Việc khai thác các hệ vi sinh vật từ các sản phẩm lên men hiện nay đang rất phát triển nó cung cấp rất nhiều các hợp chất có khả năng ứng dụng rộng rãiTrong đó axit Poly -glutamic γ PGA
Mẫu 1a MẪU BÌA LUẬN VĂN CĨ IN CHỮ NHŨ VÀNG Khổ 210 x 297 mm BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO VĂN MINH ĐÀO VĂN MINH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT AXIT POLY GAMMA GLUTAMIC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2012B Hà Nội – 2014 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131884541000000 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu cố gắng, nỗ lực thân Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà – Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Cơ ln tận tình hướng dẫn bảo, gợi mở tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội bảo tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn anh chị/ bạn, phịng thí nghiệm – mơn Vi sinh – Hóa sinh – SHPT Viện Cơng nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội chia sẻ giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Cuối tơi xin chân thành cảm ơn gia đình tơi động viên, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu khoa học tơi, thuộc đề tài KHCN cấp thành phố Hà Nội "Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ glutamic axit (PGA) ứng dụng sản phẩm thực phẩm nông nghiệp" Các kết quả, số liệu nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng tình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày tháng năm Đào Văn Minh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .1 PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu axit Poly γ- glutamic (γ-PGA) .2 1.2 Cấu trúc tính chất γ-PGA 1.2.1 Cấu trúc phân tử γ-PGA 1.2.2 Tính chất γ-PGA 1.2.3 Phân loại γ-PGA 1.3 Tác nhân tổng hợp γ-PGA 1.4 Con đường tổng hợp PGA 1.5 Ứng dụng γ-PGA .12 1.5.1 Trong lĩnh vực y tế 12 1.5.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 13 1.5.3 Trong lĩnh vực môi trường 14 1.5.4 Trong lĩnh vực mỹ phẩm 14 1.5.5 Trong lĩnh vực nông nghiệp 14 1.5.6 Trong ngành công nghiệp khác 15 1.6 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến trình tổng hợp PGA 15 1.7 Thu nhận PGA 17 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Chủng giống 19 2.2 Hóa chất mơi trường 19 2.2.1 Hóa chất 19 2.2.2 Môi trường .19 2.3 Thiết bị, dụng cụ .20 2.4 Tuyển chọn chủng có khả tổng hợp PGA 20 2.4.1 Tuyển chọn chủng có khả sinh trưởng phát triển môi trường tổng hợp PGA 20 2.4.2 Tuyển chọn chủng dựa đặc tính tạo độ nhớt 20 2.4.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp γ-PGA cách xác định hàm lượng PGA .21 2.5 Phương pháp định tên .21 2.5.1 Phương pháp sinh hóa 21 2.5.2 Phương pháp sinh học phân tử .21 2.6 Phương pháp xác định hàm lượng PGA 24 2.7 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA 24 2.7.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 24 2.7.2 Ảnh hưởng số vòng lắc 24 2.7.3 Ảnh hưởng pH 24 2.7.4 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 25 2.7.5 Ảnh hưởng hàm lượng chất 25 2.7.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ .25 2.7.7 Ảnh hưởng nguồn bon .25 2.8 Tối ưu quy hoạch thực nghiệm 25 2.9 Phương pháp kết tủa PGA dung môi .28 2.10 Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Bradford 28 2.11 Phương pháp điện di gel polyacrylamit (SDS-PAGE) 28 2.12 Phương pháp sắc ký mỏng .29 2.13 Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) 29 2.14 Khảo sát đặc tính PGA 29 2.14.1 Khả loại ion Fe3+, Cu2+ 29 2.14.2 Khảo sát khả kháng khuẩn 29 PHẦN III: KẾT QUẢ .30 3.1 Tuyển chọn chủng có khả tổng hợp PGA 30 3.1.1 Tuyển chọn chủng có khả sinh trưởng phát triển môi trường tổng hợp PGA 30 3.1.2 Tuyển chọn chủng dựa đặc tính tạo độ nhớt 31 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp γ-PGA cách xác định hàm lượng PGA .32 3.2 Định tên 33 3.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý chủng B5 .33 3.2.2 Định tên phương pháp sinh hóa 34 3.2.3 Định tên phương pháp sinh học phân tử 36 3.2.3.1 Tách chiết DNA tổng số chủng B5 36 3.2.3.2 Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA phản ứng PCR .36 3.2.3.3 Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng B5 so sánh giữ liệu ngân hàng gen 37 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA chủng Bacillus subtilis B5 40 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp PGA 40 3.4.2 Ảnh hưởng số vòng lắc đến khả sinh tổng hợp PGA .41 3.4.3 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp PGA 42 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến khả sinh tổng hợp PGA 43 3.4.5 Nồng độ chất đến khả sinh tổng hợp PGA .44 3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp PGA 44 3.4.7 Khảo sát ảnh hưởng nguồn, nồng độ cacbon đến khả sinh tổng hợp PGA 46 3.5 Tối ưu quy hoạch thực nghiệm 47 3.6 Thu nhận tinh PGA từ chủng Bacillus subtilis B5 54 3.6.1 Lựa chọn tác nhân kết tủa PGA .54 3.6.2 Lựa chọn tỷ lệ dung môi kết tủa PGA .55 3.6.3 Đánh giá độ tinh 56 3.7 Quy trình sản xuất thu hồi PGA dạng chế phẩm kỹ thuật 60 3.8 Một vài đặc tính PGA .61 3.8.1 Xác định khả loại ion Fe3+ , Cu2+ .61 3.8.2 Khả kháng khuẩn 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO .64 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 16SF Mồi xuôi 16SR Mồi ngược ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate Ca Canxi CMC Carbon methyl cenlullose DNA Deoxylribonucleic aicd EDTA Axit Ethylenediaminetetraacetic g/l Gam/lít G- Gram âm G+ Gram dương K – γ-PGA Kali – γ-PGA PCR Guanosine triphosphate PDGA Axit Poly γ- D-glutamic PLDGA Poly γ- D,L- glutamic PLGA Axit Poly γ- L-glutamic RNA Axit Ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate VO – γ-PGA Vanadyl – γ-PGA v/p Vòng/ phút v/v Thể tích/ thể tích γ-PGA Axit Poly γ- glutamic DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các chủng vi khuẩn có khả tạo γ-PGA Bảng 1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới hàm lượng PGA 10 Bảng 1.3 Ảnh hưởng chất dinh dưỡng đến khả tổng hợp PGA 15 Bảng 2.1.Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng 2.2.Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng 2.3 : Khoảng biến đổi yếu tố 26 Bảng 2.4 Ma trận thực nghiệm 27 Bảng 3.1 Khả phát triển chủng môi trường E 30 Bảng 3.2 Kết thử kit API 50 CHB chủng vi khuẩn B5 34 Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken hàm lượng PGA thu 48 Bảng 3.4 Kết Phân tích Phương sai mơ hình 49 Bảng 3.5 Hàm lượng PGA kết tủa enthanol methanol 54 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ ethanol tới hàm lượng PGA 55 Bảng 3.7 Các bước tinh PGA 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Natto – Nhật Bản Hình 1.2 Chungkokjang – Hàn Quốc Hình 1.3 Cấu trúc phân tử γ-PGA dạng muối dạng ion Hình 1.4 Cấu trúc phân tử PDGA Hình 1.5 Con đường tổng họp PGA Hình 1.6 Cơ chế tổng họp PGA 10 Hình 3.1 Kết đo độ nhớt canh trường chủng tuyển chọn 32 Hình 3.2 Kết định lượng γ-PGA chủng vi khuẩn 33 Hình 3.3 Hình thái chủng B5 34 Hình 3.4 Điện di đồ DNA tổng số chủng B5 36 Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR vùng 16S RNA chủng B5 37 Hình 3.6 Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng B5 38 Hình 3.7 So sánh trình tự 16s RNA chủng B5 NCBI 39 Hình 3.8 Sơ đồ phát sinh loài chủng B5 40 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình tổng hợp PGA 40 Hình 3.10 Ảnh hưởng số vịng lắc đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 41 Hình 3.11 Ảnh hưởng pH đến khả tổng hợp PGA 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến khả tổng hợp PGA 43 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ chất đến khả tổng hợp PGA 44 Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả tổng hợp PGA 45 Hình 3.15 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp PGA 47 Hình 3.16 Biểu đồ đáp ứng bề mặt thời gian,nhiệt độ thay đổi, chất, 51 pH giá trị trung bình Hình 3.17 Biểu đồ đáp ứng bề mặt chất, nhiệt độ thay đổi, thời 51 gian,pH giá trị trung bình Hình 3.18 Biểu đồ đáp ứng bề mặt nhiệt độ, pH thay đổi, chất, thời 51 gian mức trung bình Hình 3.19 Biểu đồ đáp ứng bề mặt thời gian, pH thay đổi, chất, nhiệt 52 độ mức trung bình Hình 3.20 Biểu đồ đáp ứng bề mặt chất, ph thay đổi, thời gian, nhiệt 52 độ mức trung bình Hình 3.21 Động thái trình sinh tổng hợp PGA 53 Hình 3.22 PGA kết tủa dung mơi 55 Hình 3.23 Điện di PGA gel polyacrylamide 6% 57 Hình 3.24 Điện di gel polyacrylamide 12% 58 Hình 3.25 Ảnh sắc ký TLC dịch thủy phân PGA 58 Hình 3.26 Phổ hồng ngoại FTIR PGA 59 Hình 3.27 Sơ đồ quy trình thu hồi PGA quy mơ phịng thí nghiệm 60 Hình 3.28 Khả loại ion Fe3+, Cu2+ 61 Hình 3.29 Khả kháng khuẩn 62