Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm

Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.Nghiên cứu thu nhận protein từ phụ phẩm cá lóc (Channa striata) và đánh giá khả năng phát triển sản phẩm.

Giới thiệu

Đặt vấn đề

Cá lóc (Channa striata) là loài cá phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long nhờ vào chất lượng thịt thơm ngon và giá thành hợp lý, dẫn đến sản lượng nuôi ngày càng tăng Sự phát triển của nghề nuôi cá lóc đã thúc đẩy nhu cầu chế biến các sản phẩm như mắm, khô, chà bông và chả cá lóc Tuy nhiên, trong quá trình chế biến khô cá lóc, hiệu suất thu hồi thịt chỉ đạt khoảng 60%, tạo ra lượng lớn phụ phẩm như đầu, xương, da, vây, vảy và nội tạng, thường được bán với giá thấp tại các cơ sở sản xuất và chợ Đáng chú ý, phụ phẩm cá lóc chứa hàm lượng protein cao lên đến 13,58%.

Việc tận dụng phụ phẩm cá để sản xuất chế phẩm protein có giá trị kinh tế cao là cần thiết và mang ý nghĩa khoa học thực tiễn Sử dụng enzyme protease để thủy phân phụ phẩm cá là một phương pháp hiệu quả và phổ biến Quá trình này có thể thực hiện bằng enzyme đơn lẻ, kết hợp hoặc theo hai giai đoạn Alcalase, một loại protease có nguồn gốc từ Bacillus licheniformis, có hoạt tính endopeptidase giúp cắt liên kết peptide bên trong protein, nâng cao hiệu suất thu hồi protein Flavourzyme, có cả hoạt tính endopeptidase và exopeptidase, chủ yếu hoạt động như exopeptidase, giúp giảm vị đắng của sản phẩm thủy phân Một số nghiên cứu đã kết hợp alcalase và flavourzyme để tối ưu hóa hiệu suất thủy phân và giảm vị đắng Tuy nhiên, việc kết hợp hai loại enzyme có thể dẫn đến sự tương tác giữa chúng Do đó, nghiên cứu của Nguyễn Thị Mỹ Hương đã chỉ ra rằng thủy phân theo trình tự, bổ sung endopeptidase trước và exopeptidase sau, có thể nâng cao hiệu suất thủy phân.

Trên toàn cầu, collagen chủ yếu được sản xuất từ da heo và xương bò Tuy nhiên, sự bùng phát của bệnh bò điên và lở mồm long móng ở heo đã làm giảm nguồn nguyên liệu collagen từ động vật có vú Do đó, việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu an toàn, có nguy cơ truyền bệnh thấp và không bị ràng buộc về tôn giáo là rất cần thiết.

Phụ phẩm từ chế biến thủy sản, đặc biệt là da và vảy cá, đang được nghiên cứu để khai thác giá trị dinh dưỡng và ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm (Kittiphattanabawon et al., 2015) Để chiết tách collagen chất lượng cao từ những phụ phẩm này, cần chú ý đến các bước tiền xử lý nhằm loại bỏ protein phi collagen (Shon et al., 2011; Lê Phan Thùy Hạnh & Trần Quyết Thắng, 2017; Nguyễn Công Bỉnh & Trần Phương Kiều).

2019) và khử khoáng từ vảy cá (Zhang at el., 2010; Matmaroh at el., 2011; Bellali at el.,

Quá trình chiết tách collagen đóng vai trò quyết định trong việc xác định chất lượng của nó Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng axit acetic là một chất hiệu quả trong việc chiết tách collagen (Duan et al., 2009; Trần Thị Huyền và ctv., 2012; Liu et al., 2015a; Sun et al., 2019a) Ngoài ra, pepsin cũng đã được chứng minh là có khả năng cải thiện hiệu suất chiết tách collagen khi kết hợp với axit acetic (Heu et al., 2010; Huang et al., 2011; Kumar & Nazeer, 2013; Pamungkas et al., 2019; Pei et al., 2019).

Nghiên cứu về việc thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme, cũng như việc chiết tách collagen từ hỗn hợp da và vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin vẫn chưa được thực hiện Do đó, cần thiết phải đẩy mạnh nghiên cứu để thu hồi protein từ các bộ phận này nhằm sản xuất chế phẩm bột đạm thủy phân và collagen, đồng thời ứng dụng các chế phẩm protein trong sản xuất thực phẩm, đây là hướng đi phù hợp cho ngành chế biến thực phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định thông số kỹ thuật và tối ưu hóa quy trình thu nhận protein từ đầu, da và vảy cá lóc nhằm chế biến các sản phẩm giàu protein Quy trình sản xuất bột đạm thủy phân từ đầu cá lóc sử dụng alcalase và flavourzyme, trong khi collagen được chiết xuất từ hỗn hợp da và vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin Các chế phẩm giàu protein này sẽ được ứng dụng trong sản xuất bột súp rau củ và nước ép collagen.

Để đảm bảo đầu cá lóc giữ được chất lượng tốt, cần xác định thời gian trữ đông phù hợp và lựa chọn biện pháp tiền xử lý phụ phẩm thích hợp.

- Thiết lập được chế độ thủy phân tối ưu cho đầu cá lóc bằng công nghệ enzyme phù hợp để thu nhận dịch đạm thủy phân.

Quy trình chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc đã được xây dựng với thành phần amino acid cân đối, mang lại màu sắc sáng đẹp và độ hòa tan cao, đảm bảo tính chất của collagen loại I.

Dự đoán thời gian bảo quản tối ưu cho chế phẩm giàu protein từ phụ phẩm cá lóc là cần thiết, nhằm đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm Việc áp dụng những chế phẩm này trong quá trình chế biến thực phẩm mở ra cơ hội cho các sản phẩm dinh dưỡng mới, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cá lóc.

Nội dung nghiên cứu

Dựa trên mục tiêu được đặt ra, nghiên cứu tiến hành thực hiện các nội dung:

- Khảo sát điều kiện tiền xử lý và trữ đông phụ phẩm cá lóc.

- Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme.

- Nghiên cứu điều kiện chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin.

- Dự đoán thời hạn sử dụng bột đạm thủy phân và xác định tỷ lệ phối trộn bột đạm thủy phân trong sản xuất bột súp rau củ.

- Xác định tỷ lệ collagen thủy phân bổ sung trong sản xuất nước ép giàu collagen.

Đối tượng và phạm vi nguyên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là đầu, da và vảy cá lóc.

Nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình thủy phân để thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme, nhằm sản xuất bột đạm thủy phân Đồng thời, collagen được chiết tách từ hỗn hợp da và vảy cá lóc thông qua acetic acid và pepsin Ngoài ra, bột đạm thủy phân đã được ứng dụng trong sản xuất bột súp rau củ, trong khi collagen thủy phân được sử dụng để sản xuất nước ép giàu collagen.

Ý nghĩa của luận án

Phát triển sản phẩm protein chất lượng cao từ peptide, amino acid và collagen dễ tiêu hóa cho dinh dưỡng con người là một ứng dụng quan trọng của công nghệ enzyme Việc kết hợp enzyme với hóa học không chỉ tối ưu hóa hiệu quả mà còn tận dụng phụ phẩm từ da và vảy cá lóc, mang lại giá trị dinh dưỡng cao trong thực phẩm.

- Nghiên cứu đã xác định được giá trị gia tăng cao của ngành nông nghiệp nuôi và thương mại cá lóc của Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn:

Quy trình công nghệ hiệu quả cao cho thủy phân đầu cá lóc đã được thiết lập bằng cách kết hợp enzyme flavourzyme và alcalase trong các điều kiện tối ưu.

Quy trình công nghệ hiệu quả cao được xây dựng để chiết tách collagen từ hỗn hợp da và vảy cá lóc thông qua phương pháp hóa sinh kết hợp.

Điểm mới của luận án

Luận án này chứng minh tính khả thi cao trong việc sản xuất sản phẩm giàu protein từ phụ phẩm như đầu, da và vảy cá lóc, đồng thời đánh giá khả năng ứng dụng của các sản phẩm này trong ngành thực phẩm.

- Nâng cao giá trị của phụ phẩm chế biến cá lóc thông qua tạo ra sản phẩm có giá trị cao.

- Giúp định hướng chế biến các sản phẩm thực phẩm từ cá lóc không phụ phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại Khoa Khoa học và Công nghệ Chế biến Thủy sản cùng với phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Cần Thơ.

Thời gian thực hiện: Từ tháng 11/2020 đến tháng 4/2023.

- Tủ sấy thực phẩm Memmert, Model UF 450, Schwabach, Đức.

- Bể điều nhiệt Memmert, model WNB 22, nhiệt độ 40-95°C, độ chính xác 0,1°C,

- Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp, Hettich Universal 320R, Đức.

- Tủ đông SANAKY, model NU-6502, nhiệt độ -80 o C, Việt Nam.

- Tủ mát Alaska, model IK-39, công suất 1.000W, Trung Quốc.

- Hệ thống lọc màng Amicon với kích thước màng lọc (3 kDa, 10 kDa và 30 kDa),

Millipore EMD, Merck KGaA, Darmstadt, Đức.

Máy sấy thăng hoa iFDs được sản xuất bởi iLab tại Thành phố Hồ Chí Minh, với nhiệt độ tối thiểu đạt -20 oC và nhiệt độ sấy là -1 oC Thiết bị này hoạt động hiệu quả trong dải áp suất từ 0 đến 520 mTorr, đảm bảo chất lượng sản phẩm và được gia công hoàn toàn tại Việt Nam.

- Tủ môi trường vi khí hậu, MLR-352H, nhiệt độ 0-50 o C, độ ẩm không khí 60-

90%, được sản xuất bởi Công ty PHC, Gunma, Nhật Bản.

- Máy cô quay chân không, BUCHI R-300 EL, Thụy Sỹ.

- Máy khuấy từ, model JS-17S, Hàn Quốc.

- Nhiệt kế Thermometer, type T, độ chính xác 0,1, Ý.

- Máy xay công nghiệp Toàn Phát, Type: TP9C-4, công suất 1,1 kW, Việt Nam.

- Thiết bị đồng hóa, MISUNG SR 30, Thụy Sĩ.

- Cân điện tử Shinko GS, độ chính xác 0,01 g, Nhật.

- Cân phân tích 4 số HERN ABJ-NM/ABS-N, Đức.

- Bộ chưng cất đạm tự động, Model UDK159, Velp, Ý.

- Hệ thống trích lipid Shoxlet, Gerhardt, Đức.

- Lò nung, Muffle Furnace Size 2, Gallenkamp, Đức.

- Tủ sấy ẩm JEIOTECH, model ON-11E, Hàn Quốc.

- Máy đo độ nhớt Brookfield, model RVDV-II+CP, Mỹ.

- Máy đo pH Consort C1020, Bỉ.

- Máy đo màu Colorimeter PCE-CSM 2, Trung Quốc.

- Máy so màu quang phổ, GENESYS™ 30 Visible Spectrophotometer, Mỹ.

- Bộ điện di hai chiều, Mini PROTEAN 3 cell, Bio– Rad, Mỹ.

- Tủ cấy vi sinh, Dalton, Nhật.

Một số dụng cụ thủy tinh thông thường và một số dụng cụ khác như thau, rổ, dao, thớt phục vụ cho quá trình thực hiện thí nghiệm.

- Chế phẩm alcalase được sản xuất bởi Công ty Novozyme, Đan Mạch, có hoạt độ

825 U/mL, điều kiện hoạt động tối ưu là ở nhiệt độ 50 o C và pH 8,3 tùy theo cơ chất.

Chế phẩm Flavourzyme, được sản xuất bởi Công ty Novozyme tại Đan Mạch, có hoạt độ 2450 LAPU/g Chế phẩm này hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 50°C và pH 7,0, tùy thuộc vào loại cơ chất sử dụng.

Chế phẩm pepsin từ dạ dày lợn của Merck, Đan Mạch có hoạt độ 0,7 FIP-U/mg Pepsin hoạt động hiệu quả nhất trong môi trường acid với pH từ 1,5 đến 2 và ở nhiệt độ từ 37 đến 42°C, tùy thuộc vào loại cơ chất.

- Sodium hydroxide (NaOH), độ tinh khiết 99%, Trung Quốc.

- Ethylendiamin Tetraacetic Acid Disodium (EDTA-2Na), Ấn Độ.

- Hexane (C6H14), độ tinh khiết > 96%, GHTECH, Trung Quốc

- Ethanol absolute (C2H5OH), độ tinh khiết 99,5%, Việt Nam.

- Isopropanol, độ tinh khiết ≥99,7%, GHTECH, Trung Quốc.

- Acetic acid (CH3COOH), độ tinh khiết 99,5%, Trung Quốc.

- Borax (NaP4O7), độ tinh khiết > 95%, Mỹ.

- Ortho-phthalaldehyde (Phthalaldehyde), Merck, Đức.

- Casein, alkaline soluble, độ tinh khiết 96%, HiMedia, Ấn Độ.

- Comassie Brilliant Blue G250, Merck, Đức.

- Disodium hydrogren phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O), độ tinh khiết 99,0%, Trung Quốc.

- Folin- Ciaucalten (C10H3NaO5S), độ tinh khiết >99,5%, Merck, Đức.

- Tyrosine, độ tinh khiết > 98%, Merck, Đức.

- Monosodium dihydrophosphate dihydrate (NaH2PO4.2H20), độ tinh khiết > 95%, Trung Quốc.

- Tricloroacetic acid-TCA (C2HCl3O2), độ tinh khiết ≥ 98%, Merck, Đức.

- Formaldehyde solution (HCHO), 37 - 40%, Trung Quốc.

- DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), Sigma-aldrich, Mỹ.

- Tris-HCl - Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, độ tinh khiết

Công ty TNHH TM & DV XNK Thành Mỹ tại Thành phố Cần Thơ chuyên nhập khẩu và phân phối các hóa chất phục vụ cho thí nghiệm và phân tích chỉ tiêu Bên cạnh đó, Công Ty TNHH TM Nông Sản và Hóa cũng cung cấp các hóa chất cần thiết cho quá trình này.

Chất PhươngTrâm (Thành phố Hồ Chí Minh).

Nguyên liệu và chuẩn bị nguyên liệu

3.2.1 Nguyên liệu Đầu, da và vảy cá lóc được mua tại Cơ sở khô cá lóc 7 Chóp (huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang) Cá lóc được cơ sở khô cá lóc 7 Chóp mua tại các ao nuôi ở tỉnh An Giang trong vùng được kiểm soát về kháng sinh, kim loại, hóa chất theo quyết định số 53/2009/QĐ-UBND tỉnh An Giang Phụ phẩm (đầu, da và vảy cá lóc) được thu gom trực tiếp tại cơ sở ngay sau quá trình xử lý trong chế biến các sản phẩm khô nguyên con, thịt cá lóc cắt sợi làm khô Phụ phẩm được làm đông ở nhiệt độ -20±2 o C trong thời gian 24 giờ và đóng thùng chuyển về phòng thí nghiệm Khoa Khoa học và Công nghệ Chế biến Thủy sản, Trường Thủy sản, Đại học Cần Thơ không quá 4 giờ nhằm đảm bảo nguyên liệu vẫn còn đông Đối với thí nghiệm bảo quản lạnh đông đầu cá lóc, thì đầu cá được thu gom tại cơ sở và bảo quản lạnh bằng nước đá với tỷ lệ nguyên liệu: nước đá là 1:1, đảm bảo nhiệt độ nguyên liệu trong quá trình vận chuyển từ 0  4 o C và vận chuyển về Cần Thơ không quá 4 giờ.

3.2.2 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm Đầu cá (110 – 130 g/ đầu) được rửa sạch bằng nước muối loãng 0,5%, loại bỏ mắt, mang, bọng nhớt và rửa sạch; da cá được loại sạch thịt và vảy và rửa sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ nhớt, máu, để ráo; vảy cá được rửa 3 lần trong nước muối loãng 0,5%, mỗi lần rửa khoảng 2 phút để loại bỏ nhớt Sau đó, vảy cá được rửa sạch và phơi ráo. Đầu, da và vảy sau khi rửa sạch, để ráo, tách riêng, cho vào túi PE (khoảng 1 kg/túi đối với đầu cá), (200 g/túi đối với da và vảy cá) và bảo quản ở nhiệt độ -20±2 o C Khi tiến hành thí nghiệm, nguyên liệu được rã đông qua đêm ở nhiệt độ 0 - 4 o C, đầu cá được cắt đôi và xay 1 phút bằng máy xay công nghiệp với tốc độ quay của trục vít là 1.400 vòng/phút; cắt da cá thành từng miếng nhỏ có kích thước 2 x 1 cm.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích và đo đạc theo các phương pháp tiêu chuẩn được tổng hợp ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu TT Chỉ tiêu

1 Màu sắc (L*, a*, b*) Đo bằng thiết bị đo màu Colorimeter PCE-CSM2

2 Nhiệt độ biến tính của collagen (DSC, o C) Theo phương pháp của Kimura at el (1988)

3 Độ nhớt (mPa.s) Đo bằng máy đo độ nhớt Brookfield DV theo phương pháp của Montero at el (1991)

4 pH Sử dụng pH kế theo ISO 2917:1999

5 Hiệu suất tách lipid (%) Hàm lượng lipid được tách khỏi nguyên liệu*100/

Hàm lượng lipid trong nguyên liệu (Wenweo at el., 2018)

6 Hiệu suất thu hồi collagen (HSTH collagen,%)

7 Độ ẩm (%); Protein (mẫu rắn, %) và (mẫu lỏng, g/L); Lipid (%); Khoáng (%)

HSTH collagen = (Lượng collagen thành phẩm×100)/(Khối lượng da-vảy đem chiết tách) Phương pháp sấy theo TCVN 3700:1990; Kjeldahl theo TCVN 3705:1990; Soxhlet theo TCVN 3703:2009; nung theo TCVN 5105:2009

8 Carbohydrate (%) % carbohydrate = 100 – % ẩm – % protein – % lipid – % khoáng – % xơ (Ramdath at el., 2020)

9 Tổng năng lượng cung cấp (Kcal)

10 Asen (mg/kg), cadimi (mg/kg), chì (mg/kg), đồng (mg/100g)

11 Chỉ số peroxide value (PV, meq/kg)

12 Khả năng khử gốc tự do (DPPH, %)

13 Tổng lượng nitơ bazơ bay hơi

14 Hàm lượng đạm amin (Naa, g/L)

15 Hàm lượng protein hòa tan (mg/mL)

Tổng năng lượng cung cấp = tổng hàm lượng béo*9 + tổng hàm lượng protein*4 + tổng hàm lượng carbohydrate*4 (Nguyễn Minh Thủy, 2009) AOAC 2013.06

Phương pháp so màu quang phổ theo TCVN 6121:2018 Theo phương pháp của Wu at el (2003)

Phương pháp chưng cất sử dụng chất kiềm hóa MgO theo TCVN 3706:1990 được áp dụng để định lượng nitơ formol Đồng thời, phương pháp hiệu chuẩn với nitơ ammoniac được thực hiện theo TCVN 12620:2019, dựa trên phương pháp Lowry (Lowry et al., 1951).

16 Thành phần amino acid Theo phương pháp của Kimura at el (1988)

17 Hiệu suất thu hồi protein (PR,%)

18 Tỷ lệ thu hồi protein của từng phân đoạn (TLTH protein, %)

Công thức tính PR được xác định bằng cách lấy hàm lượng protein trong dịch đạm nhân với khối lượng dịch đạm, sau đó chia cho hàm lượng protein trong nguyên liệu nhân với khối lượng đầu cá đem thủy phân, rồi nhân với 100 Đối với tỷ lệ TLTH protein, công thức là hàm lượng protein của phân đoạn chia cho thể tích phân đoạn, rồi chia cho hàm lượng protein dịch đạm gốc nhân với thể tích dịch đạm gốc đem lọc màng.

19 Sắc ký điện di protein Theo phương pháp của Laemmli (1970)

20 Hiệu suất thủy phân (DH, %) Theo phương pháp OPA của Nielsen at el (2001)

21 Độ hòa tan của collagen (%) Theo phương pháp của Montero at el (1991)

22 Phổ FTIR của collagen Theo phương pháp của Kong & Yu (2007)

23 Hoạt tính enzyme protease Theo phương pháp của Cupp-enyard (2008)

24 Cảm quan Phương pháp cho điểm theo TCVN 3215-79

25 Tổng vi khuẩn hiếu khí (cfu/g) Phương pháp đếm đĩa theo TCVN 5165:1990

26 Coliforms (cfu/g), Escherichia coli (cfu/g),

(cfu/g), tổng số bào tử

Theo tiêu chuẩn ISO 4832:2006; ISO 16649- 2:2001; ISO 6579-1:2017; ISO 6888-1:1999/Amd

1:2003; ISO 21527-1:2008 nấm men- nấm mốc (cfu/g)

3.3.2 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, và kết quả được tính trung bình cùng độ lệch chuẩn thông qua phần mềm Microsoft Excel 2013 Số liệu thống kê được phân tích bằng chương trình Statgraphics Centurion XV Version 15.1.02 Các kết quả lựa chọn từ thí nghiệm trước được sử dụng làm yếu tố cố định cho các thí nghiệm tiếp theo Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với thiết kế Draper-Lin small composite design được áp dụng để phân tích tác động đồng thời của nhiều biến đến hàm mục tiêu.

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các nội dung nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ tổng quát Hình 3.1.

 TN5,6,&7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian và nhiệt độ thủy phân bằng flavourzyme

 TN8&9: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian, nhiệt độ thủy phân bằng alcalase

 TN10: Tối ưu hóa điều kiện thủy phân khi kết hợp đồng thời alcalase và flavourzyme

 TN11: Ảnh hưởng thời điểm bổ sung flavourzyme

 TN12: Tối ưu hóa điều kiện thủy phân theo trình tự bổ sung alcalase trước và flavourzyme sau

TN13: Ảnh hưởng của kích thước màng lọc đến tính chất dịch đạm thủy phân

 TN14&15: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ và thời gian chiết tách collagen bằng acetic acid

 TN16&17: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian chiết tách collagen bằng pepsin

TN18: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian thủy phân collagen bằng alcalase đến chất lượng collagen thủy phân

ND4: Khảo sát khả năng ứng dụng các chế phẩm protein từ phụ phẩm cá lóc trong sản xuất sản phẩm thực phẩm

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Đầu, da và vảy cá lóc Xác định thành phần hóa học

Nội dung 1 (ND1): Nghiên cứu điều kiện tiền xử lý và trữ đông phụ phẩm cá lóc

 Thí nghiệm 1 (TN1): Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến chất lượng nguyên liệu và hiệu quả thủy phân protein từ đầu cá lóc

 TN2: Khảo sát phương pháp loại lipid từ đầu cá lóc

 TN3: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm NaOH đến khả năng khử protein phi collagen từ da cá lóc

 TN4: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm EDTA-2Na đến khả năng khử khoáng từ vảy cá lóc

ND2: Xác định điều kiện thủy phân thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme

ND3: Nghiên cứu chiết tách collagen từ hỗn hợp da-vảy cá lóc bằng acetic acid và pepsin

 TN19: Dự đoán thời hạn sử dụng chế phẩm bột đạm bằng phương pháp gia tốc

 TN20: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ bột đạm: bột kem béo thực vật đến chất lượng sản phẩm bột súp rau củ

 TN21: Khảo sát ảnh hưởng của loại nước ép và tỷ lệ collagen thủy phân đến chất lượng nước ép giàu collagen

3.4.1 Xác định thành phần hóa học của phụ phẩm cá lóc

Mục đích của nghiên cứu này là xác định thành phần hóa học của đầu, da và vảy cá lóc, từ đó đánh giá chất lượng của nguồn nguyên liệu Kết quả sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến cá lóc.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với các nguồn nguyên liệu đầu, da và vảy cá lóc với 3 lần lặp lại

Tiến hành thí nghiệm: Đầu, da và vảy ở mỗi đợt thu mẫu sau khi xử lý như mục

Để phân tích các chỉ tiêu hóa học, cần lấy ngẫu nhiên 200 g mẫu Quá trình xử lý phải được thực hiện nhanh chóng để hạn chế biến đổi và bảo đảm thành phần hóa học của nguyên liệu ban đầu không bị thay đổi.

Chỉ tiêu theo dõi: Độ ẩm (%), protein (%), lipid (%) và khoáng (%).

Kết quả thu nhận cho thấy giá trị các chỉ tiêu của nguyên liệu rất quan trọng trong việc nghiên cứu và đánh giá sự đồng nhất của nguyên liệu trong các nội dung nghiên cứu.

3.4.2 Nội dung 1: Xác định điều kiện tiền xử lý và trữ đông phụ phẩm cá lóc

3.4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến chất lượng nguyên liệu và hiệu quả thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng alcalase

Mục đích của nghiên cứu là xác định thời gian trữ đông tối ưu cho cá lóc ở nhiệt độ -20±2°C, nhằm đảm bảo chất lượng nguyên liệu cho quá trình thủy phân bằng alcalase, từ đó đạt được hiệu suất thủy phân và thu hồi protein cao.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố Nhân tố A: Thời gian trữ đông đầu cá lóc (tháng)

Ao: Mẫu đối chứng (nguyên liệu ban đầu, không trữ đông)

Số mẫu thí nghiệm: 4 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 12

Thí nghiệm được thực hiện với đầu cá lóc nặng từ 4200 – 4440 g, chia thành 12 mẫu (350 – 370 g/mẫu) và bảo quản lạnh đông ở -20±2°C tại 4 mốc thời gian (0, 1, 2 và 3 tháng) với 3 lần lặp lại Tại mỗi mốc thời gian, 3 mẫu được thu thập để phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí (TVKHK), pH, độ ẩm, tổng lượng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N) và chỉ số peroxide value (PV) Mẫu thứ hai (40 g/mẫu) được thủy phân bằng alcalase trong 24 giờ tại 50°C, pH 8,0, nồng độ alcalase 40 U/g protein, với tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch ethanol 20° là 1:1 Sau khi thủy phân, mẫu được bất hoạt enzyme ở 95°C trong 10 phút, sau đó lọc qua rây và ly tâm ở 7500 vòng/phút trong 30 phút ở 4°C Quá trình ly tâm tách thành 3 lớp: lipid, dịch đạm thủy phân và protein không tan, từ đó thu phần dịch đạm thủy phân để phân tích hiệu suất thủy phân (DH), hiệu suất thu hồi protein (PR), hàm lượng đạm ammoniac (N NH3) và tỷ số giữa đạm ammoniac và đạm tổng số (NNH3/NTS).

Chỉ tiêu theo dõi: Độ ẩm (%), PV (meq/kg), pH, TVB-N (mgN/100g), TVKHK (cfu/g), DH (%), PR (%), N NH3

Kết quả thu nhận cho thấy thời gian trữ đông nguyên liệu đầu cá lóc (tháng) ảnh hưởng đến chất lượng của quá trình thủy phân protein bằng enzyme alcalase.

3.4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý tách loại lipid từ đầu cá lóc

Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định phương pháp tiền xử lý lipid phù hợp nhằm tối ưu hóa hiệu suất tách lipid và hiệu quả thủy phân protein từ đầu cá lóc sử dụng enzym alcalase.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố Nhân tố B: phương pháp tiền xử lý loại lipid

B1: Đối chứng (không xử lý loại lipid trước khi thủy phân bằng alcalase)

B2: Gia nhiệt B3: n-hexane B4: Isopropanol B5: Ethanol

Số mẫu thí nghiệm: 7 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 21

Trong thí nghiệm tách lipid từ đầu cá lóc, đầu cá được xử lý và xay nhuyễn theo phương pháp đã nêu Các dung môi như n-hexane, isopropanol, ethanol, isopropanol/n-hexane và ethanol/n-hexane được bổ sung vào mẫu với tỷ lệ 2:1 (v/w) và gia nhiệt ở 70ºC trong 30 phút Sau khi gia nhiệt, mẫu được làm nguội, lọc qua vải lọc để thu phần dung môi nhằm xác định hàm lượng lipid và tính hiệu suất tách lipid Phần rắn sau tách lipid được thủy phân bằng enzyme alcalase Đối với nghiệm thức B2, đầu cá xay được bổ sung nước với tỷ lệ 1:1 (w/v) và gia nhiệt ở 95ºC trong 1 giờ Sau đó, mẫu được ly tâm ở 7500 vòng/phút trong 30 phút tại 4ºC, rồi làm lạnh bằng nước đá để tách lipid, và phần rắn cũng được thủy phân bằng enzyme alcalase.

Sau khi tiền xử lý loại lipid cho các mẫu NT B2, B3, B4, B5, B6, B7, phần rắn được thủy phân bằng enzyme alcalase tương tự như mẫu NT B1, không qua tiền xử lý Nguyên liệu đầu từ cá xay (NT B1) hoặc phần rắn đã được tiền xử lý lipid (NT B2, B3, B4, B5, B6, B7) sẽ được thủy phân bằng alcalase, sau đó enzyme sẽ bị bất hoạt, và quá trình lọc cùng ly tâm sẽ được thực hiện như trong thí nghiệm 1 Sau khi ly tâm, hỗn hợp sẽ phân tách thành ba lớp: lớp lipid ở trên cùng, lớp dịch đạm thủy phân ở giữa và lớp protein không tan ở đáy Các ống ly tâm sẽ được làm lạnh bằng nước đá trong 30 phút để thu thập lớp lipid trên cùng, phục vụ cho việc tính toán hiệu suất tách lipid Đồng thời, phần dịch đạm thủy phân sẽ được thu thập cẩn thận để phân tích hiệu suất thủy phân (DH), hiệu suất thu hồi protein (PR), hàm lượng đạm amin (Naa) và đạm ammoniac (NNH3).

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất tách lipid (%), DH (%), PR (%), Naa (g/L), NNH3 (g/L).

Kết quả thu nhận: phương pháp tiền xử lý loại lipid từ đầu cá lóc thích hợp nhất.

3.4.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm NaOH đến khả năng khử protein phi collagen từ da cá lóc

Mục đích: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm NaOH thích hợp nhằm đạt được hiệu quả khử protein phi collagen từ da cá lóc tốt nhất.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố C o : Nghiệm thức đối chứng

Nhân tố C: Nồng độ NaOH (M)

Nhân tố D: Thời gian ngâm NaOH (giờ) D 1 : 4 D2: 6

D3: 8 Tổng số nghiệm thức: 9 + 1 (nghiệm thức đối chứng) Số mẫu thí nghiệm: 10 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 30

Trong thí nghiệm này, da cá lóc được xử lý theo phương pháp đã nêu ở mục 3.2, ngâm quay trong dung dịch NaOH với các nồng độ và thời gian được bố trí cụ thể Các thông số cố định và phương pháp ngâm quay đã được mô tả chi tiết bởi Kittiphattanabawon và các cộng sự (2005).

Trong quá trình xử lý da cá, hỗn hợp được duy trì ở nhiệt độ 0 - 4°C và khuấy liên tục Tỷ lệ giữa da cá và dung dịch NaOH được thiết lập là 1:8 (w/v), với dung dịch kiềm được thay đổi sau mỗi 2 giờ Sau khi hoàn tất quá trình ngâm NaOH, da cá được rửa bằng nước cho đến khi đạt pH trung tính, sau đó để ráo và tiến hành phân tích hàm lượng protein còn lại để đánh giá hiệu quả khử protein phi collagen.

Chỉ tiêu theo dõi: Protein (%) và hiệu quả khử protein phi collagen (%).

Kết quả thu nhận: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm NaOH thích hợp nhất để khử protein phi collagen từ da cá lóc.

3.4.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm

EDTA-2Na đến khả năng khử khoáng từ vảy cá lóc

Mục đích: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm EDTA-2Na thích hợp nhằm đạt được hiệu quả khử khoáng từ vảy cá lóc cao.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố E o : Nghiệm thức đối chứng

Nhân tố E: Nồng độ EDTA-2Na (M) E 1 : 0,6 E2: 0,8

E3: 1,0 Nhân tố F: Thời gian ngâm EDTA-2Na (giờ) F 1 : 20 F2:

Tổng số nghiệm thức: 9 + 1 (nghiệm thức đối chứng) Số mẫu thí nghiệm: 10 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 30

Tiến hành thí nghiệm, vảy cá lóc được xử lý theo mục 3.2 và ngâm quay trong dung dịch EDTA-2Na với các nồng độ và thời gian được bố trí thí nghiệm Các thông số cố định và phương pháp ngâm được mô tả bởi Thuy et al (2014) ở nhiệt độ 0 - 4°C, với hỗn hợp được khuấy liên tục trong suốt quá trình xử lý Tỷ lệ vảy cá so với dung dịch EDTA-2Na là 1:8 (w/v), và dung dịch EDTA-2Na được thay mới sau mỗi 12 giờ Sau khi ngâm quay, vảy cá được rửa bằng nước cho đến khi đạt pH trung tính, sau đó để ráo và tiến hành phân tích hàm lượng khoáng còn lại.

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng khoáng (%) và hiệu quả khử khoáng (%)

Kết quả thu nhận: Tìm được nồng độ và thời gian ngâm EDTA-2Na thích hợp nhất để khử khoáng từ vảy cá lóc.

3.4.3 Nội dung 2: Xác định điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng alcalase và flavourzyme

3.4.3.1 Sơ đồ nghiên cứu nội dung 2

Quy trình thủy phân protein từ đầu cá lóc được thực hiện theo phương pháp của Kechaou et al (2009) với một số điều chỉnh Đầu cá lóc được xay nhuyễn để chuẩn bị cho quá trình thủy phân, như thể hiện trong sơ đồ Hình 3.2.

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2

3.4.3.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu nội dung 2 Đầu cá lóc được xử lý như mục 3.2, xay nhuyễn và tiến hành tách lipid bằng phương pháp thích hợp nhất được chọn từ thí nghiệm 2, sau đó thủy phân bằng flavourzyme và alcalase riêng lẻ theo phương pháp được mô tả bởi Kechaou at el (2009) với nồng độ flavourzyme (thí nghiệm 5), thời gian thủy phân (thí nghiệm 6) và nhiệt độ thủy phân bằng flavourzyme (thí nghiệm 7); nồng độ và thời gian (thí nghiệm 8) và nhiệt độ thủy phân bằng alcalase (thí nghiệm 9) được khảo sát Đồng thời, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) - thiết kế Draper-Lin small composite design để tối ưu hóa điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng phương pháp kết hợp alcalase và flavourzyme đồng thời (thí nghiệm 10); khảo sát thời điểm bổ sung flavourzyme bằng phương pháp thủy phân theo trình tự bổ sung alcalase trước và flavourzyme sau (thí nghiệm 11) và tối ưu hóa điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng phương pháp thủy phân theo trình tự bổ sung alcalase trước và flavourzyme sau (thí nghiệm 12). Sau khi thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme ở 95 o C trong 10 phút (Ovissipour at el., 2012) Lọc qua rây để loại bã đầu thu phần dịch lọc Dịch lọc được ly tâm với tốc độ 7500 vòng/phút trong 30 phút ở 4 o C Sau ly tâm tách thành 3 phần: phần lipid ở trên, phần dịch đạm thủy phân ở giữa và phần protein không tan ở dưới Thu phần dịch đạm thủy

Bất hoạt enzyme – Lọc (95°C, 10 phút)

(7500 vòng/phút, ở 4 o C, 30 phút) Dịch đạm thủy phân - Lọc màng (Thí nghiệm 13)

Sấy phun – Bột đạm thủy phân

Phần rắn Lipid Loại bã đầu

Alcalase trước và flavourzyme sau

Kết hợp alcalase và flavourzyme

Nghiên cứu này tập trung vào việc thủy phân để phân tích các chỉ tiêu, so sánh hiệu quả thu hồi protein từ đầu cá lóc bằng các enzyme alcalase và flavourzyme, cả khi sử dụng riêng lẻ, kết hợp, hoặc bổ sung Mục tiêu là xác định loại enzyme và điều kiện thủy phân protein từ đầu cá lóc tối ưu nhất để sản xuất dịch đạm thủy phân Đồng thời, khảo sát ảnh hưởng của kích thước màng lọc Amicon-Millipore đến chất lượng dịch đạm Cuối cùng, dịch đạm thủy phân được sấy phun để thu được bột đạm thủy phân và đánh giá chất lượng của sản phẩm này.

3.4.3.3 Thủy phân protein từ đầu cá lóc bằng flavourzyme