Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm

Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.

Giới thiệu

Đặt vấn đề

Cá lóc (Channa striata) là loài cá được nuôi phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nhờ chất lượng thịt thơm ngon và giá thành hợp lý, dẫn đến sản lượng cá lóc nuôi ngày càng tăng cao Tuy nhiên, quá trình chế biến sản phẩm khô cá lóc chỉ đạt hiệu suất thu hồi thịt cá khoảng 60%, dẫn đến việc thải ra một lượng lớn phụ phẩm như đầu, xương, da, vây, vảy và nội tạng Phụ phẩm cá lóc chứa hàm lượng protein cao khoảng 13,58%, vì vậy việc tận dụng nguồn phụ phẩm này để tạo ra những chế phẩm protein có giá trị kinh tế cao hơn là cần thiết Ứng dụng enzyme protease, đặc biệt là alcalase, để thủy phân phụ phẩm cá là cách tiếp cận hiệu quả, giúp cắt liên kết peptide bên trong phân tử protein và đem lại hiệu quả thủy phân cũng như hiệu suất thu hồi protein cao.

Flavourzyme là một loại enzyme có cả hoạt tính endopeptidase và exopeptidase, nhưng chủ yếu là exopeptidase, có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae Hoạt tính exopeptidase của flavourzyme giúp giảm đáng kể vị đắng của sản phẩm thủy phân bằng cách thủy phân từ đầu amin của protein hoặc peptide Để tăng hiệu suất thủy phân và giảm vị đắng, một số nghiên cứu đã sử dụng kết hợp endopeptidase và exopeptidase, chẳng hạn như kết hợp alcalase và flavourzyme Tuy nhiên, sử dụng kết hợp hai loại enzyme này có thể dẫn đến enzyme này là cơ chất của enzyme kia và ngược lại, do đó cần phải xem xét kỹ lưỡng khi sử dụng phương pháp này.

(2019) đã nghiên cứu thủy phân theo trình tự bổ sung endopeptidase trước và exopeptidase sau để thu được dịch đạm có hiệu suất thủy phân cao.

Trên toàn cầu, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất collagen chủ yếu đến từ da heo và xương bò Tuy nhiên, sự bùng nổ của bệnh bò điên và lở mồm long móng ở heo đã dẫn đến sự suy giảm nguồn nguyên liệu sản xuất collagen từ động vật có vú, tạo ra nhu cầu tìm kiếm nguồn nguyên liệu thay thế.

Một số nguồn collagen an toàn, có nguy cơ truyền bệnh thấp và không bị ràng buộc tôn giáo đang được quan tâm, điển hình như collagen chiết xuất từ phụ phẩm của quá trình chế biến thủy sản, chẳng hạn như da và vảy cá.

Chiết tách collagen từ da cá và vảy cá phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm bước tiền xử lý loại bỏ protein phi collagen và khử khoáng Công đoạn chiết tách là giai đoạn quyết định chất lượng collagen, và acetic acid đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong việc chiết tách collagen Kết hợp pepsin với acetic acid cũng có thể cải thiện hiệu suất chiết tách collagen, mang lại chất lượng cao hơn cho sản phẩm cuối cùng.

Tuy nhiên, vẫn còn thiếu những nghiên cứu về thủy phân thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme riêng lẻ hoặc kết hợp, cũng như thủy phân 2 giai đoạn, và chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin Do đó, việc đẩy mạnh nghiên cứu thu hồi protein từ đầu, da và vảy cá lóc để sản xuất chế phẩm bột đạm thủy phân và collagen là một hướng đi cấp thiết Đồng thời, ứng dụng các chế phẩm protein này trong sản xuất thực phẩm cũng là một nhu cầu quan trọng cần được giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu

Việc xác định các thông số kỹ thuật và tối ưu hóa quá trình thu nhận protein từ đầu, da và vảy cá lóc là bước đầu tiên quan trọng để chế biến các chế phẩm giàu protein Quá trình này hướng tới xây dựng quy trình sản xuất bột đạm thủy phân từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme, cũng như sản xuất collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin Các chế phẩm giàu protein này sau đó được ứng dụng trong sản xuất sản phẩm bột súp rau củ và nước ép giàu collagen, mang lại giá trị dinh dưỡng cao cho người tiêu dùng.

Việc xác định thời gian trữ đông thích hợp và chọn biện pháp tiền xử lý phụ phẩm phù hợp là chìa khóa để duy trì chất lượng tốt của đầu cá lóc Thông qua việc áp dụng phương pháp trữ đông đúng cách, đầu cá lóc có thể giữ được giá trị dinh dưỡng và hương vị tự nhiên, đồng thời giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn và các tác nhân gây hư hỏng.

- Thiết lập được chế độ thủy phân tối ưu cho đầu cá lóc bằng công nghệ enzyme phù hợp để thu nhận dịch đạm thủy phân.

Quy trình chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc đã được xây dựng thành công, mang lại sản phẩm collagen loại I với thành phần amino acid cân đối, màu sắc sáng đẹp và độ hòa tan cao Đây là một bước tiến quan trọng trong việc tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có để sản xuất collagen chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường.

Việc dự đoán thời gian bảo quản cho phép đối với chế phẩm giàu protein thu nhận từ phụ phẩm cá lóc là vô cùng quan trọng, giúp chúng ta có thể kiểm soát và đảm bảo chất lượng của sản phẩm trong suốt quá trình bảo quản Điều này không chỉ giúp kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm mà còn góp phần giảm thiểu lãng phí và đảm bảo an toàn thực phẩm Với việc ứng dụng chế phẩm giàu protein này, chúng ta có thể chế biến một số sản phẩm thực phẩm đa dạng và hấp dẫn, đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng về thực phẩm giàu dinh dưỡng và an toàn.

Nội dung nghiên cứu

Dựa trên mục tiêu được đặt ra, nghiên cứu tiến hành thực hiện các nội dung:

- Khảo sát điều kiện tiền xử lý và trữ đông phụ phẩm cá lóc.

- Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme.

- Nghiên cứu điều kiện chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin.

- Dự đoán thời hạn sử dụng bột đạm thủy phân và xác định tỷ lệ phối trộn bột đạm thủy phân trong sản xuất bột súp rau củ.

- Xác định tỷ lệ collagen thủy phân bổ sung trong sản xuất nước ép giàu collagen.

Đối tượng và phạm vi nguyên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là đầu, da và vảy cá lóc.

Nghiên cứu tập trung vào tối ưu hóa quá trình thủy phân thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme để sản xuất chế phẩm bột đạm thủy phân chất lượng cao Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng thực hiện chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin hiệu quả Các chế phẩm thu được sẽ được ứng dụng trong sản xuất sản phẩm bột súp rau củ giàu dinh dưỡng và nước ép giàu collagen, mang lại giá trị gia tăng cho ngành công nghiệp thực phẩm.

Ý nghĩa của luận án

Công ty chúng tôi chuyên phát triển sản phẩm protein chất lượng cao như peptide, amino acid và collagen dễ tiêu hóa, được ứng dụng trong thực phẩm chức năng nhằm hỗ trợ dinh dưỡng cho con người Với công nghệ enzyme hiện đại, kết hợp giữa enzyme và hóa học, chúng tôi đã tạo ra được những sản phẩm có hiệu quả cao từ các phụ phẩm như đầu, da, vảy cá lóc, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của nguyên liệu và giảm thiểu chất thải.

- Nghiên cứu đã xác định được giá trị gia tăng cao của ngành nông nghiệp nuôi và thương mại cá lóc của Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn:

Thiết lập quy trình công nghệ hiệu quả cao cho quá trình thủy phân đầu cá lóc có thể đạt được thông qua sự kết hợp của hai loại enzyme là flavourzyme và alcalase Sự kết hợp này đòi hỏi phải được thực hiện trong điều kiện thích hợp nhất để tối ưu hóa quá trình thủy phân Khi được áp dụng đúng cách, quy trình này có thể mang lại hiệu quả cao và giúp tận dụng tối đa giá trị dinh dưỡng của đầu cá lóc.

Xây dựng quy trình công nghệ đạt hiệu quả cao cho quá trình chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng phương pháp hóa sinh kết hợp là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học Quy trình này cho phép tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có từ da và vảy cá lóc để sản xuất collagen chất lượng cao, phục vụ nhu cầu của ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm Bằng cách áp dụng phương pháp hóa sinh kết hợp, quy trình này không chỉ giúp tăng hiệu suất chiết tách collagen mà còn đảm bảo tính an toàn và thân thiện với môi trường.

Điểm mới của luận án

Luận án này đã chứng minh khả năng thực tế cao của giải pháp tạo ra sản phẩm giàu protein từ phụ phẩm đầu, da và vảy cá lóc, đồng thời đánh giá tính khả thi khi ứng dụng trong thực phẩm, mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp thực phẩm.

- Nâng cao giá trị của phụ phẩm chế biến cá lóc thông qua tạo ra sản phẩm có giá trị cao.

- Giúp định hướng chế biến các sản phẩm thực phẩm từ cá lóc không phụ phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Thí nghiệm này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Khoa học và Công nghệ Chế biến Thủy sản, Trường Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ và phòng thí nghiệm khác.

Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ.

Thời gian thực hiện: Từ tháng 11/2020 đến tháng 4/2023.

- Tủ sấy thực phẩm Memmert, Model UF 450, Schwabach, Đức.

- Bể điều nhiệt Memmert, model WNB 22, nhiệt độ 40-95°C, độ chính xác 0,1°C, Đức.

- Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp, Hettich Universal 320R, Đức.

- Tủ đông SANAKY, model NU-6502, nhiệt độ -80 o C, Việt Nam.

- Tủ mát Alaska, model IK-39, công suất 1.000W, Trung Quốc.

- Hệ thống lọc màng Amicon với kích thước màng lọc (3 kDa, 10 kDa và 30 kDa), Millipore EMD, Merck KGaA, Darmstadt, Đức.

Máy sấy thăng hoa iFDs là thiết bị hiện đại được sản xuất bởi iLab tại Thành phố Hồ Chí Minh, với khả năng điều chỉnh nhiệt độ tối thiểu xuống -20 o C và nhiệt độ sấy lên đến -1 o C Thiết bị này còn có khả năng điều chỉnh áp suất từ 0 đến 520 mTorr, đáp ứng nhu cầu sấy khô đa dạng của người dùng Đặc biệt, máy sấy thăng hoa iFDs được gia công và sản xuất hoàn toàn tại Việt Nam, đảm bảo chất lượng và độ tin cậy cao.

- Tủ môi trường vi khí hậu, MLR-352H, nhiệt độ 0-50 o C, độ ẩm không khí 60- 90%, được sản xuất bởi Công ty PHC, Gunma, Nhật Bản.

- Máy cô quay chân không, BUCHI R-300 EL, Thụy Sỹ.

- Máy khuấy từ, model JS-17S, Hàn Quốc.

- Nhiệt kế Thermometer, type T, độ chính xác 0,1, Ý.

- Máy xay công nghiệp Toàn Phát, Type: TP9C-4, công suất 1,1 kW, Việt Nam.

- Thiết bị đồng hóa, MISUNG SR 30, Thụy Sĩ.

- Cân điện tử Shinko GS, độ chính xác 0,01 g, Nhật.

- Cân phân tích 4 số HERN ABJ-NM/ABS-N, Đức.

- Bộ chưng cất đạm tự động, Model UDK159, Velp, Ý.

- Hệ thống trích lipid Shoxlet, Gerhardt, Đức.

- Lò nung, Muffle Furnace Size 2, Gallenkamp, Đức.

- Tủ sấy ẩm JEIOTECH, model ON-11E, Hàn Quốc.

- Máy đo độ nhớt Brookfield, model RVDV-II+CP, Mỹ.

- Máy đo pH Consort C1020, Bỉ.

- Máy đo màu Colorimeter PCE-CSM 2, Trung Quốc.

- Máy so màu quang phổ, GENESYS™ 30 Visible Spectrophotometer, Mỹ.

- Bộ điện di hai chiều, Mini PROTEAN 3 cell, Bio– Rad, Mỹ.

- Tủ cấy vi sinh, Dalton, Nhật.

Một số dụng cụ thủy tinh thông thường và một số dụng cụ khác như thau, rổ, dao, thớt phục vụ cho quá trình thực hiện thí nghiệm.

- Chế phẩm alcalase được sản xuất bởi Công ty Novozyme, Đan Mạch, có hoạt độ

825 U/mL, điều kiện hoạt động tối ưu là ở nhiệt độ 50 o C và pH 8,3 tùy theo cơ chất.

Chế phẩm flavourzyme là sản phẩm của Công ty Novozyme, Đan Mạch, với hoạt độ cao 2450 LAPU/g Chế phẩm này hoạt động tối ưu trong điều kiện nhiệt độ 50 o C và pH 7,0, tuy nhiên điều kiện này có thể thay đổi tùy theo loại cơ chất sử dụng.

Chế phẩm pepsin được chiết xuất từ dạ dày lợn (Merck, Đan Mạch) có hoạt độ cao 0,7 FIP-U/mg, phù hợp với điều kiện hoạt động trong môi trường acid với pH từ 1,5 đến 2 và nhiệt độ tối ưu trong khoảng 37 - 42°C tùy theo loại cơ chất.

- Sodium hydroxide (NaOH), độ tinh khiết 99%, Trung Quốc.

- Ethylendiamin Tetraacetic Acid Disodium (EDTA-2Na), Ấn Độ.

- Hexane (C 6 H14), độ tinh khiết > 96%, GHTECH, Trung Quốc

- Ethanol absolute (C 2 H5OH), độ tinh khiết 99,5%, Việt Nam.

- Isopropanol, độ tinh khiết ≥99,7%, GHTECH, Trung Quốc.

- Acetic acid (CH 3 COOH), độ tinh khiết 99,5%, Trung Quốc.

- Borax (NaP 4 O7), độ tinh khiết > 95%, Mỹ.

- Ortho-phthalaldehyde (Phthalaldehyde), Merck, Đức.

- Casein, alkaline soluble, độ tinh khiết 96%, HiMedia, Ấn Độ.

- Comassie Brilliant Blue G250, Merck, Đức.

- Disodium hydrogren phosphate dodecahydrate (Na 2 HPO4.12H2O), độ tinh khiết 99,0%, Trung Quốc.

- Folin- Ciaucalten (C 10 H3NaO5S), độ tinh khiết >99,5%, Merck, Đức.

- Tyrosine, độ tinh khiết > 98%, Merck, Đức.

- Monosodium dihydrophosphate dihydrate (NaH 2 PO4.2H20), độ tinh khiết > 95%, Trung Quốc.

- Tricloroacetic acid-TCA (C 2 HCl3O2), độ tinh khiết ≥ 98%, Merck, Đức.

- Formaldehyde solution (HCHO), 37 - 40%, Trung Quốc.

- DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), Sigma-aldrich, Mỹ.

- Tris-HCl - Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, độ tinh khiết

Các hóa chất cần thiết cho quá trình thí nghiệm và phân tích các chỉ tiêu được nhập khẩu và phân phối bởi hai đơn vị uy tín là Công ty TNHH TM & DV XNK Thành Mỹ (Thành phố Cần Thơ) và Công Ty TNHH TM Nông Sản và Hóa Chất, đảm bảo chất lượng và độ chính xác cho kết quả thí nghiệm.

PhươngTrâm (Thành phố Hồ Chí Minh).

Nguyên liệu và chuẩn bị nguyên liệu

3.2.1 Nguyên liệu Đầu, da và vảy cá lóc được mua tại Cơ sở khô cá lóc 7 Chóp (huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang) Cá lóc được cơ sở khô cá lóc 7 Chóp mua tại các ao nuôi ở tỉnh An Giang trong vùng được kiểm soát về kháng sinh, kim loại, hóa chất theo quyết định số 53/2009/QĐ-UBND tỉnh An Giang Phụ phẩm (đầu, da và vảy cá lóc) được thu gom trực tiếp tại cơ sở ngay sau quá trình xử lý trong chế biến các sản phẩm khô nguyên con, thịt cá lóc cắt sợi làm khô Phụ phẩm được làm đông ở nhiệt độ -20±2 o C trong thời gian 24 giờ và đóng thùng chuyển về phòng thí nghiệm Khoa Khoa học và Công nghệ Chế biến Thủy sản, Trường Thủy sản, Đại học Cần Thơ không quá 4 giờ nhằm đảm bảo nguyên liệu vẫn còn đông Đối với thí nghiệm bảo quản lạnh đông đầu cá lóc, thì đầu cá được thu gom tại cơ sở và bảo quản lạnh bằng nước đá với tỷ lệ nguyên liệu: nước đá là 1:1, đảm bảo nhiệt độ nguyên liệu trong quá trình vận chuyển từ 0  4 o C và vận chuyển về Cần Thơ không quá 4 giờ.

3.2.2 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm Đầu cá (110 – 130 g/ đầu) được rửa sạch bằng nước muối loãng 0,5%, loại bỏ mắt, mang, bọng nhớt và rửa sạch; da cá được loại sạch thịt và vảy và rửa sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ nhớt, máu, để ráo; vảy cá được rửa 3 lần trong nước muối loãng 0,5%, mỗi lần rửa khoảng 2 phút để loại bỏ nhớt Sau đó, vảy cá được rửa sạch và phơi ráo. Đầu, da và vảy sau khi rửa sạch, để ráo, tách riêng, cho vào túi PE (khoảng 1 kg/túi đối với đầu cá), (200 g/túi đối với da và vảy cá) và bảo quản ở nhiệt độ -20±2 o C.Khi tiến hành thí nghiệm, nguyên liệu được rã đông qua đêm ở nhiệt độ 0 - 4 o C, đầu cá được cắt đôi và xay 1 phút bằng máy xay công nghiệp với tốc độ quay của trục vít là1.400 vòng/phút; cắt da cá thành từng miếng nhỏ có kích thước 2 x 1 cm.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích và đo đạc theo các phương pháp tiêu chuẩn được tổng hợp ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

TT Chỉ tiêu Phương pháp

1 Màu sắc (L*, a*, b*) Đo bằng thiết bị đo màu Colorimeter PCE-CSM2

2 Nhiệt độ biến tính của collagen

Theo phương pháp của Kimura at el (1988)

3 Độ nhớt (mPa.s) Đo bằng máy đo độ nhớt Brookfield DV theo phương pháp của Montero at el (1991)

4 pH Sử dụng pH kế theo ISO 2917:1999

5 Hiệu suất tách lipid (%) Hàm lượng lipid được tách khỏi nguyên liệu*100/

Hàm lượng lipid trong nguyên liệu (Wenweo at el.,2018)

6 Hiệu suất thu hồi collagen

7 Độ ẩm (%); Protein (mẫu rắn, %) và (mẫu lỏng, g/L);

HSTH collagen = (Lượng collagen thành phẩm×100)/(Khối lượng da-vảy đem chiết tách) Phương pháp sấy theo TCVN 3700:1990; Kjeldahl theo TCVN 3705:1990; Soxhlet theo TCVN 3703:2009; nung theo TCVN 5105:2009

8 Carbohydrate (%) % carbohydrate = 100 – % ẩm – % protein – % lipid – % khoáng – % xơ (Ramdath at el., 2020)

9 Tổng năng lượng cung cấp

(mg/kg), chì (mg/kg), đồng (mg/100g)

11 Chỉ số peroxide value (PV, meq/kg)

12 Khả năng khử gốc tự do

13 Tổng lượng nitơ bazơ bay hơi

15 Hàm lượng protein hòa tan

Tổng năng lượng cung cấp = tổng hàm lượng béo*9 + tổng hàm lượng protein*4 + tổng hàm lượng carbohydrate*4 (Nguyễn Minh Thủy, 2009) AOAC 2013.06

Phương pháp so màu quang phổ theo TCVN 6121:2018

Theo phương pháp của Wu at el (2003)

Phương pháp chưng cất với chất kiềm hóa là MgO theo TCVN 3706:1990

Phương pháp định lượng nitơ formol và hiệu chuẩn với nitơ ammoniac theo TCVN 12620:2019 Phương pháp Lowry (Lowry at el., 1951)

16 Thành phần amino acid Theo phương pháp của Kimura at el (1988)

17 Hiệu suất thu hồi protein

18 Tỷ lệ thu hồi protein của từng phân đoạn (TLTH protein, %)

Công thức tính hiệu suất thu hồi protein (PR) được xác định bằng cách lấy hàm lượng protein trong dịch đạm nhân với khối lượng dịch đạm, sau đó nhân với 100 và chia cho hàm lượng protein trong nguyên liệu nhân với khối lượng đầu cá đem thủy phân Ngoài ra, tổng lượng thu hồi protein (TLTH protein) được tính bằng cách lấy hàm lượng protein của phân đoạn nhân với thể tích phân đoạn, sau đó chia cho hàm lượng protein dịch đạm gốc nhân với thể tích dịch đạm gốc đem lọc màng.

19 Sắc ký điện di protein Theo phương pháp của Laemmli (1970)

20 Hiệu suất thủy phân (DH, %) Theo phương pháp OPA của Nielsen at el (2001)

21 Độ hòa tan của collagen (%) Theo phương pháp của Montero at el (1991)

22 Phổ FTIR của collagen Theo phương pháp của Kong & Yu (2007)

23 Hoạt tính enzyme protease Theo phương pháp của Cupp-enyard (2008)

24 Cảm quan Phương pháp cho điểm theo TCVN 3215-79

25 Tổng vi khuẩn hiếu khí (cfu/g) Phương pháp đếm đĩa theo TCVN 5165:1990

26 Coliforms (cfu/g), Escherichia coli (cfu/g), Salmonella,

(cfu/25 g), Staphylococcus aureus (cfu/g), tổng số bào tử

Theo tiêu chuẩn ISO 4832:2006; ISO 16649- 2:2001; ISO 6579-1:2017; ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003; ISO 21527-1:2008 nấm men- nấm mốc (cfu/g)

3.3.2 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được thiết kế và thực hiện theo phương pháp bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, sau đó kết quả được tính trung bình và độ lệch chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 Dữ liệu thu được được phân tích thống kê bằng chương trình Statgraphics Centurion XV Version 15.1.02 Để tối ưu hóa quá trình thí nghiệm, phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) - thiết kế Draper-Lin small composite design được áp dụng để phân tích ảnh hưởng của nhiều biến đến hàm mục tiêu Kết quả từ các thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định cho các thí nghiệm tiếp theo, giúp tăng độ chính xác và tin cậy của kết quả.

Nội dung 1 (ND1): Nghiên cứu điều kiện tiền xử lý và trữ đông phụ phẩm cá lóc

 Thí nghiệm 1 (TN1): Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến chất lượng nguyên liệu và hiệu quả thủy phân protein từ đầu cá lóc

 TN2: Khảo sát phương pháp loại lipid từ đầu cá lóc

 TN3: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm NaOH đến khả năng khử protein phi collagen từ da cá lóc

 TN4: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm EDTA-2Na đến khả năng khử khoáng từ vảy cá lóc

ND2: Xác định điều kiện thủy phân thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme

ND3: Nghiên cứu chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin

TN19: Dự đoán thời hạn sử dụng chế phẩm bột đạm bằng phương pháp gia tốc

TN20: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ bột đạm: bột kem béo thực vật đến chất lượng sản phẩm bột súp rau củ

TN21: Khảo sát ảnh hưởng của loại nước ép và tỷ lệ collagen thủy phân đến chất lượng nước ép giàu collagen

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các nội dung nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ tổng quát Hình 3.1.

 TN5,6,&7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian và nhiệt độ thủy phân bằng flavourzyme

 TN8&9: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian, nhiệt độ thủy phân bằng alcalase

 TN10: Tối ưu hóa điều kiện thủy phân khi kết hợp đồng thời alcalase và flavourzyme

 TN11: Ảnh hưởng thời điểm bổ sung flavourzyme

 TN12: Tối ưu hóa điều kiện thủy phân theo trình tự bổ sung alcalase trước và flavourzyme sau

TN13: Ảnh hưởng của kích thước màng lọc đến tính chất dịch đạm thủy phân

 TN14&15: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ và thời gian chiết tách collagen bằng acetic acid

 TN16&17: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian chiết tách collagen bằng pepsin

TN18: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian thủy phân collagen bằng alcalase đến chất lượng collagen thủy phân

ND4: Khảo sát khả năng ứng dụng các chế phẩm protein từ phụ phẩm cá lóc trong sản xuất sản phẩm thực phẩm

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

3.4.1 Xác định thành phần hóa học của phụ phẩm cá lóc

Mục đích của nghiên cứu này là xác định thành phần hóa học của đầu, da và vảy cá lóc, từ đó đánh giá chất lượng của nguồn nguyên liệu, tạo cơ sở vững chắc cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với các nguồn nguyên liệu đầu, da và vảy cá lóc với 3 lần lặp lại (3 đợt thu mẫu).

Tiến hành thí nghiệm: Đầu, da và vảy ở mỗi đợt thu mẫu sau khi xử lý như mục

Để đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích, mẫu 200g được lấy ngẫu nhiên và tiến hành phân tích các chỉ tiêu hóa học Quá trình xử lý mẫu cần được thực hiện nhanh chóng và cẩn thận nhằm hạn chế tối đa các biến đổi hóa học không mong muốn, từ đó giữ nguyên thành phần hóa học ban đầu của nguyên liệu.

Chỉ tiêu theo dõi: Độ ẩm (%), protein (%), lipid (%) và khoáng (%).

Kết quả thu nhận là giá trị các chỉ tiêu của nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu và đánh giá sự đồng nhất nguyên liệu trong các nội dung nghiên cứu, giúp đánh giá chất lượng và tính ổn định của nguyên liệu.

3.4.2 Nội dung 1: Xác định điều kiện tiền xử lý và trữ đông phụ phẩm cá lóc

3.4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến chất lượng nguyên liệu và hiệu quả thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng alcalase

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định thời gian trữ đông đầu cá lóc ở nhiệt độ -20±2°C để đảm bảo chất lượng nguyên liệu cho quá trình thủy phân bằng alcalase, đồng thời đạt được hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu hồi protein cao nhất.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố

Nhân tố A: Thời gian trữ đông đầu cá lóc (tháng)

Ao: Mẫu đối chứng (nguyên liệu ban đầu, không trữ đông)

Số mẫu thí nghiệm: 4 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 12

Để tiến hành thí nghiệm, đầu cá lóc đã được chuẩn bị và cân với trọng lượng từ 4200 – 4440 g, sau đó chia đều thành 12 mẫu với trọng lượng từ 350 – 370 g/mẫu Các mẫu này được bảo quản lạnh đông ở nhiệt độ -20±2°C trong 4 mốc thời gian khác nhau (0, 1, 2 và 3 tháng) và được lặp lại 3 lần Tại mỗi mốc thời gian, 3 mẫu được lấy ra và xay nhuyễn, sau đó chia thành hai phần Phần đầu tiên (310-330 g/mẫu) được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu như tổng vi khuẩn hiếu khí, pH, độ ẩm, tổng lượng nitơ bazơ bay hơi và chỉ số peroxide value Phần thứ hai (40 g/mẫu) được sử dụng để thủy phân thu hồi protein bằng alcalase với các thông số cố định như thời gian thủy phân 24 giờ và nhiệt độ thủy phân phù hợp.

50 o C; pH 8,0, nồng độ alcalase là 40 U/g protein, tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch ethanol

Quá trình thủy phân được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch ethanol 20 o như chất phòng thối, theo phương pháp mô tả bởi Lý Thị Minh Phương (2011) Sau khi thủy phân, mẫu được bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 95 o C trong 10 phút, sau đó lọc qua rây để loại bỏ bã đầu và thu phần dịch lọc Phần dịch lọc này được ly tâm với tốc độ 7500 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4 o C, tạo thành 3 lớp riêng biệt: lớp lipid phía trên, lớp dịch đạm thủy phân ở giữa và lớp protein không tan dưới đáy Cuối cùng, phần dịch đạm thủy phân được thu lại để phân tích các chỉ số như hiệu suất thủy phân (DH), hiệu suất thu hồi protein (PR), hàm lượng đạm ammoniac (N NH3) và tỷ số giữa đạm ammoniac và đạm tổng số (NNH3/NTS).

Chỉ tiêu theo dõi: Độ ẩm (%), PV (meq/kg), pH, TVB-N (mgN/100g), TVKHK

(cfu/g), DH (%), PR (%), NNH3 (g/L) và NNH3/NTS (%).

Kết quả thu nhận cho thấy thời gian trữ đông của nguyên liệu đầu cá lóc có thể duy trì chất lượng thích hợp cho quá trình thủy phân protein bằng enzyme alcalase trong một số tháng nhất định.

3.4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý tách loại lipid từ đầu cá lóc

Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra phương pháp tiền xử lý loại lipid phù hợp để tối ưu hóa hiệu suất tách lipid và tăng cường hiệu quả thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng enzyme alcalase, nhằm đạt được kết quả cao nhất trong quá trình thủy phân protein.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố

Nhân tố B: phương pháp tiền xử lý loại lipid

B1: Đối chứng (không xử lý loại lipid trước khi thủy phân bằng alcalase)

B2: Gia nhiệt B3: n-hexane B4: Isopropanol B5: Ethanol

Số mẫu thí nghiệm: 7 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 21

Để tách lipid từ đầu cá lóc, các thí nghiệm được thực hiện với các phương pháp khác nhau Đầu cá xay được bổ sung dung môi như n-hexane, isopropanol, ethanol, hỗn hợp isopropanol/n-hexane và ethanol/n-hexane, với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 2:1 (v/w) và gia nhiệt ở 70ºC trong 30 phút Sau khi gia nhiệt, hỗn hợp được để nguội trong 10 phút, lọc và thu phần dung môi để xác định hàm lượng lipid và tính hiệu suất tách lipid Ngoài ra, một phương pháp khác sử dụng nước với tỷ lệ đầu cá xay: nước là 1:1 (w/v) và gia nhiệt ở 95ºC trong 1 giờ, sau đó ly tâm và làm lạnh để tách lipid Phần rắn sau khi tách lipid được dùng để thủy phân bằng enzyme alcalase.

Sau khi tiền xử lý loại lipid, phần rắn của các loại NT B2, B3, B4, B5, B6, B7 được thủy phân bằng enzyme alcalase, tương tự như NT B1 không cần tiền xử lý loại lipid trước khi thủy phân Nguyên liệu đầu vào được xử lý bằng alcalase, bất hoạt enzyme, lọc và ly tâm như thí nghiệm trước đó Kết quả thu được bao gồm 3 lớp: lớp lipid trên cùng, lớp dịch đạm thủy phân ở giữa và lớp protein không tan dưới đáy Các lớp này được tách riêng để phân tích hiệu suất thủy phân, hiệu suất thu hồi protein, hàm lượng đạm amin và đạm ammoniac.

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất tách lipid (%), DH (%), PR (%), Naa (g/L), NNH3 (g/L).

Kết quả thu nhận: phương pháp tiền xử lý loại lipid từ đầu cá lóc thích hợp nhất.

3.4.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm NaOH đến khả năng khử protein phi collagen từ da cá lóc

Mục đích: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm NaOH thích hợp nhằm đạt được hiệu quả khử protein phi collagen từ da cá lóc tốt nhất.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố

Co: Nghiệm thức đối chứng (không ngâm NaOH)

Nhân tố C: Nồng độ NaOH (M)

Nhân tố D: Thời gian ngâm NaOH (giờ)

Tổng số nghiệm thức: 9 + 1 (nghiệm thức đối chứng)

Số mẫu thí nghiệm: 10 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 30

Để thực hiện thí nghiệm, da cá lóc đã được xử lý theo quy trình mô tả ở mục 3.2, sau đó ngâm quay trong dung dịch NaOH với các nồng độ và thời gian được bố trí thí nghiệm Quá trình ngâm quay được thực hiện ở nhiệt độ 0 - 4°C, với tỷ lệ da cá và dung dịch NaOH là 1:8 (w/v) và hỗn hợp được khuấy liên tục trong suốt quá trình xử lý Dung dịch kiềm được thay đổi sau mỗi 2 giờ và da cá được rửa bằng nước cho đến khi đạt pH trung tính sau khi kết thúc quá trình ngâm NaOH Cuối cùng, da cá được để ráo và phân tích hàm lượng protein còn lại cũng như tính hiệu quả khử protein phi collagen.

Chỉ tiêu theo dõi: Protein (%) và hiệu quả khử protein phi collagen (%).

Kết quả thu nhận: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm NaOH thích hợp nhất để khử protein phi collagen từ da cá lóc.

3.4.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm EDTA-2Na đến khả năng khử khoáng từ vảy cá lóc

Mục đích: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm EDTA-2Na thích hợp nhằm đạt được hiệu quả khử khoáng từ vảy cá lóc cao.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố

Eo: Nghiệm thức đối chứng (không ngâm EDTA-2Na)

Nhân tố E: Nồng độ EDTA-2Na (M)

Nhân tố F: Thời gian ngâm EDTA-2Na (giờ)

Tổng số nghiệm thức: 9 + 1 (nghiệm thức đối chứng)

Số mẫu thí nghiệm: 10 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 30

Thí nghiệm được thực hiện bằng cách xử lý vảy cá lóc như mô tả ở mục 3.2 và ngâm chúng trong dung dịch EDTA-2Na với các nồng độ và thời gian khác nhau Quá trình ngâm được thực hiện ở nhiệt độ 0 - 4°C, với hỗn hợp được khuấy liên tục và tỷ lệ vảy cá : dung dịch EDTA-2Na là 1:1 Các thông số cố định và phương pháp ngâm được thực hiện theo mô tả của Thuy et al (2014).

Dung dịch 8 (w/v) và EDTA-2Na được thay mới sau mỗi 12 giờ để đảm bảo hiệu quả ngâm quay Sau quá trình này, vảy cá được rửa kỹ bằng nước cho đến khi pH đạt mức trung tính, sau đó để ráo nước và tiến hành phân tích hàm lượng khoáng còn lại.

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng khoáng (%) và hiệu quả khử khoáng (%)

Kết quả thu nhận: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm EDTA-2Na thích hợp nhất để khử khoáng từ vảy cá lóc.

3.4.3 Nội dung 2: Xác định điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme

3.4.3.1 Sơ đồ nghiên cứu nội dung 2

Quy trình thủy phân protein từ đầu cá lóc được thực hiện dựa trên phương pháp thủy phân mô tả bởi Kechaou et al (2009) với một số điều chỉnh nhỏ Đầu tiên, đầu cá lóc sẽ được xay nhuyễn để chuẩn bị cho quá trình thủy phân tiếp theo.

Flavourzyme (Thí nghiệm 5-7) Alcalase (Thí nghiệm 8,9)

Bất hoạt enzyme – Lọc (95°C, 10 phút)

Dịch đạm thủy phân - Lọc màng (Thí nghiệm 13)

Sấy phun – Bột đạm thủy phân

Phần rắn Lipid Loại bã đầu

Alcalase trước và flavourzyme sau (Thí nghiệm 11,12) Kết hợp alcalase và flavourzyme (Thí nghiệm 10)

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2

3.4.3.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu nội dung 2 Đầu cá lóc được xử lý như mục 3.2, xay nhuyễn và tiến hành tách lipid bằng phương pháp thích hợp nhất được chọn từ thí nghiệm 2, sau đó thủy phân bằng flavourzyme và alcalase riêng lẻ theo phương pháp được mô tả bởi Kechaou at el.

(2009) với nồng độ flavourzyme (thí nghiệm 5), thời gian thủy phân (thí nghiệm 6) và nhiệt độ thủy phân bằng flavourzyme (thí nghiệm 7); nồng độ và thời gian (thí nghiệm