Sau khi tối ưu được i đ ều ện ôki nu i cấy ồm g nhiệt độ, pH, hàm lượng đường và hàm lượng protein, chúng tôi đem so sánh hoạt tính ACE với đối chứng là trước khi tối ưu, chúng tôi đã thu được kết quả sau.
Nhìn vào bảng 4.14 và hình 4.18 chúng tôi nh ận thấy ằng r có s ựthay đổi đáng k v ể ề khả ă n ng ức chế ACE của mẫu trước và sau khi t ưu. Sau ối khi tối ưu điều ện ôi cấy, ACEI (%) đ được là ki nu o 80,49 %, cao h n hơ ẳn so với trước khi tối ưu l 58,33 %. Qua bà ảng trên cũng cho thấy s k h ự ết ợp
giữa vi khuẩn TH2 và nấm men 28 đã cho kết ả kìqu m hãm ốt hơn khi sử t dụng đơn giống. Kết quả ày ph hợp với nghiê n ù n cứu 37, 62]. Theo [ nghiên cứu n ày chỉ ra rằng điều ện ôi cấy, chủng ống có ki nu gi ảnh ưởng h quyết định t ớikhả ă n ng kìm hãm ACE.
Bảng 4. : Khả năng ức chế ACE trước và sau khi tối ưu14
Chủng giống ACEI (%)
TH2 50
TH2+28 trước khi tối ưu 58,33 TH2+28 sau khi tối ưu 80,49
20 40 60 80 100
ACEI (%)
TH2 TH2+28 trước khi tối ưu
TH2+28 sau khi tối ưu
Chủng giống
Hình 4.18: Khả năng ức chế ACE trước và sau khi tối ưu
4.9 Tinh sạch ACEIP
Để tinh sạch ACEIP, chúng tôi đã tiến hành cho dịch sau l n men ê qua các thiết b có ị khả ă n ng loại những â ử kph n t ích thước lớn trong mẫu
Theo nhiều nghiên cứu [61, 63 cho th] ấy rằng ACEIP có kích thước càng bé ì th khả ăng kìm ãm ACE càng cao, dao động ừ 3 5 KDa. V n h t - ì vậy, chúng tôi đã cho dịch thủy ph n qua máy ọc òng ngang để loại ỏâ l d b những chất có kích thước phân tử >10 KDa. Sau đó, tiếp ục l s t ấy ản phẩm sau dòng ngang đem cut off với kích thước loại 3KDa. Nhữngchất có kích thước >3KDa ẽ ị ại ừs b lo tr , và em điện di sản ph m trêđ ẩ n SDS PAGE. -
4.9.1. Loại những phân tử kích thước lớn
Dịch sau l n men, chúng i đem lọc òng ngang v cut off loạiê tô d à những ân tử kph ích thước lớn. Sau đó đem đo hoạt ín ức t h chế ACE của c m n . K ác ẫu ày ết quả qu trình àm ạch được thể hiện trong bảng 4.1 á l s 5
Bảng 4.1 : Khả năng kìm hãm ACE trước và sau khi tinh sạch5 Mẫu Thể tích lọc Thể tích thu hồi ACEI (%) Dịch thủy phân 100ml 95ml (sau ly tâm) 80,49
Lọc dòng ngang 100ml 70ml 87,92
Cut off 3KDa 500àl 45àl 95,00
70 80 90 100
ACEI (%)
Dịch thủy phân Lọc dòng ngang Cut off 3KDa Mẫu giống
Hình 4.19: So sánh hoạt lực kìm hãm ACE trước và sau khi lọc
T bừ ảng 4.1 chúng ôi thấy ằng khả ăng kìm ãm ACE tăng l n 5 t r n h ê sau mỗi lần lọc. Khi lọc òng ngang loại những ph n tử d â có kích thước
>10KDa đã cho ACEI (%) l 87,92 % so với trước à khi lọc là 80,49 %. Khi qua cut f 3 KDa, hoof ạt l ực ức chế ă t ng lên đáng k ể đạt 95,00 % Điều n . ày chứng t rỏ ằng những peptit c khả ăng ứcó n chế ACE nằm trong khoảng 3KDa.
Như vậy, khi sử dụng Bacillus subtilis đã cho kết quả rất tốt trong việc t ạo ra ACEIPs để phòng ng ừa bệnh cao huyết áp, Khả ă n ng kìm hãm ACE cao hơn so với kết quả nghi n cứu ủa ác ê c t giả Lê Thị Thanh Ngân [3]
khi sử dụng vi khuẩn axit lactic Lactobacillus Bulgaricus k h v nết ợp ới ấm men Saccharomyces cerevisiae.
4.9.2. Điện di SDS-PAGE
Đểbiết được sản phẩm của mình có sạch hay kh ng, chúng i đem ô tô tiến hành đ ện di trê i n SDS PAGE. - Chúng tô điện di với cường độ di òng điện là 30A và điện là áp 85v.
K ết quả đ ện di được thể hiện ở ình 4.20 i h
Hình 4.20: Kết quả điện di sản phẩm trên SDS-PAGE kiểm tra mức độ sạch của sản phẩm.
Nhìn v hào ình M: Marker chuẩn 1: dịch sau lên men 2: dịch qua dòng ngang 3: dịch sau cut off 3 KDa.
Nhìn v hào ình 4.20, chúng i nhận ấy r tô th ằng ới m à d v ẫu 1 l ịch thủy phân ban đầu, nên còn r ất nhiều protein tạp thể ện hi ở ếng gi 1. Tại ẫu m 2, là m ẫu sau khi qua lọc òng ngang loại những chất d có kích thước ph n tử > â 10 KDa, nhìn v hào ình vẽ, ta thấy ằng ố ạch ên mẫu 2 đã b r s v tr ị loại ớt b nhiều, chứng t ỏ những protein kích thước ớn ơ l h n 10 KDa đã b ị loại trừ.
Nhìn v m ào ẫu 3, là m ẫu sau khi chúng i đem cut off kích thước < 3 KDa, tô chúng tôi thấy ằng ẫu 3 chỉ òn r m c chứa ột v m ạch duy nh , do ất đã qua cut off 3 KDa, nên chúng tô ó i c thể khẳng định vạch ày n có kích thước ằm n trong khoảng 3 KDa. Đ ều àyi n là phù h v ợp ới nhiều nghiên cứu cho rằng những peptit có khả ă n ng kìm hãm ACE nằm trong khoảng ừ t 1- 5 KDa, peptit có kích thước càng nhỏ thì khả ă n ng kìm hãm àng cao 61, 63 c [ ].
2.10. Sản phẩm sau khi sấy phun
Sau khi tiến hành đ ện di để kiểm tra độ s i ạch ủa sản ph c ẩm, chúng tôi xác định ằng peptit c khả ăng kìm ãm ACE nằm trong khoảng 3 r ó n h KDa.
Chúng tôi tiếp t s ục ấy phun để thu chế phẩm ạng th . Chúng i d ô tô đem dịch th y phâủ n qua máy ọc d l òng ngang để loại những chất có kích thước âph n tử ớn ơn 10 KDa, sau đó đem ấy ới nhiệ độ l h s v t đầu ào v là 80oC, đầu ra là 60oC, với t s là ốc độ ấy 1,4 lit/ giờ. Sản phẩm sau khi sấy thể hiện trong hình 2.21.
Hình 2.21: Chế phẩm thô sau khi sấy phun chứa peptit ức chế ACE sử dụng vi sinh vật là Bacillus subtilis TH2 với cơ chất là protein đậu tương.
*Xác định đặc tính của chế phẩm sau sấy phun
Sau khi sấy phun thu chế phẩm ôth , chúng tôi đem một phần chế phẩm hòa với ước ất ới ỷ ệ n c v t l như trước khi đem sấy. chúng tôi xác định hàm ượng peptit trong chế phẩm l và hoạt ực ức chế ACE của chế phẩm l sau khi sấy phun.
Bảng 4.16: Đặc ính ủa chế phẩm sau khi sấy phun t c Thể tích sấy
(lít)
Khối lượng sản phẩm thu được
sau sấy (g)
Hàm lượng peptit (mg/ml)
ACEI (%)
1,95 134,95 1,92 82,5
Nhìn v bào ảng 4.16 ta thấy rằng chế phẩm sau khi sấy v ẫncho hoạt tính ức chế ACE cao. D hoạt ực ức chếù l có giảm đi một ít nhưng kh ng ô đáng k ể
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu thực hiện đề t ài “Nghiên cứu công nghệ thu nhận peptit kìm ãm enzym chuyển h hóa Angiotensin từ vi sinh vật lên men truyền thống với ơ chất c là protein đậu tương”. Chúng tô ó mi c ột s k ố ết luận sau
1. Đã ân lập ph được ừ ưa chua chủng t d lactic DC2 v định à tên sơ ộ chủng ày thuộc chi Lactobacillus, và chủng n b n ày cho hoạt tính ức chế ACE cao hơn các chủng lactic khác, c ACEI (%) ló à 39,69%.
2. Khi nghi n cê ứu so sánh giữa chủng DC2 với ác chủng c Bacillus subtilis, chúng tôi thấy rằng chủng Bacillus subtilis TH2 cho hoạt l ực ức chế ACE cao nhất, đạtACEI (%) là 50%.
3. Nghiên cứu ả ăkh n ng lên men kết h ợp ữa chủng TH2 gi v c ới ác chủng ấm men Saccharomyces cerevisiae. Chủng ấm men n n k h v ết ợp ới TH2 cho hoạt l ực ức chế ACE cao nhất đạt 58,33% là chủng Saccharomyces cerevisiae 28.
4. Đã nghiên cứu c i ác đ ều kiện lên men tổng h ợp ACEIP t s k h ừ ự ết ợp giữa 2 chủng TH2 +28 bằng 2 phương pháp ối ưu theo t c i và ổ đ ển theo thuật toán ử ụng ma trận DOEHL s d ERT.
* Khi tối ưu theo cổ điển đã cho những k ết quả sau
• Hàm ượng đường glucoza bổ sung l 20 g/l. l à
• Hàm ượng protein đậu ương bổ sung l 10 mg/ml. l t à
• Nhiệt ôđộ nu i cấy thích ợp h là 30oC.
• pH môi trườn ban đầug là 6.5.
* Khi tối ưu theo phương pháp thuật to s dán ử ụng ma trận
• Hàm ượng đường glucoza bổ sung l 23,27 g/l. l à
• Hàm ượng protein đậu ương bổ sung l 12,18 mg/ml. l t à
• Nhiệt ôđộ nu i cấy là 32,18oC.
• pH môi trường là 7,0.
Sau khi tối ưu được i đ ều kiện nuôi, thu được hoạt tính kìm hãm ACE đạt 80,49%.
5. Đã nghiên cứu thu nhận, tinh sạch ACEIP bằng phương pháp cut off loại ững nh chất có trọng lượng phân tử >3000Da. Đem điện di ph n tích tr n SDS PAGE cho thấy â ê - peptit c hoạt tó ính ức chế ACE có trọng ượng â l ph n tử <3000Da. V hoạt ính ìm ãm ACE à t k h l n úc ày thu được là 95%.
6. Đã t ạo được chế ẩm dph ạng th khi l n men s ô ê ử dụng k ết h ợp Bacillus subtilis TH2 và nấm men Saccharomyces cerevisiae 28 v c ới ơ chất là protein đậu ương. Chế phẩm n t ày đem xác định đặc tính, thấy ằng àm ượng peptit thu được r h l là 1,92 mg/ml và hoạt l ực ức chế ACE l 82,5%.à
KIẾN NGHỊ
Do điều kiện và thời gian nghi n cứu có hê ạn, chúng t i chưa thểô nghiên cứu đi sâu v o xà ác định c ác đặc tính và thử nghiệm lâ sàm ng chế phẩm chứa peptit kìm hãm enzym ACE. Chúng tô ó mi c ột s ố ến ki nghị sau:
• Tiến hành nghi n cứu ác định trình ự axit amin của ácê x t c peptit có hoạt tính ACE thu được.
• Thử nghiệm lâm s ng để tiến tới sản xuất c sà ác ản phẩm chứa c ác peptit sinh học có hoạ ính ức chế ACE, c ác ụng điều trị ệnht t ó t d b cao huyết áp ởtrong nước.