3.1.1. Chúng giống vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn Lactic: H140, H1454, NC13, TC9, SC1, SC2 phân lập từ sữa chua, DC1, DC2, DC3 phân lập từ nước dưa.
Các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae: S. cerevisiae JICA, S. cerevíiae ĐM, S. cerevisiae Y6, S. cerevisiae 28 từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm.
Các chủng Bacillus subtilis TH2; CN2 (phân lập từ nước mắm) từ bộ sưu tập giống của phòng nghiên cứu vi sinh và kỹ thuật di truyền.
3.1.2. Hoá chất
- Cao thịt (Merck Đức), Cao nấm men (Merck Đức), Peptone (Trung - - Quốc), Sodium Citrat (Trung Quốc), Triamonium Citrat (Trung Quốc), O- phthaldehye (OPA) (Sigma), Mecapto Ethanol (Nhật), ACE chuẩn (Sigma), FAPGG (Sigma), BSA (bovine serum albumin) (Sigma)… và một số hoá chất khác.
3.1.3. Thiết bị
Nồi thanh trùng Hirayama (Nhật) Kính hiển vi quang học Nikon (Nhật) Tủ sấy Memmert (Đức)
Máy đo pH Máy so màu
Máy ly tâm eppendorf Cân phân tích, cân kỹ thuật Tủ cấy vô trùng
Tủ ấm
Ống cutoff kích thước màng 3kDa (Millipore) Máy sấy phun
Tủ nuôi lắc
Thiết bị điện di acrylamide Máy trộn Votex
Máy ổn nhiệt
3.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
• Môi trường phân lập vi khuẩn lactic: Môi trường MRS (MT1) Thành phần:
Cao thịt 10g
Cao nấm men 5g
Peptone 10g
Glucose 20g
CH3COONa 5g
(NH4)3C6H5O7 2g
MgSO4 0.2g
MnSO4 0.05g
NaH2PO4 2g
thạch 20g
CaCO3 1%
Nước cất 1lít
pH: 6.5
Thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút.
• Môi trường hoạt hoá giống: Môi trường sữa đậu nành (MT2)
Thành phần Hàm lượng
Protein đậu tương 10 g/l
Glucose 5g
Cao nấm men 0.5g Đệm natri phosphate 0.01M 1 lit
pH 6.5-7
Thanh trùng ở 110oC trong 15 phút.
• Môi trường lên men (MT3) Thành phần:
Protein đậu nành 20 g/l glucose
10 ml/l dung dịch muối Đệm Natri photphat 0.1M pH: 6- 6.5
Dung dịch muối gồm
5g MgSO4..7H20 5g KH2PO4
1g CaCl2.2H2O 0.5g MnSO4
Thanh trùng ở 110oC trong 15 phút.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn lactic
\
Vi khuẩn lactic được phân lập trực tiếp trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 theo phương pháp của Koch.
- Cách tiến hành: từ mỗi nguồn phân lập lấy 1g mẫu pha loãng trong 10ml nước cất vô trùng, tiếp tục pha loãng theo nồng độ thập phân đến độ pha loãng thích hợp (10-7, 10-8, 10-9). Hút 0.1ml dịch pha loãng nhỏ vào hộp Petri có chứa sẵn môi trường phân lập, dùng que trang vô trùng trang đều mẫu trên bề mặt môi trường. Sau khi cấy, các hộp Petri được dán kín và nuôi trong tủ nuôi yếm khí ở 37oC trong 2 đến 3 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi độ pha loãng.
- Dựa vào sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch trong đĩa Petri (kích thước, màu sắc, vòng phân giải CaCO3), chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có vòng phân giải CaCO3. Tách khuẩn lạc và cấy vào ống thạch đứng rồi nuôi ở nhiệt độ 37oC trong 48h.
3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE
Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE được thực hiện theo phương pháp của Vermeissen [61] sử dụng cơ chất là FAPGG (furanacryloyl tripeptid, FA-Phe Gly Gly). ACE xúc tác thủy phân FAPGG - - thành axit amin (FAP Phe, FAP) và dipeptit- (Gly-gly, GG).
FAPGG hấp thụ mạnh bước sóng 340nm. Dưới tác dụng của ACE,
giảm. Hoạt tính của enzym chuyển angiotensin (ACE) được xác định dựa trên mức độ giảm độ hấp thụ ánh sáng đó.
Có nhiều phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE sử dụng cơ chất là FAPGG, chúng tôi dùng phương pháp của Otte Zakora, và Shalaby [ ] 37
- Tiến hành Chuẩn bị hoá chất:
• Enzym ACE đã pha loãng đến hoạt độ 0.25 U/ml bằng nước cất.
• Cơ chất FAPGG được pha loãng đến 0.88 mM trong đệm Tris- HCL 50mM, pH 7.5 có chứa 0.3M NaCl.
• Đệm Tris-HCl 50mM, pH 7.5 có chứa 0.3M NaCl.
Xác định hoạt tính ACE
Bảng 1: Phương phá3. p đo hoạt tính kìm hãm ACE theo Otte, Zakora, và Shalaby [ ] 37
Thành phần Mẫu đo hoạt tính ACEI
Mẫu đối chứng
ACE 10μl 10μl
Dịch thuỷ phân có chứa peptit 10μl -
FAPGG 150μl 150μl
Đệm Tris-HCl - 10μl
• Hỗn hợp trên được cho vào microcuvet và đo độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, cứ 30s ghi kết quả một lần trong vòng 25 phút.
• Độ giảm sự hấp thụ được tính toán như sau ∆A = A10minute – A25 minute
• Hoạt tính kìm hãm ACE (%)được tính toán
ACEinhibitory(%) = [1 (∆A – inhibitor/ ∆Acontrol)] x 100%
3.2.3. Phương pháp so sánh khả năng tạo ACEIP của chủng lactic với các chủng Bacillus subtilis
Tiến hành thử hoạt tính kìm hãm ACE của các chủng lactic đã phân lập và có sẵn, lựa chọn chủng có hoạt tính kìm hãm ACE cao nhất. Sau đó, lấy chủng lactic có hoạt tính cao nhất đó đem so sánh với các chủng Bacillus subtilis, đo hoạt tính kìm hãm ACE lựa chọn chủng hoạt tính cao nhất đem tiến hành các nghiên cứu tiếp sau.
3.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng (BSA)
* Mục đích: Xác định hàm l ợng protein tổng trong sữa ậu nành.ư đ
*Phương pháp đo Pha loãng BSA với các nồng độ: 0; 250; 500; : 1000; 1500; 2000 àg/ml.
Đo quang tại bước sóng OD595nm.
3.2.5. Phương pháp xác định peptit tổng với OPA
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng phản ứng giữa các amino axit trong phân tử protein với hỗn hợp chất chỉ thị OPA (Ortho Phthaldehyde) tạo ra - một sản phẩm có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 340 nm. Dựa trên đường chuẩn ta tính được hàm lượng peptit. [
Mục đích: Xác định được hàm lượng peptit trong dung dịch sữa đậu sau khi lên men. Hàm lượng peptit càng cao chứng tỏ khả năng thủy phân protein trong dịch lên men càng lớn, khả năng protein bị thủy phân thành các peptit có khả năng kìm hãm ACE càng lớn.
Phương pháp đo:
- Dịch sau lên men được kết tủa protein bằng TCA 10%
- Dịch đo nồng độ peptit đã được pha loãng 2 lần.
- Trộn 200àl dung dịch OPA với 5àl dịch peptit. Để phản ứng xảy ra trong 2 phút
- Đo quang ở bước sóng 340nm
- Dựa vào đường chuẩn đo hàm lượng pepton trong dịch OPA ta xác định được hàm lượng peptit trong dung dịch
3.2.6. Tối ưu điều kiện lên men theo ph ơng pháp cổ điểnư
Trong quá trình nuôi thu sinh khối, sự sinh trưởng của vi khuẩn luôn chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ, hàm lượng đường, nồng độ protein, thời gian lên men, tốc độ khuấy, nồng độ oxy hoà tan…
các yếu tố này nếu ở điểm tối ưu sẽ cho hoạt lực ức chế ACE là cao nhất.
3.2.6 . .1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật
Mỗi loài vi khuẩn có nhiệt độ phát triển tối thích khác nhau. Để xác định nhiệt ộ tối u, chúng tôi ã lựa chọn các nhiệt ộ 25đ ư đ đ oC; 30oC; 37oC và 42oC làm nhiệt độ khảo sát. Tỷ lệ cấp giống là 10% trong môi trường lên men (MT3), nuôi trong tủ lắc với tốc ộ 200v/p và đ đo OD620nm, cứ 8h đo 1 lần.
3.2.6 . .2 Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát các hàm l ợng đường 0; 5; ư 10; 15; 20; 25 (g/l), môi trường lên men là MT3 lỏng với tỷ lệ cấp giống là 10%, nuôi trong tủ lắc với tốc ộ 200v/p và đ đo OD620nmcứ 8h đo 1 lần.
3.2.6 . .3 Ảnh hưởng của nồng độ protein
Chúng tôi đã lựa chọn các nồng ộ protein: 0; 5; 10; 15; 20; 25 đ (mg/ml) làm nồng ộ khảo sát, môi tr ờng lên men là môi trđ ư ường MT3 lỏng, với tỷ lệ cấp giống là 10%, nuôi trong tủ lắc với tốc ộ 200đ v/p và đo OD620nm cứ 8h đo 1 lần.
3.2.6 . .4 Ảnh hưởng của pH
Các giá trị pH 5,5; 6; 6,5; 7,0; 7, được lựa chọn 5 để khảo sát, môi trường lên men là MT3, tỷ lệ cấp giống 10%, nuôi trong tủ lắc với tốc độ 200 v/p và o ODđ 620nm, cứ 8h đo 1 lần.
3.2.7. Tối ưu quá trình lên men theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng ma trận DOEHLERT
C ơ sở của phương pháp: Sử dụng ma trận DOEHLERT, ma trận này cho phép tìm được vùng tối u trong khoảng giá trị ã chọn, cho phép phân ư đ chia rất cân đối các iểm thí nghiệm trong giới hạn vùng ang nghđ đ iên cứu và cho phép đi xa hơn ra ngoài giới hạn theo bất kỳ h ớng nào. Dựa vào ư ma trận, ta có thể thêm một số thí nghiệm mà không làm mất đi tính úng đ đắn của ma trận [9].
Với K là số biến độc lập. N là số thí nghiệm cần tiến hành, ta có mối quan hệ:
N= K2+ K +1
Bốn yếu tố được lựa chọn để xác ịnh ảnh h ởng của iều kiện nuôi đ ư đ cấy đến sự phát triển của chủng lần lượt ký hiệu là X1; X2; X3; X4với:
X1: Nhiệt độ (oC)
X2: Hàm lượng đường (g/l) X3: Hàm lượng protein (mg/ml) X4: pH
Các giá trị thu được từ quá trình tối u hóa bằng ph ng pháp cổ ư ươ điển được chọn làm giá trị trung tâm (mức trung bình) của phương pháp quy hoạch thông kê. Xê dịch các giá trị này quanh mức trung bình ta được cận trên (+1) và cận dưới (-1).
Tiên hành các thí nghiệm theo bảng sau