 27,961 0,000 Lặp lại 0,089 0,044 Sai số 0,503 14 0,036 Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1,239 0,320 495,872 138 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Hệ số tƣơng đồng phần mềm NTSYSpc 2.1 " SIMQUAL: input=C:\Users\Nhat Lam\Desktop\UBC.NTS, coeff=SM " by Cols 4L C1 C2 C3 C4 1.0000000 0.6428571 1.0000000 0.7857143 0.5714286 1.0000000 0.4285714 0.3571429 0.5000000 1.0000000 Sơ đồ nhánh SAHN: NTSYSpc 2.10m, (C) 2000-2001, Applied Biostatistics Inc -Input parameters Read input from file: C:\Users\Nhat Lam\Desktop\ubc out.NTS Save result tree in output file: C:\Users\Nhat Lam\Desktop\ubc tree.NTS Clustering method: UPGMA In case of ties: WARN Comments: SIMQUAL: input=C:\Users\Nhat Lam\Desktop\UBC.NTS, coeff=SM by Cols Matrix type = 3, size = by 4, missing value code = "none" (similarity) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 139 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC HÌNH Hình 1: Các bƣớc dƣỡng giống/dòng hoa huệ đơn Đài hoa Cánh hoa Nhị hoa Lá nỗn Hình 2: Mơ hình ABC phát triển quan Arabidopsis (Nguồn: Chang et al., 2009) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 140 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Hình 3: Lơ đất trồng giống/dịng hoa huệ đơn Hình 4: Giống/dịng hoa huệ kép trồng lần Hình 5: Thu hoạch chuẩn bị giống/dòng hoa huệ để trồng lần Chuyên ngành Công nghệ sinh học 141 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Hình 6: Giống/dịng hoa huệ kép trồng lần Chuyên ngành Công nghệ sinh học 142 Viện NC & PT Công nghệ sinh học ... HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc l? ??p – Tự – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án ? ?Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L. ) đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro? ?? đƣợc hoàn thành dựa... hiệu liều l? ?ợng tia gamma (60Co) hai giống /dòng hoa huệ liều gây chết 50% (LD5 0) in vitro 48 4.2.1 Hiệu liều l? ?ợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển mơ sẹo giống/dịng hoa huệ đơn.. .Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ TĨM TẮT Nghiên cứu ? ?Tạo dịng hoa huệ (Polianthes tuberosa L. ) đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro? ?? đƣợc thực nhằm ( 1) xác