BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ Ự TH C PHẨM NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ E COLI CỦA NISIN BẰNG CÁCH KẾT HỢP VỚI HÓA CHẤT VÀ CÁ[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÁC DỤNG ỨC CHẾ E.COLI CỦA NISIN BẰNG CÁCH KẾT HỢP VỚI HÓA CHẤT VÀ CÁC BIỆN PHÁP XỬ LÝ NHIỆT NGUYỄN TIẾN THÀNH HÀ NỘI 2006 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131697651000000 MỞ ĐẦU Thực phẩm, xét phương diện vi sinh, môi trường giàu chất dinh dưỡng thích hợp cho phát triển vi sinh vật Sự nhiễm tạp vi sinh vật lại vô dễ dàng thực phẩm không bảo quản tốt Nhiều biện pháp bảo quản thực phẩm sử dụng như: ướp muối, bảo quản lạnh, lạnh đông, sấy, gia nhiệt, lên men, bổ sung chất bảo quản hoá học kháng sinh… Tuy nhiên phương pháp làm thay đổi giá trị dinh dưỡng giá trị cảm quản thực phẩm để lại dư lượng có nguy gây tác động phụ có hại cho người sử dụng Vì vậy, chất bảo quản có nguồn gốc sinh học không ảnh hưởng tới chất lượng thực an toàn với người cần thiết Một chất có hoạt tính kháng khuẩn, an toàn hữu hiệu bảo quản thực phẩm nisin Nisin có phổ tác dụng rộng với nhiều loại vi khuẩn Gram dương như: Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus đặc biệt số vi khuẩn gây bệnh gây hư hỏng thực phẩm: Clostridium, Bacillus Nisin có chất protein nên dễ dàng bị phân huỷ enzim hệ tiêu hóa, khơng để lại dư lượng gây tượng nhờn thuốc chất kháng sinh y học Ngoài ra, sử dụng nisin bảo quản thực phẩm (đặc biệt sản phẩm đồ hộp) có tính kinh tế tiết kiệm lượng (giảm nhiệt độ và rút ngắn thời gian trùng) cho trình xử lý nhiệt, đảm bảo hiệu kháng khuẩn mà không làm giảm giá trị dinh dưỡng sản phẩm Bên cạnh ưu điểm, nisin có nhược điểm khơng có khả tác dụng tới nấm men, nấm mốc, đặc biệt nhóm vi khuẩn Gram âm E coli, Salmonella…vốn nguyên nhân gây bệnh qua thực phẩm chủ yếu để lại hậu nghiêm trọng cho người Một chất bảo quản thực phẩm đảm bảo phải có khả tiêu diệt ức chế hầu hết vi sinh vật có hại, nhằm tạo sản phẩm an tồn Vì vậy, với nhược điểm chưa khắc phục vậy, việc ứng dụng nisin bảo quản thực phẩm nhiều hạn chế Khả kháng nisin vi khuẩn Gram âm có nhờ cấu tạo thành tế bào Do tác động số yếu tố môi trường pH, hoá chất, áp suất thẩm thấu đặc biệt nhiệt độ, lớp màng tế bào bị suy yếu hư hỏng, vi khuẩn Gram âm trở nên nhạy cảm với nisin Xuất phát từ vấn đề nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu tăng cường tác dụng ức chế E coli nisin cách kết hợp với biện pháp xử lý nhiệt” tiến hành nhằm góp phần tăng cường khả ứng dụng nisin bảo quản thực phẩm CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nisin 1.1.1 Bacterioxin Vi sinh vật nguyên nhân gây bệnh có liên quan tới thực phẩm Ngay ngày đầu tiên, kể từ người ta phát vi sinh vật ảnh hưởng chúng người, người ta tìm cách để kiểm sốt sinh trưởng phát triển vi sinh vật thực phẩm Ngoài biện pháp truyền thống sấy, bảo quản lạnh, trùng, ướp muối… biện pháp khác phổ biến sử dụng chất phụ gia bảo quản thực phẩm Trong chất phụ gia bảo quản thực phẩm, phải kể đến nhóm chất bảo quản có tên gọi bacterioxin Bacterioxin tạo vi khuẩn, chất thường oligo polypeptit có đặc tính tiêu diệt vi khuẩn có quan hệ họ hàng với chủng sản [16] Bacterioxin biết đến colicin - tạo chủng vi khuẩn Gram âm E coli Được phát lần Gratia vào năm 1925, “principe V” sản phẩm chủng E coli để chống lại chủng E coli khác Gratia Fredericq (1946) gọi chất thuật ngữ “colicin”, sau đến năm 1953, Jacob số cộng gọi thuật ngữ “bacterioxin” để protein khả kháng khuẩn Thuật ngữ colicin dùng để nhấn mạnh protein kháng khuẩn tạo vi khuẩn E coli chủng thuộc Enterobacteriaceae [44] Ban đầu, bacterioxin (cũng colicin) định nghĩa protein kháng khuẩn có phổ tác dụng hẹp, hấp phụ lên vị trí đặc biệt bề mặt tế bào Khi phát kháng sinh mới, để dự đốn chất có phải bacterixin hay không, người ta thường xác định chất protein chúng thông qua việc sử dụng enzym proteaza Người ta xác định chất bacterioxin thông qua tiêu chuẩn sau [1] [20]: − Phổ tác dụng hẹp, có tác dụng ức chế với lồi vi khuẩn có quan hệ họ hàng với vi khuẩn sinh − Trong phân tử có phần protein cần thiết cho tác dụng ức chế − Chúng chất gây độc vi khuẩn đối kháng − Để ức chế vi khuẩn nhạy cảm, bacterioxin phải gắn vào chất mang đặc hiệu tế bào nhạy cảm − Vi khuẩn sinh bacterioxin phải tự sinh chất kháng bacterioxin hai phân tử nằm plasmit − Được tổng hợp có tác động qua lại với vi khuẩn đối kháng Bacterioxin gồm nhiều loại khác nhau, bacterioxin vi khuẩn lactic quan tâm hiệu mức độ an toàn chúng Mỗi bacterioxin chọn lọc dùng để chống lại chủng vi khuẩn cụ thể Tuy nhiên, hiệu thực phẩm cịn bị ảnh hưởng nhiều yếu tố khác Bacterioxin vi khuẩn lactic chia thành nhóm (bảng 1.1), nhóm I (lantibiotic) nhóm ý nghiên cứu Bảng 1.1: Bacterioxin vi khuẩn lactic [51] Bacterioxin Chủng sản Phổ tác dụng Kích thước (aa a ) Nhóm I: Lantibiotic Nisin (A Z) Lactococcus lactis Rộng 34 Lacticin 481 Lactococcus lactis Rộng 27 Lactocin S Lactococcus sake Rộng 37 Carnocin U149 Carnobacterium pisicola Rộng 35-37 Variacin Micrococcus varians Rộng 25 Nhóm II: Phi - lantibiotic, kích thước nhỏ, bền nhiệt Lactococcin A Lactococcus lactis Hẹp 54 Lactococcin B Lactococcus lactis Hẹp 47 Lactococcin M Lactococcus lactis Hẹp 48 Mesenterocin 52B Leuconostoc mesenteroides Hẹp 32 Curvaticin FS47 Lactobacillus curvatus TB 31 Sakacin A Lactobacillus sake TBb 41 Sakacin P Lactobacillus sake TB 41 Carnobacterioxin A, B Carnobacterium piscicola TB 53, 48 Pediocin AcH/PA-1 Pediococcus acidilactici TB 44 Leucocin A-UAL-187 Leuconostoc gelidum TB 37 Enterocin 1146/A Enterococcus faecium TB 47 Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola TB 44 Hẹp 333 Bacterioxin giống Pediocin: Nhóm III: Kích thước lớn, bền nhiệt Helveticin J Lactobacillus helveticus Chú thích: : aa: axit amin; TB : Trung bình a b Nhóm lantibotic bao gồm peptit kích thước nhỏ (65 kDa) chứa axit amin bất thường (các axit amin thioete) lanthionin (Lan) L- metyllanthionin (MeLan) số axit amin dehydrat (dehydrated amino acids) 2,3-didehydroalanin (Dha) (do serin khử nước) 2,3didehydrobutyrin (Dhb) (do threonin khử nước) [58] 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu nisin Nisin bacterioxin tạo số chủng vi khuẩn Lactococcus lactis Cho đến này, nisin nghiên cứu nhiều tính chất ứng dụng bảo quản thực phẩm Lịch sử nghiên cứu nisin kéo dài gần thể kỷ qua, kể từ năm 1925, người ta lần phát nisin [20] Khi xem xét bất thường trình xuất phomat tượng lên men diễn chậm hỏng, người ta phát nguyên nhân tượng thực khuẩn thể số chủng vi khuẩn hình cầu có sữa có khả ức chế chủng vi sinh vật khác trình lên men Năm 1928, Rogers Whittier người công bố tác động ức chế nisin sinh Streptococcus lactis (hiện Lactococcus lactis subsp lactis) Lactobacillus bulgaricus [20] Tên nisin Mattick Hirsch (1947) gọi xuất phát từ ý nghĩa “ chất ức chế N” (N inhibitory substance), Lactococcus lactis ban đầu phân vào nhóm N Streptococcus Ban đầu người ta nghiên cứu ứng dụng nisin y học nisin chủ yếu nghiên cứu để ứng dụng vào chống bệnh viêm vú bò sữa [37] Tuy nhiên nhiều nghiên cứu sau nisin khơng thích hợp cho mục đích độ hoà tan thấp pH sinh lý, bị thuỷ phân proteaza hệ tiêu hóa Ngược lại, xuất phát từ ưu điểm: không độc, không kích thích tăng trưởng, có hoạt tính chống Clostridium, nisin trở thành chất bảo quản thực phẩm có hiệu Năm 1951, Hirsch số tác giả khác bắt đầu kiểm tra khả ứng dụng vào thực phẩm nisin Hirch chứng minh: sử dụng chủng vi khuẩn lactic sinh nisin làm giống lên men ban đầu (starter culture) ngăn chặn hư hỏng phomat gây Clostridium botulium [36] Cùng lúc đó, nhiều nhà nghiên cứu khác sử dụng chủng vi khuẩn sinh nisin vào trình lên men phomat để ức chế lên men butyric vi khuẩn gây hư hỏng gây thối phomat [20] Cho tới năm 1957, nisin bắt đầu xuất phân xưởng sản xuất mát quy mô nông trại để bảo quản sản phẩm làm Cũng năm này, hãng Aplin and Barrett đưa chế phẩm thương mại nisin để sử dụng thực phẩm [20] Dạng chế phẩm nisin sẵn có thị trường Nisaplin TM, với thành phần 2,5 % nisin, 77,5 % NaCl sữa gầy [16, 51, 75] Gross Morrell người làm sáng tỏ cấu trúc nisin vào năm 1971 [31] Sau đó, có loại nisin phát thấy xác định tính chất (các loại ký hiệu ký tự từ A đến E Z), loại nisin A dạng hoạt động Mức độ an toàn nisin Người ta thử nghiệm mức độ an toàn nisin loại động vật chuột lợn khẳng định nisin khơng có hại gây ảnh hưởng động vật thí nghiệm [27, 70] Giá trị LD50 động vật thí nghiệm g/kg trọng lượng thể [38] Tổ chức nông lương thực thực phẩm quốc tế, tổ chức y tế giới (FAO/WHO) đồng ý cho phép sử dụng nisin bảo quản thực phẩm từ năm 1969 [15, 16, 20] Hiện nay, nisin nằm danh mục chất phụ gia phép sử dụng với ký hiệu quốc tế E234 Tổ chức FAO/WHO khuyến cáo mức hấp phụ tối đa hàng ngày nisin vào thể cho người nặng 70 kg 60 mg nisin tinh khiết, tương đương với 33000 đơn vị hoạt tính quốc tế [15, 16, 20] Tuy nhiên, Australia, Pháp, Anh, người ta cho phép sử dụng nisin không hạn chế công nghiệp chế biến phomat Ở Mỹ, lượng nisin sử dụng tối đa thực phẩm 10000 đơn vị hoạt tính gam thực phẩm; Nga 8000 đơn vị hoạt tính gam sản phẩm [15] Trong Argentina, Italy Mexico, giới hạn lại thấp, khoảng 500 đơn vị hoạt tính quốc tế gam sản phẩm format chế biến sản phẩm khác [15] Ở Mỹ, quản quản lý thuốc thực phẩm (FDA) cho phép sử dụng bacterioxin nisin phụ gia thực phẩm an toàn (GRAS - generally recognized as safe) Khi chất kháng sinh tự nhiên sử dụng chất bảo quản thực phẩm chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh coi vi sinh vật an toàn (GRAS - generally recognized as safe microorganism) Do vậy, việc sử dụng chủng vi khuẩn sinh nisin lactococci không bị hạn chế [15, 16] Hướng nghiên cứu nisin Hiện nay, nisin sử dụng chất phụ gia thực phẩm an toàn 50 quốc gia giới [20] Tuy nhiên, nghiên cứu nisin diễn liên tục theo số hướng chính: − Nghiên cứu mở rộng tác động nisin với chủng vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, nấm men nấm mốc - vốn có tính kháng nisin điều kiện thông thường − Nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo màng bao gói thực phẩm, thay phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm 1.1.3 Tính chất nisin 1.1.3.1 Cấu trúc nisin Cấu trúc hoàn thiện nisin làm sáng tỏ Gross Morell vào đầu năm 70 Nisin xếp vào nhóm 1: lantibiotics chứa axit amin dị thường [40, 51, 75] Phân tử nisin bao gồm 34 axit amin có số axit amin cải biến Những cải biến khử nước xerin threonin, tạo axit amin dehydroalanin axit amin dehydrobutyrin Các axít amin liên kết với axit amin khác thông qua cầu lưu huỳnh, tạo thành vịng đặc trưng (hình 1.1) [12, 77] Hình 1.1: Cấu trúc phân tử nisin [30, 32] Năm nội vòng phân tử tạo liên kết thioete Trong vịng A 3-7, Ala-S-Ala lanthionine, vòng B, C, D, E tương ứng 8-11, 1319, 23-26, 25-28 β-metyl lanthionine Các vịng A, B, C hợp lại thành nhóm ngăn cách với nhóm cịn lại gồm vịng D E thơng qua axit amin thứ 21 đóng vai trị “bản lề” (hình 1.4) Phân tử nisin khơng chứa axit amin thơm nên không hấp thụ bước sóng 280 nm [6] Các axit amin dị thường đóng vai trị nhóm nhân (nucleophile) xác định thông qua khả phản ứng với mercaptan