Luận văn thạc sĩ khoa học nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng hbv rna huyết tương ở bệnh nhân viên gan b mạn tính

Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.. Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nh

TỔNG QUAN

Tổng quan về HBV

1.1.1 Đặc điểm phân loại HBV

Hepatitis B virus (HBV) là một thành viên của họ Hepadnaviridae [130]

Virus thuộc họ này được đặt tên do chúng gây ra các bệnh viêm gan (hepatitis) và có genome là DNA Một số virus trong họ này có khả năng lây nhiễm cho động vật có vú và chim, như woodchuck HBV và heron HBV Trong số đó, HBV nổi bật nhất vì khả năng lây nhiễm ở người và là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh gan ở con người.

Các virus thuộc họ Hepadnaviridae đều có những đặc điểm chung như sau [121]:

- Hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh bao gồm 2 sợi: sợi âm đầy đủ và sợi dương không đầy đủ

- Nhân lên thông qua mạch khuôn là pre-genomic RNA (pgRNA)

- Có mức độ đặc trưng về mô và loài cao

Nghiên cứu về các virus viêm gan B (HBV) đã thu hút sự chú ý từ lâu vì hai lý do chính: đầu tiên, mặc dù có bộ gen nhỏ, các virus này vẫn có khả năng mã hóa protein và kiểm soát biểu hiện gen của chính chúng; thứ hai, bộ gen DNA của các virus này được nhân lên thông qua trung gian RNA, cho thấy sự khác biệt lớn so với các virus DNA có khả năng nhân lên trực tiếp Ngoài ra, quá trình nhân lên thông qua RNA cũng được phát hiện ở một số loài thực vật, khiến các virus này, cùng với HBV, được gọi là Pararetrovirus.

Nghiên cứu về giải trình tự nucleotide của virus viêm gan B (HBV) đã xác định 8 tuýp virus (A-H) dựa trên sự khác biệt trình tự lớn hơn 8% và không vượt quá 17% Các tuýp này có sự phân bố địa lý khác nhau: tuýp A và D chủ yếu xuất hiện ở Châu Phi, Châu Âu và Ấn Độ, trong khi tuýp B và C thường thấy ở Châu Á Tuýp E được phân bố tại các khu vực khác.

Luận văn thạc sĩ Khoa học

Tây Phi và tuýp F đã được ghi nhận xuất hiện tại cả Trung và Nam Mỹ Mặc dù sự phân bố của tuýp G và H vẫn chưa rõ ràng, nhưng có báo cáo cho thấy chúng đã xuất hiện ở Trung Mỹ và Nam Âu Nghiên cứu cũng chỉ ra sự xuất hiện của các tuýp virus mới, như tuýp I có độ tương đồng cao với tuýp C, được phát hiện ở một số quốc gia Đông Nam Á như Việt Nam, Lào và Đông Ấn Tuýp J, được phát hiện ở một người Nhật Bản sống tại Borneo, là dạng tái tổ hợp giữa tuýp C và HBV ở vượn Các tuýp A, B, C, D, F, I có thể được phân loại thành các nhóm nhỏ hơn dựa trên sự khác biệt khoảng 4% nucleotide.

Có 44 nhóm các tuýp phụ: A1–6, B1–9, C1–16, D1–7, F1–4 và I1–2 [54, 84] Thêm vào đó, còn có một số dạng tái tổ hợp của các tuýp như đã kể trên, nhưng phần lớn là các dạng tái tổ hợp B/C và C/D, trong khi các tái tổ hợp giữa các tuýp khác xảy ra ít hơn các trường hợp kể trên [8]

1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV

Dưới kính hiển vi điện tử, virus viêm gan B (HBV) xuất hiện dưới ba loại tiểu thể khác nhau: tiểu thể hình cầu nhỏ (đường kính 22 nm), tiểu thể hình ống (kích thước 22 nm, chiều dài 40-400 nm) và tiểu thể hình cầu lớn (kích thước 42-45 nm) Tiểu thể hình cầu nhỏ và hình ống là thành phần vỏ của HBV, được sản sinh dư thừa trong quá trình nhân lên, tạo thành kháng nguyên bề mặt (HBsAg) Những tiểu thể này có thể tồn tại độc lập hoặc kết hợp thành từng đám, nhưng chúng không có khả năng lây truyền bệnh.

[48] Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Đây chính là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp:

- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein Lớp này có các kháng nguyên bề mặt (HBsAg) [28]

Lớp lõi của virus viêm gan B (HBV) có cấu trúc capsid đối xứng hình hộp, chứa các kháng nguyên lõi HBcAg Bên trong lớp lõi này, virus mang theo bộ gen HBV, bao gồm hai sợi DNA đóng vòng không kín, cùng với enzyme phiên mã ngược polymerase và protein kinase.

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [100]

(A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane); (B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C)

1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV

Cấu trúc nucleocapsid của virus viêm gan B (HBV) chứa gen dài khoảng 3,2 kilobase (kb) dưới dạng DNA sợi đôi không hoàn chỉnh, cụ thể là dạng vòng không kín hoàn toàn (rcDNA) Nucleocapsid có hình dạng nhị thập diện, được tạo thành từ 240 phân tử protein capsid với đường kính khoảng 27 nm, và mỗi nucleocapsid chứa một bản sao DNA của virus cùng enzyme polymerase liên kết với đầu 5’ của sợi âm Ngoài ra, một số protein của tế bào như protein kinase cũng được đóng gói trong nucleocapsid Một đặc điểm nổi bật của hệ gen HBV là cấu trúc bất đối xứng giữa hai sợi, trong đó sợi âm được tổng hợp đầy đủ và có chiều dài tương đương với kích thước hệ gen, trong khi sợi dương bổ sung lại có sự khác biệt với sợi âm.

Chiều dài của sợi dương vẫn chưa được nghiên cứu chính xác và có sự biến đổi theo từng tuýp, từng dòng Đặc biệt, cả sợi âm và sợi dương đều là DNA dạng thẳng, nhưng nhờ sự bổ sung giữa hai sợi, chúng hình thành cấu trúc vòng rcDNA.

The viral genome contains overlapping open reading frames (ORFs) designated as S, C, P, and X, which encode four distinct proteins This overlapping structure of coding regions enables the virus to utilize its genome with an efficiency of 150%.

- Gen PreS1/PreS2 và S (mã hóa cho 3 protein vỏ L-, M- và S)

- Gen precore/core (mã hóa cho protein nucleocapsid; HBcAg và các protein không cấu trúc; HBeAg)

- Gen polymerase (enzyme reverse transcriptase, RNase H)

- Gen X (mã hóa cho protein điều hòa X)

Các gen S và C nằm ở các ORF riêng biệt với các bộ ba mã mở đầu khác nhau, tạo ra các sản phẩm gen có chức năng đa dạng ORF S và C kéo dài đến preS1 và vùng preC ở đầu 5’ Trong các vùng ORF chồng chéo, có sự hiện diện của các gen điều hòa và hai trình tự tăng cường, cho phép biểu hiện của 7 protein khác nhau từ ít nhất 5 mRNA khác nhau Sản phẩm phiên mã đầu tiên dài 0,7 kb mã hóa cho protein HBx, trong khi các sản phẩm dài 2,1 kb và 2,4 kb mã hóa cho M- và S-HBsAg, L-HBsAg Pregenomic RNA (pgRNA) là sản phẩm mã hóa cho cả protein core và polymerase, đóng vai trò là mạch khuôn cho quá trình tổng hợp virus HBV và được phiên mã ngược để hình thành hệ gen DNA của virus Hệ gen của virus dài 3,2 kb, trong khi pgRNA dài 3,5 kb, là bản sao "dự phòng" của hệ gen virus Hai vùng gen với 11 nu lặp lại được gọi là DR1 và DR2 nằm ở đầu 5’ trên cả sợi âm và sợi dương.

Hai trình tự tăng cường (enhancer) Enh1 và Enh2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của DNA virus, giúp tăng cường biểu hiện của các sản phẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan.

Vùng ORF S mã hóa cho các protein bề mặt của virus, trong đó HBsAg có cấu trúc phân chia tại các vùng preS1, preS2 và S với ba bộ ba mã mở đầu AUG khác nhau HBsAg loại L đóng vai trò quan trọng trong việc liên kết với các thụ thể, được dịch mã từ mRNA preS1, chứa các miền preS1, preS2 và S.

M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107]

Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV

Hệ gen HBV mã hóa cho bảy protein chính: HBx, core, polymerase, L-, M- và HBsAg Trong số này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào cấu trúc virus, trong khi HBeAg cũng không cấu thành virion và được giải phóng riêng biệt khỏi tế bào Polymerase đóng vai trò quan trọng trong việc nhân lên của hệ gen, còn protein core và HBsAg có chức năng hình thành cấu trúc virion Chi tiết về chức năng của từng protein virus HBV sẽ được trình bày ở phần dưới đây.

HBeAg là sản phẩm cuối cùng của quá trình dịch mã ORF precore, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định sự hoạt động của virus Đây là một trong những protein được mã hóa từ sản phẩm phiên mã của bộ gen virus, góp phần vào quá trình lây nhiễm và phát triển bệnh.

Tổng quan về viêm gan B mạn tính

Nồng độ DNA HBV trong huyết thanh vượt quá 20,000 IU/mL (10^5 copy/mL) thường được ghi nhận, trong khi giá trị thấp hơn khoảng 2,000-20,000 IU/mL (10^4-10^5 copy/mL) thường gặp ở những bệnh nhân viêm gan B mạn tính có HBeAg âm tính.

 Nồng độ ALT/AST tăng cao liên tục và kéo dài

 Sinh thiết gan cho thấy mức độ viêm gan vừa hoặc nặng

Viêm gan B mạn tính là tình trạng viêm hoại tử gan kéo dài do nhiễm virus HBV trên 6 tháng, được chia thành hai thể là HBeAg dương tính và HBeAg âm tính Nếu không được điều trị kịp thời, viêm gan B mạn tính có thể dẫn đến xơ gan hoặc ung thư gan (HCC).

Triệu chứng lâm sàng thường ít và không rõ ràng, bao gồm mệt mỏi, đau ở hạ sườn phải, vàng da và ngứa do tắc mật Khám lâm sàng có thể phát hiện gan to vừa, đôi khi kèm theo đau, và có thể thấy lách to.

1.2.2 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Nhiễm HBV là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu, ước tính khoảng

Trên toàn thế giới, khoảng 248 triệu người mang virus HBV, với tỷ lệ tử vong có thể lên đến 600.000 người mỗi năm do các bệnh lý liên quan Mặc dù đã có vaccine hiệu quả cao từ những năm 1980 và chương trình tiêm chủng được triển khai tại hơn 168 quốc gia, bệnh gan do nhiễm mạn tính HBV vẫn tiếp tục là một gánh nặng lớn cho xã hội.

Virus viêm gan B (HBV) thuộc họ Hepadnviridae, có khả năng phiên mã ngược từ RNA như retrovirus HBV gây ra nhiễm thoáng qua và mạn tính ở gan, với khoảng 0,5% trường hợp nhiễm thoáng qua dẫn đến tử vong do viêm gan cấp tính Nhiễm viêm gan B mạn tính có thể gây ra hậu quả nghiêm trọng, với khoảng 25% bệnh nhân tiến triển đến ung thư gan Mỗi năm, số ca tử vong do ung thư gan liên quan đến HBV trên toàn cầu có thể lên tới một triệu người.

Trên toàn cầu, khoảng hai tỷ người đã từng nhiễm virus viêm gan B (HBV), trong đó có 248 triệu người mắc viêm gan B mạn tính, với tỷ lệ dương tính HBsAg là 3,6% Tỷ lệ này có sự biến động theo từng khu vực, cụ thể là dưới 2% ở Mỹ, Canada và Tây Âu, trong khi các quốc gia vùng Địa Trung Hải và Nhật Bản có tỷ lệ trung bình từ 2-7%.

Trung Á, Trung Đông và một vài nước Nam Mĩ; và các nước có tỷ lệ cao (trên 8%) là các nước ở Tây Phi, Nam Sudan [78, 93, 125]

Sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính trên thế giới chủ yếu liên quan đến độ tuổi, với nguy cơ tiến triển thành mạn tính có mối liên quan nghịch Tỷ lệ chuyển từ nhiễm HBV cấp tính sang mạn tính đạt khoảng 90% ở những trường hợp nhiễm trong thai kỳ, từ 20-50% ở trẻ em từ 1 đến 5 tuổi, và dưới 5% ở người trưởng thành.

1.2.3 Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam Ở Việt Nam có rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV nước ta đứng hàng cao nhất thế giới Tần suất HBsAg dương tính ở người lớn từ 15 đến 21% thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người mang HBV mạn tính [2] Tỷ lệ mang anti-HBs trên 60%, tuy vậy tỷ lệ nhiễm HBV ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng tác giả cũng khác nhau

HBV là nguyên nhân chính gây ra các bệnh gan, dẫn đến viêm gan cấp tính và mạn tính Nó có thể gây ra các biến chứng nghiêm trọng như viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan, khiến HBV trở thành một vấn đề sức khỏe toàn cầu cần được chú ý.

Hiện nay, interferon-α (IFN), interferon-α duy trì (Peg-IFN) và các thuốc kháng virus đồng đẳng nucleos(t)ide (NAs) là những phương pháp điều trị chính cho viêm gan B mạn tính (CHB) IFN không chỉ có khả năng kháng virus mà còn hỗ trợ hệ miễn dịch, trong khi các thuốc kháng virus đồng đẳng nucleoside như lamivudine, entecavir, telbivudine và các thuốc đồng đẳng nucleotide như adefovir, tenofovir ức chế hoạt động của DNA polymerase virus HBV, ngăn chặn quá trình phiên mã ngược từ RNA sang DNA Mặc dù các thuốc này giúp giảm sự nhân lên của HBV và cải thiện tình trạng viêm gan, nhưng không có loại nào hoàn toàn trị khỏi bệnh.

Hiện nay, có 18 loại thuốc được sử dụng để điều trị nhiễm HBV, tuy nhiên, chúng thường không thể loại bỏ hoàn toàn virus Do đó, việc tìm kiếm các phân tử đích hiệu quả cho các loại thuốc kháng HBV mới là rất cần thiết để chữa trị triệt để cho bệnh nhân Các phân tử đích này có thể liên quan đến quá trình nhiễm và nhân lên của virus HBV Hiểu rõ về bản chất sinh học và chu trình sống của virus HBV sẽ giúp xác định các phân tử đích cho thuốc kháng virus, từ đó phát triển các phương pháp điều trị mới có khả năng loại bỏ hoàn toàn virus HBV.

Tình hình nghiên cứu HBV

1.3.1 Trên thế giới a) Các dấu ấn virus học ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

 Kháng nguyên bề mặt HBsAg

HBsAg là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBV), xuất hiện sớm sau khi virus xâm nhập, thường khoảng vài tuần trước khi triệu chứng lâm sàng xuất hiện Đây là chỉ tiêu quan trọng, cung cấp bằng chứng rõ ràng về tình trạng nhiễm HBV ở người bệnh.

Anti-HBs: là kháng thể sinh ra do đáp ứng với kháng nguyên bề mặt của

Anti-HBs là chỉ số cho thấy tình trạng đã khỏi bệnh hoặc miễn dịch đối với virus viêm gan B (HBV) Chỉ số này thường xuất hiện khoảng 3 tháng sau khi bệnh khởi phát và thường xuất hiện trong khoảng 1-10 tuần sau khi HBsAg trở thành âm tính.

HBcAg là kháng nguyên cấu trúc của nucleocapsid (kháng nguyên lõi), thường được phát hiện trong nhân tế bào gan nhiễm virus viêm gan B (HBV) và không bao giờ xuất hiện trong máu.

 Anti-HBc: là dấu ấn rất quan trọng để khẳng định bệnh nhân đã từng nhiễm

HBV và anti-HBc không được tạo ra từ việc tiêm chủng Các lớp kháng thể của anti-HBc có vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán giai đoạn cấp tính hoặc mạn tính của nhiễm HBV Trong giai đoạn viêm gan B cấp tính, nồng độ anti-HBc IgM dương tính là một chỉ số quan trọng.

Trong giai đoạn cấp tính của viêm gan B, nồng độ anti-HBc IgM sẽ tăng cao và sau đó giảm dần, cuối cùng biến mất trong giai đoạn mạn tính, khi chỉ còn lại anti-HBc IgG dương tính Tuy nhiên, anti-HBc IgM vẫn có thể xuất hiện trong các đợt kịch phát cấp tính của viêm gan B mạn tính.

HBeAg, có nguồn gốc gen tương tự như HBcAg, được sản xuất chủ yếu trong giai đoạn nhân lên của virus Kháng nguyên này đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá tình trạng tiến triển hoặc tiềm tàng của virus viêm gan B (HBV) trong cơ thể người bệnh, cũng như khả năng lây nhiễm cho người khác, bao gồm vợ/chồng và con cái.

Anti-HBe là dấu hiệu của sự chuyển đảo huyết thanh, khi anti-HBe chuyển từ âm tính sang dương tính và HBeAg từ dương tính sang âm tính Hiện tượng này cho thấy sự giảm dần hoặc chấm dứt sự nhân lên của virus viêm gan B (HBV).

HBV DNA dương tính cho thấy virus đang hoạt động và nhân lên mạnh mẽ trong tế bào ký chủ Trong điều trị viêm gan B mạn tính, nồng độ HBV DNA là chỉ số quan trọng quyết định phác đồ điều trị và tiên lượng sau điều trị Hiện nay, các xét nghiệm định lượng virus học đóng vai trò thiết yếu trong việc theo dõi và đánh giá tình trạng bệnh.

Hầu hết các xét nghiệm định lượng HBV DNA hiện nay trên lâm sàng đều dựa vào phương pháp khuếch đại chuỗi phản ứng polymerase (PCR), với ngưỡng phát hiện từ 50 đến 200 IU/ml (tương đương 250-1000 bản sao/ml) và khả năng đo lường lên đến 4-5 log 10 IU/mL Gần đây, công nghệ PCR đã được cải tiến để nâng cao độ nhạy trong xét nghiệm HBV DNA.

Tải lượng HBV DNA, với khả năng đo lên tới 8-9 log10 IU/mL, là dấu ấn quan trọng trong việc đánh giá bệnh nhân viêm gan B mạn tính và là cơ sở để áp dụng các biện pháp điều trị chống virus hiệu quả.

Một thách thức trong việc sử dụng nồng độ HBV DNA trong huyết tương để đánh giá là xác định giới hạn có ý nghĩa cho chỉ định điều trị và đánh giá đáp ứng Nồng độ HBV DNA thấp có thể không liên quan, vì nó vẫn tồn tại trong huyết thanh của những người đã hồi phục sau nhiễm HBV cấp tính.

Mục tiêu điều trị bệnh gan, đặc biệt là viêm gan B mạn tính, là loại bỏ hoàn toàn virus, tuy nhiên điều này thường không khả thi Tại hội nghị NIH năm 2000, giá trị chuẩn 20,000 IU/mL (10^5 copy/mL) đã được xác định làm tiêu chuẩn chẩn đoán cho tình trạng này.

Viêm gan B mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát (HCC) có thể xuất hiện ở bệnh nhân có nồng độ HBV DNA biến động từ không xác định cho đến trên 2,000,000 IU/mL.

 Định lượng HBeAg và HBsAg

Nồng độ HBV DNA không phải là yếu tố duy nhất ảnh hưởng đến tiến triển tự nhiên của bệnh viêm gan B; các kháng nguyên như HBeAg và HBsAg cũng có mối liên hệ quan trọng với sự đáp ứng của bệnh nhân đối với điều trị kháng virus.

Sự phát triển của các xét nghiệm định lượng kháng nguyên virus, đặc biệt là HBeAg và HBsAg, đã trở thành trọng tâm trong nghiên cứu lâm sàng giai đoạn tiếp theo.

Tính mới và tính sáng tạo của đề tài

Mục tiêu điều trị viêm gan B mạn tính là nâng cao chất lượng cuộc sống và kéo dài tuổi thọ bằng cách ngăn ngừa sự tiến triển của xơ gan, xơ gan mất bù, bệnh gan giai đoạn cuối, ung thư biểu mô tế bào gan và tử vong.

Việc ức chế và duy trì sự sao chép của virus viêm gan B (HBV) có thể giúp đạt được 24 tiêu chí quan trọng Giảm nồng độ HBV DNA và cải thiện hoạt động mô học trong viêm gan B mạn tính sẽ làm giảm nguy cơ xơ gan và ung thư gan (HCC), đặc biệt ở những bệnh nhân đã bị xơ gan Tuy nhiên, nhiễm HBV mạn tính không thể được loại bỏ hoàn toàn do sự tồn tại của DNA hình tròn đóng kín (cccDNA) trong nhân tế bào gan nhiễm HBV Hơn nữa, gen của HBV có thể tích hợp vào bộ gen của vật chủ, dẫn đến nguy cơ phát sinh ung thư.

Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra rằng các dấu ấn virus viêm gan B như HBV DNA, HBeAg, HBsAg đóng vai trò quan trọng trong việc quản lý bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có mô hình nào có khả năng dự đoán chính xác đáp ứng virus sớm trong điều trị cũng như đáp ứng virus bền vững sau khi kết thúc điều trị, điều này ảnh hưởng đến hiệu quả trong thực hành lâm sàng.

Hiện nay, các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính được cấp phép bao gồm Peg-IFN α-2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside (nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir, và Tenofovir Việc ức chế lâu dài sự tái bản của virus HBV bằng NAs giúp giảm thiểu các biến chứng liên quan đến nhiễm HBV, tuy nhiên, thời gian điều trị với NAs vẫn chưa được xác định và hầu hết bệnh nhân cần điều trị suốt đời Một số bệnh nhân có thể trải qua sự chuyển đảo HBeAg huyết thanh, với sự biến mất của HBeAg và sự xuất hiện của anti-HBe, điều này được công nhận là một dấu mốc quan trọng trong quá trình điều trị nhiễm HBV mạn tính Chuyển đảo HBeAg huyết thanh là điều kiện tiên quyết cho sự chuyển đảo HBsAg huyết thanh, cả hai đều thể hiện sự thuyên giảm ổn định của nhiễm HBV và cho phép ngừng điều trị Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện tại vẫn chưa xác định được công cụ hiệu quả để dự đoán sự chuyển đảo HBeAg trong quá trình điều trị bằng NAs.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều trị bằng thuốc kháng virus (NAs) giúp giảm mạnh nồng độ HBV DNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Việc ức chế tổng hợp DNA không loại bỏ hoàn toàn cccDNA trong nhân tế bào gan nhiễm HBV, dẫn đến sự phục hồi HBV DNA trong huyết tương khi ngừng điều trị Nồng độ HBsAg có thể là yếu tố tiên lượng cho đáp ứng điều trị và các biến chứng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính Tuy nhiên, do HBsAg được sản xuất dư thừa trong máu ngoại vi, nó không phản ánh chính xác mức độ cccDNA trong tế bào gan, làm giảm giá trị tiên lượng của HBsAg đối với sự nhân lên của HBV.

Việt Nam đang đối mặt với tỉ lệ lưu hành HBV cao nhất thế giới, khiến nhiễm HBV mạn tính trở thành một vấn đề y tế nghiêm trọng Việc thiết lập các công cụ theo dõi và kiểm soát điều trị là cần thiết để hạn chế sự lây nhiễm trong cộng đồng Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào trong nước làm rõ ý nghĩa lâm sàng của tải lượng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính Các nghiên cứu quốc tế về định lượng HBV pgRNA vẫn còn hạn chế về số lượng bệnh nhân Do đó, cần thiết phải xây dựng quy trình định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao cho bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng đồng đẳng nucleoside tại Việt Nam.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu

Bệnh nhân viêm gan B mạn tính (CHB) được nghiên cứu với cỡ mẫu 77 bệnh nhân nhằm đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA sau khi tối ưu hóa Nghiên cứu so sánh quy trình này với các phương pháp định lượng HBV pgRNA hiện có trên thế giới Nhóm chứng bao gồm 50 người khoẻ mạnh để xây dựng panel độ đặc hiệu, cùng với 5 mẫu bệnh nhân viêm gan C được sử dụng trong nghiên cứu Quy trình tối ưu RT-qPCR sẽ được thiết kế với các mẫu chuẩn dương trong phần tiếp theo.

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu bao gồm chẩn đoán nhiễm HBV mạn tính, theo tiêu chuẩn của Hiệp hội gan mật Mỹ năm 2018 Bệnh nhân viêm gan vi rút B mạn tính được xác định dựa trên các tiêu chí cụ thể nhằm đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy trong nghiên cứu.

 HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti-HBc IgG (+)

 HBV DNA ≥ 10 5 copy/mL ở nhóm HBeAg (+) và ≥10 4 copy/mL ở nhóm HBeAg (-)

 ALT tăng liên tục hay từng đợt

Tiêu chuẩn chọn nhóm chứng:

Nhóm chứng bao gồm những cá nhân khỏe mạnh, không mắc bệnh lý về gan Tất cả các đối tượng trong nhóm này đã được khám và xét nghiệm chức năng gan cũng như các dấu ấn virus viêm gan trước khi tiến hành thu thập mẫu máu.

Loại trừ những bệnh nhân ra khỏi nhóm bệnh nhân nghiên cứu khi có các tình trạng sau:

+ Đồng nhiễm virus viêm gan khác hoặc HIV

+ Bệnh nhân có tổn thương gan do nguyên nhân khác: rượu, do thuốc, do hóa chất, do bệnh gan tự miễn

+ Bệnh nhân đang trong giai đoạn thai kỳ và đang cho con bú

+ Bệnh nhân mắc các bệnh kết hợp như đái tháo đường, viêm đường mật

+ Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị

STT Thiết bị Hãng sản xuất

1 Máy đo nồng độ DNA Mỹ

3 Máy ly tâm Hàn Quốc

4 Tủ an toàn sinh học cấp độ Hàn Quốc

6 Khối ổn nhiệt có lắc Mỹ

Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu

TT Tên hóa chất Hãng sản xuất

1 Hóa chất dùng trong tách chiết RNA tổng số

QIAamp MinElute Virus vacuum Kit QIAGEN

2 Hóa chất dùng trong phản ứng RT-qPCR

1 Quantitect probe master mix QIAGEN

4 Nước khử deion DNA/RNAse Free Thermo Scientific

Phương pháp nghiên cứu

Thiết lập tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tối ưu quy trình RT- qPCR

Thiết kế mồi, probe Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen đích Đánh giá quy trình

Thiết lập quy trình RT-qPCR

Thiết lập chứng dương, bộ mẫu chuẩn

2.2.2 Thu thập, bảo quản mẫu

- Quy trình thu thập mẫu, lưu trữ bảo quản:

+ Quy trình thu thập bảo quản mẫu được áp dụng cả ở khu vực điều trị bệnh nhân và phòng xét nghiệm

+ Các mẫu máu ngoại vi được bảo quản lạnh 4°C - 8°C và chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu, được gán mã riêng biệt

Quy trình lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi bao gồm việc lấy 5 ml máu vào ống chứa K2 EDTA Sau khi lấy mẫu, cần vận chuyển đến labo trong vòng 2 giờ để tách huyết tương bằng cách ly tâm ở 1500 g trong 10 phút, sau đó chuyển sang ống nhựa polypropylen Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng để phục vụ cho phân tích gen khi cần thiết Mẫu huyết tương và tế bào được lưu trữ ở tủ âm -80°C cho đến khi được phân tích.

RNA huyết tương được tách chiết bằng bộ kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit của QIAGEN theo quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất Sau đó, mẫu được xử lý bằng DNase I, RNase-free của Thermo Fisher Scientific để loại bỏ DNA trước khi tiến hành tách chiết RNA Quá trình này sử dụng 500 μL huyết tương để tách chiết RNA và thu được sản phẩm cuối cùng với thể tích 50 μL.

2.2.4 Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương a) Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV-RNA trong huyết tương bệnh nhân CHB

Vùng bảo tồn gen S có kích thước khoảng 1200 nucleotit, trong đó vùng N-terminal là vùng bảo tồn nhất, như đã được chứng minh trong phần tổng quan Vùng này sẽ được đánh dấu để thiết kế mồi và probe Bước tiếp theo là tiến hành đánh giá tính đa hình và các đột biến liên quan.

30 biến của vùng này để tìm ra vùng trình tự cụ thể cho thiết kế mồi/probe sử dụng phần mềm Clustalx

Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S

Sau khi thu thập các trình tự thích hợp từ GenBank, việc thiết kế mồi và probe được thực hiện với những trình tự đại diện nhất tại Việt Nam, được công bố bởi các nhóm nghiên cứu uy tín và có kết quả giải trình tự đáng tin cậy Để tối ưu hóa thiết kế mồi, vùng bảo tồn nhất của đầu N-terminal gen S được lựa chọn, sử dụng phần mềm Oligo Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights, Hoa Kỳ) - một công cụ chuyên dụng cho việc thiết kế mồi và probe trong các kỹ thuật khuếch đại gen.

Các ứng dụng như BLAST và primer3 được sử dụng để đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và hiệu suất của RT-qPCR, bao gồm nhiệt độ gắn mồi, tỷ lệ phần trăm GC, tỷ lệ phần trăm AT, khả năng xảy ra bắt cặp nhầm và sự hình thành dimer.

Những điểm cần chú ý khi thiết kế mồi/probe:

Thiết kế mồi cho real-time PCR sử dụng Taqman probe cần tuân theo các quy tắc chung của PCR Nhiệt độ nóng chảy của mồi nên nằm trong khoảng 55°C - 60°C và thấp hơn từ 5°C đến 10°C so với nhiệt độ nóng chảy của Taqman probe Việc thiết kế Taqman probe cũng cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo hiệu quả của phản ứng.

Khi thiết kế Taqman probe cho real-time PCR, cần đảm bảo chiều dài probe không vượt quá 30 nucleotide, với tỷ lệ G-C trong probe khoảng 30-80%, trong đó tỷ lệ C phải cao hơn G Vị trí bắt cặp của đầu 5’ của Taqman probe nên cách vị trí 3’ của mồi trên sợi đích từ 2-5 nucleotide Quan trọng là đầu 5’ gắn reporter không nên là G, vì G có thể hoạt động như quencher cho nhiều loại reporter Bên cạnh đó, chiều dài sản phẩm khếch đại cũng cần được duy trì trong khoảng 75 nucleotide.

Để đạt hiệu quả tối ưu trong phản ứng PCR, nồng độ nu nên duy trì dưới 150 nu Tuy nhiên, việc lựa chọn mồi tối ưu còn phụ thuộc vào trình tự gen đích Đánh giá trình tự mồi và probe có thể thực hiện thông qua phản ứng RT-qPCR để đảm bảo chất lượng sản phẩm khuếch đại.

Khả năng bắt cặp và khuếch đại gen đích của các trình tự mồi và probe được đánh giá thông qua phản ứng realtime RT-qPCR Bảng dưới đây trình bày thành phần phản ứng RT-qPCR, cho thấy khả năng khuếch đại của các cặp mồi và probe đặc hiệu với HBV pgRNA.

Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR

STT Thành phần Thể tớch (àl)

5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 3,78

Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR

Khuếch đại Biến tính 94 15 giây

N° chu kỳ: 45 Gắn mồi 60 30 giây

2.2.5 Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA a) Nghiên cứu thiết lập chứng dương RNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh

Chức năng chính của cccDNA là làm khuôn cho quá trình phiên mã tất cả các RNA của virus, bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tổng hợp DNA của virion Nghiên cứu này sử dụng RNA của HBV được tổng hợp in-vitro từ DNA tổng hợp nhân tạo có trình tự tương tự pgRNA, được chèn vào plasmid PJET1.2 Plasmid tái tổ hợp sau đó được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn.

XhoI từ đó phiên mã RNA in-vitro tạo chứng dương và tạo bộ mẫu chuẩn HBV pgRNA

Mẫu chứng âm được tách chiết từ huyết tương của người khỏe mạnh bằng bộ kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit Nghiên cứu cũng thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA tổng hợp in-vitro với các nồng độ xác định, đồng thời đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện.

Mẫu chứng dương pgRNA được tổng hợp thông qua quá trình phiên mã in-vitro và được tinh sạch bằng Liti Clorua Sau đó, nồng độ và độ tinh sạch của mẫu được đo và đánh giá trên hệ thống máy Nanodrop của Thermo Scientific, nhằm kiểm tra độ tinh sạch và tỉ lệ.

Mẫu RNA với thông số 260/280 và 260/230 đáp ứng yêu cầu cần thiết Sau khi tinh sạch, pgRNA in-vitro đạt nồng độ xác định có thể quy đổi từ ng/µL sang copy/µL Việc này cho phép pha loãng đến các dải nồng độ khác nhau, cách nhau 10 lần, tạo thành bộ mẫu chuẩn cho quy trình định lượng HBV pgRNA.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB

3.1.1 Nghiên cứu thiết lập chứng dương RNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh

Chứng dương RNA là pgRNA được phiên mã từ trình tự DNA sợi âm, có mã số MF674459.1 trong ngân hàng gen GenBank Genotype B, subtype B4 là trình tự phổ biến nhất tại Việt Nam Toàn bộ hệ gen HBV DNA đã được công bố trên GenBank.

Trình tự DNA nhân tạo được đưa vào plasmid pJET1.2, tạo ra plasmid tái tổ hợp Plasmid này được mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn XhoI, phục vụ làm khuôn cho quá trình tổng hợp RNA in-vitro Mục tiêu là tạo ra chứng dương pgRNA của HBV phục vụ cho quy trình RT-qPCR.

Sau khi tổng hợp RNA in-vitro, pgRNA chứng dương tinh sạch có nồng độ 15,59 ng/µL với các chỉ số 260/280 là 1,67 và 260/230 là 1,85 Điều này cho thấy pgRNA có nồng độ cao và độ tinh sạch tốt, được sử dụng làm mẫu chuẩn dương cho quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA Đồng thời, RNA in-vitro được pha loãng đến các dải nồng độ khác nhau để tạo bộ mẫu chuẩn HBV pgRNA, phục vụ cho việc xây dựng đường chuẩn và panel độ nhạy.

Mẫu chứng âm được tách chiết thành công từ huyết tương người khỏe mạnh có nồng độ 7,6 ng/àL, độ tinh sạch đảm bảo

3.1.2 Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện

 Tính toán số bản copy của mẫu chuẩn:

+ Nồng độ stock: 15,59 ng/àL

+ Số bản copy = x 10 -9 x 6,022 x 10 23 =2,69 x 10 10 (copy/àl)

Vỡ sử dụng 6 àL cho một phản ứng nờn số bản sao trong 1 phản ứng là: 1,61 x 10 11 (copy/phản ứng)

Sau khi hoàn tất việc tính toán, hãy ghi lại nồng độ và ghi chú trực tiếp trên ống stock để thuận tiện cho quá trình pha loãng sau này và hỗ trợ thu thập số liệu cho nghiên cứu.

Bắt đầu từ nồng độ gốc, mẫu chuẩn được pha loãng theo các dải nồng độ cách nhau 10 lần, tạo thành bộ mẫu chuẩn Kết quả thu được bao gồm các mẫu chuẩn với nồng độ: 1,61 x 10^11 (nồng độ stock), 10^10, 10^9, 10^8, 10^7, và 10^6.

3.1.3 Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB

Dựa vào tính ổn định, đa hình và sự đột biến, vùng gen S được chọn để thiết kế mồi và probe cho quy trình định lượng HBV pgRNA.

 Kết quả lựa chọn cặp mồi/probe:

Nhóm nghiên cứu đã sử dụng công cụ thiết kế mồi và thông tin liên quan đến đoạn gen của HBV pgRNA để tạo ra một số cặp mồi/TaqMan probe, nhằm khuếch đại đặc hiệu trình tự gen đích Ba cặp mồi/probe được thiết kế là 482/198/361, 482/585/361, và 482/223/361 Thông qua phản ứng RT-qPCR và đánh giá trên mẫu chuẩn dương HBV pgRNA S4 và S5, nhóm đã tiến hành lựa chọn cặp mồi/probe có khả năng khuếch đại tốt nhất cho trình tự quan tâm.

Kết quả của phản ứng RT-qPCR được trình bày ở hình sau:

Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe

Các cặp mồi được đánh dấu với số hiệu 198+, 223+, 585+, trong khi hai mẫu chuẩn S5 và S4 được ký hiệu lần lượt là 12 và 34 Những mẫu có chữ "AM" thể hiện chứng âm của phản ứng.

Sử dụng hai mẫu chuẩn với nồng độ trung bình từ bộ mẫu chuẩn S4 (10⁴) và S5 (10⁵) Mỗi mẫu chuẩn được chia thành các ống nhỏ, trong đó hai ống mẫu chuẩn S5 và S4 được ký hiệu lần lượt là 12 và 34, sẽ được sử dụng cho quá trình tối ưu.

Các cặp mồi và probe được thiết kế đều có khả năng khuếch đại trình tự đích HBV pgRNA với tính đặc hiệu cao, khi các chứng âm không cho tín hiệu khuếch đại Tuy nhiên, hiệu suất khuếch đại giữa các cặp mồi và probe có sự khác biệt lớn Cặp mồi 482/223/361 cho thấy tiềm năng khuếch đại tốt nhất Kết quả huỳnh quang và Ct chỉ ra rằng cặp mồi và probe 223 là lựa chọn tối ưu cho quy trình định lượng tải lượng HBV pgRNA bằng phương pháp RT-qPCR.

Nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát trên các mẫu bệnh nhân mắc viêm gan B mãn tính (CHB) đã được tách chiết, cùng với các mẫu từ những người khỏe mạnh tham gia nghiên cứu Kết quả thu được từ cuộc khảo sát này sẽ được phân tích để rút ra những thông tin quan trọng về tình trạng bệnh và sức khỏe cộng đồng.

Cặp mồi và probe kí hiệu 482/223/361 đã được xác định là có tín hiệu khuếch đại tốt nhất trong nghiên cứu Do đó, nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn cặp này cho các quy trình tối ưu tiếp theo.

Sau quá trình thử nghiệm và đánh giá ban đầu, nhóm nghiên cứu đã xác định cặp mồi/probe tối ưu có khả năng khuếch đại hiệu quả và đặc hiệu HBV pgRNA cho quy trình RT-qPCR.

Trình tự mồi phiên mã ngược đặc hiệu của HBV là: 5’ - GACAAACGGGCAACATACCT - 3’ ([nt] 476 – 457)

Trình tự forward primer là: 5’ - ATGTGTCTGCGGCGTTTTAT - 3’ ([nt]

Trình tự probe là : 5’ - FAM – ATCCTGCTGCTATGCCTCAT - BHQ1 - 3’ ([nt] 410 – 429)

Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR

3.1.4 Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT- qPCR đo tải lượng HBV pgRNA

Mẫu chuẩn RNA được pha loãng xuống các dải nồng độ xác định để tạo panel độ nhạy

Pha loãng từ nồng độ 10 11 xuống đến nồng độ 10 0 :

Pha loóng xuống 10 10 : 10àL 10 11 + 90àL H 2 O

Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy chạy đánh giá bằng phản ứng RT-qPCR trên hệ thống Rotor GenQ:

Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy

Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy

Trong quá trình thiết lập đường chuẩn, hệ số tương quan R² cho thấy độ tuyến tính của quá trình khuếch đại, với giá trị đạt tiêu chuẩn lớn hơn 0,99, chứng tỏ quy trình realtime PCR có độ tuyến tính tốt Đồng thời, hiệu quả PCR (E%) đạt 0,97, phản ánh khả năng khuếch đại hiệu quả của cặp mồi và các mẫu chuẩn thiết kế.

Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB

3.2.1 Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi bước phiên mã ngược:

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở 45℃ trong vòng 10 phút sẽ được trình bày dưới đây:

Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45℃

45.1 và 45.2: hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 45°C trong khoảng thời gian 10 phút 45 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và 45 NTC là mẫu chứng âm của phản ứng này

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 10 phút sẽ được trình bày dưới đây:

Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 50°C

50.1 và 50.2 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 với thứ tự các mẫu giống như mẫu 45.1 và 45.2 và được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 10 phút 50 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và 50 NTC là mẫu chứng âm của phản ứng này

Nhóm nghiên cứu đã so sánh kết quả ở hai nhiệt độ khác nhau trong bước phiên mã ngược và nhận thấy giá trị Ct ở mỗi nhiệt độ có sự khác biệt rõ rệt.

Nghiên cứu cho thấy rằng ở nhiệt độ 50°C, giá trị Ct xuất hiện sớm hơn 1-2 chu kỳ so với 45°C, đồng thời tín hiệu khuếch đại tại 50°C thể hiện hiệu suất tốt hơn với đường tín hiệu cao hơn Kết quả này không chỉ được xác nhận ở hai mẫu mà còn ở nhiều mẫu bệnh nhân CHB khác Hơn nữa, mẫu chứng âm enzyme không có phản ứng với HBV DNA, cho thấy quá trình tách chiết và xử lý đã loại bỏ hoàn toàn HBV DNA, đảm bảo độ chính xác trong định lượng Mẫu chứng âm nước cũng không ghi nhận tín hiệu khuếch đại, khẳng định rằng phản ứng có độ đặc hiệu cao.

Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho bước phiên mã ngược RNA của quy trình định lượng là nhiệt độ 50 °C

Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 10 phút thể hiện qua hình 13:

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 20 phút như sau:

Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút

T20 M2 và T20 M1 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5, được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong 20 phút Trong khi đó, T20 E- là mẫu không có enzyme RTase, còn T20 NTC là mẫu chứng âm cho phản ứng này.

Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 40 phút như sau:

Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút

Mẫu T40 M1 và T40 M2 là hai chuẩn dương S5 và S4, được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong 40 phút Mẫu T20 E- không bổ sung enzyme RTase, trong khi T20 NTC là mẫu chứng âm cho phản ứng này.

Nhóm nghiên cứu đã quan sát rằng với ba hình kết quả tương ứng với thời gian phiên mã ngược 10, 20 và 40 phút, giá trị Ct ở hai mẫu M1 và M2 giảm dần khi thời gian phiên mã ngược tăng Điều này cho thấy rằng 10 phút là khoảng thời gian tối ưu cho phản ứng phiên mã ngược, và việc kéo dài thời gian không chỉ không cần thiết mà còn có thể làm giảm độ nhạy của phản ứng.

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi qPCR

Kết quả đánh giá nhiệt độ gắn mồi được thể hiện ở hình dưới đây:

Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C

T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4

Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C

T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4, AM: mẫu chứng âm

Sau khi khảo sát trên mẫu chuẩn dương S4, nhóm nghiên cứu xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho quá trình RT-qPCR là 63 °C Kết quả cho thấy các giá trị Ct của tube S5 ở nhiệt độ 63 °C sớm hơn 1 - 2 chu kỳ so với nhiệt độ 57 °C Nhiệt độ gắn mồi cao hơn cũng góp phần làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR.

Tối ưu thời gian gắn mồi:

Sau đây là kết quả của quá trình tối ưu thời gian gắn mồi trong chu trình luân nhiệt:

Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây

T15: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 15 giây, NTC: mẫu chứng âm

Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây

T30: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 30 giây, NTC: mẫu chứng âm

Kết quả so sánh thời gian gắn mồi cho thấy, với cùng một mẫu, thời gian 30 giây cho giá trị Ct sớm hơn 2 chu kỳ, tương đương với lượng sản phẩm gấp 4 lần so với thời gian 15 giây (29,16 so với 31,71) Do đó, thời gian gắn mồi tối ưu trong chu trình luân nhiệt được xác định là 30 giây.

3.2.2 Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm

Tối ưu nồng độ primer:

Kết quả tối ưu nồng độ mồi được trình bày ở hình sau:

Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi

Mẫu chứng dương HBV RNA (RNA HBV+) bao gồm các nồng độ khác nhau của mồi, cụ thể là 1E+ (mẫu chứng dương nồng độ mồi 1 àM), 0,5E+, 0,2E+, 0,1E+1, 0,1E+2, 0,05E+1 và 0,05E+2 Các mẫu này thể hiện các dải nồng độ mồi lần lượt là 0,5; 0,2; 0,1; và 0,05 Ngoài ra, mẫu chứng âm được ký hiệu là -0, trong khi mẫu chứng âm không enzyme với nồng độ mồi 0,05 được ký hiệu là 0,05-.

Theo kết quả RT-qPCR, nồng độ mồi 1 và 0,5 àM đều cho giá trị Ct khoảng chu kỳ thứ 29 Tuy nhiên, nghiên cứu quyết định chọn nồng độ mồi 0,5 àM vì 1 àM có thể quá cao và ảnh hưởng đến quá trình gắn probe vào trình tự đích do sự cạnh tranh với mồi trong phản ứng Đặc biệt, nhiệt độ ủ khoảng 50 °C trong giai đoạn đầu càng tạo điều kiện cho mồi gắn vào trước probe.

Tối ưu nồng độ probe:

Theo kết quả Realtime từ hình 19 và hình 20, nồng độ probe có ảnh hưởng lớn đến quy trình định lượng trên cùng một chứng dương Nồng độ probe 0,2 àM được chọn làm nồng độ tối ưu cho quy trình định lượng HBV pgRNA do giá trị Ct lớn hơn sớm hơn khoảng 3 chu kỳ.

Hỡnh 21: Kết quả đỏnh giỏ ở nồng độ probe 0,2 àM

P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1, NTC: mẫu chứng âm

Hỡnh 22: Kết quả đỏnh giỏ ở nồng độ probe 0,1 àM

P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1; NTC: mẫu chứng âm

3.2.3 Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA

Sau khi tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-qPCR, nhóm nghiên cứu đã hoàn thiện bảng thành phần tối ưu cho phản ứng này.

Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR

STT Thành phần Thể tớch (àl)

5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 1,58

Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR

3.3.1 Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB

Ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng:

Nhóm nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình RT-qPCR dựa trên bộ mẫu chuẩn Mỗi mẫu nồng độ được lặp lại ba lần trong một lần chạy, và tất cả các nồng độ được đánh giá qua 10 lần chạy Kết quả được ghi chép lại, tổng hợp số lần chạy cho tín hiệu khuếch đại có ý nghĩa, nhằm xác định ngưỡng định lượng và ngưỡng phát hiện của quy trình định lượng HBV pgRNA.

Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 10 4 –

1,25 copy/phản ứng trong 10 lần chạy

Số lần phát hiện/Tổng số phản ứng

Dựa trên kết quả đánh giá các mẫu nồng độ thấp 10^2, 10^1 và các mẫu pha loãng 2 lần, 4 lần, 8 lần của nồng độ 10^1, nhóm nghiên cứu xác định ngưỡng định lượng của phản ứng là 10^1 copy/phản ứng với tỷ lệ 100% (30/30 lần chạy lặp lại đều cho tín hiệu) Mẫu pha loãng 2 lần của 10^1 copy/phản ứng (tương đương 5 copy/phản ứng) đạt ngưỡng phát hiện với tỷ lệ 97% (29/30 lần lặp lại đều cho tín hiệu) Khả năng khuếch đại tốt của cặp mồi và các mẫu chuẩn thiết kế thể hiện chất lượng ổn định trong các lần chạy khác nhau Độ đặc hiệu của quy trình cũng được chứng minh qua chứng âm đạt tỷ lệ 100%, cho thấy tính ổn định cao của phương pháp.

Khi nhân với hệ số cô đặc của quá trình tách chiết là 10, ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-qPCR đạt 80 copy/mL huyết tương, trong khi ngưỡng định lượng là 160 copy/mL huyết tương Để xác định các thông số chất lượng của phản ứng Realtime PCR, nhóm nghiên cứu đã thiết lập các sản phẩm bao gồm chứng dương, chứng âm và bộ mẫu chuẩn với dải nồng độ xác định, trong đó mẫu chuẩn là chứng dương pgRNA HBV được tổng hợp in-vitro dựa trên trình tự HBV DNA tại Việt Nam.

Nam Kết quả chạy đánh giá quy trình RT-PCR được trình bày ở hình sau:

Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn

10 8 , 10 7 , 10 6 , 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 , 10 0 : dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm

Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn

Tên mẫu Loại Ct Nồng độ

Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo

Chu kỳ phát hiện (Ct)

Tải lượng RNA-HBV (Log10 copie/ml)

CV SD CV SD %ME

Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA thể hiện độ chính xác cao với hệ số biến thiên (CV) ≤ 0,03 và độ lặp lại tốt khi deltaCt < 0,5 Quy trình này sẽ tiếp tục được đánh giá trên mẫu bệnh nhân mắc viêm gan B mạn tính (CHB) trước khi được áp dụng.

3.3.2 Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB

Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn trong quy trình định lượng RT-qPCR được thực hiện sau 2 tuần, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng, và được trình bày thông qua hình ảnh RT-qPCR.

Hình 24: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tuần

10 8 , 10 7 , 10 6 , 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 , 10 0 (copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm

Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng

Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng

Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng

Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR

Hai tuần Một tháng Hai tháng Ba tháng

Sau khi đánh giá quy trình định lượng RT-PCR với bộ mẫu chuẩn sau hai tuần, một tháng, hai tháng và ba tháng, nhóm nghiên cứu nhận thấy bộ mẫu này ổn định và vẫn có khả năng khuếch đại các mẫu trong dải tuyến tính từ 10^8.

- 10 1 copy/pư với sự khác biệt không lớn về giá trị Ct value Các mẫu nồng độ thấp

Mặc dù đã trải qua 64 lần thử nghiệm, sự thay đổi không đáng kể và các mẫu vẫn thể hiện độ tuyến tính tốt Các thông số trong các lần chạy đều đạt kết quả khả quan, với bộ mẫu chuẩn ổn định trong suốt các khoảng thời gian đánh giá.

Đánh giá bộ mẫu chuẩn định kỳ là cần thiết để đảm bảo chất lượng quy trình định lượng Điều này đặc biệt quan trọng khi có sự thay đổi trong quy trình, chẳng hạn như vị trí máy Realtime PCR, cập nhật chương trình hoặc phần mềm phân tích kết quả, hoặc khi sử dụng hóa chất và lô sinh phẩm mới trong quy trình phân tích mẫu.

Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB

Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính

≥ 5log 10 copies/mL ˂ 5log 10 copies/mL

1) Kiểm định theo thuật toán thống kế Chi-square

(2 ) Kiểm định theo thuật toán thống kế

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy HBV pgRNA được định lượng ở 49 trong số 77 bệnh nhân mắc bệnh viêm gan B mạn tính (63,64%), với nồng độ trung bình là 4,72 ± 2,24 log 10 copy/ml Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Florian van Bommel về nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

Nghiên cứu trên 62 bệnh nhân CHB cho thấy nồng độ HBV pgRNA trung bình là 5,2 ± 1,6 log10 IU/mL, tương đương với 5,9 ± 2,3 log10 copy/mL Một nghiên cứu khác của Jie Wang (2016) xác định nồng độ HBV pgRNA huyết tương trung bình là 6,31 log10 copy/ml Ngoài ra, tác giả Yi-Wen Huang (2015) đã nghiên cứu trên 52 bệnh nhân CHB trước khi điều trị bằng lamivudin, phát hiện HBV pgRNA ở 21/52 bệnh nhân (40,38%) với nồng độ trung bình 5,2 log10 copy/ml, trong khi ngưỡng phát hiện của xét nghiệm là 2,2 log10 copy/mL.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ bệnh nhân có thể định lượng HBV pgRNA huyết tương thấp hơn so với nghiên cứu của Yi-Wen Huang, điều này có thể do sự khác biệt trong thiết kế xét nghiệm và nhóm đối tượng nghiên cứu Tác giả Jing Wang (2017) ghi nhận nồng độ HBV pgRNA huyết tương trung bình ở 35 bệnh nhân CHB là 3,02 log 10 copy/mL, thấp hơn so với kết quả của chúng tôi do đối tượng nghiên cứu đã được điều trị bằng entecavir từ 1-10 năm Các thuốc NA ức chế tổng hợp ADN virus nhưng ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp pgRNA từ cccDNA, dẫn đến việc pgRNA vẫn được sản xuất và tiết ra huyết tương Nồng độ HBV RNA huyết tương giảm chậm hơn HBV DNA và có thể định lượng khi HBV DNA đã dưới ngưỡng phát hiện Đặc biệt, nồng độ HBV pgRNA huyết tương giảm rõ rệt ở bệnh nhân điều trị NA liên tục từ 1 năm trở lên, do đó việc điều trị lâu dài là nguyên nhân chính làm nồng độ HBV pgRNA huyết tương ở nhóm bệnh nhân của Jing Wang thấp hơn so với nhóm bệnh nhân chưa điều trị kháng virus trong nghiên cứu của chúng tôi.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, giá trị trung bình nồng độ HBV pgRNA trên phân nhóm CHB có HBeAg (+) cao hơn so với phân nhóm CHB có HBeAg (-)

Nghiên cứu cho thấy nồng độ HBV pgRNA huyết tương ở nhóm bệnh nhân CHB có HBeAg (+) cao hơn (5,21 ± 1,97 log 10 copy/mL) so với nhóm HBeAg (-) (1,80 ± 1,42 log 10 copy/mL), với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p 0,05) M.J van Campenhout đã thực hiện nghiên cứu trên 274 bệnh nhân CHB HBeAg (+) và tìm thấy nồng độ HBV pgRNA trung bình là 6,5 ± 1,2 log 10 IU/l Một nghiên cứu khác của M.J van Campenhout với 175 bệnh nhân HBeAg (+) cũng cho kết quả tương tự (6,1 ± 1,1 log 10 IU/l) Điều này cho thấy quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA của nhóm nghiên cứu tương đương với các quy trình trên thế giới, nhưng cần đánh giá trên số lượng mẫu lớn hơn để khẳng định độ nhạy vượt trội của quy trình.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Thiết Lập Quy Trình Định Lượng HBV-RNA Huyết Tương Ở Bệnh Nhân Viêm Gan B Mạn Tính
Tác giả	Triệu Thị Nguyệt
Người hướng dẫn	TS. Hồ Hữu Thọ, TS. Mai Thị Đàm Linh
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Vi sinh vật học
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	93
Dung lượng	4,7 MB