Nghiên ứu sản xuất axit poly gamma glutami

Việc khai thác các hệ vi sinh vật từ các sản phẩm lên men hiện nay đang rất phát triển nó cung cấp rất nhiều các hợp chất có khả năng ứng dụng rộng rãiTrong đó axit Poly -glutamic γ PGA

Mẫu 1a MẪU BÌA LUẬN VĂN CÓ IN CHỮ NHŨ VÀNG Khổ 210 x 297 mm

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu ngoài sự cố gắng, nỗ lực của bản thân Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà – Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Cô đã luôn tận tình hướng dẫn chỉ bảo, gợi mở tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu Tôi cũng xin cảm ơn các anh chị/ bạn, trong phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh – – Hóa sinh – SHPT Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình tôi đã luôn động viên, tạo điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, thuộc

quả, số liệu nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ các công tình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm

Đào Văn Minh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu axit Poly γ glutamic (γ- -PGA) 2

1.2 Cấu trúc và tính chất của γ -PGA 3

1.2.1 Cấu trúc của phân tử γ-PGA 3

1.2.2 Tính chất của γ-PGA 5

1.2.3 Phân loại γ-PGA 6

1.3 Tác nhân tổng hợp γ -PGA 7

1.4 Con đường tổng hợp PGA 8

1.5 Ứng dụng của γ -PGA 12

1.5.1 Trong lĩnh vực y tế 12

1.5.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 13

1.5.3 Trong lĩnh vực môi trường 14

1.5.4 Trong lĩnh vực mỹ phẩm 14

1.5.5 Trong lĩnh vực nông nghiệp 14

1.5.6 Trong các ngành công nghiệp khác 15

1.6 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp PGA 15

1.7 Thu nhận PGA 17

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Chủng giống 19

2.2 Hóa chất và môi trường 19

2.2.1 Hóa chất 19

2.2.2 Môi trường 19

2.3 Thiết bị, dụng cụ 20

2.4 Tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp PGA 20

2.4.1 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường tổng hợp PGA 20

2.4.2 Tuyển chọn chủng dựa trên đặc tính tạo độ nhớt 20

2.4.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA bằng cách xác định hàm lượng PGA 21

2.5 Phương pháp định tên 21

2.5.1 Phương pháp sinh hóa 21

2.5.2 Phương pháp sinh học phân tử 21

2.6 Phương pháp xác định hàm lượng PGA 24

2.7 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PGA 24

2.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 24

2.7.2 Ảnh hưởng số vòng lắc 24

2.7.3 Ảnh hưởng của pH 24

2.7.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 25

2.7.5 Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất 25

2.7.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ 25

2.7.7 Ảnh hưởng nguồn các bon 25

2.8 Tối ưu bằng quy hoạch thực nghiệm 25

2.9 Phương pháp kết tủa PGA bằng dung môi 28

2.10 Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Bradford 28

2.11 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamit (SDS-PAGE) 28

2.12 Phương pháp sắc ký bản mỏng 29

2.13 Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) 29

2.14 Khảo sát đặc tính PGA 29

2.14.1 Khả năng loại ion Fe3+, Cu2+ 29

2.14.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn 29

PHẦN III: KẾT QUẢ 30

3.1 Tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp PGA 30

3.1.1 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường tổng hợp PGA 30

3.1.2 Tuyển chọn chủng dựa trên đặc tính tạo độ nhớt 31

3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA bằng cách xác định hàm lượng PGA 32

3.2 Định tên 33

3.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý chủng B5 33

3.2.2 Định tên bằng phương pháp sinh hóa 34

3.2.3 Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử 36

3.2.3.1 Tách chiết DNA tổng số chủng B5 36

3.2.3.2 Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR 36

3.2.3.3 Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng B5 và so sánh trên

giữ liệu ngân hàng gen 37

3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PGA của chủng Bacillus subtilis B5 40

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp PGA 40

3.4.2 Ảnh hưởng của số vòng lắc đến khả năng sinh tổng hợp PGA 41

3.4.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp PGA 42

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng sinh tổng hợp PGA 43

3.4.5 Nồng độ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp PGA 44

3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp PGA 44

3.4.7 Khảo sát ảnh hưởng nguồn, nồng độ cacbon đến khả năng sinh tổng hợp PGA 46

3.5 Tối ưu bằng quy hoạch thực nghiệm 47

3.6 Thu nhận và tinh sạch PGA từ chủng Bacillus subtilis B5 54

3.6.1 Lựa chọn tác nhân kết tủa PGA 54

3.6.2 Lựa chọn tỷ lệ dung môi kết tủa PGA 55

3.6.3 Đánh giá độ tinh sạch 56

3.7 Quy trình sản xuất và thu hồi PGA ở dạng chế phẩm kỹ thuật 60

3.8 Một vài đặc tính PGA 61

3.8.1 Xác định khả năng loại ion Fe3+, Cu2+ 61

3.8.2 Khả năng kháng khuẩn 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra γ.1 -PGA 8 Bảng 1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới hàm lượng PGA 10 Bảng 1.3 Ảnh hưởng các chất dinh dưỡng đến khả năng tổng hợp PGA 15

Bảng 3.1 Khả năng phát triển của các chủng trên môi trường E 30 Bảng 3 Kết quả thử kit API 50 CHB của chủng vi khuẩn B52 34 Bảng 3 Ma trận thực nghiệm Box Behnken và hàm lượng PGA thu 3 -được

48

Bảng 3.4 Kết quả Phân tích Phương sai mô hình 49 Bảng 3.5 Hàm lượng PGA khi kết tủa bằng enthanol và methanol 54 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol tới hàm lượng PGA 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.3 Cấu trúc của phân tử γ PGA dạng muối và dạng ion - 4

Hình 3.7 So sánh trình tự 16s RNA của chủng B5 trên NCBI 39 Hình 3.8 Sơ đồ cây phát sinh loài của chủng B5 40 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình tổng hợp PGA 40 Hình 3.10 Ảnh hưởng của số vòng lắc đến quá trình sinh tổng hợp γ PGA- 41 Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp PGA 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng tổng hợp PGA 43 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ cơ chất đến khả năng tổng hợp PGA 44 Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả năng tổng hợp PGA 45 Hình 3.15 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp PGA 47 Hình 3.16 Biểu đồ đáp ứng bề mặt khi thời gian,nhiệt độ thay đổi, cơ chất,

pH ở giá trị trung bình

51

Hình 3.17 Biểu đồ đáp ứng bề mặt khi cơ chất, nhiệt độ thay đổi, thời

Hình 3.18 Biểu đồ đáp ứng bề mặt khi nhiệt độ, pH thay đổi, cơ chất, thời gian ở mức trung bình

51 Hình 3.19 Biểu đồ đáp ứng bề mặt khi thời gian, pH thay đổi, cơ chất, nhiệt 52

độ ở mức trung bình

Hình 3.20 Biểu đồ đáp ứng bề mặt khi cơ chất, ph thay đổi, thời gian, nhiệt

độ ở mức trung bình

52

Hình 3.23 Điện di PGA trên gel polyacrylamide 6% 57

Hình 3.27 Sơ đồ quy trình thu hồi PGA ở quy mô phòng thí nghiệm 60

1

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, các sản phẩm lên men truyền thống rất phong phú Trong đó các sản phẩm lên men từ đậu tương với hệ vi sinh rất đặc trưng, cung cấp nhiều hợp chất có lợi cho con người Việc khai thác các hệ vi sinh vật từ các sản phẩm lên men hiện nay đang rất phát triển nó cung cấp rất nhiều các hợp chất có khả năng ứng dụng rộng rãi

Trong đó axit Poly -glutamic γ (PGA) được tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn

Bacillus có rất nhiều trong các sản phẩm lên men từ đậu tương: Natto,

Chungkookjang, Thua nao Đó là polymer mang điện tích âm, nó tồn tại dưới dạng

homo-polyamide và được hình thành do D- và L-glutamic nối với nhau bởi liên kết giữa hai nhóm α-amino và -carboxyl γ PGA có khối lượng phân tử rất lớn và có nhiều mức khối lượng từ 100 – 2000kDa Chính vì vậy đặc tính của PGA rất phong phú: khả năng hòa tan trong nước rất lớn, có khả năng bị phân hủy sinh học, không gây độc hại cho cơ thể sinh vật và môi trường

Do vậy axit Poly -glutamic γ có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: thực phẩm, y tế, môi trường, nông nghiệp và một số ngành công nghiệp khác Đã được nhiều công ty trên thế giới sản xuất với giá thành cao Tại Việt Nam, chưa có một nghiên cứu về sản xuất PGA từ vi khuẩn được phân lập từ Tương Xuất phát từ vấn

đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất axit Poly - γ glutamic ”

Mục tiêu nghiên cứu:

+ Nghiên cứu thu nhận PGA với hàm lượng cao, xác định một số đặc tính PGA + Đề xuất được quy trình sản PGA

Nội dung:

+ Tuyển chọn chủng i khuẩn có khả năng tổng hợp PGA cao.v

+ Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa và định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn được+ Khảo sát và tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp PGA

+ Tách, tinh sạch và xác định một vài đặc tính PGA

2

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu axit Poly γ - glutamic -PGA) (γ

Axit Poly gamma glutamic (γ-PGA) được tìm ra bởi Ivánovice và cộng sự khi nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthrasis một loại vi khuẩn gây nên bệnh than rất nguy hiểm cho động vật ăn cỏ và con người [20] Năm

1913 Sawamura đã phân lập được một chủng Bacillus subtilis từ Natto một thực , phẩm lên men truyền thống từ đỗ tương của người dân Nhật Bản Năm 1942 Bovanovick, đã chứng minh được γ PGA là thành phần chính cùng với fructan tạo -nên chất nhầy dính nhớt của Natto được tổng hợp từ vi khuẩn Bacillus subtilis Ông cũng chứng minh rằng γ PGA là sản phẩm lên men ngoại bào thông thường của -

Bacillus subtilis và đến năm 1997 người ta mới có thể mô tả được đầy đủ cấu trúc của γ-PGA [20]

Hình 1.1 Natto – Nhật Bản Hình 1.2 Chungkookjang – Hàn QuốcAxit Poly -glutamic γ không chỉ được tìm thấy ở Natto của người Nhật mà nó còn có trong các sản phẩm lên men truyền thống một số nước Đông Á và Đông Nam Á Thái Lan cũng có một sản phẩm tên “Thua-nao” tương tự như lên men Natto, Thua-nao có độ nhớt ít hơn so với Natto, các nhà nghiên cứu cũng đã chứng minh trong sản phẩm này có sự tham gia của các vi khuẩn Bacillus [39] Tại Hàn Quốc sả phẩm đậu tương lên men có tên là n Chungkookjang đã được các nhà khoa

h c phân ọ lập và tuyển chọn một chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh ra γ PGA như

-là thành phần chính tạo độ nhớt Loại vi khuẩn này sau đó được định tên -là Bacillus subtilis và có tên riêng là Chungkoongjang Ở Nelpal các nhà khoa học cũng tìm

100 năm trở lại đây Phương pháp đơn giản để phát hiện, tinh sạch, xác định γ-PGA

đã được Ashiuchi và cộng sự đưa ra [4, ] 32

Một báo cáo ây, do Mađ saaki Morikawa và cộng sự tiến hành nghiên cứu về

sự hình thành màng sinh học từ chủng Bacillus subtilis Các tác giả đã được chứng minh thành phần chính của màng γ PGA đã mở ra một hướng ứng dụng mới đầy là -tiềm năng trong tương lai [33]

1.2 C ấu trúc và tính chất của γ -PGA

1.2.1 Cấu trúc của phân tử γ -PGA

γ PGA là một polyme tự nhiên mang điện tích âm đơn phân là L

hoặc D-glutamic hoặc chứa cả hai, liên kết với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm αamino và nhóm carboxyl [γ- 37 14, ] Thông thường α-NH2 liên kết với α COOH tạo -nên liên kết α peptide Nhưng khi có được một hệ- enzyme xúc tác thích hợp, nhóm

-α-NH2 sẽ liên kết với nhóm -γ COOH để tạo nên liên kết γ-peptide Nếu trong môi trường có L-glutamic hay vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất này thì mối liên kết

γ peptide được hình thành, vi khuẩn có khả năng chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp L-glutamic thành D glutamic thì hai dạng này sẽ đồng trùng hợp tạo ra γ- - D-L- PGA [14]

-4

Hình 1.3 Cấu trúc của phân tử γ PGA dạng muối và dạng i- on [37]

Phân tử PGA là một chuỗi dài có khối lượng tùy từng chủng vi sinh tổng hợp

và môi trường dinh dưỡng thường dao động trong khoảng 100-2000kDa [23, 25,47] Cấu trúc PGA có thể chia như sau:

PGA có đơn phân là D-glutamic chỉ được tổng hợp bởi loài B anthracis Cấu trúc của Poly gamma D glutamic (PDGA đã được giả định) thông qua mô hình gồm 10 hoặc 20 glutamate trong nước Mô hình lý thuyết này cho thấymột phân PDGA trong nước là tử một chuỗi xoắn trái ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử, giữa nhóm -CO và -NH Khi đo phân tán quang là cấu trúc độ chuỗisoắn là 3,17 và 3, [47] 19

Hình 1.4 Cấu trúc phân PDGA [47] tử

1.2.2 Tính chất của γ -PGA

Axit Poly -glutamic γ tan trong nước, có thể phân hủy sinh học, ăn được, không độc với môi trường, sinh vật và con người Axit Poly γ-glutamic hòa tan tốt trong nước và tạo được các liên kết bền vững với H2O [37, 4, 20] Nó có thể được phân tách nhờ sắc kí giấy [43 Axit Poly γ] -glutamic khác biệt với protein cả về cấu trúc và tính chất chính bởi liên kết γ peptide Thường thì các liên kết α peptide bị - -phân cắt bởi protease nhưng γ PGA chỉ có thể bị phân cắt sinh học bởi γ- -GTP (γ-glutamyltranspeptidase) [14]

-glutamic Axit Poly γ tinh khiết có độ nhớt cao dù ở nồng độ thấp, đặc biệt kết hợp với một số thành phần hóa học khác mà chủ yếu là fructan để tạo nên một phức chất có độ nhớt rất cao [24, ] 20

-glutamic Axit Poly γ có thể kết hợp với một số ion kim loại để tạo muối có ứng dụng rộng rãi trong ngành y tế, môi trường, mỹ phẩm như các ion : Na+, K+,

Mg2+, Ca2+, NH4 + [1, 14]

Trong các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học Mỹ và Nhật chỉ ra rằng chất gian bào được sản xuất bởi Bacillus subtilis B-1 có khả năng hình thành màng sinh học nổi ngoài môi trường, sau khi tinh sạch, chúng được xác định chứa chủ yếu

γ-PGA [33]

6

Poly γ glutamic aicd có thể nhận biết thông qua nhuộm bằn- g xanh methylen, đặc điểm để phân biệt với protein có thể nhận biết khi nhuộm bằng Coomassie brilliant blue [12]

1.2.3 Phân loại γ - PGA

-Có nhiều hình thức phân loại γ PGA tùy thuộc vào cấu trúc, chủng vi sinh vật tổng hợp hay phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật Tuy nhiên có hai phương pháp phân loại phổ biến nhất:

Phân loại theo cấu trúc

Có 3 loại phân tử γ PGA như sau [37- , 32]:

Axit Poly γ- D-glutamic (PDGA): chỉ chứa các đơn phân là D- glutamic Cho tới nay, Bacillus anthracis là chủng vi khuẩn điển hình nhất được biết đến sản xuất PDGA PDGA không gây độc đối với động vật ăn cỏ và động vật có vú, nhưng nó làm vô hiệu khả năng miễn dịch của vật chủ và cuối cùng thúc đẩy mức độ nghiêm trọng các triệu chứng của bệnh than [32]

Axit Poly γ- L-glutamic (PLGA): chỉ chứa các đơn phân là L- glutamic PLGA được sản xuất chủ yếu từ các vi khuẩn cực kỳ ưa mặn như khuẩn cổ

Natrialba aegyptiacia để chống lại sự mất nước trong điều kiệ môi trường nồng độ n muối cao [2, 3] PLGA cũng được tìm thấy rất nhiều trong các động vật có súc tu (sứa biển, san hô) và thành phần chính trong chất dính của Hydra PLGA kết hợp với các cation như Ca²+, Mg2+ và K+ giúp sinh vật, vi khuẩn điều hòa áp suất thẩm

thấu bên trong tế bào [23, 32]

Axit Poly γ- D,L- glutamic (PLDGA): chứa cả hai loại đơn phân là L và D glutamic PLDGA được sản xuất chủ yếu từ Bacillus được chia làm 2 nhóm: Phụ

thuộc vào glutamic, không phụ thuộc vào axit glutamic Tỷ lệ D/L trong PLDGA phụ thuộc vào tỷ lệ Mn2+ trong môi trường phát triển của vi khuẩn tùy thuộc vào loài vi khuẩn [32]

Phân loại theo phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật ó 2 dạng như sau , c[43]:

Axit Poly γ glutamic dạng tự do được tiết trực tiếp vào môi trường nuôi cấy -

7

Cách phân loại này chủ yếu dựa trên hệ enzyme của vi sinh vật Loại vi khuẩn điển hình cho γ PGA dạng neo là - Bacillus anthracis Đối với loài vi khuẩn này γ PGA là một hợp chất có tác dụng kháng thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn -công vào bên trong tế bào Còn loại vi khuẩn điển hình cho γ PGA dạng tự- do là

Bacillus subtilis, γ PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao quanh tế bào vi khuẩn và có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng trong trường hợp môi trường thiếu dinh dưỡng [43]

-1.3 Tác nhân tổng hợp γ -PGA

Một số sinh vật (vi khuẩn, vi khuẩn cổ, động vật) sản xuất γ PGA tự do Kết quả bảng 1 1 cho thấy tất cả các vi khuẩn sản xuất γ PGA đều là Gram dương- chủ yếu là các vi khuẩn thuộc chi Bacillus - γ PGA có chức năng đa dạng khác nhau tùy theo loài tổng hợp và môi trường của chúng [43]

-Vi khuẩn ở đất (chủ yếu là từ loài Bacillus) sử dụng γ PGA cho việc cô lập- các ion kim loại độc hại, tăng sức đề kháng trong môi trường bất lợi Poly γ-glutamic cũng có thể là một nguồn glutamate cho vi khuẩn ở trong tình trạng đói trong giai đoạn chết dần của canh trường. Planococcus halophilus, Sporosarcina halophile và Natrialba aegyptiaca là những vi khuẩn cổ có khả năng sản xuất γ-PGA, sử dụng nó để làm giảm nồng độ muối xung quanh tế bào cho phép chúng tồn tại trong một môi trường khắc nghiệt [ , 43] 26 Bacillus anthracis sinh tổng hợpγ-PGA dạng neo gi thích nghi với sự hắc nghiệt của môi trường hoặc nguồn dự úp k là trữ năng lượng [ , 41, 43] 32

-Hydra là sinh vật nhân điển hình được biết đến là có khả năng tạo γ PGA Hydra sử dụng các bào quan để bắt mồi và vận động hàm lượng γ, -PGA lớn kích hoạt khả năng này [23, 32, 43] Các động vật có súc tu như sữa biển, san hô cũng tạo ra PGA với vai trò một chất dính, giữ các sinh vật phù du làm thức ăn [32]

8

Bảng 1 Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra γ.1 -PGA [ ] 43

Bacillus anthracis D

Bacillus mesentericus D

Bacillus licheniformis D and L

Bacillus megaterium D and L

Bacillus pumilus D and L

Bacillus subtilis D and L

Planococcus halophilus D Sprorosarcina halophile D Staphylococus

Natriaba aegyptiaca L

1.4 Con đường tổng hợp PGA

Hiện nay rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để làm sáng tỏ quá trình tổng hợp PGA Đó là quá trình phức tạp và cơ chế vô cùng độc đáo, PGA được tổng hợp một cách độc lập không qua ribosome, nhờ phức hệ đa enzyme (Multienzyme) [5, 13, 27, 28, 29] Năm 1991, Kunioka [13] đã mô tả sơ đồ tổng hợp PGA như với chủng Bacillus subtilis IFO 3335:

9

Hình 1.5 Con đường tổng họp PGA[13]

Quá trình này qua hai giai đoạn:

Giai đoạn một: tổng hợp axit glutamic, từ nguyên liệu đầu vào nếu là đường glucose

sẽ qua quá trình đường phân tại thành axipiruvic, đi vào chu trình TCA để tổng hợp axit ketoglutaric Sau đó axit ketoglutaric tác dụng với NH4+ để tạo thành axit glutamic

Giai đoạn hai: polymer hóa các axit glutamic được đồng trùng hợp tạo thành PGA.Tác giả cũng so sánh các nguồn các bon khác nhau ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp PGA kết quả như bảng 1.2

10

Bảng 1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới hàm lượng PGA[13]

Ngồn cacbon Sinh khối tế bào Hàm lượng PGA g/100l

Kết quả cho thấy khi sử dụng nguồn cacbon là axit citric hàm lượng PGA đạt cao nhất là 9,6g/l, giả thích kết quả này do axit citric đi trực tiếp vào chu trình TCA, làm tăng khả năng tổng hợp axit ketoglutaric dẫn đến tăng hàm lượng PGA, tác giả cũng khảo sát khi bổ sung axit glutamic cho thấy hàm lượng PGA tăng lên rất nhiều[13]

Năm 1997, Kunioka đã giải thích rõ cơ chế, đưa ra được các phản ứng theo sơ đồ sau:

Hình 1.6 Cơ chế tổng họp PGA [28]

1 Glutamine: 2- Oxoglutarate aminotransferase; 2 Glutamine synthetase; 3 Axit

L-Glutamic: axit pyruvic aminotransferase; 4 Alanine remase; 5 D- Glutamic: pryruvic aminotransferase; 6 PGA polymerase

Tuy nhiên ngiên cứu mới của Ashiuchi [4], cho rằng glutamate có thể trực tiếp liên kết với nhau mà không cần S-protein, bằng việc sử dụng năng lượng là ATP nhờ enzyme γ - glutamate folylpoly ligase (EC 6.3.2.17) Quá trình này được kích hoạt bởi chính PGA.

1.5 1 Trong lĩnh vực y tế

-γ PGA được sử dụng làm chất mang cho các loại thuốc khác trong quá trình điều trị căn bệnh ung thư, tiểu đường γ PGA còn được sử dụng trong thành phần -của chất cầm máu, và thành phần của chỉ khâu tự tiêu Keo sinh học là một sản phẩm được kết hợp giữa gelatin và γ PGA, dạng keo này được sử dụng nhiều - trong

y học với tác dụng làm lành những tổn thương của phổi [3] Trong các sản phẩm chăm sóc da, γ PGA được kết hợp với tia cực tím, hồng ngoại có tác dụng làm giảm -kích thước của lỗ chân lông giúp bề mặt da nhẵn mịn hơn sau khi trị liệu [37, 20 ]

PGA được ứng dụng trong phân phối thuốc vì có nhóm carboxyl trên mạch cung cấp điểm gắn, do đó khiến thuốc hòa tan tố hơn Liên hợp PGA thuốc có tht ể

đi vào các mô và khối u nhả thuốc chậm theo thời gian tự phân hủy của PGA Sản phẩm phân hủy là axit glutamic, có thể đi vào chuyển hóa tế bào bình thường và không được bài tiết qua thận γ PGA làm tăng khả năng miễn dịch bằng cách kích -thích tế bào đuôi gai (CDc) tiết IL12, interferon gamma để tiêu diệt các khối u

Canxi chiếm khoảng 1,5 2% trọng lượng cơ thể Nhưng khả năng hấp thụ –

Ca trong ruột bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố như chế độ ăn uống, hàm lượng phytate và oxalate Các chất trên với Ca hình thành phức hợp, phức hợp này không được hấp thụ và bị thải ra bằng đường tiêu hóa Thiếu hụt Ca có thể dẫn đến chứngloãng xương, Ca trong máu thấp có thể dẫn đến hiện tượng co cứng cơ, chuột rút Năm 2007, nghiên cứu của Tanimoto đã chỉ ra rằng γ PGA làm tăng khả năng hấp -thụ Ca đường ruột ở người Phức hợp Ca PGA nhanh chóng được bổ sung vào – thực phẩm chức năng để tăng cường khả năng hấp thụ Ca đường ruột giải quyết nhiều vấn đề liên quan tới thiếu hụt Ca [16, 17]

13

Vanadium là khoáng chất có nhiều trong tự nhiên có tác dụng hạ đường huyết như isulin Vanadiu chuyển hóa thành cation vanadyl kết hợp với γ-PGA hình thành phức hệ Vanadyl γ– -PGA (VO γ PGA) Phức hệ VO γ PGA đã được – - – -nghiên cứu chứng minh hoạt động tốt hơn so với sử dụng một mình Vanadium VO – -γ PGA đã được bổ sung rất nhiều vào thực phẩm chức năng giúp trị bệnh đái tháo đường [16]

Axit Poly γ- glutamic chống cao huyết áp Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh cao huyết áp trong đó do hấp thu muối quá nhiều là một nguyên nhân quan trọng K và Na là hai yếu tố ảnh hưởng đến việc tăng giảm huyết áp, khi hàm lượng

K trong máu thấp, Na cao sẽ dẫn tới tăng huyết áp K – -γ PGA trong thực phẩm giúp ngăn ngừa cao huyết áp bằng cách giảm sự hấp thụ và lưu giữ N và tăng hấp a thụ K trong máu [16]

1.5.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm

Ngày nay việc sử dụng phụ gia trong chế biến thực phẩm rất phổ biến như Carbon methyl cenllulose (CMC) một chất tạo trạng thái trong thực phẩm được sản xuất theo phương pháp hóa học và được sử dụng với số lượng rất lớn γ PGA cũng -

là một chất tạo trạng thái, ổn định sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, sản xuất theo phương pháp sinh hóa, có đặc tính tốt hơn, hiện tại đang được sử dụng thay thế một phần cho CMC trong công nghệ chế biến thực phẩm (ngành công nghiệp sản xuất

mỳ ăn liền, b n, đồ hộp thịt, nước quả ) [16ú , 20, 37]

Trong công nghệ sản xuất bánh kem xốp hiện đại γ-PGA được thêm vào trong nguyên liệu làm kem cùng với chất nhũ hóa nhằm làm tăng tính chất nhũ hóa, ổn định sản phẩm kem xốp, và tăng cường tính chất của kem giữa hai mặt bánh, giảm

độ dày của lớp kem giữa hai lớp bánh mà không ảnh hưởng đến chất lượng bánh [16, 37]

Trong đồ uống từ quả tươi thường xảy ra hiện tượng đắng khi các monodiglyceride kết hợp với axit polycarboxylic hoặc muối của axit đó, γ PGA khi được -thêm vào có tác dụng giảm độ đắng do hỗn hợp những este này gây nên Không những vậy, nó còn có tác dụng ổn định hệ cấu trúc nhũ hóa trong sản phẩm giúp sản phẩm không bị phân lớp trong thời gian bảo quản [16, 37]

1.5.3 Trong lĩnh vực môi trường

–

γ PGA được sử dụng như một chất tạo chelat trong xử lý nước thải, làm nhựa sinh học có tác dụng liên kết bùn nhằm làm đông tụ, kết lắng bùn thay thế cho muối nhôm sunfat, chitosan, axit polyacrylic… Trong quá trình xử lý môi trường,

có nhiều loại kim loại nặng, phóng xạ tự nhiên ảnh hưởng đến sức khỏe con người,

γ PGA có tác dụng làm bao bọc và cô lập các yếu tố gây hại thành một nhóm và không cho phát tán ra môi trường ngoài [20, 37]

-1.5.4 Trong lĩnh vực mỹ phẩm

Tác dụng hút ẩm và giữ ẩm của γ PGA được so sánh và thay thế cho axit hyaluronic (HA) như một loại kem dưỡng ẩm Axit Poly γ- glutamic giúp chăm sóc

-da Vitamin C là yếu tố cần thiết cho sự hình thành collagen giúp sửa chữa và hình thành các mô da Nhưng vitamin C đi vào cơ thể không ổn định do nó dễ dàng bị phá vỡ bởi nhiệt độ, ánh sáng… γ-PGA – Vitamin C làm tăng hấp thu vitamin C đường ruột giúp cải thiện lượng vitamin C trong cơ thể γ-PGA – Vitamin C còn có khả năng ức chế collagenase Khi da lão hóa, collagenase được thúc đẩy hoạt động làm giảm độ đàn hồi của da Vậy γ-PGA – Vitamin C trong thực phẩm ngoài khả năng ức chế collagenase còn đóng vai trò chất chống oxy hóa [16, 37 ]

1.5.5 Trong lĩnh vực nông nghiệp

-γ PGA còn được sử dụng nhiều trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi bởi các tính năng như tăng tác dụng hấp thụ khoáng chất, tăng sản lượng trứng, làm giảm lượng chất béo không cần thiết của vật nuôi à được sử dụng làm phân bón v[20, 37]

15

1.5.6 Trong các ngành công n ghiệp khác

Trong ngành công nghiệp chất dẻo dẫn xuất este của γ PGA được ứng dụng làm vật liệu bao bì có khả năng phân hủy sinh học trong suốt, có độ đàn hồi và độ dai cao thay thế cho các bao bì không có khả năng phân hủy sinh học

-Ứng dụng làm hydrogel có khả năng thấm hút nước, có khả năng chất mang

cố định enzyme, bảo vệ enzyme, vi sinh vật điều kiện lạnh… [20, 37]

1.6 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp PGA

Khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như khả năng tổng hợp các chất mong muốn chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường nuôi như: nhiệt độ, pH môi trường, nguồn cacbon, nguồn nitơ, lượng giống được tiếp vào ban đầu, cơ chất

PGA được tổng hợp suốt pha sau của quá trình trao đổi chất của Bacillus Rất nhiều thông số của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến quá

trình sinh tổng hợp PGA đã được rất nhiều tác giả nghiên cứu: Ashiuchi, Shih [5]

và được thống kê trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Ảnh hưởng các chất dinh dưỡng đến khả năng tổng hợp PGA

Chủng vi khuẩn Thành phần dinh

dưỡng chính

Điều kiện lên men Hàm lượng PGA thu

được

16

Nguồn cacbon và cơ chất

Trong tế bào nguồn cacbon trải qua một loạt quá trình chuyển hoá phức tạp

sẽ tạo thành bộ khung tế bào và các sản phẩm trao đổi chất Cacbon có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào Đồng thời hầu hết các nguồn cacbon trong các phản ứng sinh hoá còn sinh ra nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật

Các loài Bacillus sinh tổng hợp PGA có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau, tùy đặc điểm từng loài nguồn cacbon có thể đơn giản như đường đơn, đường đôi hoặc các axit hữu cơ: glucose, lactose, fructose, axit citric… Nguồn cơ chất tổng hợp PGA là axit glutamic, lượng glutamic bổ sung vào quá trình lên men phụ thuộc tùy từng chủng hầu hết các nghiên cứu cho rằng việc bổ xung 20-30g/l axit glutamic vào canh trường lên men tối ưu để tổng hợp PGA [9, 10]

cơ Đối với quá trình tổng hợp PGA nguồn nitơ được sử dụng phỏ biến như: cao nấm men, amon sunfat, amon nitrate, anom clorua, pepton…Trong đó nguồn nitơ

vô cơ được đánh giá có khả năng tổng hợp PGA tốt hơn so với nitơ hữu cơ [9]

Tỷ lệ giống

Lượng giống có ý nghĩa quan trọng trong cả quá trình sinh trưởng phát triển

và diệt vong của các chủng vi sinh vật Lượng giống cấp ban đầu nhiều hay ít cũng ảnh hưởng đế khả năng sinh tổng hợp PGA, nếu lượng giống ban đầu quá nhiều n môi trường dinh dưỡng sẽ nhanh chóng cạn kiệt, từ đó dẫn đến thiếu chất dinh dưỡng do đó ảnh hưởng mạnh đến sự sinh tổng hợp PGA Ngược lại nếu lượng giống ban đầu quá ít sẽ kéo dài quá trình tăng sinh, làm thay đổi chu kỳ sinh trưởng

Nhiệt độ:

Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp PGA của chủng vi sinh vật Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến phát triển Dựa trên nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chialàm 3 nhóm: các loài chịu lạnh, các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ dưới 15oC, các loài ưa ấm sinh trưởng, phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 20oC đến 37oC, còn các loài chịu nhiệt lại phát triển ở nhiệt độ cao trên 50oC Theo các nghiên trước nhiệt độ thích hợp cho quá trình tổng hợp PGA dao động trong khoảng từ 30-40oC tùy thuộc chủng giống

vi sinh vật Kunioka (1994) cho rằng nhiệt độ tối ưu trong việc sự sinh tổng hợp PGA là 37 [29] °C

1.7 T hu nhận PGA

Hiện nay sản xuất PGA đã thu hút rất nhiều nhóm nghiên cứu trong việc tối

ưu môi trường lên men, lựa chọn phương pháp lên men để thu PGA với hàm lượng lớn Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu thu hồi PGA từ canh trường lên men [6] Sau quá trình lên men canh trường có độ nhớt rất lớn bước đầu tiên đồng nhất dịch canh trường lên men bằng máy khuấy trộn, ở nhiệt độ 45-60oC trong thời gian 60-120 phút Sau đó loại loại bỏ sinh khối bằng cách ly tâm hoặc lọc màng [6] Theo Asuo Goto [13 , do ca] nh trường nuôi cấy có độ nhớt cao tiến hành ly tâm với tốc độ 20000 vòng/phút trong thời gian 30 phút để loại sinh khối Còn theo Albert

G Prescott, Westford, canh trường nuôi cấy được axit hóa sau đó lọc qua màng 0,16um, hoặc ly tâm 10000 vòng/phút Ngoài ra Pe´rez-Camero [40] sử dụng chế độ

[6]

Gần đây một nghiên cứu mới sử dụng khả năng PGA có khả năng kết tủa ion kim loại để thu hồi và tinh sạch PGA ban đầu tác giả loại sinh khối ly tâm 7800 vòng/phút, 15 phút, 20oC Sao đó thêm vào Cu2+ để kết tủa PGA, sử dụng EDTA để loại Cu2+ tiến hành thẩm tích loại muối

Hai chủng vi khuẩn kiểm định: E coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus

ATCC 25923 được cung cấp bởi trung tâm nghiêm cứu phát triển CNSH Đại học Bách Khoa Hà Nội

2.2 Hóa chất và m trường ôi

2.2.1 Hóa chất

PGA (Sigma-mỹ), Tris HCl, EDTA, SDS (sodium dodecyl sulphate), βmecaptoethanol, protease K, CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide), chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, etanol, TE, dNTP, MgCl2, đệm PCR, Taq polymerase, agarose (Sigma-Mỹ), ethidium bromide (EtBr), bộ kit API 50 CHB (BioMérieux, Pháp), BSA (sigma – Mỹ) cao nấm men (Ấn Độ), axit citric , (Anh), L- glutamic, Natri glutamate

-Các hóa chất thông dụng khác: K2HPO4, KCl, MgSO4, FeSO4 7H2O, NaNO3, glucose, cao nấm men, thạch agar

Mồi xuôi: 16SF: 5’-CGGAATTCATTGCTGGACCTG-3’, mồi ngược: 16SR: GTCCTAGAGCTTTGTCTTTAGG-3’(invitrogen)

5’-2.2.2 Môi trường

Môi trường (E): L-glutamic 20(g/l); citric 12(g/l); glycerol 20(g/l); NH4Cl 7(g/l); MgSO4.7H2O 0,5(g/l); FeCl3 6H2O 0,04(g/l); K2HPO4 0,5(g/l); CaCl2 2H2O 0,15(g/l); MnSO4 H2O 0,04(g/l)

Môi trường thạch Luria Bertani (LB) (g/L): Cao nấm men 5,0; Tryptone 10,0; NaCl 10,0; Thạch 20,0; pH 7,0

-Môi trường LB bổ sung: cacboxyl metyl cellulose (CMC) 1,0% /v), tinh (wbột tan 1,0%(w/v), casein 1,0% /v)(w Hiện màu bằng dung dịch axit tricloaxetic 10% (w/v), colloidal chitin 1,0%(w/v), phospho khó tan Ca3(PO4)2 1,0%(w/v)

- Máy đo pH (Hanna, Ý)

- Máy đo quang (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech)

- Máy li tâm (Hettich, Đức)

- Cân điện tử (Ohaus, Thụy sĩ)

- Máy votex (Đức)

- Tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), tủ lạnh sâu -20oC và -80oC (Sanyo ultralow, Nhật Bản)

- Micropipet các loại từ 2 µl 1ml (Đức)-

- Máy PCR

- Máy điện di protein, DNA( Bio-Rad)

2.4 T uyển chọn chủng có khả năng tổng hợp PGA

2.4.1 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường tổng hợp PGA

Các chủng vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường LB (35oC, pH 7, tốc độ lắc 150 vòng/phút) Sau 24h hút 100ul cấy chang trên môi trường E được nuôi ở

35oC, pH7 sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ tiến hành quan sát khả năng phát triển của khuẩn lạc

2.4.2 Tuyển chọn chủng dựa trên đặc tính tạo độ nhớt

Các chủng vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường LB (35oC, pH 7, tốc độ lắc 150 vòng/phút) Sau 24h cấp giống 2% sang môi trường E lỏng được nuôi ở

35oC, pH7, sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, tiến hành đo độ nhớt Sử dụng nhớt kế thủy tinh Osval với quy trình như sau:

Hút 30ml canh trường các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường đặc hiệu E tại các thời điểm 24h, 48h,72h và 96h vào ống fancol

Ly tâm 8000 vòng trong 10 phút để loại bỏ tế bào thu dịch nổi

Đo độ nhớt của dịch bằng nhớt kế Osval

+ Xác định khả năng đồng hóa các nguồn cacbon bằng kit API 50CHB

Để khảo sát đặc tính sinh hóa chủng B5 sử dụng bộ kit API 50CHB (BioMérieux, Pháp) Lấy 200 µl canh trường chủng B5 bổ sung vào 10ml môi trường API AUX Sau đó, được bổ sung vào các giếng thử của bộ kit Dùng dầu parafin phủ kín lên bề mặt các giếng, đậy bộ kít và nuôi ở nhiệt độ 37° Đọc kết Cquả sau 24 và 48 giờ, so sánh kết quả thu được với ngân hàng cơ sở dữ liệu bằng phần mềm APILAB plus

+ Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn

Chủng B5 được cấy chấm điểm trên môi LB cóbổ sung các cơ chất : CMC, chitin, casein, tinh bột tan, tương ứng với enzyme cần xác định Khả năng sinh enzyme ngoại bào được đánh giá theo công thức D/d, trong đó D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính khuẩn lạc sau 24 giờ

Xác định hoạt tính catalase: Chủng B5 nuôi cấy trên môi trường LB, sau 24 giờ nhỏ 2 giọt H2O2 (10%) vào bề mặt khuẩn lạc Sau đó quan sát xuất hiện O2 qua việc tạo thành các bọt khí

2.5.2 Phương pháp sinh học phân tử

+ Phương pháp tách chiết DNA

Các bước tiến hành:

22

- Chủng B5 tăng sinh trên môi trường LB, 37oC, sau 24 giờ nuôi tiến hành hút 1ml dịch nuôi cấy v ào eppendorf, ly tâm 10000 vòng/phút, 4oC, 10 phút Tiến hành chuyển dịch nổi sang oppendorf mới

- Bổ sung 1ml đệm lysis (50mM Tris pH 8, 50mM EDTA, 3% SDS, 1% βmecaptoethanol, 100 µg protease K) vào ống, ủ ở 65oC trong 1 giờ

Cho hỗn hợp Phenol : clorofrom : isoamyl alcohol (25: 24 : 1) vào dịch với tỷ lệ 1 : 1

- Ly tâm ở 13.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC, thu dịch nổi

- Cho isopropanol vào với tỷ lệ 1 : 1 Để ở - 20oC/30 phút

- Ly tâm ở 10.000 vòng/ phút, 10 phút, 4oC, loại dịch thu cặn

- Rửa bằng 500 µl ethanol 70% Ly tâm ở 10.000 vòng/phút, 5 phút

- Làm khô

- Hòa tan tủa trong 50 µl TE (10mM Tris, 1mM EDTA)

+ Phương pháp khuyếch đại một đoạn DNA bằng phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Từ đó đến nay kỹ thuật này sử dụng rất phổ biến trong công nghệ sinh học và đóng góp to lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này đuợc thiết kế dựa vào trình tự có tính bảo thủ cao của gen 16S Tiến hành:

23

Bảng 2.2.Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

Phản ứng thực hiện với cặp mồi đa năng:

Mồi xuôi: 16SF: 5’-CGGAATTCATTGCTGGACCTG-3’

Mồi ngược: 16SR: 5’-GTCCTAGAGCTTTGTCTTTAGG-3’

Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ, kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuống 4˚C

+ Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, dựa trên kích thước, điện tích

Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose) đóng vai trò để phân tách các đoạn DNA

Cân 1 gam agarose cho vào 100 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45 – 50˚C rồi đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn Sau 20 – 30 phút, khi gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di

và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 1 –

+ Đọc trình tự đoạn gen chứa vùng 16s rRNA

Sản phẩm PCR tiến hành điện di trên gel agaroza 1%, được tinh sạch bằng kit của hãng Invitrogen S au đó được gửi đi giải trình tại hãng Marcogen –Hàn Quốc

+ Xây dựng cây phát sinh chủng loại

24

Sau khi đã có kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA, tiến hành so sánh với các trình tự tương ứng đã có trên GenBank Tiếp đó dùng phần mềm tin sinh học ClustalW để xây dựng cây phát sinh chủng loại

2.6 Phương pháp xác định hàm lượng PGA

Phương pháp xác định hàm lượng γ-PGA dừa theo phương pháp của Wei Zeng [45] -γ PGA hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 216 nm Hàm lượng γ-PGA càng cao, giá trị hấp thụ quang của γ PGA càng lớn -

Xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của hàm lượng γ PGA vào OD ở 216nm có dạng y= ax+ b

-Trong đó; y: giá trị hấp thụ quang của γ-PGA ở 216nm

x: hàm lượng γ-PGA (ug/l)

2.7 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PGA

2.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chủng vi khuẩn tăng sinh trong môi trường LB lỏng ở 37ºC, 24 giờ Hút 2%canh trường vi khuẩn cấy chuyển sang 100ml môi trường lên men.Lên men tại các điều kiện nhiệt độ như sau: 30ºC, 35ºC, 40ºC, 45ºC, 50ºC ở pH 7, tốc độ lắc 50v/p Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h sau đó tiến hành định lượng γ-PGA

2.7.2 Ảnh hưởng số vòng lắc

Chủng i khuẩn tăng sinh trong môi trường LB lỏng ở 37ºC, 24 giờ Hút 2%vcanh trường vi khuẩn cấy chuyển sang 100ml môi trường lên men Quá trình lên men nuôi tại vòng lắc như sau: 0 v/p, 50 v/p, 100 v/p, 150 v/p, 200 v/p, ở 40ºC, pH

7 Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h sau đó tiến hành định lượng γ-PGA

2.7.3 Ảnh hưởng của pH

Chủng vi khuẩn tăng sinh trong môi trường LB lỏng ở 37ºC, 24 giờ Tiến hành cấp 2% giống sang 100ml môi trường lên men Lên men tại các điều kiện pH ban đầu hư sau: pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, ở 40ºC, chế độ nuôi tĩnh Tiến hành n lấy mẫu tại các thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120hsau đó tiến hành định lượng

γ-PGA

25

2.7.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống

Chủng vi khuẩn tăng sinh trong môi trường LB lỏng ở 37ºC, 24 giờ Tiến hành cấp giống sang môi trường lên men với tỷ lệ: 1%, 5%, 10%, 15% Sau đó được lên men ở pH 8, 40oC chế độ nuôi tĩnh Sau 96h lấy mẫu xác hành định lượng

γ-PGA

2.7.5 Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất

Trong môi trường lên men hàm lượng natri glutamate được bổ sung cới các

tỷ lệ như sau: 0,5; 1 ; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ,0 (% w/v Lên) men với các điều kiện ở pH 8,

40oC chế độ nuôi tĩnh Tiến hành lấy mẫu tại thời điểm 96h, sau đó tiến hành định lượng γ-PGA

2.7.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ

Sử dụng nguồn nitơ: cao nấm men, NH4Cl, NH4NO3, bổ sung vào môi trường với tỷ lệ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 % (w/v) Tiến hành cấp giống 5%, nuôi tại 40oC, nuôi tĩnh, pH 8, sau 96h tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng PGA

2.7.7 Ảnh hưởng nguồn các bon

Sử dụng 4 nguồn cacbon: axit citric, glucose, saccharose, lactose với nồng

độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,5 %(w/v) bổ xung vào lên men Sau đó cấp giống tỷ lệ 5%, nuôi tại 40oC, pH8, nuôi tĩnh, sau 96h tiến hành lấy mẫu và xác định hàm lượng PGA

2.8 Tối ưu bằng quy hoạch thực nghiệ m

Phương pháp này cho phép nghiên cứu đồng thời tác động của nhiều yếu tố lên đối tượng quan tâm, cũng như những tác động qua lại của những yếu tố này Ngoài ra, còn cho phép đánh giá một cách định lượng về mức độ ảnh hưởng của chúng Cho phép sử dụng số thí nghiệm ít nhất mà có thể diễn tả được nhiều nhất ảnh hưởng của các yếu tố đã chọn

-Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng γ PGA như: pH, nhiệt độ, tỷ lệ cấp giống, nồng độ cơ chất, số vòng lắc, thời gian…Chúng tôi tiến hành khảo sát nhận thấy 4 yếu tố tác động mạnh nhất đến hàm lượng γ PGA là: thời gian, nhiệt -

độ, nồng độ cơ chất và pH, lựa chọn 4 yếu tố đó để tiến hành tối ưu quá trình sinh tổng hợp γ-PGA

26

Lựa chọn ma trận Box Behnken để khảo sát vùng tối ưu Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 (State Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) để phân tích các hệ số hồi -quy, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ưu theo hàm mong đợi Với 4 yếu tố lựa chọn

-có miền biến thiên: X1= 35-45oC, X2 = 72-120h, X3= 20-30(g/l), X4= 7-9

Bảng 2 : Khoảng biến đổi của các yếu tố.3

-+ Với 4 yếu tố trên bài toán có hàm mục tiêu Ymax = Y( X1,X2,X3,X4)

Trong đó : Y hàm mục tiêu – hàm lượng PGA lớn nhất

+ Chọn phương án quy hoạch: phương án quy hoạch trực giao cấp I chỉ biểu diễn sự tác động của các yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu theo dạng tuyến tính, mặt khác khi số lượng yếu tố ảnh hưởng tăng lên K 3, thì sự tác động của hàm mụctiêu theo dạng phi tuyến tính ( tức là mặt cong hay đáp ứng bề mặt ) Vì vậy chúng tôi tiến hành lựa chọn quy hoạch trực giao cấp II, để tiết kiệm số thí nghiệm và mô tả chính xác sự tác động qua lại giữa các yếu tố đến hàm mục tiêu Phương trình hồi quy có dạng : Y= bo + b1X1+ b2X2+ b3X3 + b4X4 + b12X1X2 + b23X2X3 + b13X1X3 + b24X2X4 + b14X1X4 + b34X3X4 + b11X12 + b22X22 + b33X32 + b44X42

Với: bo là hệ số hồi quy tại tâm, b1, b2, b3,b4 là các hệ số tuyến tính, b11, b22, b33, b44 là các hệ số bậc hai, b12, b23, b13, b14, b24, b34 là các hệ số tương tác.Mỗi hệ số b đặc trưng cho ảnh hưởng của các yếu tố, hệ số nào có giá trị tuyệt đối lớn nhất thì yếu tố tương ứng sẽ ảnh đến quá trình lớn nhất

+ Số thí nghiệm tiến hành N= 2K + 2K + no

Trong đó K: số yếu tố ảnh hưởng, ở đây K=4,

2K: số thí nghệm của quy hoạch trực giao cấp I,

27

2K: số thí nghiệm tại các điểm sao( số thí nghiệm ở các điểm giới hạn trên và giới hạn dưới

no: số thí nghiệm lặp tại tâm, thường no=3 5, chúng tôi lựa chọ- n 5

Vậy số thí nghiệm được tiến hành N= 24 + 2*4+5=29

Sử dụng phần mềm Desgin Expert 7.0.1 có bảng thí nghiệm như sau

Bảng 2.4 Ma trận thực nghiệmSTT Nhiệt độ (oC) Thời gian (h) Cơ chất Glutamate

2.9 Phương pháp kết tủa PGA bằng dung môi

Sử dụng hai loại dung môi là ethanol và methanol với cách tiến hành như sau: dịch lên men được lắc 180 v/p, tại nhiệt độ 40oC, 60 phút, sau đó được ly tâm

80000 v/p, 15 phút, 4oC thu dịch nổi Bổ xung dung môi với tỷ lệ 1 dịch: 3 dung môi (3ml dịch: 9ml dung môi), để -20oC, thời gian 24 giờ, tiến hành ly tâm 10000 vòng/phút, 15 phút ở 4oC thu cặn Kết tủa được hòa tan bằng 3 ml dH2O, bổ sung dung môi với tỷ lệ như lần 1 để , -20oC, sau 24 giờ tiến hành ly tâm thu kết tủa, sau

đó xác định hàm lượng PGA

2.10 X ác định hàm lượng Protein theo phương pháp Bradford

Theo phương pháp của Bradford, M.M [7] dựa trên sự hấp thụ màu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính axit, khi chưa tác dụng với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thụ cực đại 465nm, khi tác dụng với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở bước sóng 595nm

- Tiến hành: hút 1000µl mẫu cần phân tích với 300µl thuốc thử Brandford, để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, đo quang ở bước sóng 595nm Kết quả OD được tính toán dựa vào phương trình đường chuẩn BSA

2.11 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamit (SDS-PAGE)

Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử trong điện trường, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng phân tử, điện tích Để nhận biết PGA mẫu được

29

thực hiện trên gel polyacylamid 6% sau khi chạy nhuộm bằng xanh methylen trong

2 giờ sau đó được tẩy mầu bằng nước theo phương pháp Fumio Yamaguchi [12]

Để nhận biết protein mẫu được điện di trên gel polyacrylamit 12% sau khi chạy gel được nhuộm bằng Coomasie Brilliant blue trong 1 giờ Sau đó được rủa nhuộm bằng dung dịch Metanol : axtit acetic : nước (4: 1: 5), thành phần được tiến hành theo phương pháp Laemmli [30]

2.12 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Dịch PGA thủy phân bằng HCL 6N ở 100oC được xác định bằng sắc ký bản mỏng (TLC) trên tấm Silica Gel- 60, sử dụng hệ dung môi n-butanol- axit acetic -nước (12:3:5 v/v), được hiện màu bằng ninhydrin 0,2% pha trong acetone ở 110oC trong 5 phút

2.13 Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR)

- Phổ FTIR của PGA được chụp trên máy tại Viện kỹ thuật Hóa học trường Đại học Bách khoa Hà Nội Các mẫu được sấy khô và ép nén thành viên với KBr theo tỷ lệ (1:400), được đo trong khoảng từ 500- 4000cm-1

2.14 Khảo sát đặc tính PGA

2.14 1 Khả năng loại ion Fe 3+ , Cu 2+

Dung dịch ion Fe3+ được chuẩn bị bằng cách pha muối Fe2(SO4)3 nồng độ 100mM trong nước cất pH7 Hút 1ml dung dịch Fe3+ vào 6 ống nghiệm, sau đó bổ xung lần lượt 0 , 200ul, 400ul, 600ul, 800ul, 1000ul PGA với nồng độ 25g/l lắc ulđều để ở nhiệt độ phòng Sau 24h phân tích hàm lượng Fe3+ trong dịch theo TCVN 6177:1996

Dung dịch ion Cu2+ được pha với nồng độ 50mM rong nước cất pH 7 Hút t1ml dung dịch Cu2+ vào sáu ống nghiệm, sau đó bổ xung lần lượt 0, 200ul, 400ul, 600ul, 800ul, 1000ul PGA với nồng độ 25g/l lắc đều để ở nhiệt độ phòng Sau 24h phân tích hàm lượng Cu2+ trong dịch theo TCVN 4572:1988

2.14 2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn

Chủng vi sinh vật kiểm định : E coli, S taphylo coccus aur eus được hoạt hóa trong môi trường LB lỏng sau 24h Tiến hành cấy chang vi sinh vật kiểm định lên môi trường lên đĩa thạch, tạo giếng thạch các giếng được nhỏ 200ul PGA ở các nồng độ khác nhau Sau đó được ủ ở 37oC, sau 24h tiến hành đọc kết quả

30

PHẦN III: KẾT QUẢ

3.1 Tuyển chọn chủng có khả năng tổng hợp PGA

3.1.1 Tuyển chọn chủng có khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường tổng hợp PGA

Chúng tôi lựa chọn môi trường E là môi trường chọn lọc các chủng có khả năng tổng hợp PGA Do môi trường có hàm lượng chất khô và áp suất thẩm thấu E rất lớn, lên chỉ có những chủng tổng hợp PGA để duy trì áp xuất tế bào mới có thể sinh trưởng được Môi trường E đã được đưa ra bởi Leonard và công sự [31], từ đó đến nay rất nhiều các nghiên cứu sử dụng môi trường E [9, 10, 14,31, 35] là môi trường cơ bản để tổng hợp PGA

12 chủng vi khuẩn được phân lập từ Chao, ThuaNao, Tương được tăng sinh trên môi trường LB, sau 24h hút 100ul dịch canh trường cấy chang trên môi trường

E, tiến hành quan sát khả năng phát triển của từng chủng thu được kết quả trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Khả năng phát triển của các chủng trên môi trường E