Nghiên cứu sản xuất axit poly gamma glutamic

Nghiên cứu sản xuất axit poly gamma glutamic Nghiên cứu sản xuất axit poly gamma glutamic Nghiên cứu sản xuất axit poly gamma glutamic luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO VĂN MINH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT AXIT POLY GAMMA GLUTAMIC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO VĂN MINH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT AXIT POLY GAMAMA GLUTAMIC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà – Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Cô tận tình hướng dẫn bảo tơi suốt q trình thục luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội bảo tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn anh chị, bạn, phịng thí nghiệm – mơn Vi sinh – Hóa sinh – SHPT Viện Cơng nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội chia sẻ giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình tơi ln động viên, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu khoa học Các kết quả, số liệu nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công tình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày tháng năm Đào Văn Minh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iii MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN 1.1.Poly γ- glutamic acid (γ-PGA) 1.2 Cấu trúc tính chất γ-PGA 1.2.1 Cấu trúc phân tử γ-PGA 1.2.2 Tính chất γ-PGA 1.2.3 Phân loại γ-PGA 1.3 Cơ chế tổng hợp γ-PGA 1.4 Vi khuẩn tổng hợp γ-PGA 11 1.5 Ứng dụng γ-PGA 12 1.5.1 Trong lĩnh vực y tế 13 1.5.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 15 1.5.3 Trong lĩnh vực môi trường 15 1.5.4 Trong lĩnh vực mỹ phẩm 16 1.5.5 Trong lĩnh vực nông nghiệp 16 1.5.6 Trong ngành công nghiệp khác 16 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Đối tượng 17 2.1.2 Môi trường 17 2.1.3 Hóa chất 17 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Tuyển chọn chủng có khả tổng hợp PGA 18 2.2.2 Phương pháp định tên 18 2.2.2.1 Định tên theo phương pháp sinh lý, sinh hóa 18 2.2.3 Xác định ảnh hưởng nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn 21 2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng PGA 21 2.2.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA 22 2.2.5.1 Ảnh hưởng nguồn bon 22 2.2.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 22 2.2.6 Tối ưu đa yếu tố 23 2.2.7 Nghiên cứu động học trình lên men 25 2.2.8 Phương pháp tinh 25 2.2.9 Phương pháp xác định hàm lượng Protein 26 2.2.10 Phương kiểm tra độ tinh xác định khối lượng phân tử điện di sdspage 26 Điện di trình dịch chuyển phân tử điện trường, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng phân tử, điện tích 26 2.2.11 Nghiên cứu cấu trúc PGA 26 2.2.11.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) 26 2.2.11.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 27 2.2.12 Khảo sát đặc tính sinh học PGA 28 2.2.12.1 Khả loại ion Fe3+, Cu2+ 28 2.2.12.2 Khảo sát khả kháng khuẩn 28 PHẦN III: KẾT QUẢ…………………………………………………………………… 29 3.1 Tuyển chọn chủng có khả sinh PGA 29 3.1.1 Tuyển chọn chủng có khả sinh trưởng phát triển môi trường tổng hợp PGA 29 3.1.2 Tuyển chọn chủng dựa đặc tính tạo độ nhớt 30 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp γ-PGA cách xác định hàm lượng PGA 31 3.2 Định tên phương pháp sinh hóa 31 3.2.1 Xác định khả đồng hóa nguồn cacbon kit API 50CHB 31 3.3 Ảnh hưởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng phát triển chủng B5 33 3.4 Định tên phương pháp sinh học phân tử 35 3.4.1 Tách chiết DNA tổng số từ chủng B5 35 3.4.2 Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA phản ứng PCR 36 3.4.3 Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng B5 so sánh giữ liệu ngân hàng gen 37 3.5 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA 39 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ 39 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon nồng độ 41 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 42 3.5.4 Nồng độ chất đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 43 3.6 Tối ưu đa yếu tố 44 3.7 Khảo sát động thái trình lên men tổng hợp PGA từ chủng Bacillus subtilis B5 49 3.8 Thí nghiệm kiểm chứng xác định hàm lượng PGA trước sau tối ưu 51 3.9 Thu nhận tinh PGA từ chủng Bacillus subtilis B5 52 3.9.1 Lựa chọn tác nhân kết tủa PGA 52 3.9.2 Lựa chọn tỉ lệ dung môi kết tủa PGA 52 3.9.3 Đánh giá độ tinh 53 3.10 Đề suất quy sản xuất thu hồi PGA dạng chế phẩm kỹ thuật 56 3.11 Đặc tính PGA 57 3.11.1 Phổ hồng ngoại FT- IR 57 3.10 Xác định khả loại ion Fe3+, Cu2+ 58 3.11 Khả kháng khuẩn 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận 60 Kiến Nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 16SF Mồi xuôi 16SR Mồi ngược ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate Ca Canxi CMC Carbon methyl cenlullose DNA Deoxylribonucleic aicd EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid V/p Vòng/phút Rrna Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate g/l Gam/lít G- Gram âm G+ Gram dương K – γ-PGA Kali – γ-PGA PCR Guanosine triphosphate PDGA Poly γ- D-glutamic acid PLDGA Poly γ- D,L- glutamic PLGA Poly γ- L-glutamic acid VO – γ-PGA Vanadyl – γ-PGA γ-PGA Poly γ- glutamic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các chủng vi khuẩn có khả tạo γ-PGA [18] 17 Bảng Sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn 18 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Khoảng biến đổi yếu tố 29 Bảng 2.4 Thí nghiệm với yếu tố 30 Bảng 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn từ tương Chao 34 ThuaNao Bảng 3.2 Kết lựa chọn chủng môi trường đặc hiệu 36 Bảng 3.3 Kết đo độ nhớt chủng tuyển chọn 37 Bảng 3.4 Kết thử kit API 50 CHB chủng vi khuẩn B5 39 Bảng 3.6 Bảng kết sau tối ưu quy hoạch thực nghiệm 53 Bảng 3.7 Bảng phân tích ANOVA 55 Bảng 3.8 Kết thu hồi PGA 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Cơng thức phân tử γ-PGA Hình 2: Natto – Nhật Bản Hình 3: Chungkokjang – Hàn Quốc Hình Cấu trúc phân tử γ-PGA dạng muối dạng ion[13] 10 Hình Cấu trúc phân tử PDGA 14 Hình Con đường tổng hợp γ-PGA [23] 15 Hình 3.1 Kết định lượng γ-PGA chủng vi khuẩn 39 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh trưởng chủng B5 42 Hình 3.3 Ảnh hưởng pH đến khả phát triển chủng B5 42 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng B5 43 Hình 3.5 Điện di đồ DNA tổng số chủng B subtilis B5 44 Hình 3.6 Sản phẩm PCR vùng 16S RNA chủng B5 45 Hình 3.7 Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng B5 46 Hình 3.8 So trình tự 16s RNA chủng B5 NCBI 47 Hình 3.9 Sơ đồ phát sinh lồi chủng B5 48 Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 49 Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn cacbon 51 Hình 3.12 ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 52 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ chất 53 Hình 3.14 Khi thời gian nhiệt độ thay đổi, chất pH giá trị trung 57 bình Hình 3.15 Khi chất nhiệt độ thay đổi, thời gian pH giá trị trung 57 bình Hình 3.16 Khi nhiệt độ pH thay đổi, chất thời gian mức trung 58 bình Hình 3.17 Khi thời gian pH thay đổi, chất, nhiệt độ giữ mức trung 59 bình Hình 3.18 Khi chất, ph thay đổi, thời gian, nhiệt độ mức trung bình 59 Hình 3.19 Hàm lượng PGA trước sau tối ưu 60 Hình 3.19 Điện di PGA gel polyacrylamide 6% 60 Hình 3.20 Điện di gel polyacrylamide 12% 61 Hình 3.21 Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất PGA quy mơ phịng thí 62 nghiệm Hình 3.22 Phổ hồng ngoại FTIR PGA 63 Hình 3.23 Khả loại ion Fe3+, Cu2+ 64 Hình 3.24 Khả kháng khuẩn 64 Hình 3.17 Khi thời gian pH thay đổi, chất, nhiệt độ giữ mức trung bình Hình 3.18 Khi chất, ph thay đổi, thời gian, nhiệt độ mức trung bình Biểu đồ đáp ứng bề mặt thể tương tác yếu tố, giá trị đỉnh biểu đồ vùng màu đỏ cho hàm lượng PGA lớn Xây dựng hàm kỳ vọng cho giá trị tối ưu theo lý thuyết nhiệt độ 38oC, thời gian 92.78h, chất 24.03 (g/l), pH 7.73 3.7 Khảo sát động thái trình lên men tổng hợp PGA từ chủng Bacillus subtilis B5 Trong trình lên men gián đoạn theo mẻ chất dinh dưỡng không bổ xung không thu nhận sản phẩm trao đổi chất Lên sinh trưởng, phát triển quần thể vi khuẩn bị gián đoạn, tuân theo quy luật bắt buộc qua giai đoạn: pha lag ( pha thích ứng ), pha log ( phát triển lũy tiến), pha cân pha suy vong Đối với trình lên men sinh tổng hợp PGA, chủng B5 lên men môi trường: Glutamate 25(g/l); citric 15(g/l); glycerol 35(g/l); NH4NO3 15(g/l); MgSO4.7H2O 0,5(g/l); FeCl3 6H2O 0,04(g/l); K2HPO4 0,5(g/l); CaCl2 2H2O 0,15(g/l); MnSO4 H2O 0,04(g/l); pH 7.7; khử trùng 121OC, 15 phút Điều kiện lên men là: 38OC, nuôi tĩnh Tiến hành nuôi 144 giờ, sau 12h tiến hành xác 49 định khối lượng sinh khối ướt, pH hàm lượng PGA Kết biểu diễn hình: Hình 3.19 Động thái trinhg lên men Kết cho thấy, trình sinh trưởng phát triển chủng B5 theo pha Từ đến 24 sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn chủng B5 thích ứng dần với mơi trường lên men, khẳng định pha lag Giai đoạn từ 24 đến 72 sinh khối tế bào tăng mạnh từ 15,1 đến 55,6 g/l, cho thấy tế bào sinh sản nhanh, chất dinh dưỡng chủ yếu tổng hợp sinh khối Trong khoảng thời gian từ 72h-120h, quần thể vào pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ mức ổn định số tế bào chết số tế bào sinh Giai đoạn cuối từ 120 đến 144 sinh khối bào bắt giảm, môi trường chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, chứa nhiều chất trao đổi thứ cấp gây ức chế sinh trưởng Đối với trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 48 đến 96 bắt đầu giảm vào cuối pha cân Điều lý giải cuối pha cân lượng chất dinh dưỡng chất cảm ứng giảm mạnh, đồng thời sản phẩm trao đổi chất thứ cấp nhiều ức chế trình tổng hợp PGA Trong giai đoạn cưối pha cân chủng B5 sử dụng PGA làm chất dinh dưỡng lên hàm lượng giảm 50 Đối với pH, sau 24 nuôi cấy giảm từ 7,7 xuống 6,84 Điều lý giải chủng B5 bắt đầu thích ứng với mơi trường, sinh hợp làm giảm pH Từ 24 đến 120 pH bắt đầu tăng dần vào ổn định so sánh với nghiên trước tác giả cho trình tổng hợp PGA làm tăng dần pH giữ mức trung tính Qua phân tích kết nhận thấy PGA lên men điều kiện trên, tổng hợp PGA diễn mạnh đầu pha cân bằng, điều thuận lợi thời gian nuôi cấy ngắn, thu hồi tinh dễ 3.8 Thí nghiệm kiểm chứng xác định hàm lượng PGA trước sau tối ưu Kiểm tra khả sinh tổng hợp PGA chủng B5 trước tối ưu, sau khảo sát yếu sau tối ưu theo quy hoach thực nghiệm Trước tối ưu thời gian nuôi cấy 96h, 35oC, tỉ lệ cấp giống 2%, nuôi môi trường E Sau tối ưu cổ điển thời gian nuôi 96h, tỷ lệ cấp giống 5%, pH8, 40oC Sau tối ưu theo quy hoạch thực nghiệm thời gian nuôi cấy 93h, nhiệt độ 38oC, pH 7.73 Tiến hành nuôi theo điều kiện trên, sau xác định hàm lượng PGA, thu kết sau: Hình 3.20 Hàm lượng PGA trước sau tối ưu Kết cho thấy hàm lượng PGA trước tối ưu đạt 6.18(g/l), sau tối ưu cổ điển đạt 20.51(g/l), sau tối ưu quy hoạch thực nghiệm đạt 26.2(g/l) Kết cho thấy tìm điều kiện thích hợp tổng hợp PGA hàm lượng tăng lên lớn Kết thực nghiệm cho thấy giá trị hàm kỳ vọng tính tốn theo lý thuyết 51 có sai khác nhỏ Q trình tối chúng tơi tìm điều kiện thích hợp để sinh tổng hợp PGA: nhiệt độ 38oC, thời gian 93h, pH 7,7 3.9 Thu nhận tinh PGA từ chủng Bacillus subtilis B5 3.9.1 Lựa chọn tác nhân kết tủa PGA Sau trình lên men canh trường tồn PGA nhiều tạp chất Để thu nhận PGA, nghiên cứu trước chủ yếu sử dụng hai dung môi Ethanol Methanol để kết tủa Chúng tiến hành so sánh khả kết tủa PGA hai dung môi để chọn dung mơi thích hợp nhất, cách tiến hành nêu phần phương pháp, kết sau: Bảng 3.6 Hàm lượng PGA kết tủa enthanol methanol Dung môi Hàm lượng PGA (g/l) Tủa Ethanol Tủa methanol 25,3 21,7 Kết cho thấy sử dụng ethanol để kết tủa hàm lượng PGA thu 25,3 g/l cao so với dung môi methanol Trong q trình thực nghiệm chúng tơi nhận thấy, sử dụng ethanol kết tủa PGA tạo dạng viên hạt thời gian nhanh rễ ly tâm thu tủa Cịn sử dụng methanol kết tủa dạng phân tán, lơ lửng thời gian ly tâm dài Được chụp lại hình sau Hình 3.21 PGA kết tủa dung mơi Điều có ý nghĩ lớn thu hồi PGA lượng lớn, giảm thời gian ly tâm tiết kiệm chi phí Qua chúng tơi lựa chọn dung mơi để thu hồi PGA ethanol 3.9.2 Lựa chọn tỉ lệ dung môi kết tủa PGA Sau lựa chọn dung môi tiến hành khảo sát tỉ lệ dung môi với dịch lên men với tỉ lệ sau: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5 Kết mô tả bảng sau: 52 Bảng 3.7 Tỉ lệ ethanol dịch thô Tỉ lệ Hàm lượng PGA (g/l) 1:1 2,6 1:2 4,6 1:3 24,9 1:4 26,5 1:5 26,5 Qua kết cho thấy tỉ lệ 1:1 hàm lượng PGA thu thấp đạt 2,6 g/l, tăng dần tỉ lệ lớn tỉ lệ 1:4 1:5 26,5 g/l Ở tỉ lệ 1:3 khả thu hồi PGA thấp không đáng kể so với tỉ lệ 1:4 1:5 đạt 24,9 g/l Mà lượng dung mơi sử dụng lên lựa chọn tỉ lệ kết tủa 1:3 3.9.3 Đánh giá độ tinh Sau lựa chọn tỉ lệ ethanol với PGA 1:3, tiến hành kiểm tra độ tinh bằng, xác định hàm lượng protein tạp, điện di gel poly acrylamide, chạy sắc ký mỏng Xác định hàm lượng protein từ dịch thô qua hai bước tủa cồn lần lần Sau chúng tơi chạy qua màng cut of 100kDa để loại bỏ phân tử có kích thước nhỏ Kết thể bảng sau Bảng 3.8 Kết thu hồi PGA Các bước Hàm lượng Hàm tinh protein lượng (ug/ml) PGA (g/l) aZA Hiệu suất (%) 17.00157 Thô Độ tinh (lần) 33571.43 100 Tủa cồn lần 6.692294 27099.12 81 1.69 Tủa cồn lần 5.748733 25609.34 75 2.03 Cutoff100kDa 7.006815 45024.34 45 2.76 53 Qua bảng kết quả, PGA thu hồi hiệu xuất đạt 81% lần kết tủa cồn lần 1, độ tinh sach đạt 1.69 so với dịch thô Ở lần kết tủa thứ hiệu xuất đạt 75%, độ tinh 2,03 lần Sau chạy qua màng cutoff 100kDa cho độ tinh lên 2,76 lần hiệu suất thu hồi đạt 45% Chúng chạy điện di để dánh giá độ tinh xác định khối lượng PGA Chạy điện di gel Polyacrylamide 6%, gel nhuộm xanh methylene Kết hình: Hình 3.22 Điện di PGA gel polyacrylamide 6% Giếng 1: PGA thô, giếng : PGA kết tủa cồn lần 1, giếng PGA kết tủa cồn lần 2, giếng : maker, gel nhuộm xanh methylen Kết điện nhuộm xanh methylene nhận biết PGA Cho thấy mẫu thô hàm lượng PGA lớn lên tạo vệt nhiều tạp, giếng kết tủa cồn cho thấy hàm lượng tạp giảm nhiều, xuất băng đậm hàm lượng PGA lớn Trên gel 6%, PGA di chuyển chậm mép gel tách điều cho thấy khối lượng phân tử rât lớn So sánh với maker mầu khẳng định PGA có khối lượng lớn 272 Để đánh giá bước tinh protein tạp hay không, điện di mẫu gel polyacrylamide 12%, nhuộm comassiblue để phát kết hình 3.23 54 Hình 3.23 Điện di gel polyacrylamide 12% Giếng 1: PGA thô, giếng : PGA kết tủa cồn lần 1, giếng PGA kết tủa cồn lần 2, giếng : maker, Gel nhuộm comassiblue Trên điện di đồ cho thấy, giếng không xuất protein tạp Ở mẫu thô không xuất Tại giếng tủa cồn lần lần khơng xuất băng protein tạp, marker dõ Điều lý giải hàm lượng protein mẫu thấp lên không đủ nhạy để xuất băng Có thể thể cho thấy phương pháp dung cồn có khả loại protein tạp tơt Để khẳng định xác hiệu tinh PGA, tiến hành thủy phân PGA tinh HCl 6M, 110OC, lấy mẫu thời điểm 6h, 8h, 24h chạy sắc lý mỏng kết hình Hình 3.24 Ảnh chạy TLC thủy phân PGA thủy phân PGA 24h, 3: thủy phân 6h, 4: thủy phân 8h, 5: Glutamic 55 Do thành phần PGA có đơn phân glutamic acid, mẫu tinh thủy phân PGA cho glutamic acid so sánh với L glutamic chuẩn Kết cho thấy vị trí chấm thứ thủy phân 24h xuất glutamic tương đương với glutamic chuẩn, vị trí thứ 3, xuất vệt chứng tỏ thời gian thủy phân chưa triệt để Chúng lựa chọn phương pháp tinh sử dụng ethanol với tỉ lệ 1:3, cho hiệu xuất đạt 45%, độ tinh 2,76 3.10 Đề suất quy sản xuất thu hồi PGA dạng chế phẩm kỹ thuật Dựa kết nghiên cứu thu tiến hành xây dựng quy trình sản xuất PGA tạo chế phẩm kỹ thuật quy mô phịng thí nghiệm theo sơ đồ hình 3.21 sau: Giống Môi trường LB, PH 37oC, 24 Môi trường tổng hợp PGA Dịch PGA thô Kết tủa EtOH (1:3) Chế phẩm kỹ thuật Hình 3.25 Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất PGA quy mơ phịng thí nghiệm 56 Chủng B5 tăng sinh môi trường LB pH 7, nuôi 37oC, nồng độ NaCl 1%, pH4, tốc độ lắc 180 v/p, sau 24h tiến hành cấp giống với tỷ lệ 5% Sau cấp giống 5% sang mơi trường tổng hợp PGA( bình tam giác 250ml, chứa 100ml môi trường tổng hợp) Tiến hành nuôi 38oC, tốc độ lắc v/p, pH 7.73, sau 92h nuôi cấy tiến hành ly tâm 4oC, tốc độ 10000 v/p, thời gian 10 phút, thu dịch PGA thô Dịch PGA thô kết tủa EtOH 99% với tỷ lệ 1:3 (1 phần dịch PGA thô: lần EtOH99%), sau ly tâm với tốc độ 10000 v/p, thời gian 10 phút thu chế phẩm kỹ thuật, có hiệu xuất thu hồi 85% 3.11 Đặc tính PGA 3.11.1 Phổ hồng ngoại FT- IR Phổ hồng ngoại cho phép xác định liên kết, nhóm chức từ thể nhận biết số hợp chất Qua đánh giá độ tinh mẫu, tiến hành chụp phổ hồng ngoại với chất chuẩn PGA(sigma), PGA sau tinh 2360.6 1078.8 90 3750.5 95 3855.9 100 1126.9 85 618.3 75 70 65 1403.1 60 55 1592.5 50 3424.6 %Transmittance 80 45 40 3500 3000 2000 2500 Wavenumbers (cm-1) Number of sample scans: 32 Number of background scans: 32 Resolution: 4.000 Sample gain: 4.0 Mirror velocity: 0.6329 Aperture: 100.00 H 57 1500 1000 500 Hình 3.26 Phổ hồng ngoại FTIR PGA Kết phổ cho thấy tai vị trí bước sóng 3424.6 cm-1 xuất peak liên kết N-H, phổ hấp thụ nhóm methylande bước sóng 2935 cm-1, phổ hấp thụ liên kết C=O nhóm cacbonyl bước sóng 1592.5 cm-1, nhóm OH bending bước sóng 1403.1cm-1 Các peak xuất cho thấy PGA So sánh với phổ chuẩn PGA cho thấy có tương đồng lớn 3.10 Xác định khả loại ion Fe3+, Cu2+ PGA biết đến chất có khả ứng dụng sử lý mơi trường Do có khả liên kết với ion kim loại tạo phúc kết tủa, lên PGA úng dụng nhiều vào hệ thống sủ lý nước thải để loại bỏ ion lom loại ứng dụng vào nhà máy mạ để thu hồi tái sử dụng lượng kim loại thất thoát Do tiến hành khảo sát khả loại ion kim loại phịng thí nghiệm với ion Fe3+, Cu2+ cách tiến hành phần Phương pháp, sau thời gian nhìn thấy dõ tủa qua hình 3.27 a b Hình 3.27 Khả loại ion Fe3+, Cu2+ Kết phân tích cho thấy khả loại ion Fe3+ đến 80% 2ug PGA, kết khả quan cần nghiên cứu sâu diều kiện kết tủa pH, khối lượng phân tử PGA Đối với Cu2+ khả kết tủa loại khoảng 20% nồng độ 2,5ug PGA Qua cho thấy PGA có tiềm ứng dụng môi trường rât lớn 3.11 Khả kháng khuẩn Hiện ứng dụng PGA y sinh phát triển mạnh đa dạng Trong nghiên cứu tạo vật liệu kháng khuẩn liên kết PGA với chitonsan cho hiệu lớn Nhưng chưa có nghiên cứu xác định khả kháng khuẩn 58 độc lập PGA, tiến hành nghiên cứu sử dụng PGA để kháng lại chủng E.coli, Sthaphylococuss auries, phương pháp đục lỗ thạch kết hình 3.28 5 a b Hình 3.28 Khả kháng khuẩn a: vi khuẩn E.coli, b: Sthaphylococuss auries 1: 100ug PGA, 2: 200 ug PGA, 3: 300ug PGA, 4: 400ug, 5: 500ug Kết cho thấy PGA có khả kháng chủng vi khuẩn, nồng độ từ 100 đến 500ug PGA đề tạo vòng kháng khuẩn với E coli, Sthaphylococuss auries nồng độ 100ug khơng thấy rõ vịng kháng khuẩn, nồng độ cao cho thấy PGA tạo vòng kháng khuẩn rõ Kết luận nhận thấy PGA có khả Kháng vi khuẩn G- G+, lý giải cho điều phân tử PGA bám vào thành tế bào gây ức chế sụ trao đổi kênh vận chuyển làm vi khuẩn chêt Kết mở khả ứng dụng lớn 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình thực đề tài: “ Nghiên cứu sản xuất axit Poly gamma glutamic”, thu số luận sau Đã tuyển chọn chủng B5, T1 có khả tổng hợp PGA cao Định tên xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng B5 lồi Bacillus subtilis B5 Tìm điều kiện để thu PGA: +lựa chọn nguồn nồng độ nito: 1,5% NH4NO3 +lựa chọn nguồn nồng độ cacbon : 1,5% acid citric + lựa chọn tỉ lệ giống: 5% + lựa chọn hàm lượng chất: 25g/l natri glutamate + Bằng quy hoạch thực nghiệm bậc Box- BenKen tìm điều kiện tối ưu để sản xuất PGA: nhiệt độ 38oC, thời gian 92.78h, chất 24.03 (g/l), pH 7.7, hàm lượng PGA đạt 25.8 (g/l) + Lựa chọn dung môi thu hồi PGA Ethanol với tỉ lệ 1:3 Đưa quy trình thu hồi tạo chế phẩm kỹ thuật với hiệu xuất 81% Khảo sát vài đặc tính sinh học : + kháng E coli, Staphylococcus aureus + Khảo sát khả loại ion Fe3, Cu2+: với 2,0ug PGA loại 80 mM Fe3, với 2,5 ug PGA loại được10mM Cu2+ Kiến Nghị Nghiên cứu sản xuất PGA quy mô pilot, ứng dụng PGA vào xử lý môi trường 60 Tài liệu tiếng anh TÀI LIỆU THAM KHẢO Application of statistical experimental methods to optimize production ofpoly(γglutamic acid) by Bacillus licheniformis CCRC 12826 (2002) I.L Shih, Y.T.Van, Y.N Chang.Enzyme and Microbial Technology 31, 213–220 Biochemistry and molecular genetics of poly-γ-glutamate synthesis (2002a) Ashiuchi M, Misono H Appl Microbiol Biotechnol 59, 9–14 Biofilm formation by a Bacillus subtilisstrain that producesc γ–polyglutamate (2006) Masaaki Morikawa, Shinji Kagihiro, Mitsuru Haruki, Kazufumi Takano, Steve Branda, Roberto Kolter, and Shigenori Kanaya Microbiology 152, 2801–2807 Biosynthesis of glutamine and glutamate and the assimilation of ammonia In Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacteria (1993) Schreier, H.J., Sonenshein, A.L., Hoch, J.A., and Losick, R (eds) Washington, DC: American Society for Microbiology 281–298 Characterization of γ-Glutamyl Hydrolase Produced by Bacillus sp Isolated from Thai Thua-nao (2006) Orawan Chun Hachart, Takenori Itoh, Morakot Sukchotiratana, Hiroyuk Itanimoto, Yasutaka Tahara.Biosci.Biotechnol.Biochem 70, 2779–2782 Chemistry and biosynthesis of the poly(γ-D-glutamyl) capsule in Bacillus licheniformis L Properties of the membrane-mediated biosynthetic reaction (1937) Troy, F.A., J Biol Chem 248, 305-316 Determination of γ-Polyglutamic Acid in "Natto" Using Cetyltrimethylammonium Bromide (Studies on "Natto" Part V) (1995) Akishige Kanno and Haruki Takamatsu Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 42, 878–886 Disruption of the cell wall lytic enzyme CwlO affects the amount and molecular size of poly-γ-glutamic acid produced by Bacillus subtilis (natto) (2011) Nobuo Mitsui, Hisashi Murasawa, and Junichi Sekiguchi.J Gen Appl Microbio 57, 35 – 43 Food Applications of Poly-Gamma-Glutamic Acid Hiroyuki Tanimoto (2010) 166- 168 10 High yield and cost-effective production of poly(γ-glutamic acid) with Bacillus subtilis (2011).Jin Huang, Yinming Du, Guohua Xu, Huili Zhang, Fan Zhu, Lei Huang, Zhinan Xu Eng Life Sci 11, 291–297 61 11 Isolation of Bacillus subtilis (chungkookjang), a poly-γ-glutamate producer with high genetic competence (2001) M Ashiuchi, T Kamei, D.-H.Baek, S.-Y.Shin, M.-H Sung, K Soda, T Yagi, H Misono Appl Microbiol Biotechnol 57, 764–769 12 Natto Mucilage Containing Poly-γ-glutamic Acid Increases Soluble Calcium in the Rat Small Intestine (2001) Hiroyuki Tanimoto, Masato Mori, Masao Motoki, Kunio Torii, Motoni Kadowaki, Tadashi Noguchi.Biosci.Biotechnol.Biochem 65, 516-521 13 Natural and Edible Biopolymer Poly-γ-glutamic Acid: Synthesis, Production, and Applications (2005) Moon-hee Sung, Chung Park, Chul-joong Kim, Haryoung Poo, Kenji Soda, Makoto Ashiuchi.The Chemical Record 5, 352–366 14 Occurrence and Biosynthetic Mechanism of Poly-Gamma-Glutamic Acid Makoto Ashiuchi 88-93 15 Occurrence of poly-γ-D-glutamic acid and poly-α-L-glutamine in the genera Xanthobacter , Flexithrix , Sporosa-rcina and Planococcus (1983) Kandler, O., König, H., Wiegel, J., and Claus, D Syst Appl Microbiol 4, 34–41 16 Physiological and biochemical characteristics of poly γ-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis (2001) Ashiuchi, M., Nawa, C., Kamei, T., Song, J.J., Hong, S.P., Sung, M.H., et al Eur J Biochem 268, 5321–5328 17 Poly(y-glutamic Acid)s Are the Major Constituents of Nematocysts in Hydra (Hydroxoa, Cnidaria) (1990) Jakob Weber The Journal of biological chemistry 265, 9664-9669 18 Poly-gamma-glutamate in bacteria (2006) Thomas Candela and Agnès Fouet.Molecular Microbiology 60, 1091–1098 19 Polyglutamic acid synthesis by cell-free extracts of Bacillus licheniformis (1963) Leonard, C.G., and Housewright, R.D.Biochim Biophys Acta 73, 530–532 20 Poly-γ-glutamic acid (2002b) Ashiuchi M, Misono H In: Fahnestock SR, Steinbuchel A (eds).Biopolymers 7, 123–174 21 Relationship between the Antifreeze Activities and the Chemical Structures of Oligoand Poly(glutamic acid)s (1998) Masata Mitsuiki, Akinori Mizuno, Hiroyuki Tanimoto, and Masao Motoki.J Agric Food Chem 46, 891−895 62 22 XX 23 The production of poly-(γ-glutamic acid) from microorganisms and its various applications (2001) Ing-Lung Shih, Yi-TsongVan Bioresource Technology 79, 207–225 24 γ-Polyglutamic Acid Produced by Bacillus subtilis (natto): Structural Characteristics, Chemical Properties and Biological Functionalities (2006) Guan-Huei Ho, Tong-Ing Ho, Kuo-Huang Hsieh, Yuan-Chi Su, Pi-Yao Lin, Jeng Yang, Kun-Hsiang Yang, and ShihChing Yang.Journal of the Chinese Chemical Society 53, 1363–1384 Tài liệu tiếng Việt 25 Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis (2006) Đại học nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh.33–35 63 ... khuẩn Bacillus phân lập từ tương Xuất phát từ vấn đề trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu sản xuất Poly γ -glutamic aicd” Mục tiêu nghiên cứu: + Nghiên cứu thu nhận PGA với hàm lượng cao,... γ-PGA PCR Guanosine triphosphate PDGA Poly γ- D -glutamic acid PLDGA Poly γ- D,L- glutamic PLGA Poly γ- L -glutamic acid VO – γ-PGA Vanadyl – γ-PGA γ-PGA Poly γ- glutamic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng... TỔNG QUAN 1.1 .Poly γ- glutamic acid (γ-PGA) Poly γ- glutamic acid (γ-PGA) polymer tự nhiên mang điện tích âm, đơn phân D- L -glutamic nối với liên kết nhóm α-amino γcarboxyl [1] Poly γ- glutamic acid