Luận văn thạc sĩ khoa học nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng hbv rna huyết tương ở bệnh nhân viên gan b mạn tính

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRIỆU THỊ NGUYỆT ận Lu vă NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG n HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH ạc th sĩ Kh oa LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC c họ Hà Nội – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Triệu Thị Nguyệt Lu NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ận HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH vă Chuyên ngành: Vi sinh vật học n Mã số: 8420101.07 ạc th sĩ oa Kh LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC c họ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược Học Quân - HVQY TS Mai Thị Đàm Linh – Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn xin trân trọng gửi tới TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược học quân - Học viện Quân Y, người thầy tận tình giúp đỡ, bảo hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô anh chị Phịng Cơng nghệ gen Di Lu truyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân Y ận thầy anh chị tận tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài phịng Tôi đặc biệt cảm ơn CN Vũ Nguyễn Quỳnh Anh nhiệt tình giúp đỡ tơi vă suốt q trình hồn thành luận văn n th Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo môn Vi sinh vật học ạc thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Kh nghiên cứu trường sĩ gia Hà Nội hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tơi q trình học tập oa Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn c họ Hà Nội, 10 tháng 01 năm 2020 Học viên Triệu Thị Nguyệt MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG 10 Chương - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan HBV Đặc điểm phân loại HBV 1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV .4 1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV 1.1.4 Các protein HBV 1.1.5 Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe 10 1.1.6 Chu trình nhân lên HBV .12 1.1.7 Con đường lây nhiễm virus HBV 14 ận Lu 1.1.1 n vă ạc th sĩ oa Kh 1.2 Tổng quan viêm gan B mạn tính 15 c họ 1.2.1 HBV viêm gan B 15 1.2.2 Tình hình nhiễm HBV giới 16 1.3 Tình hình nghiên cứu HBV 18 1.3.1 Trên giới 18 1.3.2 Trong nước 21 1.4 Tính tính sáng tạo đề tài 23 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu .26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .26 2.1.2 Vật liệu, hóa chất 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.2.2 Thu thập, bảo quản mẫu 29 2.2.3 Tách chiết acid nucleic 29 2.2.4 Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương .29 2.2.5 Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 32 Lu ận Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược: .34 vă Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược 35 n Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 36 th Tối ưu thời gian luân nhiệt 36 ạc Tối ưu nồng độ mồi 37 sĩ Kh Tối ưu nồng độ probe 37 oa Các chất phụ gia phản ứng RT-qPCR .38 c họ 2.2.6 Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 38 2.2.7 Phân tích, xử lý số liệu 39 Chương – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB 41 3.1.1 Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA tổng hợp in-vitro, chứng âm tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh .41 3.1.2 Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định Đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn trước hoàn thiện .41 3.1.3 Thiết kế trình tự mồi probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB .42 3.1.4 Nghiên cứu thiết lập panel độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng RTqPCR đo tải lượng HBV pgRNA 44 3.2 Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB 47 Lu ận 3.2.1 Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian bước tốc dộ thay đổi nhiệt độ phản ứng phản ứng RT-qPCR 47 vă 3.2.2 Tối ưu thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, enzyme n th DNA polymerase, nồng độ mồi probe Thành phần phản ứng bao gồm ạc dUTP AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm .54 sĩ 3.2.3 Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 56 oa Kh 3.3 Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR 57 3.3.1 Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng lần xét c họ nghiệm Xác định độ xác, độ lặp lại lần xét nghiệm quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB .57 3.3.2 Xác định tính ổn định mẫu chuẩn quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB 61 3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR mẫu bệnh nhân CHB 64 KẾT LUẬN .67 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………85 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Nghĩa Từ viết tắt Covalently closed circular DNA – DNA kép, mạch cccDNA vòng CHB Chronic Hepatitis B – Viêm gan B mạn tính Ct Crossing threshold CV Coefficient of Variation - Hệ số biến thiên ER Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất HBeAg Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e Hepatitis B core antigen – Kháng nguyên lõi HBcAg ận HBV Hepatocellular Carcinoma – Ung thư biểu mô tế n HCC vă Lu HBV 10 HBsAg Hepatis B Virus – Virus viêm gan B Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên vỏ sĩ HBV ạc th bào gan Kh HBV ME Meaning – Độ lệch phép đo 12 ORF Open Reading Frame – Khung đọc mở 13 NAs Nucleos(t)ide Analogues 14 RT-qPCR Reverse Transcription Realtime - quantitative oa 11 c họ Polymerase Chain Reaction 15 rcDNA Relaxed circular DNA – DNA dạng vòng khơng kín 16 SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn 17 pgRNA Pre-genomic RNA 18 UNG Uracil Deoxyribonucleic Acid Glycosylase DANH MỤC HÌNH Hình 1: Ba loại tiểu thể virus HBV [99] Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV .7 Hình 3: Chu trình nhân lên virus HBV [47] 14 Hình 4: Mơ hình nhân lên hệ gen virus [47] 14 ận Lu Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S 30 Hình 6: Kết phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe 43 n vă ạc th Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR 44 Hình 8: Panel độ nhạy .45 sĩ Kh Hình 9: Kết thiết lập panel độ nhạy .46 oa c họ Hình 10: Kết dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy .46 Hình 11: Kết panel độ đặc hiệu .47 Hình 12: Kết phản ứng RT-qPCR phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45°C 48 Hình 13: Kết phản ứng RT-qPCR phần mềm RotorGene với nhiệt độ 50°C 49 Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút .50 Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút .51 Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C 52 Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C 52 Hình 18: Kết thời gian gắn mồi 15 giây .53 Lu ận Hình 19: Kết thời gian gắn mồi 30 giây .53 vă Hình 20: Kết tối ưu nồng độ mồi 54 n th Hình 21: Kết đánh giá nồng độ probe 0,2 µM 55 ạc sĩ Hình 22: Kết đánh giá nồng độ probe 0,1 µM 55 Kh oa Hình 23: Kết chạy đánh giá quy trình dựa mẫu chuẩn 59 c họ Hình 24: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau hai tuần 61 Hình 25: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau tháng 62 Hình 26: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau hai tháng 62 Hình 27: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau ba tháng .63 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị 27 Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu 27 Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR 31 Bảng 4: Chu trình nhiệt phản ứng RT-qPCR .32 ận Lu Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR 34 Bảng 6: Chu trình nhiệt phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác bước vă phiên mã ngược 35 n th ạc Bảng 7: Thành phần tối ưu phản ứng RT-qPCR 56 sĩ Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu phản ứng RT-qPCR 56 oa Kh Bảng 9: Kết đánh giá quy trình định lượng dải nồng độ 104 – 1,25 c họ copy/phản ứng 10 lần chạy 57 Bảng 10: Kết chạy đánh giá quy trình dựa mẫu chuẩn 59 Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua số SD, CV, độ lệch phép đo (ME) 60 Bảng 12: Kết đánh giá độ ổn định quy trình RT-PCR .63 Bảng 12: Kết đánh giá độ ổn định quy trình RT-PCR .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Trần Ngọc Ánh, 2012, Nồng độ HBsAg, HBV-DNA bệnh nhân viêm gan B mạn tính Tạp chí Nghiên cứu Y học 2: p 1-6 Bùi Đại, 2002, Viêm gan virus B D Lê Đăng Hà, Đào Đình Đức, Nguyễn Đức Hiền, Trịnh Thị Minh Liên, 1997, Dịch tễ học viêm gan virút B Việt Nam Tạp chí Y học thực hành 9: p 1-3 Võ Triều Lý, Phạm Thị Lệ Hoa, Nguyễn Thị Cẩm Hường, 2015, Giá trị Lu HBsAg định lượng để phân biệt người mang HBV khơng hoạt tính viêm ận gan siêu vi B mạn tái hoạt, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh 19: p 330-335 vă Phạm Hồng Phiệt, Nguyễn Phương Thảo, 2010, Khảo sát mối tương quan n lượng HBsAg với số kết virus học lâm sàng bệnh th nhân viêm gan B mạn tính hoạt động chưa điều trị đặc hiệu 13: p 5-13 ạc Hoàng Tiến Tuyên, Nguyễn Hữu Quyền, Nguyễn Văn Diễn, 2017, Tìm hiểu sĩ mối tương quan hàm lượng HBsAg với tải lượng virut hoạt độ ALT Kh bệnh nhân viêm gan virut B mạn tính, Tạp chí Y Dược học Quân 2: p c họ Tài liệu Tiếng Anh: oa 126-131 L Allweiss and M Dandri, 2017, The Role of cccDNA in HBV Maintenance, Viruses 9(6) N M Araujo, 2015, Hepatitis B virus intergenotypic recombinants worldwide: An overview, Infect Genet Evol 36: p 500-510 R Bartenschlager and H Schaller, 1988, The amino-terminal domain of the hepadnaviral P-gene encodes the terminal protein (genome-linked protein) believed to prime reverse transcription, EMBO J 7(13): p 4185-92 10 R Bartenschlager, M Junker-Niepmann and H Schaller, 1990, The P gene product of hepatitis B virus is required as a structural component for genomic RNA encapsidation, J Virol 64(11): p 5324-32 11 T F Baumert, L Meredith, Y Ni, D J Felmlee, J A McKeating and S Urban, 2014, Entry of hepatitis B and C viruses - recent progress and future impact, Curr Opin Virol 4: p 58-65 12 R P Beasley, 1988, Hepatitis B virus The major etiology of hepatocellular carcinoma, Cancer 61(10): p 1942-56 13 L Belloni, T Pollicino, F De Nicola, F Guerrieri, G Raffa, M Fanciulli, et Lu al., 2009, Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the ận epigenetic regulation of cccDNA function, Proc Natl Acad Sci U S A 14 n vă 106(47): p 19975-9 F Bernard, G Raymond, B Willems and J P Villeneuve, 1997, th Quantitative assessment of serum hepatitis B e antigen, IgM hepatitis B core ạc antibody and HBV DNA in monitoring the response to treatment in patients sĩ with chronic hepatitis B, J Viral Hepat 4(4): p 265-72 Kh 15 A Bertoletti and A J Gehring, 2013, Immune therapeutic strategies in oa chronic hepatitis B virus infection: virus or inflammation control?, PLoS 16 c họ Pathog 9(12): p e1003784 F Birnbaum and M Nassal, 1990, Hepatitis B virus nucleocapsid assembly: primary structure requirements in the core protein, J Virol 64(7): p 331930 17 T M Block, H Guo and J T Guo, 2007, Molecular virology of hepatitis B virus for clinicians, Clin Liver Dis 11(4): p 685-706, vii 18 Florian Bömmel, Anne Bartens, Alena Mysickova, Jörg Hofmann, Detlev H Krüger, Thomas Berg, et al., 2015, Serum hepatitis B virus RNA levels as an early predictor of hepatitis B envelope antigen seroconversion during treatment with polymerase inhibitors, Hepatology 61(1): p 66-76 19 S Bonhoeffer and P Sniegowski, 2002, Virus evolution: the importance of being erroneous, Nature 420(6914): p 367, 369 20 R Bonilla Guerrero and L R Roberts, 2005, The role of hepatitis B virus integrations in the pathogenesis of human hepatocellular carcinoma, J Hepatol 42(5): p 760-77 21 C Brechot, M Hadchouel, J Scotto, M Fonck, F Potet, G N Vyas, et al., 1981, State of hepatitis B virus DNA in hepatocytes of patients with hepatitis Lu B surface antigen-positive and -negative liver diseases, Proc Natl Acad Sci ận U S A 78(6): p 3906-10 vă 22 C Brechot, D Kremsdorf, P Paterlini and V Thiers, 1991, Hepatitis B virus n DNA in HBsAg-negative patients Molecular characterization and clinical th implications, J Hepatol 13 Suppl 4: p S49-55 ạc 23 C Brechot, 2004, Pathogenesis of hepatitis B virus-related hepatocellular sĩ S56-61 oa 24 M R Brunetto, 2010, A new role for an old marker, HBsAg, J Hepatol c họ 52(4): p 475-7 25 Kh carcinoma: old and new paradigms, Gastroenterology 127(5 Suppl 1): p V Bruss, 2004, Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid, Virus Res 106(2): p 199-209 26 C J Chu, M Hussain and A S Lok, 2002, Quantitative serum HBV DNA levels during different stages of chronic hepatitis B infection, Hepatology 36(6): p 1408-15 27 Jacobson I Colucci G, Lalatta F, Vernance S, Waksal SD, Weksler ME, 1986, Detection of hepatitis B virus DNA, RNA and surface antigen in mononuclear cells from patients with type B hepatitis, Clin Res 28 D S Dane, C H Cameron and M Briggs, 1970, Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis, Lancet 1(7649): p 695-8 29 S Datta, 2008, An overview of molecular epidemiology of hepatitis B virus (HBV) in India, Virol J 5: p 156 30 E C Doo and M G Ghany, 2010, Hepatitis B virology for clinicians, Clin Liver Dis 14(3): p 397-408 31 C Dunn, D Peppa, P Khanna, G Nebbia, M Jones, N Brendish, et al., 2009, Temporal analysis of early immune responses in patients with acute Lu hepatitis B virus infection, Gastroenterology 137(4): p 1289-300 ận 32 Liver European Association For The Study Of The, 2012, EASL clinical vă practice guidelines: Management of chronic hepatitis B virus infection, J n Hepatol 57(1): p 167-85 th S Ezzikouri, M Ozawa, M Kohara, N Elmdaghri, S Benjelloun and K ạc 33 Tsukiyama-Kohara, 2014, Recent insights into hepatitis B virus-host sĩ D Ganem and A M Prince, 2004, Hepatitis B virus infection natural oa 34 Kh interactions, J Med Virol 86(6): p 925-32 history and clinical consequences, N Engl J Med 350(11): p 1118-29 W H Gerlich, 2013, Medical virology of hepatitis B: how it began and where we are now, Virol J 10: p 239 36 c họ 35 J R Gu, Y C Chen, H Q Jiang, Y L Zhang, S M Wu, W L Jiang, et al., 1985, State of hepatitis B virus DNA in leucocytes of hepatitis B patients, J Med Virol 17(1): p 73-81 37 S Gunther, 2006, Genetic variation in HBV infection: genotypes and mutants, J Clin Virol 36 Suppl 1: p S3-S11 38 Pasquinelli C Hadchouel M, Fournier JG, 1988, Detection of mononuclear cells expressing hepatitis B virus in peripheral blood from HBsAg positive and negative patients by situ hybridization: p 27–123 39 T Hatakeyama, C Noguchi, N Hiraga, N Mori, M Tsuge, M Imamura, et al., 2007, Serum HBV RNA is a predictor of early emergence of the YMDD mutant in patients treated with lamivudine, Hepatology 45(5): p 1179-86 40 R A Heijtink, J Kruining, P Honkoop, M C Kuhns, W C Hop, A D Osterhaus, et al., 1997, Serum HBeAg quantitation during antiviral therapy for chronic hepatitis B, J Med Virol 53(3): p 282-7 Lu 41 Y W Huang, K Chayama, M Tsuge, S Takahashi, T Hatakeyama, H ận Abe, et al., 2010, Differential effects of interferon and lamivudine on serum th 42 n p 177-84 vă HBV RNA inhibition in patients with chronic hepatitis B, Antivir Ther 15(2): Y W Huang, S Takahashi, M Tsuge, C L Chen, T C Wang, H Abe, et ạc al., 2015, On-treatment low serum HBV RNA level predicts initial virological sĩ response in chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogue Kh therapy, Antivir Ther 20(4): p 369-75 oa 43 L Jansen, N A Kootstra, K A van Dort, R B Takkenberg, H W Reesink c họ and H L Zaaijer, 2016, Hepatitis B Virus Pregenomic RNA Is Present in Virions in Plasma and Is Associated With a Response to Pegylated Interferon Alfa-2a and Nucleos(t)ide Analogues, J Infect Dis 213(2): p 224-32 44 Jerzy Jaroszewicz, Beatriz Calle Serrano, Karsten Wursthorn, Katja Deterding, Jerome Schlue, Regina Raupach, et al., 2010, Hepatitis B surface antigen (HBsAg) levels in the natural history of hepatitis B virus (HBV)infection: a European perspective, Journal of hepatology 52(4): p 514-522 45 Yiqi Yu Jing Wang, Guojun Li, et al., , 2017, Relationship between serum HBV RNA levels and intrahepatic viral as well as histologic activity markers in entecavir-treated patients, Journal of Hepatology 46 Venetia Saunders John Carter, Viriology - Principles and Applications 2007 47 M Kann, A Schmitz and B Rabe, 2007, Intracellular transport of hepatitis B virus, World J Gastroenterol 13(1): p 39-47 48 P M Kaplan, R L Greenman, J L Gerin, R H Purcell and W S Robinson, 1973, DNA polymerase associated with human hepatitis B antigen, J Virol 12(5): p 995-1005 Lu P Karayiannis, 2017, Hepatitis B virus: virology, molecular biology, life ận 49 cycle and intrahepatic spread, Hepatol Int 11(6): p 500-508 vă 50 M Karimova, N Beschorner, W Dammermann, J Chemnitz, D n th Indenbirken, J H Bockmann, et al., 2015, CRISPR/Cas9 nickase-mediated 13734 ạc disruption of hepatitis B virus open reading frame S and X, Sci Rep 5: p sĩ A Kay and F Zoulim, 2007, Hepatitis B virus genetic variability and evolution, Virus Res 127(2): p 164-76 K Kidd-Ljunggren, Y Miyakawa and A H Kidd, 2002, Genetic variability c họ 52 oa Kh 51 in hepatitis B viruses, J Gen Virol 83(Pt 6): p 1267-80 53 S Kim, J Lee and W S Ryu, 2009, Four conserved cysteine residues of the hepatitis B virus polymerase are critical for RNA pregenome encapsidation, J Virol 83(16): p 8032-40 54 A Kramvis, 2014, Genotypes and genetic variability of hepatitis B virus, Intervirology 57(3-4): p 141-50 55 J P Lamelin and C Trepo, 1990, The hepatitis B virus and the peripheral blood mononuclear cells: a brief review, J Hepatol 10(1): p 120-4 56 Daniel Lavanchy and Mark Kane, Global epidemiology of hepatitis B virus infection, in Hepatitis B Virus in Human Diseases 2016, Springer p 187203 57 H C Li, E Y Huang, P Y Su, S Y Wu, C C Yang, Y S Lin, et al., 2010, Nuclear export and import of human hepatitis B virus capsid protein and particles, PLoS Pathog 6(10): p e1001162 58 T J Liang, 2009, Hepatitis B: the virus and disease, Hepatology 49(5 Suppl): p S13-21 59 Y F Liaw, J J Sung, W C Chow, G Farrell, C Z Lee, H Yuen, et al., Lu 2004, Lamivudine for patients with chronic hepatitis B and advanced liver ận disease, N Engl J Med 351(15): p 1521-31 vă 60 Yun-Fan Liaw and Chia-Ming Chu, 2009, Hepatitis B virus infection, The n Lancet 373(9663): p 582-592 th S Locarnini, M Littlejohn, M N Aziz and L Yuen, 2013, Possible origins ạc 61 and evolution of the hepatitis B virus (HBV), Semin Cancer Biol 23(6 Pt B): Kh A S Lok, E J Heathcote and J H Hoofnagle, 2001, Management of oa 62 sĩ p 561-75 hepatitis B: 2000 summary of a workshop, Gastroenterology 120(7): p 63 c họ 1828-53 A S Lok and B J McMahon, 2009, Chronic hepatitis B: update 2009, Hepatology 50(3): p 661-2 64 J Lucifora, S Arzberger, D Durantel, L Belloni, M Strubin, M Levrero, et al., 2011, Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain virus replication after infection, J Hepatol 55(5): p 996-1003 65 L Ludgate, X Ning, D H Nguyen, C Adams, L Mentzer and J Hu, 2012, Cyclin-dependent kinase phosphorylates s/t-p sites in the hepadnavirus core protein C-terminal domain and is incorporated into viral capsids, J Virol 86(22): p 12237-50 66 M.J van Campenhout, F van Bömmel, M Grossmann, J Fischer, D Deichsel, A Boonstra, et al., 2017, Serum hepatitis B virus RNA level is associated with hepatitis B virus genotype and BCP mutations in untreated patients with HBeAg positive chronic hepatitis B, Journal of Hepatology 66: p S253-S254 67 Margo van Campenhout, Florian van Bömmel, Willem Pieter Brouwer, Qing Xie, Qin Zhang, Adrian Streinu Cercel, et al., 2017, Serum HBV RNA level Lu predicts response to peginterferon add-on therapy for HBeAg-positive ận chronic hepatitis B, Hepatology 66(1): p 97A-98A A Mason, B Yoffe, C Noonan, M Mearns, C Campbell, A Kelley, et al., vă 68 n 1992, Hepatitis B virus DNA in peripheral-blood mononuclear cells in th chronic hepatitis B after HBsAg clearance, Hepatology 16(1): p 36-41 ạc 69 W S Mason, G Seal and J Summers, 1980, Virus of Pekin ducks with sĩ structural and biological relatedness to human hepatitis B virus, J Virol oa 70 Kh 36(3): p 829-36 J E Maynard, 1990, Hepatitis B: global importance and need for control, c họ Vaccine Suppl: p S18-20; discussion S21-3 71 Brian J McMahon, 2009, The natural history of chronic hepatitis B virus infection, Hepatology 49(S5) 72 Yatsuhashi H Mei SD, Parquet MC, Hamada R, Fujino T, Matsumoto T, Inoue O, Koga M, Yano M., 2000, Detection of HBV RNA in peripheral blood mononuclear cells in patients with and without HBsAg by reverse transcription polymerase chain reaction., Hepatol Res 18: p 19-28 73 M Melegari, S K Wolf and R J Schneider, 2005, Hepatitis B virus DNA replication is coordinated by core protein serine phosphorylation and HBx expression, J Virol 79(15): p 9810-20 74 M Mizokami, E Orito, K Ohba, K Ikeo, J Y Lau and T Gojobori, 1997, Constrained evolution with respect to gene overlap of hepatitis B virus, J Mol Evol 44 Suppl 1: p S83-90 75 M Nassal, 2015, HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B, Gut 64(12): p 1972-84 76 H Okamoto, M Imai, M Kametani, T Nakamura and M Mayumi, 1987, Lu Genomic heterogeneity of hepatitis B virus in a 54-year-old woman who ận contracted the infection through materno-fetal transmission, Jpn J Exp Med 77 n vă 57(4): p 231-6 E Orito, M Mizokami, Y Ina, E N Moriyama, N Kameshima, M th Yamamoto, et al., 1989, Host-independent evolution and a genetic ạc classification of the hepadnavirus family based on nucleotide sequences, sĩ Proc Natl Acad Sci U S A 86(18): p 7059-62 Kh 78 J J Ott, G A Stevens, J Groeger and S T Wiersma, 2012, Global oa epidemiology of hepatitis B virus infection: new estimates of age-specific c họ HBsAg seroprevalence and endemicity, Vaccine 30(12): p 2212-9 79 D M Parkin, P Pisani and J Ferlay, 1999, Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990, Int J Cancer 80(6): p 827-41 80 J M Pawlotsky, 2002, Molecular diagnosis of viral hepatitis, Gastroenterology 122(6): p 1554-68 81 D H Perlman, E A Berg, B O'Connor P, C E Costello and J Hu, 2005, Reverse transcription-associated dephosphorylation of nucleocapsids, Proc Natl Acad Sci U S A 102(25): p 9020-5 hepadnavirus 82 Teerha Piratvisuth, Patrick Marcellin, Matei Popescu, Hans-Peter Kapprell, Vivien Rothe and Zhi-Meng Lu, 2013, Hepatitis B surface antigen: association with sustained response to peginterferon alfa-2a in hepatitis B e antigen-positive patients, Hepatology international 7(2): p 429-436 83 T Pollicino, C Saitta and G Raimondo, 2011, Hepatocellular carcinoma: the point of view of the hepatitis B virus, Carcinogenesis 32(8): p 1122-32 84 M R Pourkarim, S Amini-Bavil-Olyaee, F Kurbanov, M Van Ranst and F Tacke, 2014, Molecular genotypes/subgenotypes: identification revised of classification hepatitis hurdles and B virus updated Lu resolutions, World J Gastroenterol 20(23): p 7152-68 ận 85 R Prange, R Nagel and R E Streeck, 1992, Deletions in the hepatitis B vă virus small envelope protein: effect on assembly and secretion of surface n antigen particles, J Virol 66(10): p 5832-41 th 86 G Radziwill, W Tucker and H Schaller, 1990, Mutational analysis of the ạc hepatitis B virus P gene product: domain structure and RNase H activity, J Kh 87 sĩ Virol 64(2): p 613-20 G Raimondo, J P Allain, M R Brunetto, M A Buendia, D S Chen, M oa Colombo, et al., 2008, Statements from the Taormina expert meeting on c họ occult hepatitis B virus infection, J Hepatol 49(4): p 652-7 88 B Rehermann, C Ferrari, C Pasquinelli and F V Chisari, 1996, The hepatitis B virus persists for decades after patients' recovery from acute viral hepatitis despite active maintenance of a cytotoxic T-lymphocyte response, Nat Med 2(10): p 1104-8 89 A Rodella, C Galli, L Terlenghi, F Perandin, C Bonfanti and N Manca, 2006, Quantitative analysis of HBsAg, IgM anti-HBc and anti-HBc avidity in acute and chronic hepatitis B, J Clin Virol 37(3): p 206-12 90 A Rokuhara, A Matsumoto, E Tanaka, T Umemura, K Yoshizawa, T Kimura, et al., 2006, Hepatitis B virus RNA is measurable in serum and can be a new marker for monitoring lamivudine therapy, J Gastroenterol 41(8): p 785-90 91 S J Scaglione and A S Lok, 2012, Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice, Gastroenterology 142(6): p 1360-1368 e1 92 S Schadler and E Hildt, 2009, HBV life cycle: entry and morphogenesis, Viruses 1(2): p 185-209 93 A Schweitzer, J Horn, R T Mikolajczyk, G Krause and J J Ott, 2015, Lu Estimations of worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection: a ận systematic review of data published between 1965 and 2013, Lancet 94 n vă 386(10003): p 1546-55 C Seeger and J A Sohn, 2014, Targeting Hepatitis B Virus With th CRISPR/Cas9, Mol Ther Nucleic Acids 3: p e216 ạc 95 C Seeger and W S Mason, 2015, Molecular biology of hepatitis B virus sĩ MJ Sonneveld, Roeland Zoutendijk and HLA Janssen, 2011, Hepatitis B oa 96 Kh infection, Virology 479-480: p 672-86 surface antigen monitoring and management of chronic hepatitis B, Journal 97 c họ of viral hepatitis 18(7): p 449-457 C E Stevens, R P Beasley, J Tsui and W C Lee, 1975, Vertical transmission of hepatitis B antigen in Taiwan, N Engl J Med 292(15): p 771-4 98 T S Su, C J Lai, J L Huang, L H Lin, Y K Yauk, C M Chang, et al., 1989, Hepatitis B virus transcript produced by RNA splicing, J Virol 63(9): p 4011-8 99 J Summers and W S Mason, 1982, Replication of the genome of a hepatitis B like virus by reverse transcription of an RNA intermediate, Cell 29(2): p 403-15 100 W S Tan and K L Ho, 2014, Phage display creates innovative applications to combat hepatitis B virus, World J Gastroenterol 20(33): p 11650-70 101 N C Tassopoulos, G J Papaevangelou, M H Sjogren, A RoumeliotouKarayannis, J L Gerin and R H Purcell, 1987, Natural history of acute hepatitis B surface antigen-positive hepatitis in Greek adults, Gastroenterology 92(6): p 1844-50 Lu 102 K Tatematsu, Y Tanaka, F Kurbanov, F Sugauchi, S Mano, T Maeshiro, ận et al., 2009, A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known vă human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally n assigned to new genotype J, J Virol 83(20): p 10538-47 th 103 J E Tavis, X Cheng, Y Hu, M Totten, F Cao, E Michailidis, et al., 2013, ạc The hepatitis B virus ribonuclease H is sensitive to inhibitors of the human sĩ immunodeficiency virus ribonuclease H and integrase enzymes, PLoS oa 104 Kh Pathog 9(1): p e1003125 N A Terrault, A S F Lok, B J McMahon, K M Chang, J P Hwang, M c họ M Jonas, et al., 2018, Update on Prevention, Diagnosis, and Treatment of Chronic Hepatitis B: AASLD 2018 Hepatitis B Guidance, Clin Liver Dis (Hoboken) 12(1): p 33-34 105 Norah A Terrault, Natalie H Bzowej, Kyong‐ Mi Chang, Jessica P Hwang, Maureen M Jonas and M Hassan Murad, 2016, AASLD guidelines for treatment of chronic hepatitis B, Hepatology 63(1): p 261-283 106 cộng Trần Thị Thùy Trinh, 2008, New complex recombinant genotype of hepatitis B virus identified in Vietnam, J Virol 82(11): p 5657-63 107 T C Tseng and J H Kao, 2013, Clinical utility of quantitative HBsAg in natural history and nucleos(t)ide analogue treatment of chronic hepatitis B: new trick of old dog, J Gastroenterol 48(1): p 13-21 108 M Tsuge, N Hiraga, H Takaishi, C Noguchi, H Oga, M Imamura, et al., 2005, Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engineered hepatitis B virus, Hepatology 42(5): p 1046-54 109 P Uhl, G Fricker, U Haberkorn and W Mier, 2014, Current status in the therapy of liver diseases, Int J Mol Sci 15(5): p 7500-12 110 F van Bommel, A Bartens, A Mysickova, J Hofmann, D H Kruger, T Lu Berg, et al., 2015, Serum hepatitis B virus RNA levels as an early predictor ận of hepatitis B envelope antigen seroconversion during treatment with 111 n vă polymerase inhibitors, Hepatology 61(1): p 66-76 Mauro Viganò, Massimo Puoti and Pietro Lampertico, Nucleos (t) ide th Analogue Based Therapy and Management of Patients, in Hepatitis B Virus ạc in Human Diseases 2016, Springer p 339-359 sĩ H P Wang and C E Rogler, 1991, Topoisomerase I-mediated integration of Kh 112 hepadnavirus DNA in vitro, J Virol 65(5): p 2381-92 oa 113 J Wang, A S Lee and J H Ou, 1991, Proteolytic conversion of hepatitis B c họ virus e antigen precursor to end product occurs in a postendoplasmic reticulum compartment, J Virol 65(9): p 5080-3 114 J Wang, T Shen, X Huang, G R Kumar, X Chen, Z Zeng, et al., 2016, Serum hepatitis B virus RNA is encapsidated pregenome RNA that may be associated with persistence of viral infection and rebound, J Hepatol 65(4): p 700-10 115 Jie Wang, Tao Shen, Xiangbo Huang, G Renuka Kumar, Xiangmei Chen, Zhenzhen Zeng, et al., 2016, Serum hepatitis B virus RNA is encapsidated pregenome RNA that may be associated with persistence of viral infection and rebound, Journal of hepatology 116 Y X Wang, C Luo, D Zhao, J Beck and M Nassal, 2012, Extensive mutagenesis of the conserved box E motif in duck hepatitis B virus P protein reveals multiple functions in replication and a common structure with the primer grip in HIV-1 reverse transcriptase, J Virol 86(12): p 6394-407 117 A Wasley, S Grytdal, K Gallagher, Control Centers for Disease and Prevention, 2008, Surveillance for acute viral hepatitis United States, 2006, MMWR Surveill Summ 57(2): p 1-24 Lu 118 K Watashi, S Urban, W Li and T Wakita, 2014, NTCP and beyond: ận opening the door to unveil hepatitis B virus entry, Int J Mol Sci 15(2): p n 119 vă 2892-905 M Weber, V Bronsema, H Bartos, A Bosserhoff, R Bartenschlager and H th Schaller, 1994, Hepadnavirus P protein utilizes a tyrosine residue in the TP ạc domain to prime reverse transcription, J Virol 68(5): p 2994-9 sĩ J Weiss, H Wu, B Farrenkopf, T Schultz, G Song, S Shah, et al., 2004, Kh 120 Real time TaqMan PCR detection and quantitation of HBV genotypes A-G oa with the use of an internal quantitation standard, J Clin Virol 30(1): p 86- 121 c họ 93 K Wursthorn, M Lutgehetmann, M Dandri, T Volz, P Buggisch, B Zollner, et al., 2006, Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B, Hepatology 44(3): p 675-84 122 Y Xiong and T H Eickbush, 1990, Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences, EMBO J 9(10): p 335362 123 B Yoffe, C A Noonan, J L Melnick and F B Hollinger, 1986, Hepatitis B virus DNA in mononuclear cells and analysis of cell subsets for the presence of replicative intermediates of viral DNA, J Infect Dis 153(3): p 471-7 124 Q Zhang and G Cao, 2011, Genotypes, mutations, and viral load of hepatitis B virus and the risk of hepatocellular carcinoma: HBV properties and hepatocarcinogenesis, Hepat Mon 11(2): p 86-91 125 Q Zhang, W Qi, X Wang, Y Zhang, Y Xu, S Qin, et al., 2016, Epidemiology of Hepatitis B and Hepatitis C Infections and Benefits of Programs for Hepatitis Prevention in Northeastern China: A Cross- Lu Sectional Study, Clin Infect Dis 62(3): p 305-12 ận 126 W Zhang, H J Hacker, M Tokus, T Bock and C H Schroder, 2003, vă Patterns of circulating hepatitis B virus serum nucleic acids during n lamivudine therapy, J Med Virol 71(1): p 24-30 th 127 X Zhang, J Hou and M Lu, 2013, Regulation of hepatitis B virus ạc replication by epigenetic mechanisms and microRNAs, Front Genet 4: p Kh 128 sĩ 202 Z Zhang, N Torii, Z Hu, J Jacob and T J Liang, 2001, X-deficient oa woodchuck hepatitis virus mutants behave like attenuated viruses and induce c họ protective immunity in vivo, J Clin Invest 108(10): p 1523-31 129 F Zoulim and C Seeger, 1994, Reverse transcription in hepatitis B viruses is primed by a tyrosine residue of the polymerase, J Virol 68(1): p 6-13 130 Arie J Zuckerman, 1996, Medical Microbiology, 4th edition, University of Texas Medical Branch at Galveston Chapter 70