Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.Nghiên cứu biểu hiện của TILs và PDL1 trong carcinôm vú xâm lấn.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân nữ mắc bệnh carcinôm vú xâm lấn, đáp ứng các tiêu chuẩn bao gồm tiêu chuẩn nhận vào và tiêu chuẩn loại trừ
2.2.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu
➢ Có ghi nhận đầy đủ các dữ kiện lâm sàng, chẩn đoán lâm sàng
➢ Có bệnh phẩm là mô u của phẫu thuật cắt vú và kết quả giải phẫu bệnh là carcinôm vú xâm lấn
➢ Có tiêu bản để có thể đọc, phân tích và xác nhận lại các dữ kiện trên tiêu bản H&E, ER, PR, HER2 và Ki-67
➢ Khối mô còn nguyên vẹn đủ mô để có thể nhuộm HMMD PD-L1 hoặc các dấu ấn ER, PR, HER2, Ki-67 khi cần
➢ Bệnh nhân đã hóa, xạ trị vào khối u carcinôm vú xâm lấn trước đó.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu này được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh của Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Mô phôi - Giải phẫu bệnh thuộc Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, và Khoa Giải phẫu bệnh – Tế bào của Bệnh viện Hùng Vương, Thành phố Hồ Chí Minh.
➢ Dữ liệu nghiên cứu được thu thập trong khoảng thời gian ngày 15 tháng 01 năm
2022 đến 30 tháng 11 năm 2022, các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn nhận vào có thời gian chẩn đoán bệnh từ năm 2014 đến năm 2021.
Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu được áp dụng theo công thức tính cỡ mẫu mô tả định tính như sau:
➢ n: số lượng đối tượng tối thiểu cần phải nghiên cứu
➢ α: mức ý nghĩa thống kê (chúng tôi chọn 0,05)
➢ Z: hệ số giới độ hạn tin cậy (Z = 1,96 tương ứng α = 0,05)
➢ d: sai số tuyệt đối cho phép (chúng tôi chọn d = 0,1 - 0,05) (tức là mức chênh giữa mẫu nghiên cứu và quần thể)
➢ P 1 = 0,27 (27%) là tỷ lệ biểu hiện TILs trong nghiên cứu của tác giả Guo H và cs (2020) 132 Thay vào công thức trên ta có:
Bảng 2.1 Cỡ mẫu ước tính khi giá trị d thay đổi, p 1 = 0,27
➢ P 2 = 0,25 (25%) là tỷ lệ biểu hiện của PD-L1 trong 01 nghiên cứu tổng quan của tác giả Matikas A và cs (2019) 15 Thay vào công thức trên ta có:
Bảng 2.2 Cỡ mẫu ước tính khi giá trị d thay đổi, p 2 = 0,25
Alpha P 1 ước tính d KTC 95% ước tính n 1
Alpha P 2 ước tính d KTC 95% ước tính n 2
Chúng tôi chọn số đối tượng nghiên cứu tối thiểu phải là n = 211 trường hợp
(với α = 0,05, d = 0,06 và z = 1,96) carcinôm vú xâm lấn, phù hợp với điều kiện thực tế về thời gian và năng lực nghiên cứu của chúng tôi (Bảng 2.1 và Bảng 2.2)
2.5 Xác định các biến số độc lập và phụ thuộc
➢ Biểu hiện lymphô bào thấm nhập trong u (TILs)
➢ Biểu hiện của PD-L1: kết cục quan trọng nhất
➢ Kết cục bất lợi của bệnh nhân: kết cục phụ trong nghiên cứu trong nghiên cứu chúng tôi
➢ Các biến số độc lập liên quan đến đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân:
✓ Tuổi bệnh nhân tại thời điểm mắc bệnh
✓ Tình trạng mãn kinh tại thời điểm mắc bệnh
✓ Chỉ số khối cơ thể (BMI) tại thời điểm mắc bệnh
✓ Tiền căn bệnh đái tháo đường
✓ Tiền căn bệnh lý tuyến vú lành tính
✓ Tình huống phát hiện bệnh
➢ Các biến số độc lập liên quan đến đặc điểm giải phẫu bệnh của bệnh nhân:
✓ Số lượng hạch di căn
✓ Tình trạng xâm lấn mạch máu
➢ Các biến số độc lập liên quan đến đặc điểm các dấu ấn sinh học của bệnh nhân:
Chúng tôi sẽ trình bày chi tiết về cách thu thập dữ liệu, các công cụ đo lường và phương pháp đánh giá các biến đã nêu trong phần tiếp theo (Mục 2.6).
2.6 Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu
2.6.1.1 Biểu hiện của lymphô bào thâm nhập khối u - TILs
TILs được xem xét trong thành phần mô đệm của carcinôm vú xâm lấn Tỷ lệ phần trăm (%) diện tích mô đệm bị tế bào viêm đơn nhân chiếm chỗ được tính bằng cách chia diện tích mô đệm bị ảnh hưởng cho tổng diện tích mô đệm trong carcinôm vú xâm lấn.
Nhóm chuyên gia TILs Thế giới năm 2014 khuyến nghị nên chia thành 3 nhóm: 126
➢ TILs có biểu hiện thấp: TILs ≤10%
➢ TILs có biểu hiện trung bình: 10%< TIL 10%
Bảng 2.3 Đánh giá TILs theo Nhóm chuyên gia TILs thế giới năm 2014 Đánh giá TILs trong carcinôm vú xâm lấn theo Nhóm chuyên gia TILs thế giới năm 2014 21,126
Đánh giá TILs (tế bào lympho xâm nhập) trong mô đệm của carcinôm vú xâm lấn chỉ tập trung vào tỷ lệ phần trăm (%) diện tích mô đệm bị tế bào viêm đơn nhân chiếm chỗ, so với tổng diện tích mô đệm trong carcinôm vú xâm lấn.
2 Chỉ đánh giá TILs giới hạn trong diện tích của carcinôm vú xâm lấn
3 Không đánh giá TILs ngoài u, quanh vùng DCIS và tiểu thùy vú bình thường
4 Không đánh giá TILs trong vùng gấp nếp do lỗi kỹ thuật, vùng hoại tử, vùng bị thoái hóa hyalin và vùng sinh thiết lõi trước đó
5 Tất cả các tế bào viêm đơn nhân (lymphô bào, tương bào) sẽ được đánh giá, không đánh giá tế bào viêm đa nhân
6 Mỗi bệnh nhõn chỉ cần 01 tiờu bản H&E (4-5àm, độ phúng đại x200-400)
7 Mẫu sinh thiết lõi vẫn có thể được dùng để đánh giá TILs, tuy nhiên mẫu cắt u vẫn được ưu tiên lựa chọn hơn
8 Đánh giá toàn bộ diện tích của khối u, không nên chỉ đánh giá vùng hiện diện nhiều TILs
9 Kết quả đánh giá nên được trình bày chi tiết bằng phần trăm (%)
10 TILs nên được coi như là thông số liên tục
Hiện tại, chưa có ngưỡng cắt thống nhất cho TILs trong ứng dụng lâm sàng, nhưng đa số đồng thuận rằng ngưỡng từ 50-60% trở lên biểu hiện TILs mạnh Việc đánh giá TILs được thực hiện dưới kính hiển vi quang học, do nghiên cứu sinh và một bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm thực hiện độc lập Kết quả sẽ được đối chiếu, và nếu không đồng thuận, sẽ được thảo luận cùng người hướng dẫn, với kết luận cuối cùng thuộc về người hướng dẫn.
Hình 2.1 Cách xác định giới hạn đánh giá TILs
Hình 2.2 Các bước tiếp cận chuẩn để đánh giá TILs
Chúng tôi đánh giá biểu hiện của PD-L1 thông qua hệ thống thang điểm dương tính kết hợp (CPS) CPS có hai giá trị, trong đó trị số 1 là ngưỡng cắt của CPS, với giá trị là 132.
Hướng dẫn đánh giá kết quả HMMD PD-L1 IHC 22C3 pharmDx yêu cầu bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm và được đào tạo đầy đủ Quá trình đánh giá được thực hiện bằng kính hiển vi quang học, đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy trong kết quả.
Trong nghiên cứu này, việc đánh giá PD-L1 được thực hiện độc lập bởi nghiên cứu sinh và một bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm Kết quả được đối chiếu, và nếu không đồng thuận, sẽ được thảo luận cùng người hướng dẫn Kết luận của người hướng dẫn sẽ là kết quả cuối cùng được sử dụng trong nghiên cứu.
Trước khi tiến hành đánh giá kết quả nhuộm PD-L1, việc kiểm tra chứng âm và chứng dương để đảm bảo chất lượng nhuộm là rất quan trọng Cần đảm bảo rằng có ít nhất 100 tế bào u đạt tiêu chuẩn trong mẫu để thực hiện đánh giá đầy đủ.
Tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) của mẫu mô được đánh giá để xác định chất lượng mô học và chất lượng bảo quản mô Việc định nghĩa thang điểm dương tính kết hợp là một bước quan trọng trong quá trình này.
Biểu hiện PD-L1 được xác định thông qua thang điểm dương tính kết hợp (CPS), được tính bằng cách chia số lượng tế bào bắt màu PD-L1, bao gồm tế bào khối u, lymphô bào, đại thực bào và mô bào, cho tổng số tế bào khối u sống, sau đó nhân với 100.
Số lượng tế bào bắt màu PD-L1 (Tế bào khối u, lymphô bào, đại thực bào, mô bào) x 100
Tổng số tế bào ung thư đạt chất lượng
Chú ý: Mặc dù kết quả của phép tính có thể vượt quá 100, điểm tối đa của CPS được xác định vẫn là 100
Bảng 2.4 Cách xác định tiêu chuẩn cho tử số trong công thức CPS
Thành phần Tiêu chuẩn nhận Tiêu chuẩn loại trừ
Tế bào u Bắt màu một phần hoặc toàn bộ màng tế bào của các tế bào khối u xâm lấn (ở bất kỳ cường độ nào)
Tế bào u không bắt màu
Tế bào u chỉ bắt màu ở bào tương
Bắt màu tế bào u của DCIS
Nhuộm màng hoặc tế bào chất (ở bất kỳ cường độ nào) của tế bào viêm đơn nhân (MIC) trong mô u xâm lấn và mô đệm lân cận:
- Tế bào bạch huyết (bao gồm cả tập hợp lymphô bào)
- Đại thực bào: Chỉ MICs liên quan trực tiếp đến phản ứng với khối u mới được tính điểm
Tế bào MICs không bắt màu
Tế bào MICs liên quan DCIS
Tế bào MICs liên quan vùng lành tính
Tế bào MICs không liên quan đến vùng u xâm lấn
Bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan và tương bào
Không đưa vào Tế bào biểu mô lành tính
Các tế bào mô đệm (kể cả nguyên bào sợi)
Để đánh giá diện tích khối u, cần xem xét các tế bào hoại tử hoặc mảnh vỡ tế bào ở độ phóng đại thấp Việc đánh giá tổng thể các vùng tế bào khối u nhuộm PD-L1 và không nhuộm là rất quan trọng, đặc biệt lưu ý rằng việc nhuộm màng một phần hoặc nhuộm màng 1+ có thể khó nhìn thấy ở độ phóng đại thấp Đảm bảo mẫu có ít nhất 100 tế bào khối u còn tồn tại để có kết quả chính xác.
Bảng 2.5 Cách xác định tiêu chuẩn cho mẫu số trong công thức CPS
Các thành phần mô Tiêu chuẩn nhận Tiêu chuẩn loại trừ
Bắt màu một phần hoặc toàn bộ màng tế bào của các tế bào khối u xâm lấn (ở bất kỳ cường độ nào)
Tế bào miễn dịch Không đưa vào Tất cả tế bào miễn dịch
Tế bào khác Không đưa vào
Tế bào biểu mô lành tính Các tế bào mô đệm (kể cả nguyên bào sợi)
Các tế bào hoại tử hoặc mảnh vỡ tế bào
Để tiêu bản nhuộm PD-L1 (sinh thiết và phẫu thuật) được xem là đủ tiêu chuẩn đánh giá, cần có tối thiểu 100 tế bào khối u đạt chuẩn trong mẫu.
Các bước chuẩn bị để nhuộm HMMD và đánh giá biểu hiện PD-L1:
Giới thiệu sơ lược về bộ kít 22C3 và quy trình nhuộm PD-L1:
➢ PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (gọi tắt là 22C3, mã số SK006), là xét nghiệm
HMMD sử dụng kháng thể đơn dòng kháng PD-L1 chuột để phát hiện PD-L1 protein trên bệnh phẩm vùi mô trong nến của bệnh nhân carcinôm vú xâm lấn
➢ Lam hóa mô miễn dịch được thực hiện nhuộm với hệ thống nhuộm tự động
Autostainer Link48 và Roche Ventana Benchmark XT là hai thiết bị quan trọng trong quy trình nhuộm mô phôi tại Bộ môn Mô phôi – Giải phẫu bệnh, Đại học Y dược TP.HCM Việc so sánh và đối chiếu giữa hai hệ thống này được thực hiện theo quy trình kỹ thuật hướng dẫn của nhà sản xuất, nhằm đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong công tác nghiên cứu và chẩn đoán.
Bộ kít 22C3 gồm 50 xét nghiệm, có thể thực hiện cho 15 lần chạy máy:
➢ EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, (50×)
➢ Primary Antibody: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3
➢ PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Cell Line Slides
Chuẩn bị chứng âm, chứng dương: Nghiên cứu chúng tôi chọn mẫu chứng âm và chứng dương là mô Amydan theo hướng dẫn đánh giá PD-L1 theo sản phẩm 22C3 (2020):
➢ PD-L1 dương mạnh: ở tế bào biểu mô vùng hốc
➢ PD-L1 dương yếu đến trung bình: ở đại thực bào vùng trung tâm mầm
➢ PD-L1 không biểu hiện: ở tế bào nội mô, nguyên bào sợi và biểu mô bề mặt
Hình 2.3 PD-L1 bắt mạnh ở tế bào biểu mô vùng hốc (A), dương tính từ yếu đến trung bình ở các đại thực bào vùng trung tâm mầm (B)
“Nguồn: Hướng dẫn đánh giá PD-L1 theo sản phẩm 22C3, 2020” 135
Các khối nến được chọn dùng để nhuộm trong nghiên cứu này phải thỏa các điều kiện sau:
Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu
2.6.1.1 Biểu hiện của lymphô bào thâm nhập khối u - TILs
TILs được đánh giá dựa trên tỷ lệ phần trăm (%) diện tích mô đệm carcinôm vú xâm lấn bị chiếm chỗ bởi tế bào viêm đơn nhân, so với tổng diện tích mô đệm trong mẫu carcinôm vú xâm lấn.
Nhóm chuyên gia TILs Thế giới năm 2014 khuyến nghị nên chia thành 3 nhóm: 126
➢ TILs có biểu hiện thấp: TILs ≤10%
➢ TILs có biểu hiện trung bình: 10%< TIL 10%
Bảng 2.3 Đánh giá TILs theo Nhóm chuyên gia TILs thế giới năm 2014 Đánh giá TILs trong carcinôm vú xâm lấn theo Nhóm chuyên gia TILs thế giới năm 2014 21,126
Đánh giá TILs chỉ được thực hiện trong thành phần mô đệm của carcinôm vú xâm lấn Để tính toán, phần trăm (%) diện tích mô đệm bị tế bào viêm đơn nhân chiếm chỗ được chia cho tổng diện tích mô đệm trong carcinôm vú xâm lấn.
2 Chỉ đánh giá TILs giới hạn trong diện tích của carcinôm vú xâm lấn
3 Không đánh giá TILs ngoài u, quanh vùng DCIS và tiểu thùy vú bình thường
4 Không đánh giá TILs trong vùng gấp nếp do lỗi kỹ thuật, vùng hoại tử, vùng bị thoái hóa hyalin và vùng sinh thiết lõi trước đó
5 Tất cả các tế bào viêm đơn nhân (lymphô bào, tương bào) sẽ được đánh giá, không đánh giá tế bào viêm đa nhân
6 Mỗi bệnh nhõn chỉ cần 01 tiờu bản H&E (4-5àm, độ phúng đại x200-400)
7 Mẫu sinh thiết lõi vẫn có thể được dùng để đánh giá TILs, tuy nhiên mẫu cắt u vẫn được ưu tiên lựa chọn hơn
8 Đánh giá toàn bộ diện tích của khối u, không nên chỉ đánh giá vùng hiện diện nhiều TILs
9 Kết quả đánh giá nên được trình bày chi tiết bằng phần trăm (%)
10 TILs nên được coi như là thông số liên tục
Hiện tại, chưa có ngưỡng cắt thống nhất cho TILs trong ứng dụng lâm sàng, nhưng phần lớn đồng thuận rằng ngưỡng từ 50-60% trở lên được coi là biểu hiện TILs mạnh Việc đánh giá TILs được thực hiện dưới kính hiển vi quang học, với sự tham gia độc lập của nghiên cứu sinh và bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm Kết quả đánh giá sẽ được đối chiếu; nếu không đồng thuận, sẽ được thảo luận và đưa ra kết luận cuối cùng từ người hướng dẫn của nghiên cứu sinh.
Hình 2.1 Cách xác định giới hạn đánh giá TILs
Hình 2.2 Các bước tiếp cận chuẩn để đánh giá TILs
Chúng tôi đánh giá biểu hiện của PD-L1 bằng hệ thống thang điểm dương tính kết hợp (CPS), với ngưỡng cắt CPS là 1 Biến phân nhóm này có 2 giá trị, trong đó trị số 1 đóng vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ biểu hiện.
Hướng dẫn đánh giá kết quả HMMD PD-L1 IHC 22C3 pharmDx yêu cầu bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm và được đào tạo đầy đủ trong việc sử dụng kính hiển vi quang học.
Trong nghiên cứu này, việc đánh giá PD-L1 được thực hiện độc lập bởi nghiên cứu sinh và một bác sĩ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm Kết quả được đối chiếu và nếu không đồng thuận, sẽ được thảo luận cùng người hướng dẫn Kết luận của người hướng dẫn sẽ là kết quả cuối cùng được sử dụng trong nghiên cứu.
Trước khi đánh giá kết quả nhuộm PD-L1, cần kiểm tra chứng âm và chứng dương để đảm bảo chất lượng nhuộm Để có đánh giá chính xác, cần phải có ít nhất 100 tế bào u đạt chuẩn trong mẫu.
Tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) của mẫu mô được đánh giá đầu tiên nhằm xác định chất lượng mô học và chất lượng bảo quản mô Định nghĩa thang điểm dương tính kết hợp là một yếu tố quan trọng trong quá trình đánh giá này.
Biểu hiện PD-L1 được xác định thông qua thang điểm dương tính kết hợp (CPS), được tính bằng cách chia số lượng tế bào bắt màu PD-L1, bao gồm tế bào khối u, lymphô bào, đại thực bào và mô bào, cho tổng số tế bào khối u sống, sau đó nhân với 100.
Số lượng tế bào bắt màu PD-L1 (Tế bào khối u, lymphô bào, đại thực bào, mô bào) x 100
Tổng số tế bào ung thư đạt chất lượng
Chú ý: Mặc dù kết quả của phép tính có thể vượt quá 100, điểm tối đa của CPS được xác định vẫn là 100
Bảng 2.4 Cách xác định tiêu chuẩn cho tử số trong công thức CPS
Thành phần Tiêu chuẩn nhận Tiêu chuẩn loại trừ
Tế bào u Bắt màu một phần hoặc toàn bộ màng tế bào của các tế bào khối u xâm lấn (ở bất kỳ cường độ nào)
Tế bào u không bắt màu
Tế bào u chỉ bắt màu ở bào tương
Bắt màu tế bào u của DCIS
Nhuộm màng hoặc tế bào chất (ở bất kỳ cường độ nào) của tế bào viêm đơn nhân (MIC) trong mô u xâm lấn và mô đệm lân cận:
- Tế bào bạch huyết (bao gồm cả tập hợp lymphô bào)
- Đại thực bào: Chỉ MICs liên quan trực tiếp đến phản ứng với khối u mới được tính điểm
Tế bào MICs không bắt màu
Tế bào MICs liên quan DCIS
Tế bào MICs liên quan vùng lành tính
Tế bào MICs không liên quan đến vùng u xâm lấn
Bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan và tương bào
Không đưa vào Tế bào biểu mô lành tính
Các tế bào mô đệm (kể cả nguyên bào sợi)
Để đánh giá diện tích khối u một cách chính xác, cần xem xét các tế bào hoại tử và mảnh vỡ tế bào ở độ phóng đại thấp Việc đánh giá tổng thể các vùng tế bào khối u nhuộm PD-L1 và không nhuộm là rất quan trọng, tuy nhiên, việc nhận diện nhuộm màng một phần hoặc nhuộm màng 1+ có thể gặp khó khăn ở độ phóng đại thấp Đảm bảo rằng mẫu có ít nhất 100 tế bào khối u còn tồn tại để có kết quả đáng tin cậy.
Bảng 2.5 Cách xác định tiêu chuẩn cho mẫu số trong công thức CPS
Các thành phần mô Tiêu chuẩn nhận Tiêu chuẩn loại trừ
Bắt màu một phần hoặc toàn bộ màng tế bào của các tế bào khối u xâm lấn (ở bất kỳ cường độ nào)
Tế bào miễn dịch Không đưa vào Tất cả tế bào miễn dịch
Tế bào khác Không đưa vào
Tế bào biểu mô lành tính Các tế bào mô đệm (kể cả nguyên bào sợi)
Các tế bào hoại tử hoặc mảnh vỡ tế bào
Để tiêu bản nhuộm PD-L1 (sinh thiết và phẫu thuật) được coi là đủ tiêu chuẩn để đánh giá, cần phải có ít nhất 100 tế bào khối u đạt chuẩn trong mẫu.
Các bước chuẩn bị để nhuộm HMMD và đánh giá biểu hiện PD-L1:
Giới thiệu sơ lược về bộ kít 22C3 và quy trình nhuộm PD-L1:
➢ PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (gọi tắt là 22C3, mã số SK006), là xét nghiệm
HMMD sử dụng kháng thể đơn dòng kháng PD-L1 chuột để phát hiện PD-L1 protein trên bệnh phẩm vùi mô trong nến của bệnh nhân carcinôm vú xâm lấn
➢ Lam hóa mô miễn dịch được thực hiện nhuộm với hệ thống nhuộm tự động
Autostainer Link48 và Roche Ventana Benchmark XT là hai thiết bị quan trọng trong lĩnh vực mô phôi và giải phẫu bệnh Việc so sánh và đối chiếu giữa hai hệ thống này được thực hiện theo quy trình kỹ thuật hướng dẫn của nhà sản xuất Nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Mô phôi – Giải phẫu bệnh, Đại học Y dược TP.HCM, nhằm đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong quy trình xét nghiệm.
Bộ kít 22C3 gồm 50 xét nghiệm, có thể thực hiện cho 15 lần chạy máy:
➢ EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, (50×)
➢ Primary Antibody: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3
➢ PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Cell Line Slides
Chuẩn bị chứng âm, chứng dương: Nghiên cứu chúng tôi chọn mẫu chứng âm và chứng dương là mô Amydan theo hướng dẫn đánh giá PD-L1 theo sản phẩm 22C3 (2020):
➢ PD-L1 dương mạnh: ở tế bào biểu mô vùng hốc
➢ PD-L1 dương yếu đến trung bình: ở đại thực bào vùng trung tâm mầm
➢ PD-L1 không biểu hiện: ở tế bào nội mô, nguyên bào sợi và biểu mô bề mặt
Hình 2.3 PD-L1 bắt mạnh ở tế bào biểu mô vùng hốc (A), dương tính từ yếu đến trung bình ở các đại thực bào vùng trung tâm mầm (B)
“Nguồn: Hướng dẫn đánh giá PD-L1 theo sản phẩm 22C3, 2020” 135
Các khối nến được chọn dùng để nhuộm trong nghiên cứu này phải thỏa các điều kiện sau:
Mô được cố định trong dung dịch formol đệm trung tính trong khoảng thời gian từ 30 đến 60 phút và tiếp tục được cố định từ 6 đến 72 giờ Thời gian cố định này rất quan trọng để đảm bảo chất lượng mẫu mô.
3 giờ không nên dùng để nhuộm và đánh giá PD-L1
➢ Chọn mẫu mô số lượng tế bào u đầy đủ để đánh giá, tế bào u hình thái nguyên vẹn không bị hoại tử
➢ Các lát cắt mô phải có chiều dày từ 3-4 mm, được xử lý theo quy trình chuyển mô tự động
➢ Nhiệt độ của nến không vượt quá 60°C
Các khối nến được chọn sẽ được:
➢ Cắt mỏng 3-4 àm mẫu chứng, vớt lờn tiờu bản
➢ Cắt mỏng 3-4 àm, vớt block TMA lờn tiờu bản đó cú mẫu chứng và tiờu bản nhuộm H&E
➢ Nhuộm PD-L1 IHC 22C3 pharmDx và nhuộm H&E nên được thực hiện trên các lát cắt mỏng mô liên tiếp trên cùng một khối sáp chứa bệnh phẩm
➢ Để ráo tiêu bản qua đêm ở nhiệt độ phòng
➢ In nhãn hóa mô cho tiêu bản cần nhuộm
➢ Thực hiện nhuộm HMMD dấu ấn PD-L1 (22C3)
➢ Pha kháng thể: Pha theo bảng Tỷ lệ pha kháng thể Lưu trữ trong tủ lạnh 2-
➢ Tiêu bản sau khi nhuộm HMMD xong, lấy ra rửa xà phòng cho sạch dầu
➢ Rửa lại bằng nước cất Rửa qua cồn 99,50 trong 30 giây
➢ Để khô, dán tiêu bản
➢ Đánh giá biểu hiện PD-L1 theo các bước nêu trên
Quy trình nghiên cứu
Dựa trên hệ thống quản lý thông tin của các cơ sở nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập mã số bệnh nhân và xác định được danh sách bệnh nhân có chẩn đoán mắc carcinôm vú xâm lấn.
Chúng tôi tiến hành mượn hồ sơ giấy hoặc điện tử để thu thập thông tin lâm sàng và bệnh học ban đầu từ phiếu thu thập số liệu Danh sách nghiên cứu ban đầu của bệnh nhân đủ tiêu chuẩn được lập tại Bệnh viện Hùng Vương, Bệnh viện Đại học Y dược và Bộ môn Mô phôi – Giải phẫu bệnh Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh Tiếp theo, chúng tôi tìm lam H&E và lam HMMD để đánh giá các biến liên quan đến giai đoạn bệnh, biến HMMD và biến TILs, đồng thời bổ sung thông tin cần thiết vào phiếu thu thập số liệu của bệnh nhân Cuối cùng, chúng tôi chọn khối nến chứa mô u đạt tiêu chuẩn về số lượng và chất lượng tế bào để tiến hành nhuộm HMMD, đánh giá PD-L1 và các dấu ấn HMMD khác còn thiếu.
Ban đầu chúng tôi đọc tất cả các lam H&E của khối u, chọn lam đại diện để thực hiện đánh giá TILs và nhuộm HMMD để đánh giá PD-L1
Chúng tôi đã chọn khối nến và thực hiện kỹ thuật TMA với đường kính 5 mm Để đánh giá PD-L1 và các dấu ấn khác, chúng tôi đã đọc lam HMMD và bổ sung các dữ liệu liên quan vào phiếu thu thập số liệu tương ứng.
Nhập liệu vào phần mềm trực tuyến REDCAP để quản lý thông tin và kiểm tra, theo dõi mức độ hoàn thiện của dữ liệu nghiên cứu.
Phương pháp phân tích dữ liệu
2.8.1 Quản lý thông tin và phân tích dữ liệu
Sau khi thu thập phiếu dữ liệu, nhóm nghiên cứu sẽ kiểm tra tính hoàn thiện của thông tin Những thông tin thiếu sót hoặc nghi ngờ về độ chính xác sẽ được liệt kê và đối chiếu với hồ sơ bệnh án gốc Các trường hợp nghiên cứu sẽ được ghi nhận đầy đủ thông tin và tiến hành mã hóa dữ liệu.
Dữ liệu được nhập bằng phần mềm EpiData phiên bản 4.6.0.4, một công cụ miễn phí với chức năng kiểm tra trong quá trình nhập liệu, do nhóm nhập liệu đã được đào tạo thực hiện Khoảng 10% tổng số mẫu (n = 22) đã được nghiên cứu viên chính chọn ngẫu nhiên và nhập lại lần thứ hai để xác minh độ chính xác của cơ sở dữ liệu so với phiếu thu thập dữ liệu Nếu tỷ lệ số liệu sai lệch trên 1%, chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra toàn bộ số liệu đã nhập (n = 216).
Sau khi hoàn tất việc nhập dữ liệu, mức độ hợp lý của dữ liệu sẽ được kiểm tra dựa trên phạm vi dữ liệu cho biến định lượng và phân phối tần suất cho biến định tính, cùng với việc kiểm tra chéo giữa các biến Những bất hợp lý được phát hiện sẽ được xem xét lại và đối chiếu với phiếu thu thập số liệu Các
2.8.2 Lập bảng thống kê về tần suất, tỷ lệ và liên quan giữa các biến số
Trung bình và độ lệch chuẩn được sử dụng để mô tả các biến định lượng như tuổi và kích thước khối u, trong khi trung vị và khoảng tứ phân vị thích hợp để báo cáo dữ liệu định lượng có phân phối không bình thường, chẳng hạn như số lượng hạch di căn Đối với dữ liệu định tính như phân nhóm phân tử carcinôm vú, biểu hiện TILs và PD-L1, tần số và tỷ lệ phần trăm là những chỉ số chính được sử dụng Để ước tính tỷ lệ biểu hiện TILs và tỷ lệ PD-L1 trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu, chúng tôi tính khoảng tin cậy 95% cho tỷ lệ này.
2.8.2.2 Thống kê phân tích Để xác định mối liên quan giữa tỷ lệ biểu hiện của TILs và PD-L1 (có/không) với các đặc điểm của lâm sàng và giải phẫu bệnh của các đối tượng nghiên cứu dạng định tính (nhóm tuổi, phân nhóm phân tử, độ mô học) thì kiểm định Chi bình phương được sử dụng Khi có 25% vọng trị 10% (Bảng 3.1) Hình 3.4 minh họa rõ nét sự biểu hiện của TILs.
Hình 3.4 A Không có biểu hiện TILs (≤10%); B Có biểu hiện TILs (>10%)
Trong nghiên cứu về tỷ lệ biểu hiện của TILs, nhóm bệnh nhân dưới 50 tuổi có tỷ lệ đạt 45%, trong khi nhóm trên 50 tuổi chỉ đạt 30,1% Đối với bệnh nhân chưa mãn kinh, tỷ lệ biểu hiện TILs là 45,5%, so với 25,5% ở nhóm đã mãn kinh Ngoài ra, bệnh nhân có chỉ số khối cơ thể (BMI) ≥25 kg/m² có tỷ lệ biểu hiện TILs là 18,9%.
Bệnh nhân có tiền căn bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) có tỷ lệ biểu hiện của TILs là 20,5%, trong khi bệnh nhân không bị đái tháo đường có tỷ lệ cao hơn, đạt 39% Đối với bệnh nhân không có tiền căn bệnh lý tuyến vú lành tính, tỷ lệ biểu hiện TILs là 36,3%, trong khi bệnh nhân có tiền căn bệnh lý tuyến vú lành tính chỉ đạt 26,7% Đáng chú ý, tỷ lệ biểu hiện TILs ở những bệnh nhân tự phát hiện u là 43,2%, nhưng chỉ có 29,8% ở nhóm bệnh nhân được phát hiện qua kiểm tra định kỳ.
3.2.2 Tỷ lệ biểu hiện TILs ở các đặc điểm giải phẫu bệnh của bệnh nhân
Trong nghiên cứu về tỷ lệ biểu hiện TILs ở bệnh nhân, nhóm có kích thước khối u ≤2 cm có tỷ lệ biểu hiện là 38,8%, trong khi nhóm có kích thước từ >2 đến ≤5 cm là 34,1% Đối với nhóm có khối u >5 cm, tỷ lệ này đạt 36,4% Tỷ lệ biểu hiện TILs giữa nhóm không có di căn và các nhóm có di căn hạch khác nhau tương đối đồng đều, khoảng 35% Đặc biệt, nhóm bệnh nhân có hơn 10 hạch di căn ghi nhận tỷ lệ biểu hiện TILs cao nhất, lên đến 45% (Bảng 3.2).
Mối liên quan giữa biểu hiện TILs và PD-L1 với đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh, các đặc điểm dấu ấn sinh học và đặc điểm kết cục bất lợi của bệnh nhân trong nghiên cứu
3.4.1 Mối liên quan giữa biểu hiện của TILs với đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh và các đặc điểm dấu ấn sinh học của bệnh nhân
3.4.1.1 Mối liên quan đơn biến giữa biểu hiện của TILs với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân
Chúng tôi tìm thấy biểu hiện của TILs có mối liên quan thuận với những bệnh nhân tự phát hiện hiện u (P = 0,042) (Bảng 3.1) Đặc điểm Tổng
OR (KTC 95%) P Biểu hiện ER Âm tính 65 (30,1) 27 (41,5) 38 (58,5) 1 -
Biểu hiện PR Âm tính 82 (38,0) 31 (37,8) 51 (62,2) 1 -
Biểu hiện HER2 Âm tính 150 (69,4) 44 (29,3) 106 (70,7) 1 -
Biểu hiện của TILs có mối liên quan nghịch với bệnh nhân trên 50 tuổi (P = 0,029), bệnh nhân đã mãn kinh (P = 0,002), chỉ số BMI ≥25 kg/m² (P = 0,004) và bệnh nhân có tiền sử mắc bệnh tiểu đường (P = 0,033) (Bảng 3.1).
Chúng tôi không tìm thấy mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện của TILs và tiền căn bệnh lý tuyến vú lành tính (P = 0,455) (Bảng 3.1)
3.4.1.2 Mối liên quan đơn biến giữa biểu hiện của TILs với các đặc điểm giải phẫu bệnh của bệnh nhân
Chúng tôi không phát hiện mối liên hệ thống kê có ý nghĩa giữa kích thước khối u, hạch di căn, xâm lấn mạch máu, loại mô học, độ mô học và giai đoạn bệnh với sự biểu hiện của TILs, với tất cả các giá trị P đều lớn hơn 0,05 (Bảng 3.2).
3.4.1.3 Mối liên quan đơn biến giữa biểu hiện của TILs với các đặc điểm dấu ấn sinh học của bệnh nhân
Biểu hiện của TILs có sự liên quan tích cực với bệnh nhân HER2 dương tính (P = 0,01), bệnh nhân có chỉ số Ki-67 ≥20% (P = 0,001), cũng như bệnh nhân thuộc phân nhóm phân tử tam âm (P = 0,001) và phân nhóm phân tử HER2 dương.
Chúng tôi tìm thấy mối liên quan nghịch của bệnh nhân có biểu hiện ER+ (P
10% 0,004
ST: viết tắt của Sinh thiết; PT: viết tắt của Phẫu thuật; TMA: viết tắt của Tissue Microarray
Mặc dù chỉ số khối cơ thể (BMI) chưa được nghiên cứu sâu về mối liên hệ với sự biểu hiện của TILs, nhưng nó đã được xác định là yếu tố nguy cơ cho bệnh lý carcinôm vú xâm lấn Một phân tích tổng hợp đã xem xét hơn
Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy, ở phụ nữ sau mãn kinh, chỉ số BMI cao có liên quan đến nguy cơ mắc carcinôm vú xâm lấn, với nguy cơ tương đối RR = 1,1 cho mỗi 5 đơn vị BMI Mối liên hệ này có thể do sự chuyển đổi tiền chất estrogen từ mô mỡ thành estrogen, cho thấy ngay cả phụ nữ có BMI bình thường nhưng tỷ lệ mỡ cơ thể cao cũng có thể đối mặt với nguy cơ này Một nghiên cứu trên 3.460 phụ nữ mãn kinh có BMI bình thường chỉ ra rằng, những người có tỷ lệ mỡ cơ thể cao nhất có nguy cơ mắc carcinôm vú xâm lấn gấp 1,89 lần so với nhóm có tỷ lệ mỡ thấp nhất Do đó, chỉ số BMI được xem là yếu tố nguy cơ quan trọng liên quan đến tình trạng biểu hiện của TILs trong ung thư vú, đặc biệt ở phụ nữ đã mãn kinh.
Mối liên quan giữa biểu hiện TILs với tiền căn bệnh đái tháo đường
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy bệnh lý đái tháo đường có mối liên quan chặt chẽ với biểu hiện của TILs, với sự giảm khoảng 60% biểu hiện TILs ở nhóm bệnh nhân đái tháo đường so với nhóm không có bệnh này (OR = 0,40, khoảng tin cậy 95% là 0,18 – 0,93) Tuy nhiên, nghiên cứu trước đó của tác giả Feng J trên 826 bệnh nhân Trung Quốc không ghi nhận mối liên quan này.
Bảng 4.6 So sánh tiền căn đái tháo đường, TILs với nghiên cứu trước
Tiền căn đái tháo đường Cỡ mẫu
Tỷ lệ TILs (%) Quốc gia Bệnh phẩm Ngưỡng cắt P
Chúng tôi 216 Việt Nam TMA >10% 0,033
ST: viết tắt của Sinh thiết; PT: viết tắt của Phẫu thuật; TMA: viết tắt của Tissue Microarray
Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh mãn tính phổ biến toàn cầu, và một số nghiên cứu đã chỉ ra mối liên hệ giữa ĐTĐ và nguy cơ phát triển carcinôm vú xâm lấn Cụ thể, phụ nữ mắc bệnh đái tháo đường týp 2 có nguy cơ cao hơn bị carcinôm vú xâm lấn, có thể do nồng độ estrogen giảm do tình trạng kháng insulin Mặc dù đặc điểm tiền căn bệnh đái tháo đường chưa được nghiên cứu nhiều liên quan đến biểu hiện của TILs trong ung thư vú, nhưng đây có thể là một dấu ấn tiềm năng cho các nghiên cứu trong tương lai Do sự khác biệt giữa các dân số, cần tiếp tục nghiên cứu để làm rõ đặc điểm biểu hiện của TILs trong bệnh lý ung thư vú.
Mối liên quan giữa biểu hiện TILs với tiền căn bệnh lý tuyến vú lành tính
Biểu hiện của tế bào lympho xâm nhập (TILs) ở bệnh nhân có tiền căn bệnh lý tuyến vú lành tính và bệnh nhân không có tiền căn này tương tự nhau (OR = 0,64, khoảng tin cậy 95% là 0,20 – 2,07) Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các bệnh lý tuyến vú lành tính, đặc biệt là tổn thương tăng sinh, có liên quan đến nguy cơ cao hơn của carcinôm vú xâm lấn (RR = 1,76, khoảng tin cậy 95% là 1,58-1,96) Mặc dù tiền căn bệnh lý tuyến vú có thể ảnh hưởng đến biểu hiện của TILs ở bệnh nhân mắc carcinôm vú xâm lấn, nhưng hiện tại vẫn còn rất ít nghiên cứu khảo sát yếu tố này.
4.3.1.2 Mối liên quan giữa biểu hiện của TILs với đặc điểm giải phẫu bệnh của bệnh nhân
Mối liên quan giữa biểu hiện của TILs với kích thước khối u
Biểu hiện của TILs trong nhóm bệnh nhân có đường kính u từ >2 đến ≤5 cm giảm 19% so với nhóm bệnh nhân có đường kính u ≤2 cm (OR = 0,81, khoảng tin cậy 95% là 0,44 – 1,49) Đối với bệnh nhân có đường kính u >5 cm, biểu hiện của TILs chỉ giảm 10% so với nhóm có đường kính u ≤2 cm (OR = 0.90, khoảng tin cậy 95% là 0,24 – 3,38) Nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện của TILs và kích thước u, điều này cũng được xác nhận trong một số nghiên cứu trước đó của tác giả Feng J trên 826 đối tượng nghiên cứu người Trung Quốc.
Bảng 4.7 So sánh đặc điểm kích thước u, TILs với nghiên cứu trước Đặc điểm kích thước u Cỡ mẫu
Tỷ lệ TILs (%) Quốc gia Bệnh phẩm Ngưỡng cắt P
Denkert C 127 3.771 Đức ST ≥11% 50% 0,02 cT1-2 102 - 30.4 - - cT3-4 146 - 17,8 - -
Chúng tôi 216 Việt Nam TMA >10% -
ST: viết tắt của Sinh thiết; PT: viết tắt của Phẫu thuật; TMA: viết tắt của Tissue Microarray
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng kích thước u có mối liên quan thống kê với biểu hiện của TILs Nghiên cứu của Denker C trên 3.771 bệnh nhân người Đức phân chia kích thước u thành 5 nhóm từ T1 đến T4 và ghi nhận rằng tuổi tác có ảnh hưởng đến biểu hiện của TILs với ngưỡng cắt là 11% Tương tự, nghiên cứu của Hwang HW trên 248 bệnh nhân người Hàn Quốc cũng cho thấy sự liên quan giữa biểu hiện của TILs và độ tuổi, được chia thành 2 nhóm Điều này cho thấy kích thước u có thể là yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện của TILs, mặc dù mối liên quan này có thể khác nhau giữa các dân số khác nhau.
Mối liên quan giữa biểu hiện của TILs với số lượng hạch di căn