Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y Trang 8 LỜI MỞ ĐẦU Trong khoảng 20 năm trở lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nê
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC CAO ETHYL ACETATE Khóa luận nghiệp đại học CỦA LOÀI ĐỊAtốt Y ROCCELLA MONTAGNEI GVHD: TS DƢƠNG THÚC HUY SVTH: NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƢ MSSV: K40.201.059 Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2018 Xác nhận Hội đồng phản biện: Khóa luận tốt nghiệp đại học KÍ TÊN VÀ DUYỆT (Kí ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập rèn luyện Khoa Hóa học, trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, thân em tiếp nhận nhiều kiến thức kĩ cần thiết để tự tìm tịi phát triển thân Em xin cảm ơn thầy Dương Thúc Huy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt trình thực lúc hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô anh chị, bạn sinh viên Khoa Hóa học hỗ trợ cho em thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Tuy nghiên, kinh nghiệm chưa thật dày dặn thời gian có hạn hạn chế mặt vật chất nên khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót, em mong nhận thơng cảm góp ý từ phía quý thầy cô người Em xin chân thành cảm ơn! Khóa luận tốt nghiệp đại học i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC PHỤ LỤC v LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa phân loại địa y 1.2 Vai trò sinh thái hợp chất tự nhiên địa y 1.3 Nghiên cứu hoá học hợp chất địa y Khóa luận tốt nghiệp đại học 1.4 Nghiên cứu hóa học số lồi địa y thuộc chi Roccella 1.5 Hoạt tính địa y hợp chất địa y 1.5.1 Hoạt tính động vật 1.5.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao 1.5.3 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y 1.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y 1.5.5 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y 12 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 15 2.1 Máy móc, thiết bị, hóa chất 15 2.2 Thu hái xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích lập hợp chất 15 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất DS 18 ii 3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất R1 18 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 19 4.1 Kết luận 19 4.2 Đề xuất 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined Khóa luận tốt nghiệp đại học iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Ac Acetone AcOH Acid acetic br Mũi dãn rộng (Broad) C Chloroform DMSO Dimethyl sulfoxide d Mũi đôi (Doublet) EA Ethyl acetate H n-hexane HMBC Tương quan 1H-13C qua 2, nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC Tương quan 1H-13C qua nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) IC50 Nồng độ ức chế phát triển 50% số tế bào thử nghiệm (Half Maximal Inhibitory Concentration) J NMR Khóa luận tốt nghiệp đại học Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin) s Mũi đơn (Singlet) SKC Sắc ký cột δ Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học) iv DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Ba dạng địa y Hình 1.2 Sinh tổng hợp hợp chất từ địa y Hình 1.3 Các hợp chất lập từ địa y thuộc chi Rocella Hình 1.4 Một số hợp chất cô lập từ địa y Hình 2.1 Địa y Rocella montagnei Hình 3.1 Một số tương quan HMBC hợp chất DS Hình 3.2 Một số tương quan HMBC hợp chất R1 Hình 4.1 Cấu trúc hai hợp chất cô lập Sơ đồ 2.1 Sơ đồ sắc ký cột cao n-hexane Sơ đồ 2.2 Sơ đồ sắc kí cột cao ethyl acetate DANH MỤC BẢNG Hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao Bảng 1.1 Bảng 1.3 Khóa luận tốt nghiệp đại học Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất cô lập từ địa y Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất cô lập từ địa y Bảng 1.5 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y Bảng 3.1 So sánh số liệu phổ NMR hợp chất DS, acid lecanoric acid Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y diorcinolic Bảng 3.2 So sánh số liệu phổ NMR hợp chất R1 lecanorin DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H 13C-NMR hợp chất DS Phụ lục Phổ HSQC HMBC hợp chất DS Phụ lục Phổ 1H 13C-NMR hợp chất R1 Phụ lục Phổ HSQC HMBC hợp chất R1 v LỜI MỞ ĐẦU Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nghiên cứu hóa học sinh học địa y giới trở nên phổ biến Địa y thực vật bậc thấp, kết cộng sinh tảo nấm Nhờ dạng sống này, địa y sống nhiều nơi đất đá, thân cây, cây, điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến khắc nghiệt Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy có mặt địa y nơi quen thuộc với phân bố phong phú đa dạng Từ xưa, người biết sử dụng địa y vào nhiều mục đích khác làm thực phẩm, men rượu, phẩm nhuộm Địa y Evernia prunastri sử dụng ngành kỹ nghệ mỹ phẩm để làm chất định hương Một vài loại hợp chất polyphenol có địa y có khả hấp thu tia UVB nên chúng sử dụng làm kem chống nắng Quan trọng hết địa y sử dụng để chữa số bệnh bệnh lao, bệnh dại, cảm sốt, ho, vết thương da Địa y Lobaria pulmonaria sử dụng để chữa bệnh liên quan đến đường hô hấp, viêm khớp (Atalay 2011 [1], Suleyman 2003 [2]), Khóa luận tốt nghiệp đại học địa y Parmelia sulcata chữa bệnh sọ não, loài Peltigera sử dụng để chữa trị bệnh dại (Barrington 1974 [3]) Địa y Cetraria islandica sử dụng Thuỵ Điển làm thuốc chữa bệnh đái tháo đường, viêm phổi (Ahmadjian 1963 [4]) Các nghiên cứu cho biết địa y thường chứa loại hợp chất thơm depside, depsidone, depsone, dẫn xuất dibenzofuran hợp chất có màu xanthone, antraquinone dẫn xuất acid usnic (Devehat 2007 [5]) Nhiều loại depsidone có đa dạng hoạt tính sinh học đặc biệt ức chế enzyme liên quan đến bệnh chuyển hóa người [6] Nhằm phát triển nghiên cứu thành phần hóa học lồi địa y sinh trưởng Việt Nam nói chung mở rộng nghiên cứu loài địa y Roccella montagnei, lựa chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lồi địa y Roccella montagnei” CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa phân loại địa y Địa y dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, kết cộng sinh nấm (mycobiont) thành phần quang hợp (photobiont) thường tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium) Hiện có khoảng 17.000 lồi địa y tìm thấy Thơng thường địa y chia làm dạng: dạng khảm, dạng phiến dạng sợi (Choi cộng sự, 2008)[7]: Khóa luận tốt nghiệp đại học Xanthoria sp., (Crustose lichen) Flavoparmelia caperata, (Foliose lichen) Letharia vulpina, (Fructicose lichen) Hình 1.1 Ba dạng địa y Thành phần tảo địa y sản sinh carbohydrate q trình quang hợp, cịn thành phần nấm sản sinh hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước khoáng chất Kết từ cộng sinh giúp địa y sinh trưởng sống sót điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, diện khắp nơi đá, đất, cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi cộng sự, 2008)[7] Ðể hiểu chất địa y giải thích nguồn gốc chúng, nhà thực vật học thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo nấm Mặc dù hai thành phần nuôi cấy riêng rẽ việc tổ hợp lại thành địa y thật khó khăn 1.2 Vai trị sinh thái hợp chất tự nhiên địa y Bảo vệ trồng bậc thấp bậc cao Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại xạ có hại Các acid carboxylic từ địa y tác chất tạo phức mạnh giúp cho địa y lấy khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi cộng sự, 2008)[7] Giúp xua đuổi thú ăn thịt trùng 1.3 Nghiên cứu hố học hợp chất địa y Có nhiều hệ thống phân loại hợp chất hóa học từ địa y, sử dụng nhiều hệ thống phân loại Shibata công đề nghị (Huneck 1997)[8]: Các hợp chất hóa học địa y chia làm ba nhóm dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp chúng (Hình 1.2) Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone dẫn xuất acid tetronic Nguồn gốc acid mevalonic: triterpenoid Khóa luận tốt nghiệp đại học Nguồn gốc acetate-malonate: acid dây dài acid phenol Tảo Nấm Hình 1.2 Sinh tổng hợp hợp chất từ địa y 1.5.1 Hoạt tính động vật Acid caperatic cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm tăng trưởng lồi ốc Pallifera varia Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng loài giun Toxocara canis Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, acid evernic, acid psoromic, acid physodic, acid 3-hydroxyphysodic, acid fumarprotocetraric, acid stictic, acid norstictic, acid salazinic, acid vulpinic, acid rhizocarpic acid usnic làm giảm tăng trưởng ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis không ảnh hưởng đến sống cịn chúng 1.5.2 Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng thực vật bậc cao Một số hợp chất từ địa y thể hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao Bảng 1.1 Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng thực vật bậc cao Địa y hợp chất địa y Hoạt tính Khóa luận tốt nghiệp đại học Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic, acid Ức chế tăng trưởng rau diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid β- diếp orcinolcarboxylic, acid orsellinic Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật Acid evernic Giảm nồng độ chất diệp lục rau bina Acid lecanoric Nguyên nhân gây bất thường cho gốc Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vịng Hoạt tính ức chế độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine spp Ức chế nguyên phân rễ Allium cepa Acid usnic Ức chế nảy mầm phát triển Lepidium sativum 1.5.3 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y Anthraquinone emodin chất tương tự có hoạt tính kháng virus Hypericin có hoạt tính đáng kể chống lại chép ngược virus HIV (antiretroviral) Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) anthraquinone monochloro có hoạt tính giảm Hoạt tính dường tăng theo số lượng nguyên tử Cl cấu trúc (Muller 2001)[18] Các hợp chất thơm cô lập từ loài địa y depsidone, depside diphenyl ether thể hoạt tính ức chế mạnh nhiều loại enzyme Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y Hợp chất Virus enzyme virus Depsidone: acid virensic dẫn xuất tương tự Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV Nhân đại HIV học Khóa luận tốt nghiệp Acid butyrolactone: acid protolichesterinic (+)-Acid usnic depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro-1-Omethylemodin, 5,7-dichloroemodin, hypericin HIV, cytomegalovirus virus khác Từ địa y Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm, thu hái núi Zelengora (Bosnia), hai hợp chất depsidone lập, là: diacid 4-formyl-8-hydroxy-1,9-dimethyl-3methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-6,7-carboxylic 7,8-diacetoxy-4- formyl-1,9-dimethyl-3-methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin [6] Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy hợp chất diacid khơng có hoạt tính hợp chất mang hai nhóm acetate lại có hoạt tính nồng độ g/ mL, so với chất đối chứng dương galanthamine hoạt tính nồng độ 0,01 g/ mL [6] Depsidone acid lobaric [9] ức chế mạnh nhiều loại enzyme 12(S)lipoxygenase platelet-type (IC50 28,5 µM), 5-lipoxygenase (IC50 7,3 µM), protein tyrosine phosphate 1B (PTP1B, IC50 0,87 µM), cyclogenase (IC50 29,2 µM) Các hợp chất diphenyl ether pseudodepsidone (H1) (H2) [7] có khả ức chế mạnh dòng enzyme PTP1B với giá trị IC50 6,86 2,48 µM depside acid baeomyceric ức chế enzyme 5-lipoxygenase với giá trị IC50 8,3 µM Một số hợp chất địa y khác ức chế vài loại enzyme thống kê Boustie (2010) [6] Muller (2001) [15], minh họa Bảng 1.1 1.2 1.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y Các hợp chất từ địa y hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu Acid protolichesterinic thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid thành phần thuốc cổ truyền giảm đau dày với tên Iceland moss) (Muller 2001)[18] Một số lượng lớn hợp chất địa y kiềm hãm phát triển vi khuẩn hay nấm alectosarmentin, pannarin chloropannarin, emodin physcion, acid evernic, Khóa luận tốt nghiệp đại học acid leprapinic dẫn xuất, hợp chất phenol đơn vòng, acid puvinic dẫn xuất, acid usnic dẫn xuất (Bảng 1.3) (Muller 2001)[18] Khả kháng nấm hợp chất địa y đánh giá dựa giá trị MIC, thí dụ hợp chất parietin, fallacinal, emodin (Boustie 2010) [6] Trong hợp chất địa y, acid usnic dẫn xuất cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhiều dịng vi khuẩn Khóa luận tốt nghiệp đại học Hình 1.4 Một số hợp chất cô lập từ địa y 10 Bảng 1.3 Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất cô lập từ địa y [6] Tên hợp chất Loại enzyme (H8) Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 63,5 µM) Depside acid baeomycesic Ức chế yếu enzyme 12(S)-lipoxygenase platelettype (100 µg/mL: 15%) Depside atranorin (H4) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase từ porcine leukocyte (IC50= 8,3 µM) Tridepside tenuiorin (H7) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 59,6 µM) Orcinol (H10) Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial fluid A2 (IC50= 0,22 mM) Methyl β-orsellinate (H11) Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial fluid A2 (IC50= 0,26 mM) Acid usnic (H14) Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 16,4 µM) Khóa luậnphosphatase tốt nghiệp đại họcµM) 1B (PTP1B) (IC = 16,423,0 Usimines AC (H15, H16) Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine 50 Acid (H13) protolichesterinic Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type (IC50= 77,0 µM) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 20,0 µM) Acid lichesterinic (H9) Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type (IC50= 77,0 µM) Stereocalpin A (H17) Ức chế mức độ yếu enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 40,0 µM) cis-9-Octadecenamide (H12) Ức chế enzyme cyclogenase (IC50= 64,3 µM) 11 Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất cô lập từ địa y [18] Hợp chất Enzyme Atranorin (H8) Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Bis-(2,4-dihydroxy-6-npropylphenyl)methane, divarinol, cao chiết thô địa y Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes and Letharia vulpina Tyrosinase Chrysophanol Glutathione reductase Acid confluentic, methylperlatolic acid 2β-O- Acid 4-O-methylcryptochlorophaeic Monoaminoxidase B Prostataglandinsynthetase Khóa luận tốt nghiệp đại học 5-Lipoxygenase (ngăn cản chép Acid (+)-protolichesterinic ngược virus HIV) Acid vulpinic Phosphorylase Acid norsolorinic Monoamino oxidase Acid physodic Arginine decarboxylase Acid usnic (H14) Ornithine decarboxylase 1.5.5 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y Hợp chất từ địa y có khả gây độc tế bào mạnh acid usnic Thử nghiệm kháng u (antitumour) acid usnic khám phá cách thập niên, thử nghiệm lần đầu hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis Kupchan Kopperman (1975)[20] Những nghiên cứu mối liên hệ hoạt tính cấu trúc 12 khảo sát kết tính thân dầu (lipophilicity) có ảnh hưởng quan trọng khả gây độc tế bào Hai liên kết hydrogen nội phân tử cấu trúc acid usnic làm tăng tính thân dầu tự nhiên Depside depsidone thể độc tính tế bào tương đối Acid depsidone lobaric acid depside baeomyceic có khả ức chế phát triển 14 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 khoảng 12-65 µg/mL (Boustie 2010) [6] Depsidone pannarin depside sphaerophin ức chế phát triển tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU-145 tế bào ung thư da M14 với IC50 khoảng 25-30 µg/mL (Bảng 1.4) (Boustie 2010) [6] Ngồi ra, số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme trình bày bảng 1.5 Bảng 1.5 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y Hợp chất Vi khuẩn Acid usnic dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Acid protolichesterinic Helicobacter pylori Methyl orsellinate, ethyl orsellinate, methyl β-orsellinate, methyl haematommate Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M gypseum, Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis 1´-Chloropannarin, pannarin Leishmania spp Emodin, physcion Bacillus brevis Acid pulvinic dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn kỵ khí Acid leprapinic dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) Gram (-) Khóa luận tốt nghiệp đại học 13