Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRIỆU THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HBV RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRIỆU THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Triệu Thị Nguyệt NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược Học Quân - HVQY TS Mai Thị Đàm Linh – Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội – Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn xin trân trọng gửi tới TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược học quân - Học viện Quân Y, người thầy tận tình giúp đỡ, bảo hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô anh chị Phịng Cơng nghệ gen Di truyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Qn Y thầy anh chị tận tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài phịng Tơi đặc biệt cảm ơn CN Vũ Nguyễn Quỳnh Anh nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo môn Vi sinh vật học thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tơi q trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thực luận văn Hà Nội, 10 tháng 01 năm 2020 Học viên Triệu Thị Nguyệt MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG 10 Chương - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan HBV 1.1.1 Đặc điểm phân loại HBV 1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV .4 1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV 1.1.4 Các protein HBV 1.1.5 Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe 10 1.1.6 Chu trình nhân lên HBV .12 1.1.7 Con đường lây nhiễm virus HBV 14 1.2 Tổng quan viêm gan B mạn tính 15 1.2.1 HBV viêm gan B 15 1.2.2 Tình hình nhiễm HBV giới 16 1.3 Tình hình nghiên cứu HBV 18 1.3.1 Trên giới 18 1.3.2 Trong nước 21 1.4 Tính tính sáng tạo đề tài 23 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu .26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .26 2.1.2 Vật liệu, hóa chất 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.2.2 Thu thập, bảo quản mẫu 29 2.2.3 Tách chiết acid nucleic 29 2.2.4 Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương .29 2.2.5 Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 32 Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược: .34 Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược 35 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 36 Tối ưu thời gian luân nhiệt 36 Tối ưu nồng độ mồi 37 Tối ưu nồng độ probe 37 Các chất phụ gia phản ứng RT-qPCR .38 2.2.6 Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 38 2.2.7 Phân tích, xử lý số liệu 39 Chương – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB 41 3.1.1 Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA tổng hợp in-vitro, chứng âm tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh .41 3.1.2 Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định Đánh giá độ ổn định mẫu chuẩn trước hoàn thiện .41 3.1.3 Thiết kế trình tự mồi probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB .42 3.1.4 Nghiên cứu thiết lập panel độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng RTqPCR đo tải lượng HBV pgRNA 44 3.2 Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB 47 3.2.1 Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian bước tốc dộ thay đổi nhiệt độ phản ứng phản ứng RT-qPCR 47 3.2.2 Tối ưu thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi probe Thành phần phản ứng bao gồm dUTP AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm .54 3.2.3 Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 56 3.3 Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR 57 3.3.1 Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng lần xét nghiệm Xác định độ xác, độ lặp lại lần xét nghiệm quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB .57 3.3.2 Xác định tính ổn định mẫu chuẩn quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB 61 3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR mẫu bệnh nhân CHB 64 KẾT LUẬN .67 KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………85 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Nghĩa Từ viết tắt cccDNA Covalently closed circular DNA – DNA kép, mạch vòng CHB Chronic Hepatitis B – Viêm gan B mạn tính Ct Crossing threshold CV Coefficient of Variation - Hệ số biến thiên ER Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất HBeAg Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e HBV HBcAg Hepatitis B core antigen – Kháng nguyên lõi HBV HCC Hepatocellular Carcinoma – Ung thư biểu mô tế bào gan HBV Hepatis B Virus – Virus viêm gan B 10 HBsAg Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên vỏ HBV 11 ME Meaning – Độ lệch phép đo 12 ORF Open Reading Frame – Khung đọc mở 13 NAs Nucleos(t)ide Analogues 14 RT-qPCR Reverse Transcription Realtime - quantitative Polymerase Chain Reaction 15 rcDNA Relaxed circular DNA – DNA dạng vịng khơng kín 16 SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn 17 pgRNA Pre-genomic RNA 18 UNG Uracil Deoxyribonucleic Acid Glycosylase DANH MỤC HÌNH Hình 1: Ba loại tiểu thể virus HBV [99] Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV .7 Hình 3: Chu trình nhân lên virus HBV [47] 14 Hình 4: Mơ hình nhân lên hệ gen virus [47] 14 Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S 30 Hình 6: Kết phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe 43 Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR 44 Hình 8: Panel độ nhạy .45 Hình 9: Kết thiết lập panel độ nhạy .46 Hình 10: Kết dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy .46 Hình 11: Kết panel độ đặc hiệu .47 Hình 12: Kết phản ứng RT-qPCR phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45°C 48 Hình 13: Kết phản ứng RT-qPCR phần mềm RotorGene với nhiệt độ 50°C 49 Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút .50 Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút .51 Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C 52 Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C 52 Hình 18: Kết thời gian gắn mồi 15 giây .53 Hình 19: Kết thời gian gắn mồi 30 giây .53 Hình 20: Kết tối ưu nồng độ mồi 54 Hình 21: Kết đánh giá nồng độ probe 0,2 µM 55 Hình 22: Kết đánh giá nồng độ probe 0,1 µM 55 Hình 23: Kết chạy đánh giá quy trình dựa mẫu chuẩn 59 Hình 24: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau hai tuần 61 Hình 25: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau tháng 62 Hình 26: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau hai tháng 62 Hình 27: Kết đánh giá mẫu chuẩn sau ba tháng .63 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị 27 Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu 27 Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR 31 Bảng 4: Chu trình nhiệt phản ứng RT-qPCR .32 Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR 34 Bảng 6: Chu trình nhiệt phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác bước phiên mã ngược 35 Bảng 7: Thành phần tối ưu phản ứng RT-qPCR 56 Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu phản ứng RT-qPCR 56 Bảng 9: Kết đánh giá quy trình định lượng dải nồng độ 104 – 1,25 copy/phản ứng 10 lần chạy 57 Bảng 10: Kết chạy đánh giá quy trình dựa mẫu chuẩn 59 Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua số SD, CV, độ lệch phép đo (ME) 60 Bảng 12: Kết đánh giá độ ổn định quy trình RT-PCR .63 Bảng 12: Kết đánh giá độ ổn định quy trình RT-PCR .63 Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính nhóm HBeAg dương tính âm tính 64 MỞ ĐẦU Nhiễm Hepatitis B virus (HBV) vấn đề y tế tồn cầu Mặc dù có phát triển vaccine ngăn chặn bệnh hiệu cao từ năm 1980 việc bổ sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng 168 quốc gia, bệnh gan nhiễm mạn tính HBV gánh nặng khổng lồ tồn xã hội Tính đến thời điểm nay, giới, nhiễm HBV nguyên nhân 30% bệnh nhân xơ gan 53% số họ tiến triển thành HCC, với khoảng 200,000 300,000 người mang HBsAg chết năm tương ứng xơ gan ung thư gan Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính cấp phép Peg-IFN α2a thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng nucleoside (nucleos(t)ide analogues, NAs) Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir, Tenofovir Peg-IFN vừa có tác dụng điều hịa miễn dịch vừa có tác dụng kháng virus trực tiếp, nhờ trì ức chế HBV DNA sau ngừng điều trị nhóm bệnh nhân Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV DNA biến chứng hầu hết bệnh nhân Tuy nhiên NAs không ảnh hưởng tới tổng hợp RNA tiền gen (pgRNA) HBV bệnh nhân viêm gan B mạn tính hay tổng hợp protein virus HBsAg cccDNA khơng bị ảnh hưởng giữ nguyên hoạt tính phiên mã Hệ là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh tái phát hầu hết bệnh nhân cần điều trị đời Không may việc điều trị thuốc NAs (như lamivudine) khoảng thời gian dài dẫn đến đột biến kháng thuốc số nguy nghiêm trọng khác liên quan tới gan Chính vậy, việc đánh giá nồng độ cccDNA bệnh nhân điều trị NAs vô quan trọng giúp xác định thời điểm hiệu loại thuốc kháng virus Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng mẫu mô sinh thiết, gây khó khăn q trình đánh giá lâm sàng Chức cccDNA khn cho q trình phiên mã cho tất RNA virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ tiếp tục tổng hợp tạo DNA virion Do đó, nồng độ cccDNA lại phản ánh RNA Được phát vào năm 1996 huyết bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV pgRNA gần báo cáo dấu ấn sinh học đầy hứa hẹn tiên lượng đánh giá đáp ứng điều trị bệnh nhân CHB Việt Nam nằm khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV cộng đồng vào loại cao giới, nhiễm HBV mạn tính vấn đề y tế nặng nề nước ta Sự cấp thiết việc tìm hay thiết lập cơng cụ theo dõi, kiểm sốt điều trị quản lý lây nhiễm cộng đồng rõ ràng bối cảnh phổ biến nhiễm HBV mạn tính Hiện nay, chưa có nghiên cứu nước đề cập đến dấu ấn tiềm HBV pgRNA huyết tương bệnh nhân CHB Chính vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Xây dựng tối ưu quy trình RTqPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao đối tượng bệnh nhân viêm gan B mạn tính điều trị đồng đẳng nucleoside Việt Nam Chương - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan HBV 1.1.1 Đặc điểm phân loại HBV Hepatitis B virus (HBV) thành viên họ Hepadnaviridae [130] Sở dĩ họ virus có tên virus nguyên nhân gây bệnh viêm gan (hepatitis) genome DNA Một số virus thuộc họ có khả lây nhiễm động vật có vú chim; ví dụ bao gồm woodchuck HBV heron HBV HBV biết đến nhiều virus có khả lây nhiễm người, nguyên nhân gây bệnh gan người [46] Các virus thuộc họ Hepadnaviridae có đặc điểm chung sau [121]: - Hệ gen DNA sợi đơi khơng hồn chỉnh bao gồm sợi: sợi âm đầy đủ sợi dương không đầy đủ - Enzyme DNA polymerase - Nhân lên thơng qua mạch khn pre-genomic RNA (pgRNA) - Có mức độ đặc trưng mơ lồi cao Việc nghiên cứu HBV từ lâu quan tâm hai lý Thứ nhất, virus có gen nhỏ, nhiên chúng có khả mã hóa protein virus kiểm soát biểu gen virus Thứ hai, gen DNA virus nhân lên thông qua trung gian RNA Nói cách khác, nhân lên virus bao gồm trình phiên mã ngược, virus thuộc nhóm khác biệt lớn với virus có gen DNA có khả nhân lên cách trực tiếp DNA virus nhân lên thơng qua trung gian RNA cịn tìm thấy loài thực vật Những virus này, với HBV gọi Pararetrovirus [46] Các nghiên cứu giải trình tự nucleotide HBV phân lập người khắp giới thiết lập, tuýp virus HBV xác định (A-H) dựa khác biệt trình tự lớn 8% không vượt 17% [61, 102] Các tuýp có phân bố khác nhau, tuýp A D thường xuất Châu Phi, Châu Âu Ấn Độ; tuýp B C thường phân bố Châu Á; tuýp E tìm thấy Tây Phi, tuýp F xuất Trung Nam Mỹ Sự phân bố tuýp G tuýp H chưa rõ ràng, có báo cáo cho hai tuýp xuất Trung Mĩ Nam Âu [54] Bên cạnh đó, có số nghiên cứu có xuất tuýp virus mới, tuýp I tuýp có độ tương đồng lớn với tuýp C tuýp phát số nước Đông Nam Á Việt Nam, Lào Đông Ấn [106]; tuýp J phát người Nhật Bản sống Borneo, dạng tái tổ hợp tuýp C HBV vượn [102] Các tuýp A, B, C, D, F, I phân thành nhóm nhỏ dựa khác biệt khoảng 4% nucleotide Có 44 nhóm tuýp phụ: A1–6, B1–9, C1–16, D1–7, F1–4 I1–2 [54, 84] Thêm vào đó, cịn có số dạng tái tổ hợp tuýp kể trên, phần lớn dạng tái tổ hợp B/C C/D, tái tổ hợp tuýp khác xảy trường hợp kể [8] 1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy HBV tồn loại tiểu thể khác (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm, tiểu thể hình ống (tubµLar particle) kích thước 22nm có chiều dài 40 - 400nm tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Tiểu thể hình cầu nhỏ hình ống thành phần vỏ HBV mà trình nhân lên tổng hợp dư thừa Đây kháng nguyên bề mặt (HBsAg) Các tiểu thể đứng riêng rẽ hay đứng hợp với thành đám, chúng khả lây truyền bệnh [48] Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Đây hạt virus hồn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm lớp: - Bao ngồi: Lớp bao ngồi có chất Lipoprotein Lớp có kháng nguyên bề mặt (HBsAg) [28] - Lớp lõi: Capsid đối xứng hình hộp có chứa kháng nguyên lõi HBcAg Bên lõi có chứa gen HBV gồm sợi DNA đóng vịng khơng kín, enzyme phiên mã ngược polymerase protein kinase [28, 34] Hình 1: Ba loại tiểu thể virus HBV [100] (A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane); (B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C) Tiểu thể hình ống 1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV Cấu trúc nucleocapsid HBV chứa gen với chiều dài khoảng 3,2 kilobase (kb) phân tử DNA sợi đơi khơng hồn chỉnh dạng vịng khơng kín hồn tồn (relaxed circular DNA - rcDNA) [11, 17] Nucleocapsid cấu trúc nhị thập diện hình thành 240 phân tử protein capsid virus với đường kính khoảng 27 nm, nucleocapsid chứa DNA virus enzyme polymerase liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ sợi âm [17, 58] Một vài protein tế bào bao gồm protein kinase đóng gói vào cấu trúc nucleocapsid [17] Một đặc điểm độc đáo hệ gen HBV cấu trúc bất đối xứng hai sợi Sợi âm tổng hợp đầy đủ có chiều dài kích thước hệ gen, cịn sợi dương bổ sung với sợi âm lại có khác biệt chiều dài, chiều dài sợi dương chưa nghiên cứu xác, thay đổi theo tp, dịng [30] Ngồi ra, sợi âm sợi dương có chung điểm đặc biệt sợi DNA dạng thẳng nhờ bổ sung sợi mà hình thành cấu trúc vịng rcDNA Hệ gen virus có chứa khung đọc mở (open reading frame - ORF) xếp chồng lên kí hiệu S, C, P X mã hóa cho bốn protein khác [58] Cấu trúc xếp chồng lên vùng mã hóa khiến cho virus sử dụng hệ gen với hiệu suất 150% (Hình 2) [124] - Gen PreS1/PreS2 S (mã hóa cho protein vỏ L-, M- S) - Gen precore/core (mã hóa cho protein nucleocapsid; HBcAg protein không cấu trúc; HBeAg) - Gen polymerase (enzyme reverse transcriptase, RNase H) - Gen X (mã hóa cho protein điều hòa X) Các gen S C nằm ORF riêng có ba mã mở đầu khác nhau, tổng hợp sản phẩm gen có chức khác [30, 58] Các ORF S C kéo dài đến preS1 (preS1 preS2) vùng preC đầu 5’ Ở vùng ORF xếp chồng lên có xuất gen điều hòa vùng khởi động (preC/C, preS1/S X) trình tự tăng cường, gen cho phép biểu protein khác phiên mã từ ba mã mở đầu khác mRNA khác với đuôi tự Sản phẩm phiên mã có chiều dài 0,7 kb mã hóa cho protein HBx; sản phẩm phiên mã có chiều dài 2,1 kb 2,4 kb mã hóa cho M- S-HBsAg, L-HBsAg [30] Sản phẩm phiên mã mã hóa cho protein core polymerase pregenomic RNA (pgRNA) Pregenomic RNA mạch khn cho q trình tổng hợp virus HBV phiên mã ngược để hình thành nên hệ gen DNA HBV Như biết, hệ gen virus có chiều dài 3,2 kb, chiều dài pgRNA 3,5 kb, tức dài hệ gen virus, “dự phòng” hệ gen virus [75, 95] Hai vùng gen với 11 nu lặp lại gọi DR1 DR2 nằm đầu 5’ sợi âm sợi dương hai gen có vai trị quan trọng q trình nhân lên DNA virus [33, 58] Hai trình tự tăng cường (enhancer) kí hiệu Enh1 Enh2, giúp tăng biểu sản phẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan [58] Vùng ORF S mã hóa cho protein bề mặt virus, HBsAg có cấu trúc phân chia phân hóa vùng preS1, preS1 S với ba mã mở đầu AUG khác [92] Trong L HBsAg có vai trị liên kết với thụ thể dịch mã từ mRNA preS1 có chứa domain preS1, preS2 S; protein M S HBsAg dịch mã từ mRNA preS2/S mRNA S [30, 33, 107] Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV 1.1.4 Các protein HBV Hệ gen HBV mã hóa cho protein: HBx, core, polymerase, L-, M- SHBsAg Trong số protein này, HBx protein điều hịa khơng tham gia vào hình thành cấu trúc virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc virion protein giải phóng cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệm cho trình nhân lên hệ gen, protein core HBsAg có chức hình thành cấu trúc virion Chức protein virus HBV nhắc đến chi tiết phần Kháng nguyên E HBeAg sản phẩm cuối trình sau dịch mã ORF precore Là protein mã hóa sản phẩm phiên mã từ gen virus, biểu protein phụ thuộc vào vùng khởi động gen virus ORF HBeAg mã hóa cho trình tự với đích lưới nội chất (endoplasmic reticulum ER) đồng thời dịch mã peptide hướng ER, nơi mà protein sau hoàn thiện tồn dạng 15kD HBeAg - kháng nguyên tiết từ tế bào nhiễm HBV [113] Kháng nguyên bề mặt HBsAg protein vỏ virion HBV Như tồn HBsAg virion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa lượng dư tiểu thể hình cầu nhỏ tiểu thể hình ống HBsAg khơng có khả gây nhiễm tồn huyết họ Những tiểu thể tiết nhiều (100 -100,000 lần) so với số lượng virus trưởng thành tiết [107] Có số báo cáo lý tiểu thể hình cầu nhỏ tiểu thể hình ống HBsAg tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane bẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, nhiễm mạn tính hình thành [30, 35] HBsAg khơng tạo trình dịch mã mRNA mà cịn từ DNA tích hợp với gen người Điều kiện giúp biết trạng thái nhiễm bệnh nhân cách tồn diện [107] Chức kháng ngun bề mặt hình thành nên lớp vỏ virus Ba dạng khác hạt virus giải phóng từ tế bào nhiễm HBV kết q trình biểu khơng đồng ba kháng nguyên bề mặt SHBsAg protein có mức biểu cao kháng nguyên bề mặt virus HBV protein thành phần cấu thành nên vỏ virus [25] Protein lõi (protein core) Protein core (protein lõi) (21 kD) hay gọi HBcAg, protein có vai trị định hình cho virion Khi biểu tế bào, protein thường tồn dạng nhị hợp, dạng capsid nhị thập diện T = T = Khoảng 95% nucleocapsid phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = tạo nên khoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% lại capsid T = với 90 nhị hợp Protein lõi dịch mã từ pgRNA 149 axit amin hình thành nên vùng lắp ráp, có chức cho hình thành in vitro capsid, capsid có khác biệt với capsid phân lập từ tiểu thể Dane [16] Khoảng 34 - 36 axit amin lại tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); q trình phosphoryl hóa số axit amin vùng CTD có chức điều hịa số giai đoạn chu trình sống virus [57, 65, 73, 81] Polymerase/Reverse transcriptase (RTase) Không lâu sau xác định dạng virus giống HBV vịt [69], mơ hình DHBV sử dụng để xác định gen DHBV có trải qua trung gian RNA, cho thấy HBV nhân đôi thông qua trình phiên mã ngược (RT) [99] Trong trình phiên mã ngược chế nhiều virus sử dụng, HBV trải qua trình chép gen với nhiều đặc điểm độc đáo Protein polymerase (reverse transcriptase/RTase/Pol/P) protein 90kD có khoảng 838 axit amin tạo thành từ vùng chức vùng đệm thay đổi Ở vùng N-terminal vùng TP (terminal protein), vùng có vai trị quan trọng việc khởi động trình chép gen virus Mặc dù vùng có vai trị quan trọng giúp polymerase bám vào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết protein [9, 119, 129], vùng TP domain độc đáo khơng có virus RT khơng thuộc nhóm HBV Một vùng đệm thay đổi có khả phân chia TP domain từ RT domain, có số nghiên cứu cho thấy gần tất axit amin thuộc vùng đệm bị đột biến mà không làm thay đổi chức P [86] Thực tế là, có phân tử cysteine nằm vùng C-terminal vùng đệm, với phần tư đầu N-terminal RT domain quan trọng chức enzyme RTase/polymerase [53] RT domain có vai trị q trình nhân lên gen virus cách phiên mã ngược pgRNA để hình thành sợi âm DNA gen virus sau sợi âm sử dụng làm khn cho q trình tổng hợp sợi dương DNA Domain có độ tương đồng cao loại retrovirus khác [122] Hiện domain RT liệu pháp đích chống lại HBV [91], dựa hiệu loại thuốc NAs có khả ức chế khả enzyme RTase virus HIV Thực tế ... tương b? ??nh nhân CHB .57 3.3.2 Xác định tính ổn định mẫu chuẩn quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA huyết tương b? ??nh nhân CHB 61 3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR mẫu b? ??nh nhân CHB 64 KẾT LUẬN...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Triệu Thị Nguyệt NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HBV- RNA HUYẾT TƯƠNG Ở B? ??NH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH Chuyên... giảm mạnh HBV DNA biến chứng hầu hết b? ??nh nhân Tuy nhiên NAs không ảnh hưởng tới tổng hợp RNA tiền gen (pgRNA) HBV b? ??nh nhân viêm gan B mạn tính hay tổng hợp protein virus HBsAg cccDNA khơng b? ??