Chuyên đề công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp

Chuyên đề Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp download by : skknchat@gmail.com Nội dung Giới thiệu CN SX protein TTH Kỹ thuật biểu protein TTH Sản xuất protein TTH hệ thống Bacillus Ứng dụng protein TTH download by : skknchat@gmail.com Giới thiệu  Kỹ thuật tái tổ hợp DNA - phân lập khuếch đại đoạn DNA từ genome sinh vật bất kì, biến đổi chuyển đoạn DNA vào sinh vật khác  Theo đó, gen ngoại lai biểu nhiều chủng chủ prokaryote eukaryote nhằm tạo protein tái tổ hợp  Từ bước đầu thành công việc tạo chủng E coli mang gen mã hóa insulin người (1978), hàng loạt protein tái tổ hợp có giá trị tạo mà điển hình protein sử dụng sản xuất dược phẩm công nghệ enzyme download by : skknchat@gmail.com Giới thiệu  Việc sản xuất protein tái tổ hợp trở thành ngành quan trọng công nghệ sinh học đại  FDA (Food and Drug Administration) EMEA (European Medicines Agency) công nhận cấp quyền sáng chế cho 150 loại protein tái tổ hợp sử dụng dược phẩm  Phần lớn sản lượng enzyme công nghiệp thị trường tạo từ quy trình sản xuất protein tái tổ hợp  Quy mô sản xuất protein tái tổ hợp tăng việc lựa chọn hệ thống biểu đạt hiệu cao trọng download by : skknchat@gmail.com Giới thiệu  Để kiểm sốt biểu protein tái tổ hợp, gen mục tiêu dung hợp với promoter kiểm soát chất cảm ứng isopropyl thiogalactose (IPTG), xylose, glycine…  Một hệ thống biểu - tốt - kiểm soát biểu cách chặt chẽ cho phép biểu vượt mức protein mục tiêu  Sự phiên mã diễn thấp khơng có chất cảm ứng thêm chất cảm ứng vào, mức độ biểu protein mục tiêu đạt 10 - 30% protein tổng số tế bào  Lựa chọn hệ thống biểu phù hợp, cho phép sản xuất protein mục tiêu cách hiệu đóng vai trị quan trọng lĩnh vực sản xuất protein tái tổ hợp download by : skknchat@gmail.com Quy trình sản xuất protein TTH download by : skknchat@gmail.com Quy trình sản xuất protein TTH Sequencing techniques PCR and RT-PCR gDNA and cDNA Libraries Acrylamide gel, SDS-PAGE, Western blot download by : skknchat@gmail.com Biểu protein Một chủng chủ phù hợp sản xuất protein tái tổ hợp:  Dễ nuôi cấy môi trường có nguồn carbon rẻ tiền;  Lên men mật độ cao mở rộng quy mô (scale up) đơn giản;  Thông tin di truyền đầy đủ dễ dàng thao tác;  Có khả biến đổi sau dịch mã;  Dễ dàng thu hồi tinh sản phẩm tổng hợp (downstream processing);  Là sinh vật an tồn khơng sinh độc tố download by : skknchat@gmail.com Hệ thống biểu protein TTH Bacterial Yeast Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris E.coli Insect Poecilotheria metallica Mammalian download by : skknchat@gmail.com Bacillus Tế bào chủ E.coli  E coli xem nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp từ sớm phổ biến nhiều thập kỷ  Ưu điểm: thông tin di truyền hiểu rõ, dễ dàng thao tác, nuôi cấy đơn giản tế bào eukaryote, có sẵn nhiều loại vector chủng đột biến có lợi  Nhược điểm: (i) tạo nội độc tố lẫn vào sản phẩm protein sau tinh chế; (ii) protein sản xuất dạng thể vùi thường hoạt tính, khơng tan u cầu phải tái gấp cuộn download by : skknchat@gmail.com ĐIỆN DI MINI GEL SDS-POLYARYLAMIDE  1.4 g SDS/ gram protein (approximately one molecule of SDS for every two amino acid residues) download by : skknchat@gmail.com ĐIỆN DI MINI GEL SDS-POLYARYLAMIDE Hoá chất Đệm Tris-HCl pH 8,8 Nước cất hai lần Dung dịch acrylamide 30% Dung dịch SDS 10% APS 25% Thể tích (µl) 745 1375 2145 28,5 50 Hoá chất Đệm Tris-HCl pH 8.8 Nước cất hai lần Dung dịch acrylamide 30% Dung dịch SDS 10% APS 25% download by : skknchat@gmail.com Thể tích (µl) 290 570 130 16 10 ĐIỆN DI MINI GEL SDS-POLYARYLAMIDE download by : skknchat@gmail.com 20,000 9,000 6,500 4,000 2,500 2,000 500 download by : skknchat@gmail.com download by : skknchat@gmail.com download by : skknchat@gmail.com Ví dụ : THỰC NGHIỆM Phân tích gen mã hóa nattokinase chọn trình tự gen mã hóa đại diện     Thu nhận gen mã hóa nattokinase từ chủng phân lập pp PCR Giải trình tự gen mã hóa nattokinase Nhận định tính đa dạng gen mã hóa Chọn trình tự mã hóa phù hợp Cấu trúc chủng Bacillus subtilis mang hệ thống cảm ứng biểu tiết nattokinase ngoại bào  Dịng hóa gen mã hóa nattokinase trình tự tiết tự nhiên vào hệ thống vector biểu  Biến nạp vector nói vào chủng chủ Bacillus subtilis  Nuôi cấy cảm ứng biểu nattokinase download by : skknchat@gmail.com Thu nhận, giải trình tự phân tích gen mã hóa nattokinase Sản phẩm khuếch đại khoảng 1146 cặp base thu nhận PCR với cặp mồi tự thiết kế tạo plasmid tái tổ hợp pB-aprN để lưu trữ gen sử dụng vector pBluescript II KS (+) DNA gen chủng Bacillus spp phân lập từ Natto sản phẩm khuếch đại gen aprN gel agarose 1% Giếng 1, 2: Sản phẩm PCR gen aprN; Giếng 3: Thang chuẩn kb; Giếng 4, 5, 6: DNA gen chủng đại diện Bacillus sp phân lập từ natto Kết sàng lọc dịng tế bào E coli DH5α có mang pB-aprN phản ứng PCR Giếng 1, 5: Phản ứng PCR sử dụng pB-aprN làm khuôn, mồi T3/T7 Giếng 2: Phản ứng PCR sử dụng pB làm khuôn, mồi T3/T7 Giếng 3: Phản ứng PCR không sử dụng DNA khuôn (chứng âm), mồi T3/T7 Giếng 4: Thang DNA 1kb 10 plasmid mang gen aprN tương ứng với 10 chủng Bacillus phân lập từ natto tạo dịng thành cơng pBluescript II-KS (+) phục vụ mục tiêu lưu trữ gen giải trình tự download by : skknchat@gmail.com Thu nhận, giải trình tự phân tích gen mã hóa nattokinase Giải trình tự gen aprN nhận định tuyển chọn gen mã hóa thích hợp cho nattokinase  Tám mẫu có trình tự nucleotide sai khác nucleotide (tại vị trí 528) tổng số 1.146 nucleotide gen aprN; amino acid mã hóa tương đồng 100% với nattokinase (EMBL ACJ11220.1 hay AAC60424.1) (hình 2.6) Vậy mẫu gen thích hợp chọn cho cấu trúc hệ thống nattokinase tái tổ hợp download by : skknchat@gmail.com Cấu trúc chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu tiết ngoại bào nattokinase Sơ đồ bước tạo dòng gen aprN vào hệ thống pBG01 download by : skknchat@gmail.com Cấu trúc chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu tiết ngoại bào nattokinase Psgrac - aprN 1.5 giờ Hệ thống vector pBG01 tồn độc lập chủng Bacillus subtilis Gen aprN kiểm soát promoter Pgrac, promoter mạnh nhạy cảm với lượng IPTG nồng độ thấp Chủng Bacillus subtilis mang plasmid tái tổ hợp pBG01-aprN tiến hành nuôi cấy 27.7 kDa môi trường LB nuôi cấy lắc chủng giá trị OD578nm đạt khoảng 0,6 – 0,8 cảm ứng IPTG Giếng 1: Thang protein Giếng 2,5: B subtilis mang pBG01 cảm ứng IPTG Giếng 3,6: B subtilis mang pBG01-aprN cảm ứng IPTG Giếng 4,7: B subtilis mang pBG01-aprNkhông cảm ứng IPTG download by : skknchat@gmail.com Cấu trúc plasmid pDG1730-Pgrac-aprN sáp nhập vào gen Bacillus subtilis Mục tiêu: đưa casset biểu Pgrac-aprN từ plasmid pBG01-aprN chèn vào DNA gen Bacillus subtilis, nhằm giữ ổn định cấu trúc tế bào mà không cần sử dụng kháng sinh, sử dụng plasmid sát nhập pDG1730 làm khung để dịng hóa bla amyE EcoRI spc pDG1730 Plasmid pDG1730 chứa hai trình tự tương đồng với locus amyE cho phép chèn đoạn trình tự hai trình tự vào gen Bacillus subtilis thông qua tượng trao đổi đoạn kép, đồng thời plasmid mang vị trí cắt EcoRI nằm hai trình tự tương đồng amyE amyE erm download by : skknchat@gmail.com Cấu trúc plasmid pDG1730-Pgrac-aprN sáp nhập vào gen Bacillus subtilis Plasmid pDG1730-Pgrac-aprN thu nhận từ E.coli DH5α, sau biến nạp vào chủng Bacillus subtilis DB104 sàng lọc môi trường chứa spectinomycin Kiểm tra xát nhập plasmid tái tổ hợp locus amyE thông trao đổi đoạn tương đồng kép (A) mt LB chứa erythromycin; (B) mt LB chứa spectinomycin; (C) mt LB chứa tinh bột Chọn dòng khuẩn lạc mẫn cảm với erythromycin, kháng spectinomycin khơng có khả tạo vòng tan phân giải tinh bột download by : skknchat@gmail.com So sánh khả tổng hợp nattokinase ngoại bào chủng Bacillus subtilis pBG01-aprN amyE::Pgrac-aprN chủng hoang dại phân lập So sánh khả tiết nattokinase dịch ngoại bào điện di SDS-PAGE Kết chạy điện di mẫu nattokinase chủng vi khuẩn 1, 2: B subtilis DB104, 3, 4: B subtilis DB104 amyE::PSgrac-aprE, 5, 6: B subtilis natto D3, 7, 8: B subtilis DB104/pBG01-aprE B subtilis D3 B subtilis DB104/pBG01aprN Hoạt tính 170,184 ± 454,056 ± (FU/ml) 12,821 26,315 B subtilis DB104 B subtilis amyE::PSgrac- DB104 aprN 290,586 ± 5,359 -1,977 ± 0,621 download by : skknchat@gmail.com Thank You! download by : skknchat@gmail.com ... Agency) công nhận cấp quyền sáng chế cho 150 loại protein tái tổ hợp sử dụng dược phẩm  Phần lớn sản lượng enzyme công nghiệp thị trường tạo từ quy trình sản xuất protein tái tổ hợp  Quy mô sản xuất. .. nhằm tạo protein tái tổ hợp  Từ bước đầu thành công việc tạo chủng E coli mang gen mã hóa insulin người (1978), hàng loạt protein tái tổ hợp có giá trị tạo mà điển hình protein sử dụng sản xuất. .. biểu phù hợp, cho phép sản xuất protein mục tiêu cách hiệu đóng vai trị quan trọng lĩnh vực sản xuất protein tái tổ hợp download by : skknchat@gmail.com Quy trình sản xuất protein TTH download