Nghiên ứu công nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hoá angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với cơ chất là đậu tương

bộ giáo dục đào tạo trờng đại học bách khoa hµ néi - NGUYễN THị PHƯƠNG THảO NGHIấN CU CễNG NGHỆ THU NHẬN PEPTIT KÌM HÃM ENZYM CHUYỂN HỐ ANGIOTENSIN TỪ VI SINH VẬT LÊN MEN TRUYỀN THỐNG VỚI CƠ CHT L U TNG 23.04.3898 luận văn thạc sĩ khoa học ngành : công nghệ sinh học NGI HNG DN KHOA HỌC: TS Trần Liên Hà Hµ Néi - 2008 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205019431000000 MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình PHẦN I: MỞ ĐẦU PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc tính enzym chuyển Angiotensin 2.1.1 Giới thiệu enzym chuyển Angiotensin (ACE) thể người 2.1.2 Cấu trúc hóa học ACE 2.1.3 Đặc tính enzym ACE 2.2 Giới thiệu peptit ức chế enzym chuyển Angiotensin (ACEIP) 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu ACEI 2.2.2 Cơ chế hoạt động ACEI .8 2.2.3 Phân loại ACEIP 10 2.2.3.1 ACEIP tổng hợp hóa học 10 2.2.3.2 ACEIP tổng hợp tự nhiên 13 2.3 Công nghệ sản xuất ACEIPs 14 2.3.1 Sản xuất ACEIP theo đường hóa học 14 2.3.2 Sản xuất ACEIP từ nguồn tự nhiên 14 2.3.2.1 Sản xuất ACEIP từ protein động vật 15 2.3.2.2 Sản xuất ACEIP từ nguồn protein thực vật 19 2.3.2.3 Sản xuất ACEIP từ vi khuẩn lactic 23 2.3.2.4 Tình hình sử dụng peptit ức chế ACE giới 28 2.4 Lên men tổng hợp ACEIP từ protein đậu tương sử dụng chủng Bacillus subtilis TH2 30 2.4.1 Protein đậu tương .30 2.4.2 Các hợp phần protein đậu tương 30 2.4.3 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis 32 Phần III: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 33 3.1 Nguyên liệu .33 3.1.1 Chủng giống vi sinh vật 33 3.1.2 Hóa chất 33 3.1.3 Thiết bị 33 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 34 3.2 Phương pháp nghiên cứu 36 3.2.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactic 36 3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế ACE .36 3.2.3 Phương pháp so sánh khả tạo ACEIP chủng lactic với chủng Bacillus subtilis 38 3.2.4 Phương pháp xác định protein tổng (BSA) 38 3.2.5 Phương pháp xác định peptit tổng .38 3.2.6 Tối ưu điều kiện lên men theo phương pháp cổ điển 39 3.2.6.1 Tối ưu nhiệt độ .39 3.2.6.2 Tối ưu hàm lượng đường .39 3.2.6.3 Tối ưu hàm lượng protein 39 3.2.6.4 Tối ưu pH .40 3.2.7 Tối ưu điều kiện lên men theo thuật toán sử dụng ma trận DOEHLERT 40 3.2.8 Tinh enzyme 42 3.2.8.1 Phương pháp lọc dòng ngang 42 3.2.8.2 Phương pháp lọc qua màng cut off 42 3.2.8.3 Phương pháp điện di protein 43 3.2.9 Phương pháp sấy phun sản phẩm 44 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp ACEIP .45 4.2 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh ACEIP cao 45 4.3 Định tên sơ chủng vi khuẩn lactic lựa chọn 46 4.4 So sánh khả tạo ACEIP chủng vi khuẩn lactic với chủng Bacillus subtilis 52 4.5 Lên men kết hợp chủng vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 với chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 53 4.6 Tối ưu điều kiện lên men theo phương pháp cổ điển 55 4.6.1 Tối ưu hàm lượng đường 55 4.6.2 Tối ưu nhiệt độ 58 4.6.3 Tối ưu hàm lượng protein 61 4.6.4 Tối ưu pH 64 4.7 Tối ưu điều kiện lên men theo thuật toán sử dụng ma trận DOEHLERT 65 4.8 So sánh khả kìm hãm ACE trước sau tối ưu 71 4.9 Tinh enzym 72 4.9.1 Loại phân tử kích thước lớn 73 4.9.2 Kết điện di Protein 74 4.10 Sản phẩm dạng sấy phun 76 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Study on producing angiotensin converting enzyme inhibitory peptides using traditional fermented microorganisms from soybean Abstract Nowadays, hypertention is a significant health problem in the world It is one of the major controllable factors, which associated with cardiovasscular disease event such as myocardial infarction, heart failture, and end- stage diabetes and is the main cause of many death in the western countries In this study, we isolated and screened microorganisms from traditional fermented food such as lactic acid bacteria, from fermented vegestable and yoghourt, and Bacillus subtilis from fish sauce and Natto Among 13 strains lactic acid bacteria, DC2 were selected Comparison angiotensin converting enzyme inhibitory activity between DC2 lactic acid bacteria and strains Bacillus subtilis, Bacillus subtilis TH2 was selected with ACEI (%) = 50,00% Combination using Bacillus subtilis TH2 and the yeast Saccharomyces cerevisiae 28 showed higher ACEI (%) =58.33% The study also showed that the potential using soy bean is a good source for producing ACEIP The optimum incubation condition for producing were investigated with traditional method and algorithm The optimum condition for ACEIP were pH of 6.5, incubation time of 48h, at 30 oC, protein 10 mg/ml and glucose 20 g/l The purified peptide showed inhibitory activity of 95% The molecular weight of ACEIP is less than 3000 Da Ngun ThÞ Phơng Thảo Công nghệ sinh học Nghiờn cu cụng nghệ thu nhận peptit kìm hãm enzym chuyển hố angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với chất protein đậu tương Tóm tắt Ngày bệnh cao huyết áp vấn đề sức khỏe mang tính tồn cầu Nó nhân tố gây nên bệnh tim mạch, chí dẫn tới nhồi máu tim, tai biến mạch máu não nguyên nhân gây tử vong cao nước phương tây Trong nghiên cứu này, phân lập lựa chọn nhiều loại vi sinh vật từ thực phẩm lên men truyền thống Như vi khuẩn lactic từ dưa chua sữa chua Bacillus subtilis từ nước mắm natto Trong số 13 loại vi khuẩn lactic, DC2 lựa chọn So sánh hoạt tính ức chế enzym chuyển hóa angiotensin vi khuẩn lactic DC2 loại Bacillus subtilis, Bacillus subtilis TH2 chọn cho hoạt tính ức chế ACE 50,00% Kết hợp sử dụng Bacillus subtilis TH2 nấm men Saccharomycs cerevisiae 28 cho hoạt tính ức chế ACE cao đạt 58.33% Nghiên cứu cho thấy đậu tương lên men nguồn có tiềm tốt cho hoạt tính ức chế ACE Chúng tơi tối ưu điều kiện nuôi cấy theo phương pháp cổ điển thuật tốn Điều kiện ni cấy tối ưu để tạo peptit có khả kháng huyết áp từ TH2 là: pH 6.5 48 giờ, 30 oC Với hàm lượng protein 10 mg/ml Hàm lượng đường glucoza 20 mg/ml Tinh peptit cho tỷ lệ ức chế ACE 95% Peptit có hoạt tính ức chế ACE xác định có kích thước nhỏ hn KDa Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phơng Thảo Công nghệ sinh học Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Trần Liên HàGiảng viên phòng vi sinh kỹ thuật di truyền Viện Công Nghệ Sinh Học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn giảng viên, cán phòng, bạn sinh viên phòng vi sinh kỹ thuật di truyền, phịng hóa sinh tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè ln động viên, ủng hộ giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Hà nội, ngày 24 tháng 11 năm 2008 Học viên Nguyễn Thị Phương Thảo Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phơng Thảo Công nghệ sinh học Li cam đoan Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn khoa học Các kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực, thơng số kết tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Hà nội, ngày 24 tháng 11 năm 2008 Học viên Nguyễn Thị Phương Thảo Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phơng Thảo Công nghệ sinh học DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích RAAS Renin- Angiotensin- Aldosterol system (hệ thống Renin-Angiotensin Aldosterol) ACEI Angiotensin I converting enzyme inhibitor (chất ức chế enzym chuyển angiotensin I) ACEIP Angiotensin I converting enzyme inhibitor peptides (peptit ức chế enzym chuyển angiotensin I ACE Angiotensin I converting enzyme (enzym chuyển hóa angiotensin I) BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) Da Dalton BW Body weight (trọng lượng thể) IC50 50% inhibitory concentration (mg/ml) (nồng độ ức chế 50% hoạt tính ACE) f Fracment (đoạn) Km Michaelis Menten constant (hằng số Michaelis Menten) MWCO Molecular weight cut off (cut off trọng lượng phân tử) SDS- sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis (điện PAGE di gel acrylamid) SHR FAPGG Spontaneously hypertensive rat(s) (tiến hành huyết áp chuột) Furanacryloy- L- phenylalaninylglycylglycine MRS De Man, Rogosa, Sharpe (môi trường MRS) SBP Systolic blood pressure (áp suất máu tâm thu Luận văn thạc sỹ khoa học 2006 - 2008 Nguyễn Thị Phơng Thảo Công nghệ sinh học DANH MC CÁC BẢNG Bảng Tên bàng Trang Bảng 2.1 Một số ACEI tổng hợp hóa học dùng 132 điều trị bệnh cao huyết áp thị trường giá trị IC50 chúng Bảng 2.2 Một số enzym thương phẩm dùng để thủy phân 15 whey protein Bảng 2.3 18 Những peptit cho hoạt tính ức chế ACE từ nước sốt cá lên men Bảng 2.4 Một số ACEIP thu từ nguồn protein động vật 19 Bảng 2.5 Khả ức chế ACE số loại protein thực 22 vật Bảng 2.6 Giá trị IC 50 số sản phẩm lên men từ đậu 23 tương Bảng 2.7 ACEIP từ protein sữa vi khuẩn lactic 24 Bảng 2.8 Casein sữa chuyển peptit kháng huyết áp chuột 26 Bảng 2.9 Ảnh hưởng sữa lên men peptit sữa đến 28 huyết áp người Bảng 2.10 Giá trị sinh học protein đậu tương Bảng 2.11 Tỷ lệ đặc trưng đoạn protein hòa tan 30 31 nước đậu tương Bảng 3.1 Phương pháp đo hoạt tính kìm hãm ACE theo Otte, 37 Zakora, Shalaby Bng 3.2 Ma trn DOEHLERT Luận văn thạc sỹ khoa häc 41 2006 - 2008