Nghiên ứu á saponin triterpenoid ó hoạt tính sinh họ ủa một số ây thuố việt nam

Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Trường đại học bách khoa hà nội ****** ****** LUậN VĂN THạC Sĩ KHOA HọC NGHIÊN CứU SAPONIN TRITERPENOID Có HOạT TíNH SINH HọC Của MộT Số CÂY THUốC Việt nam Ngành: công nghệ sinh học Bùi thị minh giang Người hướng dẫn khoa học: T.S Đỗ THị HOA VIÊN Hµ néi 2006 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17061131580541000000 MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 TỔNG QUAN VỀ CÁC SAPONIN TRITERPENOID II.1.1 Giới thiệu chung saponin II.1.2 Giới thiệu saponin triterpenoid II.1.2.1 Các saponin triterpenoid pentacyclic (5 vòng) II.1.2.2 Các saponin triterpenoid tetracyclic (4 vòng) II.1.3 Các saponin steroid II.1.4 Tính chất hố lý saponin II.1.5 Hoạt tính sinh học ứng dụng saponin II.2 TỔNG QUAN VỀ LOẠI CÂY ĐINH LĂNG II.2.1 Đinh lăng xẻ II.2.2 Đinh lăng tròn II.3 TỔNG QUAN VỀ NGƯU TẤT-CỎ XƯỚC II.3.1 Ngưu tất II.3.2 Cỏ xước II.4 TỔNG QUAN VỀ HAI CÂY TIÊN MAO II.4.1 Tiên mao nhỏ II.4.2 Tiên mao to II.5 TỔNG QUAN VỀ RAU MÁ II.6 CÁC SẢN PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG PHẦN III : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III.1 NGUYÊN LIỆU III.1.1 Đối tượng nghiên cứu III.1.2 Hoá chất thiết bị thí nghiệm III.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III.2.1 Phương pháp chiết cao cồn saponin III.2.2 Phương pháp chiết cao Saponin tồn phần III.2.3 Định tính xác định saponin III.2.4 Phương pháp thuỷ phân, chiết xuất sapogenin III.2.5 Phương pháp sắc kí III.2.5.1 Giới thiệu phương pháp sắc kí III.2.5.2 Phân tích thành phần saponin triterpenoid sapogenin tương ứng dược liệu III.3 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC SAPONIN TRITERPENOID III.3.1 Đối tượng nghiên cứu 4 5 10 10 12 13 13 16 17 17 19 21 21 23 24 26 29 29 29 30 30 30 31 32 33 34 35 38 38 III.3.2 Phương pháp tiến hành III.3.3 Các tiêu nghiên cứu phương pháp định lượng PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN IV.1 QUY TRÌNH CHIẾT CAO SAPONIN TỒN PHẦN IV.1.1 Quy trình chiết cao saponin tồn phần dung mơi cồn IV.1.2 Quy trình chiết cao saponin tồn phần dung mơi n-Butanol IV.1.3 Định tính chất saponin dược liệu IV.1.4 Kết phân tích saponin triterpenoid IV.2 QUY TRÌNH THUỶ PHÂN, CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍCH CÁC SAPOGENIN CỦA CÁC DƯỢC LIỆU IV.2.1 Quy trình thuỷ phân, chiết xuất sapogenin IV.2.2 Kết phân tích sapogenin IV.3 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SAPONIN IV.3.1 Ảnh hưởng cao cồn dược liệu đến trọng lượng thể chuột IV.3.2 Ảnh hưởng cao cồn đến sinh lực chuột thí nghiệm IV.3.3 Ảnh hưởng cao cồn saponin đến quan sinh dục chuột đực (tinh hoàn tuyến tiền liệt) PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ V.1 Về kết nghiên cứu saponin triterpenoid dược liệu V.2 Về kết nghiên cứu hoạt tính sinh học dược liệu V.3 Kiến nghị PHỤ LỤC 38 40 40 41 44 48 53 59 59 63 75 76 78 79 83 85 85 87 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Một số sản phẩm bổ sung dinh dưỡng nước có mặt thị trường Việt Nam Bảng 4.1: kết chiết cao cồn saponin dược liệu Bảng 4.2: kết chiết cao saponin toàn phần từ 10g cao cồn saponin dược liệu Bảng 4.3: kết chiết cao saponin toàn phần từ 100g bột dược liệu Bảng 4.4: kết thí nghiệm tạo bọt cao cồn saponin dược liệu Bảng 4.5: kết thuỷ phân, chiết thu sapogenin từ 1g saponin toàn phần Bảng 4.6: kết thuỷ phân, chiết thu sapogenin từ 100g bột dược liệu Bảng 4.7: kết ảnh hưởng cao cồn saponin đến trọng lượng chuột thí nghiệm Bảng 4.8: kết ảnh hưởng cao cồn saponin đến sinh lực chuột thí nghiệm Bảng 4.9: kết ảnh hưởng cao cồn saponin đến quan sinh dục chuột thí nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Khung Olean Hình 2.2: Khung Usan Hình 2.3: Khung Lupan Hình 2.4: Khung Hopan Hình 2.5: Khung Dammaran Hình 2.6: Khung Lanostan Hình 2.7: Khung Cucurbitan Hình 2.8: Đinh lăng xẻ Hình 2.9: Axit oleanolic Hình 2.10: Đinh lăng trịn Hình 2.11: Cây ngưu tất Hình 2.12: Cây Cỏ xước Hình 2.13: Cấu trúc saponin hạt Cỏ xước Hình 2.14: Cây tiên mao nhỏ Hình 2.15: Cây Tiên mao to Hình 2.16: Cây Rau má Hình 2.17: Saponin triterpenoid Rau má Hình 4.1: Bình chiết ngấm kiệt Hình 4.2: Quy trình chiết cao cồn saponin Hình 4.3: Quy trình chiết saponin tồn phần Hình 4.4: Thí nghiệm tạo bọt cao cồn saponin Đinh lăng trịn mơi trường kiềm axit Hình 4.5: Phản ứng tạo mầu saponin tồn phần Hình 4.6: Bản sắc kí mỏng saponin tồn phần Hình 4.7: Bản sắc kí mỏng saponin tồn phần Rau má Hình 4.8: Sắc kí đồ sắc kí mỏng saponin tồn phần dược liệu Hình 4.9: Sắc kí đồ HPLC saponin Đinh lăng xẻ Hình 4.10: Sắc kí đồ HPLC saponin Đinh lăng trịn Hình 4.11: Sắc kí đồ HPLC saponin Rau má Hình 4.12: Quy trình thuỷ phân, chiết xuất sapogenin Hình 4.13: Bản sắc kí mỏng sapogenin dược liệu Hình 4.14: Sắc kí đồ sắc kí mỏng sapogenin dược liệu Hình 4.15: Sắc kí mỏng điều chế dược liệu Hình 4.16: Phổ hồng ngoại sapogenin Đinh lăng xẻ Hình 4.17: Phổ hồng ngoại sapogenin Đinh lăng trịn Hình 4.18: Phổ hồng ngoại sapogenin rễ Đinh lăng trịn HÌnh 4.19: Phổ hồng ngoại sapogenin thân rễ Tiên mao to Hình 4.20: Phổ hồng ngoại sapogenin thân rễ Tiên mao nhỏ Hình 4.21: Phổ H1-NMR sapogenin Đinh lăng xẻ Hình 4.22: Phổ H1-NMR sapogenin Đinh lăng trịn Hình 4.23: Chuột sau uống cao cồn saponin dược liệu Hình 4.24: Thí nghiệm thời gian bơi gắng sức chuột Hình 4.25: Tinh hồn tuyến tiền liệt chuột thí nghiệm Bïi thÞ minh giang Líp CNSH 2004 PHẦN I: MỞ ĐẦU Trong kỉ 21 ngành khoa học cơng nghệ đặc biệt ý ngành khoa học công nghệ chất bổ sung dinh dưỡng hay gọi thực phẩm chức Các chất bổ sung dinh dưỡng xác định sản phẩm có tác dụng hiệu lực bổ sung, điều chỉnh, nâng cao hoạt động chức phận riêng lẻ thể hay tồn thể mà mục đích giúp thể nâng cao khả miễn dịch, tăng sức đề kháng, tăng sinh lực để phòng chống bệnh tật, chống lại chất oxy hoá, chống lão hoá nhằm nâng cao tuổi thọ cho người Các sản phẩm khơng phải thực phẩm khơng tạo lượng cho thể thuốc khơng có đặc tính hay phản ứng phụ cho người dùng nên sử dụng thường xuyên lâu dài Ngành khoa học công nghệ chất bổ sung dinh dưỡng vừa hình thành phát triển thời gian gần Lúc đầu phát triển Nhật Bản dạng thực phẩm chức (Functional food), sau phát triển rộng rãi ỡ Mỹ, Canada dạng chất bổ sung dinh dưỡng (Nutritional supplements), sau tiếp tục phát triển Tây Âu dạng thực phẩm - thuốc (Nutraceutics) cuối năm lại chúng phát triển toàn giới Nguồn nguyên liệu để sản xuất sản phẩm bổ sung dinh dưỡng đa phần sản phẩm từ thiên nhiên cỏ, động vật cỏ nhiệt đới Đông Nam Á, Đông Á, Châu Phi, Châu đại dương, Châu Mỹ Các nước Bắc Mỹ, Tâu Âu, Nhật phải nhập sản phẩm từ Trung Quốc, Ấn độ, Brazil, Hàn Quốc .v.v.Việt Nam mt nc nhit i vỡ vy cú h luận văn thạc sĩ khoa học ĐH bách khoa hà nội Bùi thÞ minh giang Líp CNSH 2004 động thực vật phong phú đa dạng, có nhiều loại đặc hữu có nhiều tiềm để tham gia vào việc sản xuất sản phẩm bổ sung dinh dưỡng nhằm cung cấp cho nhu cầu tiêu dùng nước có khả xuất sản phẩm sang thị trường Nhật Bản, Bắc Mỹ, Tây Âu Trong nhóm sản phẩm bổ sung dinh dưỡng nhóm sản phẩm thích nghi sinh học sử dụng nhiều Thành phần chủ yếu nhóm saponin, alkaloid, flavonoid, steroid .mà nhóm saponin sử dụng nhiều nhóm saponin triterpenoid Nhóm saponin triterpenoid mà sử dụng nhiều có loại sâm (sâm Triều tiên, sâm Mỹ, sâm Xibêri, sâm Việt Nam, ), sau đến loại khác Tam thất, Ngưu tất, Cam thảo, Rau má Các saponin triterpenoid có tác dụng bổ, tăng lực, tăng khả miễn dịch tăng thích nghi sinh học Ngồi chúng cịn có tác dụng bảo vệ gan, phịng điều trị viêm gan, tác dụng an thần, chống viêm Những nghiên cứu cịn xác định saponin có tác dụng ức chế phòng số bệnh ung thư Xuất phát từ vấn đề chọn nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu saponin triterpenoid có hoạt tính sinh học số thuốc Việt Nam ” Nhằm đưa sở cho việc tiếp cận ứng dụng hoạt chất sản xuất số sản phẩm thực phẩm chức để đáp ứng nhu cầu tăng cường sức kho cho cng ng luận văn thạc sĩ khoa học ĐH bách khoa hà nội Bùi thị minh giang Lớp CNSH 2004 * Đối tượng phạm vi nghiên cứu: - Đối tượng nghiên cứu đề tài sử dụng số thuốc Việt Nam: Đinh lăng xẻ: (Polyscias fruticosa (L) Harm) Đinh lăng tròn: rễ (Polyscias balfouriana Bailey) Ngưu tất: rễ (Achyranthes bidentata Blume) Cỏ xước: toàn (Achyranthes aspera L) Tiên mao to: thân rễ (Curculigo glacilis Hook.f) Tiên mao nhỏ: thân rễ (Curculigo orchioides Gaertn ) Rau má: toàn (Centella asiatica Urb) - Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu phương pháp chiết xuất, định tính, định lượng, phân tích thành phần nghiên cứu số hoạt tính sinh học số saponin * Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài: - Nghiên cứu thành phần saponin có dược liệu, hoạt tính sinh học chúng nhằm đưa sở cho việc tiếp cận ứng dụng hoạt chất sản xuất số sản phẩm bổ sung dinh dưỡng để đáp ứng nhu cầu tăng cường sức khoẻ, phòng bệnh cho cộng đồng Cụ thể góp phần vào đề tài nghiên cứu sản xuất sản phẩm bổ sung dinh dưỡng Dinta (có chứa saponin triterpenoid Đinh lăng xẻ saponin steroid Tật lê) có tác dụng tăng sinh lực Bộ y tế cho phép sử dụng tồn quốc Denton (có chứa saponin triterpenoid rễ Ngưu tất, cao Thạch hộc cao Ba kích) có tác dụng bổ gân cốt chống mệt mỏi Phân viện Công Nghệ Mới - Bảo Vệ Mơi Trường -Bộ Quốc Phịng nghiên cứu, phối hợp với xí nghiệp dược phẩm TW25 sản xuất Sẽ đưa vào sản xuất sản phẩm bổ sung dinh dưỡng từ saponin Rau má với tên Masapon công ty dược phm Savipharm-TPHCM sn xut luận văn thạc sĩ khoa học ĐH bách khoa hà nội Bùi thị minh giang Líp CNSH 2004 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 TỔNG QUAN VỀ CÁC SAPONIN TRITERPENOID II.1.1 Giới thiệu chung saponin (2, 4, 6,19,37,42) - Saponin hay gọi Saponosid chữ la tinh sapo = xà phịng (vì tạo bọt xà phịng), nhóm glucosid lớn Saponin thường gặp thực vật, chúng có mặt 90 lồi thực vật có mặt số động vật Hải sâm, Sao biển - Đa số saponin có vị đắng trừ số như: glycyrhizin có Cam thảo bắc, abruosid Cam thảo dây có vị - Saponin tan nước nóng, rượu etylic, tan ete, aceton, người ta thường dùng chất để kết tủa saponin - Saponin khó bị thẩm tích người ta dựa vào tính chất để tinh chế saponin q trình chiết suất - Saponin tạo bọt nhiều lắc mạnh với nước, bền mơi trường nước có đầu ưa nước đầu kị nước, tính chất đặc trưng saponin - Cũng giống glucosid khác thuỷ phân dung dịch axit lỗng nóng enzym, saponin bị thuỷ phân tạo phần đường phần không đường gọi aglycon sapogenin (37): Saponin = Đường (glycon) + sapogenin (aglycon) - Phần glycon saponin glucose, arabinose, xylose axit glucosonic Còn phần sapogenin thay đổi nhóm saponin khác Dựa vào cấu trúc phần sapogenin người ta chia cỏc saponin luận văn thạc sĩ khoa học ĐH bách khoa hà nội Bùi thị minh giang Lớp CNSH 2004 thành hai nhóm : Saponin triterpenoid Saponin steroid Saponin triterpenoid có loại trung tính loại axit cịn saponin steroid có loại trung tính loại kiềm - Các saponin thành phần quan trọng nhiều vị thuốc nam, thuốc Trung y số thuốc tân dược II.1.2 Giới thiệu saponin triterpenoid (4,19,42) - Các Saponin tritterpenoid phổ biến giới thực vật, phần nhiều hai mầm chiếm hầu hết saponin tìm thấy tự nhiên - Các Saponin triterpenoid tác dụng với antimoin triclorua dung dịch chloroform soi đèn tử ngoại cho huỳnh quang mầu xanh (4) - Các saponin triterpenoid glucosid mà phần sapogenin có cấu trúc triterpen với 30 nguyên tử C (cacbon) dựa vào số vòng cấu tạo khung người ta chia saponin triterpenoid thành hai loại: Các saponin triterpenoid pentacyclic saponin triterpenoid tetracyclic II.1.2.1 Các saponin triterpenoid pentacyclic (5 vịng) - Loại gồm nhóm : Olean, Ursan, Lupan, Hopan (2,4,6,13,19,20) a Nhóm Olean (I): Phần lớn saponin tự nhiên thuộc nhóm Phần aglycon thường có vịng thường dẫn chất 3-β hydroxy olean 12-ene, tức β-amyrin Một vài aglycon làm ví dụ: Axit oleanolic: R = R = R = R = -CH , R = -COOH Hederagenin: R = R = R = -CH , R = -CH OH, R = -COOH - Mạch đường nối vào vị trí C theo dây nối acetal, có mạch đường nối vào vị trớ C 28 theo dõy ni este luận văn thạc sĩ khoa học ĐH bách khoa hà nội