Ngày nay, insulin được tinh chếbằng phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa rất cao.+ Insulin người.Được sản xuất từ insulin động vật qua các phương pháp:+ Bán tổng hợp từ insulin lợn.+ Tái
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG SEMINAR: SẢN XUẤT INSULIN TÁIhọc TỔ HỢP Tiểu luận môn GVHD: TS Trần Thị Dung Nguyễn Thị Mỹ Duyên - 61203027 Nguyễn Thị Hoài Nhiên – 61203099 Nguyễn Khấu Phương Nhung – 61203100 I SƠ LƯỢC VỀ INSULIN: Sơ lược bệnh tiểu đường: + Tiểu đường dạng bệnh rối loạn chuyển hoá cacbon hydrat hormone insulin tuyến tuỵ bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu cao + Bệnh tiểu đường bệnh chính: bệnh tiểu đường loại tuỵ không tiết insulin, loại tiết giảm insulin đề kháng insulin + Biểu hiện: giai đoạn phát sinh, người bệnh thường tiểu nhiều, tiểu vào ban đêm kèm theo chứng khô miệng, khát nước + Nguyên nhân phát sinh bệnh: insulin tiết thiếu không đủ tế bào có tính mẫn cảm với insulin giảm thấp, dẫn tới rối loạn trình trao đổi đường, nước, chất béo chất điện giảm thể Sơ lược Insulin: a Nguồn gốc: Insulin hormon quan trọng, giúp thể hấp thu glucose - thành phần cung cấp lượng cho người Nguồn gốc insulin: + Nguồn gốc động vật: từ tụy bò hay lợn Ngày nay, insulin tinh chế phương pháp sắc kí độ tinh khiết hóa cao Tiểu luận mơn học + Insulin người Được sản xuất từ insulin động vật qua phương pháp: + Bán tổng hợp từ insulin lợn + Tái tổ hợp gen: loại insulin trung tính đơn thành phần, sản xuất kỹ thuật tái tổ hợp DNA, sử dụng nấm men làm thể sinh sản đạt đến độ tinh khiết hóa chất lượng cao nhất, có cấu trúc giống hệt insulin tự nhiên người, tạo kháng thể thời gian tác dụng ngắn b Cấu tạo: Là protein gồm 51 acid amin tạo thành chuỗi polypeptid Ở hầu hết loài, chuỗi A gồm 21 acid amin, chuỗi B gồm 30 acid amin nối cầu nối SS(disulfua) Trọng lượng phân tử khoảng : 5800-6000 Dalton Cấu trúc phân tử insulin Mặc dù trình tự acid amin khác loài số đoạn định phân tử có tính bảo tồn cao, đoạn có chứa cầu nối disulfua, hai đầu chuỗi A nhánh bên đầu COOH chuỗi B Sự tương đồng tình tự acid amin dẫn đến cấu trúc chiều Insulin loài khác giống Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao lồi khác Tiểu luận mơn học c Phân loại: Có loại insulin: + Insulin có tác dụng nhanh + Insulin tác dụng bán chậm (trung bình) + Insulin tác dụng chậm + Insulin hốn hợp d Cơ chế: + Thời gian bán hủy 3-5 phút + Bị phá hủy đường tiêu hóa enzym proteinase dày + Hấp thu tốt đường tiêm Mức độ phụ thuộc vào nồng độ insulin, vị trí tiêm, độ sâu mũi tiêm, vận động + Insulin bị chuyển hóa gan, thận, Trong 50% gan + Đào thải qua thận II QUY TRÌNH SỬ DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP ĐỂ SẢN XUẤT INSULIN: Khái quát công nghệ DNA tái tổ hợp: Kỹ thuật DNA tái tổ hợp tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo gen hệ gen ; cải biến cấu trúc gen, nhằm tạo gen chuyển chúng vào tế bào, thể chủ nhằm mục đích sản xuất sản phẩm ( protein, enzym,…), tế bào, thể có tính trạng theo mong muốn Tiểu luận môn học Những hiểu biết sâu sắc đại phân tử sinh học sở khoa học kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu kỹ thuật DNA tái tổ hợp Kỹ thuật DNA tái tổ hợp gồm bước sau: + Tách chiết tạo DNA, RNA theo mong muốn ( phân lập gen) + Tạo vector tái tổ hợp ( chuẩn bị vector tách dòng, enzym cắt giới hạn enzym nối) + Chuyển ( biến nạp) DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng gen + Sàng lọc theo dõi hoạt động gen chuyển vào tế bào chủ, tạo số lượng lớn đoạn DNA theo mong muốn để sử dụng vào mục đích khác a Phân lập gen: Tách chiết DNA: tùy theo nguồn acid nucleic,có kiểu tách chiết khác nhau: + Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ màng, loại bỏ protein enzim, kết tủa tinh DNA hóa chất, dung mơi, dịch chiết thích hợp + Đối với mô, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết DNA Tuy nhiên trực tiếp lấy mẫu sinh phẩm lơng, tóc, thịt, máu, nước bọt., mô thân , rễ, lá… Tách chiết RNA: quy trình tương tự tách chiết RNA, dịch chiết sau làm protein, sử dụng enzim phân hủy RNA, kết tủa thu RNA Định lượng DNA, RNA: sản phẩm sau tách chiết cần có độ tinh hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định số hấp phụ, tù đánh giá độ tinh hàm lượng cần thiết Hoặc dùng phương pháp điện di gel thạch xác định băng DNA, RNA, suy độ tinh hàm lượng cần thiết cho nghiên cứu b Tạo vector tái tổ hợp: Vector tách dịng: phân tử DNA có kích thước nhỏ, có khả gắn gen cần thiết, tự tái bản, tồn tế bào chủ đặc biệt phải mang tín hiệu nhận biết tế bào chủ mang vector tái tổ hợp Các loại vector tách dòng thường dùng : + Plasmid : phân tử DNA dạng vịng, xoắn kép, có tế bào chất vi khuẩn + Phage : phần lớn phagơ Lamda, có hệ gen chứa vị trí thuận lợi cho cài gen khác nhau, giúp gen dễ dàng xâm nhập vào vi khuẩn có khả có khả chép nhanh + Virut tế bào nhân thực : virut SV40, adenovirut, retrovirut, virut herpes…được sử dụng tách dòng chuyển gen tế bào động vật, thực vật Tiểu luận môn học Enzym cắt giới hạn: enzym có khả nhận biết đoạn trình tự phân tử DNA cắt DNA điểm đặc hiệu Đồng thời cắt gen từ hệ gen đó, cắt vector tách dịng vector tái tổ hợp, tạo điều kiện gắn đoạn gen cần thiết Enzym nối Ligase: enzym quan trọng tế bào, chúng xúc tác hình thành liên kết photphodieste để nối đoạn acid nucleic với Có loại enzym nối quan trọng Cơng nghệ di truyền: enzym E.Coli DNA tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T DNA enzym T4 RNA tách chiết từ phage T4 Ngoài ra, ngày người ta cịn sử dụng đoạn nối (đầu dính - adaptor ) cho enzym đầu Adaptor xúc tác nối đoạn DNA enzym cắt đầu từ tạo nên đầu sol Các adaptor đặc trưng riêng cho loại enzym Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn DNA khác nhau, qua khâu nối trộn lẫn tạo sản phẩm DNA tái tổ hợp c Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhân dòng gen: Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuyển trực tiếp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế bào chủ vi khuẩn, tế bào động vật, tế bào thực vật; nhờ máy di truyền tế bào chủ nhân DNA tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn Những tế bào chủ thường dùng: + Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, tốn kém, sinh sản nhanh, tạo dịng DNA tái tổ hợp nhanh + Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro, loại tế bào thường dùng vào mục đích cụ thể; nghiên cứu điều hòa hoạt động gen, đột biến gen… Những phương pháp chủ yếu dùng để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận: + Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( khơng có thành Xelulose) mơi trường thích hợp + Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm) tạo lỗ thủng nhỏ tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệ gen tế bào chủ + Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ DNA vào tế bào chủ tế bào trứng thụ tinh giai đoạn phôi 4-8 tế bào + Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển ( súng bắn gen) vào hệ gen tế bào chủ Vi đạn hạt Volfram vàng trộn với gen cần chuyển phụ gia, vi đạn bắn vào viên đạn lớn hơn, bắn, viên đạn lớn giữ lại, vi đạn bắn vào tế bào nhận với gia tốc lớn d Chọn lọc, tạo dòng biểu gen: Việc chọn lọc dòng tế bào ý không đơn giản tốn nhiều công sức Khi xác nhận DNA tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào mang gen cần thiết chúng sinh sản để tạo dòng tạo điều kiện cho gen biểu Tiểu luận môn học Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau biến nạp DNA vào tế bào nhận, tạo nhiều dịng tế bào vi khuẩn khác Chúng ni thành dòng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dòng tế bào vi khuẩn khơng nhận plasmit, dịng nhận plasmit khơng có gen lạ dịng nhận plasmit tái tổ hợp) Do muốn nhận tách dòng gen từ thư viện DNA, người ta sử dụng phương pháp: + Lai acid nucleic: làm tan chỗ khuẩn lạc vi khuẩn giấy lọc nitrocellulose DNA thoát gắn với mẫu thử acid nucleic có mang dấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu Nếu tượng bắt cặp bổ sung xảy có nghĩa gen chuyển vào tế bào nhận + Phát kiểu hình: địi hỏi dịng mục tiêu phải có biểu dạng protein dễ phát phép thử + Phản ứng miễn nhiễm: tế bào nhận plasmit có gắn đoạn DNA lạ tế bào vi khuẩn hoạt tính kháng tetracyclin, khuẩn lạc mọc mơi trường có ampicilin, khơng mọc mơi trường có tetrecyclin Đây dịng tế bào cần chọn Sự biểu gen tạo dịng: nói chung gen lạ sau đưa vào tế bào nhận, muốn gen có biểu tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ yếu tố phiên mã dịch mã phù hợp sở chế điều hòa biểu biểu gen Các vector gọi vector biểu Ý nghĩa sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất insulin: Sản xuất Insulin công nghệ tái tổ hợp bước nhảy vọt việc chữa trị bệnh tiểu đường Ngoài ý nghĩa quan sử dụng công nghệ để sản xuất Insulin, hiệu kinh tế, sử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ nhiều mà chất lượng sản phẩm bảo đảm, nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao tế bào nhân tham gia quy trình nghệ DNA tái tổ hợp Quy trình sản xuất Insulin công nghệ DNA tái tổ hợp: Tổng hợp Insulin người q trình sinh hóa gồm nhiều bước, gồm hai phương pháp a Phương pháp 1: Tạo chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học tạo tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử tách gen mã hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 + Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết mRNA người có polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA Tiểu luận mơn học + Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mRNA cần thiết cho q trình dịch mã; cịn lại loại bỏ DNA RNA khác + Cắt bỏ cầu nối A - T thu mRNA Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp + Cắt gen mã hoá proinsulin plasmit loại enzym giới hạn Nối DNA ligase phageT4 Trong thành phần vector biểu phải có promoter mạnh giúp gen biểu vi khuẩn + Thiết kế trình tự mã hố cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ngồi tế bào chất Nếu sử dụng mRNA tách từ tiến hành sau: + Sao mRNA tinh khiết thành DNA (cDNA) nhờ enzym phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT - PCR) + Cài đoạn cDNA mã hố insulin hồn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca+ tạo lỗ xung điện Tiểu luận môn học Tách biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli Bước 4: Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp Sau trình biến nạp, cần chọn lọc dòng vi khuẩn mang gen mong muốn Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy trình gen đánh dấu vector sử dụng Thông thường sử dụng kháng sinh Ampixilin Tetraxilin để chọn lọc Sau kiểm tra dịng chọn lọc theo nhiều cách khác cách giải đoạn trình tự nucleotic đoạn gen cài vào vector tái tổ hợp so sánh với trình tự gốc Bước 5: Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phầm Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào nồi lên men Nuôi chúng nồi lên men với điều kiện tối ưu Sử dụng phương pháp ni cấy liên tục, theo chất dinh dưỡng liên tục bổ sung để đảm bảo tăng trưởng vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ nhân lên qua nguyên phân Như vậy, sau thời gian ngắn, sinh khối tăng Bước 6: Tiền tinh + Sau lên men cần tách tế bào khử trùng nhiệt + Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit + Proinsulin tách khỏi mảnh vỡ tế bào phương pháp li tâm lọc Bước 7: Hoạt hố + Do hệ thống E.coli có khả biểu gen insulin khơng có khả hoạt hoá insulin + Hoạt hoá proinsulin invitro cách xử lý dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết Bước 8: Hỗn hợp tinh cịn có insulin + Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzym + Độ tinh insulin đánh giá qua giai đoạn trung gian trình sản xuất nhờ phịng thí nghiệm chun hố Cuối insulin tinh thể hố Tiểu luận mơn học Các tinh thể insulin b Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B + Phương pháp tránh việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin + Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A B Xác định trình tự DNA để qua tổng hợp tách hai dòng gen + Mỗi DNA chèn vào plasmit Sau sản xuất tương tự sản xuất proinsulin + Cuối hai chuỗi A B trộn với hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ chất oxi hoá định Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt Tiểu luận môn học Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B c Các phương pháp sản xuất khác: + Giả insulin : Cải tiến phương thức hoạt động insulin thể người cách thay đổi trình tự acid amin tạo chất tương tự Insulin giả kết dính với khuếch tán vào máu dễ dàng Quy trình sản xuất Insulin giả tương tự quy trình sản xuất insulin + Phương pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với in vitro tạo cầu nối disulfur Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp Do đó, Eli Lilly phát triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin 10 + Phương pháp sản xuất tập đoàn Novo Nordisk: phương pháp này biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với bằng acid amin, được biểu hiện nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin Phương pháp này có nhiều thuận lợi cầu nối disulfur được hình thành quá trình biểu hiện và quá trình tiết miniproinsulin, và miniproinsulin này được tách chiết và tinh sạch dễ dàng được tiết thẳng môi trường nuôi cấy + Phương pháp công ty Bio-Technology General: Trong phương pháp này, một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện tế bào E.coli Bằng cách này, hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và hiệu quả của quá trình hình thành các cầu nốii Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase B + Sử dụng tế bào gốc lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh: Các nhà khoa học Anh Mỹ cho biết họ sử dụng tế bào gốc lấy từ máu dây rốn trẻ sơ sinh để giúp bệnh nhân tiểu đường loại khôi phục khả sản xuất insulin thể Ưu phương pháp + Insulin tạo gần hoàn chỉnh với cấu trúc Insulin người + Tạo số lượng lớn Insulin thời gian ngắn Tiểu luận môn học + Năng suất cao + Nguồn ngun liệu dễ tìm ,khơng nguy hại đến mơi trường + Trong q trình tách chiết: dễ thao tác kĩ thuật chuẩn hóa phịng thí nghiệm + Ít tốn chi phí + Giá thành rẻ III ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA INSULIN: Insulin tác dụng nhanh a Ưu điểm: + Là loại dùng cấp cứu tác dụng hạ đường huyết nhanh chóng + Có thể trộn lẫn với insulin chậm tùy theo mục đích nhu cầu điều trị + Có thời gian tác dụng ngắn mạnh để làm giảm đường huyết sau ăn b Nhược điểm : Thời gian tác dụng ngắn nên phải tiêm nhiều lần ngày (4 mũi tiêm da, thực tế không dùng riêng insulin tác dụng nhanh để điều trị mà phải kết hợp thêm insulin tác dụng bán chậm chậm) Insulin tác dụng bán chậm (dịch tiêm đục sữa) 11 Để làm giảm bớt số lần tiêm ngày, người ta sản xuất loại insulin có tác dụng dài gồm loại insulin NPH (Neutral Protamine Hagedorn) hay IZS (Insulin Zinc Suspension) để sử dụng chế độ điều trị với hay mũi tiêm ngày a Ưu điểm: insulin tác dụng trung bình có nhiều loại với thời gian tác dụng khác tùy thuộc vào yêu cầu điều trị thuận lợi bệnh nhân b Nhược điểm: gây đau trộn với insulin nhanh Insulin trộn sẵn (dịch tiêm đục sữa) Là loại insulin trộn lẫn loại nhanh trung bình theo tỷ lệ định + Có tỷ lệ 30% insulin nhanh 70% insulin trung bình + Có tỷ lệ 50% insulin nhanh 50% insulin trung bình Ngồi cịn tiến hành trộn theo tỷ lệ khác mà loại nhanh chiếm 10- 20- 40% a Ưu điểm: tiện dùng, phù hợp với sinh lý mà khơng địi hỏi phải tự trộn lấy liều dùng riêng loại nhanh chậm b Nhược điểm: tỷ lệ pha trộn cố định nên khó điều chỉnh cho phù hợp với tình cụ thể: ăn bữa no tăng liều insulin nhanh chậm gây hạ đường huyết muộn Trong lẽ tăng từ đến đơn vị loại insulin nhanh Insulin tác dụng chậm (dịch tiêm đục sữa) Tiểu luận môn học a Ưu điểm: Chỉ cần mũi tiêm có tác dụng 24 ngày Có thể dùng kỹ thuật mũi tiêm/ ngày, mũi nhanh vào trước bữa ăn mũi vào lúc ngủ (22 giờ) b Nhược điểm: Bị đỏ, đau nơi tiêm Hạ đường huyết không lường trước tác dụng kéo dài chồng chéo với mũi tiêm khác Thường không làm giảm đường máu sau ăn thời gian hấp thu vào máu chậm 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] http://d.violet.vn/uploads/resources/562/1075370/ preview.swf [2] http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php? file=article&name=News&sid=1149 [3] http://baigiang.violet.vn/present/show?entry_id=487936 [4] http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong- nghe-sinh-hoc/2659-insulin-va-cong-nghe-san-xuat-insulintren-the-gioi [5]http://vi.wikipedia.org/wiki/Insulin Tiểu luận môn học 13