Nghiên ứu công nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hoá angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với cơ chất là đậu tương

Hà nội, ngày 24 tháng 11 năm 2008 H ên ọc vi Trang 9 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích RAAS Renin Angiotensin- Aldosterol system hệ thống Renin-Angiotensin Aldosterol - ACEI

-

NGUYÔN THÞ PH¦¥NG TH¶O

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc tính của enzym chuyển Angiotensin 3

2.1.1 Giới thiệu về enzym chuyển Angiotensin (ACE) trong cơ thể người 3

2.1.2 Cấu trúc hóa học của ACE 4

2.1.3 Đặc tính enzym của ACE 6

2.2 Giới thiệu về các peptit ức chế enzym chuyển Angiotensin (ACEIP) 6

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu ACEI 7

2.2.2 Cơ chế hoạt động của ACEI 8

2.2.3 Phân loại ACEIP 10

2.2.3.1 ACEIP tổng hợp hóa học 10

2.2.3.2 ACEIP tổng hợp tự nhiên 13

2.3 Công nghệ sản xuất ACEIPs 14

2.3.1 Sản xuất ACEIP theo con đường hóa học 14

2.3.2 Sản xuất ACEIP từ nguồn tự nhiên 14

2.3.2.1 Sản xuất ACEIP từ protein động vật 15

2.3.2.2 Sản xuất ACEIP từ nguồn protein thực vật 19

2.3.2.3 Sản xuất ACEIP từ vi khuẩn lactic 23

2.3.2.4 Tình hình sử dụng peptit ức chế ACE trên thế giới 28 2.4 Lên men tổng hợp ACEIP từ protein đậu tương sử dụng chủng

2.4.2 Các hợp phần của protein đậu tương 30

2.4.3 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis 32

Phần III: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 33

3.1 Nguyên liệu 33

3.1.1 Chủng giống vi sinh vật 33

3.1.2 Hóa chất 33

3.1.3 Thiết bị 33

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 34

3.2 Phương pháp nghiên cứu 36

3.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactic 36

3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế ACE 36

3.2.3 Phương pháp so sánh khả năng tạo ACEIP của chủng lactic với các chủng Bacillus subtilis 38

3.2.4 Phương pháp xác định protein tổng (BSA) 38

3.2.5 Phương pháp xác định peptit tổng 38

3.2.6 Tối ưu các điều kiện lên men theo phương pháp cổ điển 39

3.2.6.1 Tối ưu nhiệt độ 39

3.2.6.2 Tối ưu hàm lượng đường 39

3.2.6.3 Tối ưu hàm lượng protein 39

3.2.6.4 Tối ưu pH 40

3.2.7 Tối ưu các điều kiện lên men theo thuật toán sử dụng ma trận DOEHLERT 40

3.2.8 Tinh sạch enzyme 42

3.2.8.1 Phương pháp lọc dòng ngang 42

3.2.9 Phương pháp sấy phun sản phẩm 44

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp ACEIP 45

4.2 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh ACEIP cao 45

4.3 Định tên sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic đượclựa chọn 46

4.4 So sánh khả năng tạo ACEIP của chủng vi khuẩn lactic với các chủng của Bacillus subtilis 52

4.5 Lên men kết hợp chủng vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 với các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 53

4.6 Tối ưu điều kiện lên men theo phương pháp cổ điển 55

4.6.1 Tối ưu hàm lượng đường 55

4.6.2 Tối ưu nhiệt độ 58

4.6.3 Tối ưu hàm lượng protein 61

4.6.4 Tối ưu pH 64

4.7 Tối ưu điều kiện lên men theo thuật toán sử dụng ma trận DOEHLERT 65

4.8 So sánh khả năng kìm hãm ACE trước và sau khi tối ưu 71

4.9 Tinh sạch enzym 72

4.9.1 Loại những phân tử kích thước lớn 73

4.9.2 Kết quả điện di Protein 74

4.10 Sản phẩm dạng sấy phun 76

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Study on producing angiotensin converting enzyme inhibitory peptides

using traditional fermented microorganisms from soybean

Abstract

Nowadays, hypertention is a significant health problem in the world

It is one of the major controllable factors, which associated with cardiovasscular disease event such as myocardial infarction, heart failture, and end- stage diabetes and is the main cause of many death in the western countries

In this study, we isolated and screened microorganisms from traditional fermented food such as lactic acid bacteria, from fermented vegestable and yoghourt, and Bacillus subtilis from fish sauce and Natto Among 13 strains lactic acid bacteria, DC2 were selected Comparison angiotensin converting enzyme inhibitory activity between DC2 lactic acid bacteria and 2 strains Bacillus subtilis Bacillus subtilis, TH2 was selected with ACEI (%) = 50,00% Combination using Bacillus subtilis TH2 and the yeast Saccharomyces cerevisiae 28 showed higher ACEI (%) =58.33% The study also showed that the potential using soy bean is a good source for producing ACEIP The optimum incubation condition for producing were investigated with traditional method and algorithm The optimum condition for ACEIP were pH of 6.5, incubation time of 48h, at 30oC, protein 10 mg/ml and glucose 20 g/l The purified peptide showed inhibitory activity of 95% The molecular weight of ACEIP is less than

3000 Da

Nghiên cứu công nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hoá angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với cơ chất là protein

đậu tương Tóm tắt

Ngày nay bệnh cao huyết áp là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu Nó là một nhân tố chính gây nên các bệnh về tim mạch, thậm chí sẽ dẫn tới nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não và cũng là nguyên nhân gây tử vong cao tại các nước phương tây

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập và lựa chọn nhiều loại

vi sinh vật từ thực phẩm lên men truyền thống Như vi khuẩn lactic từ dưa chua và sữa chua Bacillus subtilis từ nước mắm và natto Trong số 13 loại

vi khuẩn lactic, DC2 được lựa chọn So sánh hoạt tính ức chế enzym chuyển hóa angiotensin của vi khuẩn lactic DC2 và 2 loại Bacillus subtilis, Bacillus subtilis TH2 đã được chọn và cho hoạt tính ức chế ACE là 50,00% Kết hợp sử dụng Bacillus subtilis TH2 và nấm men Saccharomycs cerevisiae 28 cho hoạt tính ức chế ACE cao hơn đạt 58.33% Nghiên cứu

đã cho thấy rằng đậu tương lên men là một nguồn có tiềm năng tốt cho hoạt tính ức chế ACE Chúng tôi đã tối ưu điều kiện nuôi cấy theo phương pháp

cổ điển và thuật toán Điều kiện nuôi cấy tối ưu để tạo ra peptit có khả năng kháng huyết áp từ TH2 là: pH 6.5 trong 48 giờ, tại 30oC Với hàm lượng protein là 10 mg/ml Hàm lượng đường glucoza là 20 mg/ml Tinh sạch peptit cho tỷ lệ ức chế ACE là 95% Peptit có hoạt tính ức chế ACE được xác định có kích thước nhỏ hơn 3 KDa

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Hà nội, ngày 24 tháng 11 năm 2008

Học viên

Nguyễn Thị Phương Thảo

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghi n cứu luận ăn khoa họcê v

c tôủa i Các ết quả nghi n cứu k ê trong luận văn hoàn to trung th , các àn ực

thông số ết quả k tính to án được là ho àn chàn to ính x và ác chưa được công

b b k côố ở ất ỳ ng tr h nghiìn ên cứu ào khác n

Hà nội, ngày 24 tháng 11 năm 2008

H ên ọc viNguyễn Thị Phương Thảo

ACEIP Angiotensin I converting enzyme inhibitor peptides (peptit ức chế

enzym chuyển angiotensin I

ACE Angiotensin I converting enzyme (enzym chuyển hóa angiotensin I) BSA Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

Da Dalton

BW Body weight (trọng lượng cơ thể)

IC50 50% inhibitory concentration (mg/ml) (nồng độ ức chế 50% hoạt tính

ACE)

f Fracment (đ ạno )

Km Michaelis Menten constant (hằng số Michaelis Menten)

MWCO Molecular weight cut off (cut off trọng lượng phân tử)

MRS De Man, Rogosa, Sharpe (môi trường MRS)

SBP Systolic blood pressure (áp suất máu tâm thu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số ACEI tổng hợp hóa học đang được dùng

trong điều trị bệnh cao huyết áp trên thị trường và giá trị IC50 của chúng

132

Bảng 2.2 Một số enzym thương phẩm được dùng để thủy phân

whey protein

15

Bảng 2.3 Những peptit cho hoạt tính ức chế ACE từ nước sốt

cá được lên men

huyết áp của người

28 Bảng 2.10 Giá trị sinh học của protein đậu tương 30

Bảng 2.11 Tỷ lệ và đặc trưng của các đoạn protein hòa tan trong

nước của đậu tương

Bảng 4.1 Kết quả phân lập chủng lactic từ dưa chua 45 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng giống vi khuẩn

lactic cho hoạt tính kìm hãm ACE cao nhất

Bảng 4.5 Khả năng kìm hãm ACE của TH2 khi kết hợp với

các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của hàm lượng protein đến sự sinh

trưởng và phát triển của chủng TH2+28

62

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của chủng 64 Bảng 4.11 Liệt kê các biến và khoảng chạy của chúng 66 Bảng 4.12 Kết quả tối ưu theo ma trận DOEHLERT 67

Bảng 4.14 Khả năng ức chế ACE trước và sau khi tối ưu 72 Bảng 4.15 Khả năng kìm hãm ACE trước và sau khi tinh sạch 73 Bảng 4.16 Đặc tính của sản phẩm sau khi sấy phun 77

Hình 2.3 Cấu trúc và hình dáng của ACE từ huyết tương, tế

bào soma và tế bào sinh dục, biễu diễn trung tâm hoạt động, vị trí gắn kẽm, các vùng N và C kinin,

5

Hình 2.4 Liên kết giữa angiotensin I và trung tâm hoạt động

của ACEI

6

Hình 2.5 Liên kết giữa Captopril và trung tâm hoạt động của

ACE – cơ chế kìm hãm hoạt tính ACE của ACEI

6

Hình 2.6 Mô hình liên kết trong phản ứng giữa peptit kìm

hãm ACE (Leu-Gly Pro) và trung tâm hoạt động của ACE

-6

Hình 2.7 Giá tiền sau 28 ngày xử lý bằng thuốc ức chế ACE

có trên thị trường

13

Hình 2.8 Sự thay đổi trong áp suất tâm thu (SBP) và áp suất

tâm trương (DBP) của chuột sau khi xử lý trong 8 tuần với nguồn sữa Calpis

27

Hình 2.9 Những loại thực phẩm chức năng chứa peptit ức chế

ACE đang có mặt trên thị trường hiện nay

29

Hình 4.1 Sự thay đổi trong áp suất tâm thu (SBP) và áp suất

tâm trương (DBP) của chuột sau khi xử lý trong 8 tuần với nguồn sữa Calpis

48

Hình 4.2 Đồ thị khảo sát khả năng ACEI của các chủng lactic 50 Hình 4.3 Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau của

chủng DC2

50

Hình 4.4 Khả năng sử dụng đường của chủng DC2: 1

Glucoza, 2 Saccaroza, 3 Lactoza, 4 Galactoza, 5

Hình 4.7 Đồ thị so sánh khả năng ức chế ACE của chủng

lactic DC2 với các chủng Bacillus subtilis

54

Hình 4.8 Đồ thị khảo sát khả năng kìm hãm ACE khi kết hợp

với các chủng nấm men

56

Hình 4.9 Đồ thị khảo sát ảnh hưởngcủa hàm lượng đường đến

khả năng tạo peptit

Hình 4.13 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng protein

tới khả năng tạo peptit của chủng

64

Hình 4.14 Đồ thị khảo sát hàm lượng peptit tại các giá trị pH

khác nhau

65 Hình 4.15 Mối liên hệ giữa hàm Y và các biến 69

Hình 4.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH khi cố định hàm

lượng đường 23,27 g/l và hàm lượng protein 12,18 mg/ml

70

Hình 4.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ và hàm lượng đườngkhi cố

định hàm lượng pH =7,0 và hàm lượng protein 12,18 mg/ml

71

Hình 4.18 Khả năng ức chế ACE trước và sau khi tối ưu 72 Hình 4.19 So sánh hoạt lực kìm hãm ACE trước và sau khi lọc 74 Hình 4.20 Kết quả điện di sản phẩm trên SDS-PAGE kiểm tra

mức độ sạch của sản phẩm

75

Hình 4.21 Chế phẩm thô sau khi sấy phun chứa peptit ức chế

ACE sử dụng vi sinh vật là Bacillus subtilis TH2 với cơ chất là protein đậu tương

77

M Ở ĐẦU

Hi ện nay cao huyết áp được biết là một trong những chứng ệnh bnguy hiểm làm ảnh ưởng đến ột phầ ư dâ h m n t n số toàn ầu Nó là tác nh n c âchính gây n n các ệnh v ê b ề tim mạch và cũng là nguy n nh n của nhiều ê â

trường hợp t ử vong tại c n c ác ướ phương t Theo con sây ố ống kê ên thế th tr

giới ện nay có hơn một t hi ỷ người m bắc ệnh cao huyết áp (chiếm khoảng 15%), ở Việt Nam con s n là ố ày 16% [2]

Khi bị cao huyết áp, bệnh nhân sẽ thường dẫn đến nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não thường gây tử vong Bệnh được chữa trị bằng nhiều phương pháp và loại thuốc đặc hiệu cho cơ chế gây cao huyết áp Phương pháp phổ biến hiện nay là dùng thuốc ức chế enzym chuyển hóa angiotensin (ACEI) như Captopril, Enalapril…Tuy nhiên thuốc đã biểu hiện nhiều tác dụng phụ khi bệnh nhân sử dụng thuốc, như gây hạ huyết áp, chóng mặt, choáng váng Ngoài ra còn một số tác dụng phụ khác như nổi mề đay, tăng nồng độ Kali huyết thanh, giảm chức năng của thận ở những bệnh nhân bị suy tim, hạ Natri huyết hoặc tình trạng giảm thể tích Phù mạch hiếm khi xảy ra nhưng hay gặp hơn ở bệnh nhân da đen sử dụng ACEI Các chất ức chế ACE

có thể gây ho khan do thuốc có khả năng ảnh hưởng đến tổng hợp prostaglandin ở phổi, bệnh thường xuất hiện trong 10 30% số bệnh nhân - điều trị), gây quái thai (khi mang thai sử dụng ACEI), viêm da…, [60; 73]

Do những tác dụng phụ như vậy, nên thuốc có chứa peptit ức chế enzym chuyển hóa angiotensin được tổng hợp bằng nguồn tự nhiên đã rất được quan tâm, nghiên cứu Và nhóm sản phẩm này đã được công nhận là không thể thiếu trong điều trị bệnh cao huyết áp và được xếp hàng đầu trong điều trị suy tim ứ đọng mãn tính Có thể dùng nhiều năm mà không gây tác dụng phụ Theo thống kê của [61] thì hiện nay đã có rât nhiều sản phẩm có chứa peptit ức chế ACE được sử dụng hàng ngày như một loại thực phẩm

chức năng, đồ uống (sữa Calpis), những người bình thường có thể sử dụng các loại thực phẩm này mà không hề có một ảnh hưởng nào[23, 56]

T ại Việt Nam ố người ị ệnh cao huyết áp s b b và tim mạch ngày àng cgia tăng Hiệ nay đã có mn ột số nghi n cứu ề việc ử ụng những nguồnê v s d

t ự nhi n để ạo peptit c khả ăng ức chế ACE (ACEIP) 2, 59 , Nhữngê t ó n [ ]nghiên cứu n ày đã mang lại k ết quả rất ả quan trong việc tạo ACEIP để kh

s dử ụng cho những ệnh nh n bị cao huyết áp b â

Do tính ấp ách tr n, chúng i đã tiến ành thực hiện đề ài:

“Nghiên cứu công nghệ thu nhận peptit có khả năng kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với cơ chất là protein đậu tương”

Mục tiêu của đề tài:

• Tìm được chủng giống vi sinh vật có khả năng tạo ACEIP cao nhất

• L ựa chọn đ ều kiện n men thích ợp nhất để thu nhận ACEIP i lê h nhiều ất Từ đó nh tiến ành tinh sạch và t h ạo ra chế phẩm chứa peptit kìm

hãm ACE dùng đ ều trị ệnh cao huyết áp i b

Nội dung đề tài:

1 Phân lập, định t n cê ác ch ủng lactic từ ưa chua c d ó khả ă n ng kìm

hãm enzym chuyển h a angiotensó in và đem so sánh hoạt tính ức chế ACE

v c ới ác chủng lactic hiện có

2 So sánh khả ă n ng kìm hãm ACE của chủng lactic lựa ch có ọnhoạt lực k hìm ãm ACE cao nhất ới các loại Bacillus subtilis v

3 L ựa chọn i đ ều kiện ônu i cấy thích ợp h nhất để chủng ống l gi ựa

chọn có ả ăkh n ng kìm hãm ACE cao nhất bằng 2 phương ph : cổ điển và ápquy hoạch thực nghiệm

4 Tinh sạch ACEIP, Sau đó t ạo ra chế phẩm có chứa ACEIP và

Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Enzym chuyển hóa enzym angiotensin (ACE)

2.1.1 Giới thiệu về enzym chuyển Angiotensin (ACE) trong cơ thể người

Cao huyết áp hiện nay là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tỷ lệ tử vong khá cao, nhất là những người lớn tuổi Lý do của sự gia tăng huyết áp này là do hoạt động của ACE trong hệ thống Renin Angiotens- in-Ald terol os(RAAS) và h ệ thống Kalikrein- kinin

* Hoạt động của ACE trong hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS)

Hệ thống này được hoạt hóa khi áp suất máu giảm, thận của chúng ta

sẽ tiết ra renin là một enzym protease Enzym này sẽ xúc tác chuyển hóa angiotensinogen có trong gan thành angiotensin I Lúc này tại bề mặt của phổi và màng trong của thận sẽ tiết ra enzym ACE có tác dụng chuyển hóa Angiotensin I thành Angiotensin II sẽ kích thích hệ thần kinh trung ương, đồng thời nó còn tiết ra một loại hormon là aldosteron từ vỏ thượng thận Aldosteron có vai trò giữ natri, tiết kali và làm tăng quá trình giữ nước Sự gia tăng này làm cho thể tích chất lỏng trong cơ thể tăng lên  gia tăng áp suất máu gây cao huyết áp, [72]

* Hoạt động ủa ACE trong hệ thống kallikrein- kinin c

Khi áp suất máu trong cơ thể tăng lên ệ thống n s h ày ẽ được hoạt

hó La úc này trong cơ thể sẽ tiết ra enzym kallikrein làm cho kininogen có chủ yếu trong gan bị thủy phân tạo ra bradykinin là chất có khả năng gây giãn mạch mạnh do nó giải phóng NO dẫn đến làm hạ huyết áp Khi đó dưới tác dụng của ACE sẽ làm bất hoạt bradykinin áp suất máu tăng lên

gây cao huyết áp, [72 ]

Hình 2.2: ACE xúc tác tạo thành Angiotensin II hoạt động từ

Angiotensin I, đồng thời làm vô hoạt bradykinin, [72]

2 .2 Cấu trúc hóa học của ACE trong cơ thể người

Trong cơ thể người ACE tồn tại ở 2 dạng chủ yếu là ACE soma và ACE sinh dục, cả 2 dạng này đều được mã hóa bởi cùng một vùng gen trên nhiễm sắc thể 17 tại q23; hứa 26 exon và 25 intron Đoạn dài hơn là C ACE soma với 1302 amino axit, được phiên mã từ exon 1 12 và 14 26 Đoạn - -

mã từ exon 13- P26 romoter của ACE soma nằm trong vùng 5’ của exon đầu tiên, còn ACE sinh dục nằm bên trong vùng intron 12 [75]

ACE soma được tìm thấy trên bề mặt trong của phổi, thận, ruột, nhau thai, đám rối của tràng mạch Nó được cộng hợp bởi 2 vùng là vùng N và vùng C Mỗi vùng đều có một kiểu gắn kẽm đặc thù, có tâm hoạt động là His Glu- -X-X-His Trong đó, hai histidin sẽ cung cấp 2 trong số 3 ligand kết hợp kẽm và nhóm cacboxyl của glutamat là một nguồn cho điện tử cho phản ứng xúc tác [ ] 75

ACE sinh dục chỉ có duy nhất trong bộ phận sinh dục, nó tương ứng với vùng C của ACE soma, có một tâm hoạt động và chỉ có một kiểu gắn kẽm, [55]

Gần đây đã có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ACE trong huyết tương của người và tại màng trong là một metalloprotease với sự kết hợp chính trong mức độ phân hủy protein Bradykinin và làm bất hoạt peptit angiotensin I [ ] 75

Hình 2.3: Cấu trúc và hình dáng của ACE từ huyết tương, tế bào soma và tế bào sinh dục, biễu diễn trung tâm hoạt động, vị trí gắn kẽm, các

vùng N và C [60]

2.1.3 Đặc tính enzym của ACE

Đặc tính enzym của ACE là nó hoạt động với tư cách là dipeptyl cacboxypeptidase có khả năng giải phóng dipeptit đầu C từ các cơ chất có một nhóm cacboxyl tự do cuối cùng ACE ưu tiên phân cắt những

cơ chất có các amino axit kị nước tại vị trí thứ 3 từ dưới lên và có ít ái lực với những cơ chất có các amino axit dicacboxylic đầu C (Glu, Asp) hoặc với prolin ở vị trí cuối cùng [ ]16 Theo cơ chế này, nó sẽ xúc tác việc phân cắt angiotensin I thành peptit gây co mạch angiotensin II và làm bất hoạt các peptit gây giãn mạch như Bradykinin và kallidin

Mức độ thủy phân angiotensin I và Bradykinin của 2 vùng N và C là khác nhau, vùng C đòi hỏi nồng độ ion clo cao hơn để hoạt động tối ưu, đặc tính này được tạo nên do arginin có trong vùng Tại 2 vùng, i lực liên kết ávới một vài chất ức chế ACE là khác nhau, ví dụ với enalapril thích hợp liên kết tại vùng C, trong khi ramipril lại bị cản trở ở cả 2 vùng

2.2 Peptit ức chế enzym chuyển angiotensin (ACEIP)

Hiện nay bệnh cao huyết áp được biết là một trong những chứng bệnh nguy hiểm làm ảnh hưởng đến một phần tư dân số trên toàn cầu Khi ,

bị cao huyết áp sẽ dẫn đến nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não và gây

tử vong Các nhà khoa học đã xác định rằng sự hoạt động của enzym ACE

là nguyên nhân chính gây cao huyết áp Vì vậy một hướng mới , trong nghiên cứu là tìm ra loại thuốc mà có khả năng kìm hãm enzym này và c ácpeptit ìm k hãm ACE đã được nghiên cứu Chúng có thể làm giảm tử vong

và giảm nguy cơ vào viện do suy tim Những xu hướng thuận lợi như nhồi máu cơ tim, đột tử hoặc tử vong do loạn nhịp tim, đột quỵ và tắc nghẽn mạch máu Ngoài ra những chất ức chế ACE còn làm giảm quá trình phát

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu ACEIP

Lịch sử của peptit ức chế enzym chuyển angiotensin (ACEI ) bắt Pđầu nǎm 1954, khi tầm quan trọng của enzym ACE được thừa nhận lần đầu Nǎm 1968, hợp chất đầu tiên có khả nǎng ức chế chuyển angiotensin I

thành angiotensin II được tách chiết từ nọc rắn Nǎm 1980, aptopril trở Cthành chất ức chế enzym chuyển angiotensin đầu tiên được phép sử dụng trên lâm sàng

Từ khi Captopril, một dẫn xuất của prolin được tổng hợp và xác định

có hoạt tính chống cao huyết áp thì có rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để tạo ra những chất ức chế ACE bằng con đường hóa học như Enalapril, Benazepril, Lisinopril…Hiện nay có ít nhất 40 chất ức chế ACE được tổng hợp hóa học Tuy nhiên nhược điểm của các ACEIP tổng hợp theo con đường hóa học là chúng đã gây ra những tác dụng như ho khan (xuất hiện trong 10 30% số bệnh nhân điều trị)- , gây quái thai (khi mang thai sử dụng ACEI), viêm da…, [60; 73]

Vì những nhược điểm như trên, nên ngay từ những năm 1980 xu hướng tạo ra các ACEI có nguồn gốc tự nhiên đã diễn ra mạnh mẽ.P Nghiên cứu đã được thực hiện trên rất nhiều nguồn protein khác nhau Như các nhà khoa học Nhật Bản đã sử dụng nguồn nguyên liệu rất sẵn có ở đất nước họ để tìm ra ACEIP Nghiên cứu sớm nhất là c t ủa ác giả Kawwamura vào năm 1989, ô ng đã thành công với cá mòi, cá ngừ khô thịt , lợn [ ] 59

Sau đó hầu hết các nhà khoa học của nhiều nước trên thế giới như

Mỹ, Trung Quốc, Đài Loan… đã chú ý nhiều đến nguồn protein thực vật (đậu tương, ngô…) và các protein sữa, fomat,…

Các sản phẩm chống cao huyết áp có nguồn gốc tự nhiên này được thử nghiệm lâm sàng nhiều lần trên chuột cao huyết áp tự phát, hiện nay đã thử nghiệm thành công trên người, [14, 23, 50, 61, 66]

2.2.2 Cơ chế tác dụng của ACEIP

Theo Cushman và Ondentti [61] thì ACE có tâm hoạt động chứa

Zn2+ ACEI là chất kìm hãm cạnh tranh, nó gắn vào tâm hoạt động của ACE làm giảm khả năng liên kết giữa ACE và cơ chất của nó (angiotensin

I, bradykinin) ngăn không cho ACE thủy phân angiotensin I tạo thành angiotensin II cũng như ngăn chặn sự bất hoạt bradykinin nên dẫn đến hạ huyết áp và làm ổn định huyết áp

Nghiên cứu về cấu trúc của những peptit có tác dụng kìm hãm ACE cho thấy tripeptit đầu cacbon đã góp phần lớn nhất vào việc gắn các peptit này vào tâm hoạt động của ACE và chuỗi tripeptit đầu cacbon tốt nhất để gắn vào tâm hoạt động đó là Phe-Ala-Pro Những axit amin này tạo ra một

sự tác động qua lại lớn nhất với các vị trí thứ cấp s1, s’1, s’2 tại tâm hoạt động của ACE [Hình 2.4, 2.5, 2.6] Đặc tính kỵ nước và ưa nước của peptit cũng là một nhân tố quan trọng tác động đến hoạt tính ức chế Tính ưa nước của peptit cao thường làm cho khả năng kìm hãm thấp hoặc không có khả năng kìm hãm ACE do nó làm cho peptit không thể tiến đến trung tâm hoạt động của ACE được Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ACE rất ưa các

cơ chất có chứa các amino axit kị nước tại vị trí cacbon tận cùng [61]

Hình 2.4: Liên kết giữa angiotensin I và trung tâm hoạt động của ACEI [61]

Hình 2.5: Liên kết giữa Captopril và trung tâm hoạt động của ACE –

Hình 2.6: Mô hình liên kết trong phản ứng giữa peptit kìm hãm ACE

(Leu-Gly Pro) và trung tâm hoạt động của ACE [ ] - 55

2.2.3 Phân loại ACEIP

2.2.3 .1 ACEI tổng hợp hóa học P

C ác ACEIP tổng ợp h hóa học được sử dụng phổ biến trên khắp thế giới ACEIP được tổng hợp hóa học dựa trên cấu trúc của ACEI tự nhiên P Đầu thập niên 1970, Cushman và Ondetti, làm việc tại viện nghiên cứu Squibb đã sáng chế thuốc Teprotide là loại thuốc tiêm chống ACE Những nghiên cứu sau đó đưa đến việc thiết kế thuốc uống chống ACE đầu tiên là

Captopril

Dựa trên cấu trúc phân tử người ta chia các chất kìm hãm ACE thành

3 nhóm lớn sau [73]

* Các ACEI có chứa Sulfhydryl

Tiêu biểu là Captopril

Công thức phân tử: C9H15NO3S

Công thức cấu tạo

Trọng lượng phân tử: 217.29 g/mol

Captopril là chất ức chế ACE đầu tiên được phép sử dụng trên lâm sàng, nó có tác dụng chống cao huyết áp mạnh, với thời gian ngắn Tuy nhiên việc sử dụng thuốc đã gây ra những phản ứng có hại Được cho là do

sự có mặt của nhóm sulfhydryl trong phân tử captopril, do các phản ứng tương tự như giảm bạch cầu trung tính, protein niệu, phát ban, rối loạn vị giác đã xảy ra khi điều trị bằng các hợp chất khác có chứa nhóm sulfhydryl (penicillamin) Ngoài ra khi chuyển bệnh nhân dùng captopril sang dùng

giảm được phản ứng này ở một số bệnh nhân Tuy nhiên, giảm liều sử dụng captopril tối đa hằng ngày từ 450mg/ngày xuống còn 150mg/ngày cũng giảm được tỷ lệ bị phản ứng này, [61, 73]

• Các ACEI có chứa Dicarboxylat

Captoril có một số đồng phân an toàn hơn, ít gây ảnh hưởng phụ hơn

do chúng không có nhóm Sulfhydryl, đang được sử dụng rất phổ biến hiện nay như Enalapril, Lisinopril, Peridopril, Ramipril, Quinapril, Bennazepril

Trong đó Enalapril là thuốc ức chế ACE được dùng nhiều trong điều trị suy tim ứ huyết do kết quả của nhiều thử nghiệm lớn được công bố năm 1991- 1992 đã chứng minh tác dụng có ích trên tử suất, Enalapril hiện này được thừa nhận là thuốc đầu bảng trong điều trị bệnh suy tim ứ huyết

Công thức phân tử là C20H28N2O5

Công thức cấu tạo

Trọng lượng phân tử: 372 g/mol

* Các ACEI có chứa Phosphat

Có 1 thành viên duy nhất là: Fossinopril (Monopril)

Công thức phân tử: C30H46NO7P

Trọng lượng phân tử: 563.663 g/mol

Công thức cấu tạo

Nhược điểm: Các loại ACEI được tổng hợp hóa học có thể gây nên những tác dụng phụ khi sử dụng như gây hạ huyết áp, chóng mặt, choáng váng Ngoài ra còn một số tác dụng phụ khác như nổi mề đay, tăng nồng độ Kali huyết thanh, giảm chức năng của thận ở những bệnh nhân bị suy tim,

hạ Natri huyết hoặc tình trạng giảm thể tích Phù mạch hiếm khi xảy ra nhưng hay gặp hơn ở bệnh nhân da đen sử dụng ACEI Các chất ức chế ACE có thể gây ho khan do thuốc có khả năng ảnh hưởng đến tổng hợp prostaglandin ở phổi Điều này có thể gây khó khăn cho việc theo dõi chính xác liệu pháp chất ức chế ACE trong điều trị suy tim, [73]

Hiệu quả ức chế của các loại ACEI tổng hợp hóa học là khác nhau Bảng 2.1 cho thấy hiệu quả ức chế ACE của các ACEI khác nhau Với Ramiprilat cho hoạt lực kìm hãm cao nhất do nồng độ cần để ức chế 50% ACE (IC50) chỉ cần 0.7nM, trong khi sử dụng Enalapril thì cần tới 4645nM

Tên thương mại của các ACEI

Hình 2.7 Giá tiền sau 28 ngày xử lý bằng thuốc ức chế ACE có trên :

2.2.3 .2 ACEI có nguồn gốc tự nhiên P

ACEIP có nguồn ốc ự nhi n là những pepti ức chế ACE thu được g t ê t nhờ quá trình thủy phân những protein thực phẩm như: protein động vật, protein thực vật và protein sữa

Năm 1967, nhà khoa học John Vane và nhà khoa học Segio Ferreira Brasil đã phát hiện ra pepti từ nọc rắn ở vùng nam Mỹ Bothrops raraca t Ja

có thể ức chế sự phân hóa bradykinin bằng cách làm bất hoạt enzym bradykinase Năm 1968, người ta biết thêm nọc rắn cũng ức chế enzym chuyển angiotensin I thành angiotensin II [4] Những peptit này chứa từ 3 đến 15 amino itax , và hầu hết chúng đều có một trình tự có đầu cacbon là Ala-Pro hoặc Pro Pro Có nhiều những thử nghiệm lâm sàng trên người và -chuột bị bệnh cao huyết áp tự phát đã chứng minh rằng ACEIP từ nguồn tự nhiên rất an toàn, kinh tế hơn nhiều so với dùng thuốc được tổng hợp theo con đường hóa học Ngoài ra nó còn không gây bất kỳ một ảnh hưởng phụ nào cho dù phải sử dụng thuốc trong một thời gian dài, [14, 23, 56, 64] Ngay cả khi người sử dụng thuốc không phải là bệnh nhân bị cao huyết áp,

thuốc cũng không gây giảm huyết áp, [23] Điều này đã mang lại ý nghĩa rất quan trọng trong việc sử dụng phổ biến ACEIP từ nguồn tự nhiên, sử dụng như một nguồn thực phẩm hằng ngày mà không hề gây tổn hại về mặt sức khỏe cho người tiêu dùng

Chính vì vậy mà ACEIP từ nguồn tự nhiên rất được quan tâm nghiên cứu và sản xuất trong những năm gần đây

Hiện nay ACEIP được sản xuất theo hai cách chính: đó là tổng hợp hóa học và sản xuất từ các nguồn protein tự nhiên

2.3 Công nghệ sản xuất ACEIP

2.3.1 Sản xuất ACEIP bằng cách tổng hợp hóa học

Các chất ức chế ACE tổng hợp hóa học đều dựa trên trình tự những chuỗi pepti có khả năng kìm hãm ACE của protein thực phẩm t được sử dụng nhiều trên thế giới trong nhiều năm qua

Tuy nhiên do những nhược điểm của thuốc khi sản xuất theo con đường này như chóng mặt, choáng váng, nổi mề đay, ho khan… Nên gần đây những ACEI sản xuất từ nguồn protein tự nhiên đã thu hút nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu và các nhà sản xuất do những lợi thế của nó đem lại Như sản xuất ACEI từ các protein tự nhiên sẽ cho một giá thành thấp hơn so với khi tổng hợp hóa học và đặc biệt ACEI thu được từ các protein tự nhiên có tính an toàn cao, không gây độc, gây phản ứng phụ đối với người sử dụng do nó là nguồn protein thân thiện với con người

2.3.2 Sản xuất các ACEI từ nguồn tự nhiên P

Các ACEIP có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn protein khác nhau như từ protein động vật: sữa, cá, côn trùng…, từ protein thực vật như gạo, ngô, đậu tương, khoai…bằng vi sinh vật như vi khuẩn lactic, hayBacillus subtilis

2.3.2.1 Sản xuất ACEIP từ protein động vật

Các nguồn protein động vật rất phong phú, chúng được biết là nguồn sinh peptit kìm hãm ACE hiện nay như protein sữa, protein trứng, protein thịt…

• Từ nguồn Protein sữa

Trong nguồn protein sữa (sữa bò, dê, sữa tách béo, sữa bột, sữa đặc)

có chứa các peptit được biết là có khả năng kìm hãm ACE Các pepti này t chủ yếu có trong cấu trúc protein của casein (αs, β, γ, κ -casein) và protein sữa gầy (α-lactalbumin, β lactoglobulin, lactoferrin, và immunoglobulins) -[12, 30] ACEIP có thể được giải phóng bằng cách thủy phân enzym hoặc lên men vi khuẩn nhờ vào hệ thống tiêu hóa hoặc trong quá trình chế biến , thực phẩm Với quá trình thủy phân bằng enzym, ta có thể dùng một loại protease hoặc kết hợp sử dụng các protease với nhau như trypsin, alcalase, chymotrypsin, carboxypeptidase, pancreatin, pepsin và các enzym có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc nấm mốc (proteinase K từ Tritirachium album) Khi sử dụng enzym thủy phân đã cho hoạt lực ức chế ACE rất cao, thể hiện trong bảng 2.2, ACEI (%) dao động từ 56.7 đến 98.6 % Trong đó đạt cao nhất là thermolysin với ACEI (%) = 98.6%, tiếp đến là proteinase K với ACEI% = 95.7% [9]

Bảng 2.2: Một số enzym thương phẩm được dùng để thủy phân whey protein, [30]

Enzym thương phẩm Hoạt tính ức chế ACE (%)

Các ACEIP được tìm thấy nhiều trong dịch lên men sữa bởi vi khuẩn lactic như Lactococcus lactis subsp cremoris, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus GG strain, Lactobacillus delbruskii subsp Bulgaricus [36, 40, 42]

Lượng ACEIP tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện nuôi

c và ấy chủng giống như loại vi sinh vật sử dụng, môi trường lên men, thời gian thủy phân…Với các sản phẩm có thời gian thủy phân ngắn như sữa chua và pho mát tươi, hoạt tính kìm hãm ACE thấp, trong khi đó với pho mát có thời gian làm chín dài hơn thì hoạt tính kìm hãm ACE cao hơn

nhiều [42]

Những peptit này ngoài khả năng ức chế ACE, chúng còn có thêm nhiều khả năng khác như β casokinins (từ α, β- -casein) có khả năng chống cao huyết áp và điều khiển miễn dịch; Lactoferricin (f17-41 lactoferrin) có khả năng kháng khuẩn; Casomorphins (từ α, β-casein) và α-casein exorphin (f90-96 của αs-casein) cho hoạt tính opioid …[63]

• Từ nguồn protein trứng

Trứng là một nguồn thực phẩm rất bổ dưỡng, quen thuộc và rất được

ưa thích Trong thành phần của trứng chứa hàm lượng protein rất cao Ngoài ra Protein trứng còn là một nguồn giàu ACEIP Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng protein trứng cho khả năng tạo ra ACEIP, trong đó nổi bật là nghiên cứu [42] Hai ông đã thủy phân ovalbumin của trứng với chymotripsin và pepsin Hoạt tính ức chế ACE đã được tìm thấy, các peptit

có khả năng làm giãn mạch có trình tự chuỗi peptit là RADHPF (f359 đến f364 của ovalbumin), và ovokinin (FRADHPFL, từ f358 đến 365 của ovalbumin) được phân lập từ chymotriptic và peptic của ovalbumin

• Protein thịt: protein gà, protein cơ lợn

Thịt gà được biết làm một nguồn có thể sinh ACEIP Theo Korhonen

và Pihlanto, 2003, [36] Các ông đã thủy phân protein thịt gà nhờ enzym thermolysin Hoạt tính ức chế ACE đã được tìm thấy trong sản phẩm này,

và 2 peptit có khả năng chống cao huyết áp đã được phát hiện có trình tự là Ile-Lys Trp và Leu Lys Pro- - -

• Protein cá và hải sả

[Theo nhiều nghiên cứu trên đối tượng cá 28 45, , 60] đã phát hiện được: Cá là nguồn protein có khả năng tạo ACEIP như thịt cá mòi, ịtth cá cơm, thịt cá ngừ và da cá Pollack Alaska Các enzym khác nhau được sử dụng để tạo ACEIP trong nghiên cứu của [28] Peptit LKP NM được tách ra -

từ sự thủy phân của enzym thermolysin trên cá ngừ khô đã cho hoạt tính ,

ức chế ACE cao gấp 8 lần hoạt tính ức chế ACE tự bản thân nó, và hiệu quả kéo dài sau khi uống Hoặc với cá mòi, sau 17h thủy phân bởi enzym protease kiềm của Bacillus licheniformis đã cho hoạt tính ức chế ACE mạnh (IC50=0.015mg protein/ml), với khả năng giảm huyết áp sau 4 tuần

sử dụng cho bệnh nhân bị cao huyết áp

Theo nghiên cứu [60] nước sốt cá được lên men cũng là một nguồn cho ACEIP, trình tự của những peptit này đã được xác định thể hiện trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Những peptit cho hoạt tính ức chế ACE từ nước sốt cá :

được lên men, [60]

Trình tự peptit Đối tượng IC50hoặc % ức chếAla- Pro

560

* Protein côn trùng

Sữa ong chúa (RJ), một sản phẩm giàu protein từ ong, cũng được nghiên cứu và được công nhận là nguồn để tạo thành các peptit kìm hãm ACE Matsui và cộng sự, 2002, [50] đã phát hiện ra rằng sữa ong chúa ban đầu và đoạn protein của nó không thể hiện hoạt tính ức chế ACE Tuy nhiên, sau khi thủy phân với pepsin và sau đó là trypsin và chymotrypsin, sữa ong chúa đã thể hiện hoạt tính ức chế ACE cao với IC50 =0.099mg protein/ ml

Bảng 2.4: Một số ACEIP thu được từ nguồn protein động vật [2]

Thịt lợn

-549.0 66.6 207.4

-0.5 6.0

2.3.2.2 Sản xuất ACEI từ protein thực vậtP

ACEIP đã được sản xuất từ nguồn protein thực vật như: gạo, ngô, đậu tương, lúa mạch, lúa mì bằng cách dùng các enzym thủy phân hay lên men truyền thống Những enzym tham gia vào quá trình thủy phân protein

từ những nguồn này thường là các protease như alcalase, trypsin, chymotrypsin và pepsin ACEIP tạo ra thường được đem phân tách bởi hệ thống siêu lọc hoặc nhựa trao đổi cation ACEIP tạo ra thường phụ thuộc vào nguồn protein, enzym sử dụng, điều kiện lên men… Tùy vào enzym sử

dụng mà cơ chất protein đậu tương sẽ tạo ra peptit có khả năng kháng khuẩn, peptit kháng ung thư hay peptit có hoạt tính ức chế ACE [58] ACEIP sản xuất từ nguồn nguyên liệu thực vật được nghiên cứu và phát triển nhiều nhất tại Nhật Bản và Hàn Quốc Theo nghiên cứu [49] đã tách được 16 peptit có khả năng ức chế ACE với giá trị IC50 thấp hơn 20mM, chúng được cấu tạo từ 2 đến 7 aminoaxit từ dịch thủy phân mầm lúa mỳ Ile-Val yr được xác định là peptit đóng vai trò quan trọng trong sự ức chế -TACE của dịch thủy phân Dựa trên dữ liệu phân tích trình tự peptit có khả năng ức chế ACE, prolamin gạo được xem là một trong những tiền chất tốt nhất của peptit kháng huyết áp, [21] Những peptit ức chế ACE như LQP, LLP, LSP, LAA, FY cũng được tìm thấy trong dịch thủy phân thermolysincủa đạm ngô [60]

Theo nghiên cứu [47] Bột kiều mạch cũng thể hiện hoạt tính ức chế ACE với giá trị IC50 là 3.0 mg/ml Sau khi thủy phân với pepsin, chymotripsin, và trypsin, hoạt tính ức chế ACE đã tăng lên rõ rệt (IC50 là 0.14 mg protein/ml so với trước khi thủy phân (0.36 mg protein/ ml) Trình

t ự peptit được ác định x có khả ăng ức chế ACE l Gln yr n à -T và Pro erS

Asn Gln - (IC50=14µM), Phe Phe Leu (IC- - 50 =37µM), và Ile-Tyr Leu Leu - (IC50 =42mM) Những đ ạn peptit đó đã được đem thử m sang tr n chuột o lâ ê

-bằng đường ống ới liều ử ụng u v s d là 2.0 g/kg B , kết quả ủa thử nghiệmW c cho thấy huyết cáp ủa chuột b ị ảm gi đi so với đối chứng Những peptit

chống cao huyết c áp òn được ìm thấy trong đậu t t ương khi sử ụng d enzym alcalase [ ]58 Huyết táp âm thu củachuột đã giảm đi đáng ể khi sử ụng, k dtuy nhi n cê ác peptit ày ại kh ng làm ảnh ưởng đến huyết áp ủa những n l ô h c con chuột có huyết báp ình thường dù s dử ụng liều cao nhất (1000 mg/kg

BW/ngày) Đây là một phát hiện ất r có ý nghĩa trong việc phổ biến những

thực phẩm chứa peptit ức chế ACE, về ức độ an toàn ủa thuốc đối ới m c v

người s dử ụng Tiếp đó là nghiên cứu của Kodera và Nio [41] đã tạo ra các peptit từ đậu tương có hoạt tính kìm hãm ACE và sản phẩm có mùi vị dễ chịu 5 pepti có khả năng kìm hãm ACE dưới đây được tạo ra trongt quá trình thủy phân protein đậu tương nhờ protease D3: (1) Tyr-Val Val Phe -Lys, (2) Pro-Asn Asn Lys Pro Phe - - - Gln, (3) Asn-Trp Gly Pro Leu Val, (4) - -Ile-Pro Pro Gly Val Pro Tyr Trp Thr và (5) Thr Pro Arg Val Ph- - - e

S ản phẩm đậu ương l n men là nguồn chứa các peptit chống bệnh t êcao huyết áp ất r tuyệ ời C pt v ác eptit kìm hãm ACE được tìm thấy từ nhiều sản phẩm lên men đậu tương sử dụng môi trường có Bacillus Natto hoặc B subtilis có thể chiết được một vài peptit kìm hãm ACE như Val Ala His -Ile-Asn Val Gly Lys hay Tyr Val Trp Lys [40] Sản phẩm đậu tương n - - - lêmen truyền trống ở châu Á cũng là nguồn thu ACEIP như bột đậu tương (His His- -Leu), soy sauce, natto, và tempeh [29, 54] chunggugjang, một , sản phẩm đậu tương truyền thống của Hàn quốc được lên men bởi Bacillus subtilis CH-1023 [42 điều kiện lên men tối ưu để tạo ra peptit có khả năng ],kìm hãm ACE từ chunggugjang là 60 giờ, tại 40oC, dịch chiết được tinh sạch bởi màng cutoff kích thước 3KDa và sắc ký lọc gel sephadex G-10 và

G-25, sau quá trình tinh sạch ACEI%= 94.3%, trình tự peptit là Al Phea- His [ ] 17

-Bảng 2.5: Khả năng ức chế ACE của một số loại protein thực vật [57]

Kitts và Weiler

2003 Protein đậu

tương biến

đổi gen

Proteinase S, alcalase;

Protein hoa

hướng

dương

xử lý với pepsin và pancreatin

sự 2004

Bảng 2.6: Giá trị IC50 của một số sản phẩm lên men từ đậu tương [56]

Tên sản phẩm IC50 (mg/ml)

Dịch lên men của hỗn hợp

đậu tương và mỳ (Soy sauce)

Tofuyo: Sản phẩm lên men từ đậu phụ sủ dụng Aspergillus oryzae (Sản phẩm này được sản xuất và đưa ra thị trường bởi hãng Nippon như một loại thức ăn kiêng chống béo phì)

Soy sauce: dịch lên men giữa đậu tương và bột mỳ

Những sản phẩm này được dùng nhiều ở các nước châu Á, nhưng gần đây các nước phương Tây đã chú trọng hơn đến các loại sản phẩm lên men từ thực vật này

2.3.2.3 Sản xuất ACEI từ vi khuẩn lactiP c

Một số peptit kìm hãm ACE được tách chiết từ sản phẩm được lên men, phổ biến là từ sữa Hệ thống thủy phân của vi khuẩn lactic có thể góp phần vào việc giải phóng các peptit có hoạt tính sinh học [44]

Hiện nay các vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong sản xuất thực phẩm chức năng và thuốc chữa bệnh, đặc biệt là trong sản xuất

ACEIP để điều trị cao huyết áp Theo báo cáo 26 thì có khoảng 26 giống [ ]

vi khuẩn lactic, chủ yếu thuộc Lactococcus lactic và Lactobacillus

helveticus đã được nghiên cứu là có khả năng tạo ra một sản phẩm lên men có hoạt tính ức chế ACE

+ pepsin và trypsin β casein, κ– -casein Tyr Pro PheVal-- Pro Tyr Pro-- -Pro, Ala-- - Gln -

Vi khuẩn axit lactic Lactobacillus helveticus là một nguồn tạo những peptit ức chế ACE chính Đây là vi sinh vật có hoạt tính protease

và peptidase So với các vi khuẩn axit lactic khác, sữa lên men từ dòng L helveticus cho hoạt tính ức chế ACE cao hơn và có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả giảm áp suất máu Xa hơn, sữa được lên men cho hoạt tính

ức chế ACE cao hơn biểu hiện sự phát triển tốt hơn của vi khuẩn axit lactic, đồng thời mức độ giảm pH lớn hơn, hàm lượng peptit và hoạt tính protease cao hơn [66]

Dựa trên rất nhiều nghiên cứu cả chuột lẫn những người tình nguyện, cho thấy một kết quả khả quan trong việc sử dụng ACEIPs từ protein sữa lên men bởi vi khuẩn lactic

Nghiên cứu trên đối tượng chuột

* Một số lượng lớn nghiên cứu trên chuột thể hiện ảnh hưởng của protein sữa đến huyết áp của chuột, bảng 2.8 thấy rằng huyết áp tâm thu chuột giảm từ 2 34mmHg, đồng thời ta thấy được mối quan hệ giữa sự - giảm huyết áp tâm thu với giá trị IC50 như với β Casein đoạn f(169 175) - -

có IC50= 1000µmol/l, huyết áp tâm thu đo được là giảm cao nhất 31.5 mmHg

Bảng 2.8: Casein sữa chuyển peptit kháng huyết áp trên chuột, [56]

* Sữa Calpis là sản phẩm sữa lên men bởi 2 dòng vi sinh vật là L helveticus và Saccharomyces cerevisiae, được lên men trong 24 giờ, tại 37oC cho hàm lượng peptit ức chế ACE cao, những peptit như Val-Pro Pro và Ile- -Pro Pro - được tạo ra bởi protease ngoại bào của Lactobacillus helveticus dưới hoạt động của một số enzym peptidase trong suốt quá trình lên men [65] Cả nguồn sữa Calpis và những peptit chiết tách được đều thể hiện ảnh hưởng kháng huyết áp Khi kiểm tra lâm sàng trên chuột thấy rằng áp suất máu giảm ít nhất là 20 mmHg sau 4 8 giờ cho uống với liều dùn- g là 5 ml/ kg

BW từ sữa Calpis và 0.6 mg V -al Pro Pro/kg BW và 0.3 mg Il- e-Pro-Pro/ kg