Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano nhằm tăng sinh khả dụng của curcumin dùng theo đường uống

150DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trang 8 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ANOVA : Analysis of variance Phân tích phương sai AUC : The area under the c

TỔNG QUAN

CURCUMIN

Curcumin (CUR) có thể được tìm thấy trong tự nhiên hoặc được tổng hợp Curcumin là thành phần chính của curcuminoid, chiếm khoảng 77% trong hỗn hợp này, cùng với demethoxycurcumin (17%) và bis-demothoxycurcumin (3%).

- Tên khoa học: 1,7-bis (4–hydroxy– 3-methoxyphenyl) -1,6– heptadien- 3,5-dion

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của curcumin [89]

- Hình thức: bột kết tinh hoặc vô định hình màu vàng

- Độ tan: curcumin ít tan trong nước (độ tan 11 ng/ml trong môi trường pH 5,5 [75]), tan một phần trong methanol, tan tốt trong aceton, dimethylsulfoxyd, ethanol và cloroform [89]

Curcumin tồn tại dưới ba dạng thù hình khác nhau, trong đó dạng thứ nhất có cấu trúc tinh thể đơn tà, còn dạng thứ hai và thứ ba có cấu trúc tinh thể trục thoi, thể hiện sự đa dạng về hình thái tinh thể của hợp chất này.

Luận án tiến sĩ Dược học

Curcumin có thể tồn tại ở nhiều dạng phân tử khác nhau, bao gồm dạng đơn tà và dạng trục thoi, với sự khác biệt về hình dạng và tương tác liên kết hydro giữa các phân tử Dạng đơn tà có hình dạng phẳng, trong khi dạng trục thoi có hình dạng cong và hơi xoắn, với sự khác biệt về hướng ceto-enol giữa dạng 2 và dạng 3 Về hình thái tiểu phân, curcumin dạng đơn tà thường có hình kim, còn dạng trục thoi có hình thái tiểu phân giống hạt gạo hoặc hình cầu, và còn có thể tồn tại ở dạng vô định hình.

- Dung dịch curcumin trong methanol hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng

430 nm và dung dịch curcumin trong aceton hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng khoảng 415-420 nm

- Curcumin có tính acid, pK a của curcumin lần lượt là 7,8, 8,5 và 9,0 [75],

Curcumin là một hợp chất ít tan chứa hai vòng phenolic, mỗi vòng có một nhóm thế methoxy ether ở vị trí ortho Cấu trúc hóa học của curcumin bao gồm hai vòng phenolic kết hợp với nhau qua một liên kết hepten chưa bão hòa, chứa nhóm α, β diceton ở carbon số 3 và 5 Nhóm diceton này có thể chuyển dạng thuận nghịch giữa dạng enolic và cetonic tùy thuộc vào pH môi trường Curcumin tồn tại chủ yếu ở dạng bis-ceto trong môi trường acid và trung tính, còn dạng enol chiếm ưu thế trong môi trường kiềm Điều này giúp curcumin có đặc tính chống oxy hóa mạnh mẽ.

Hình 1.2 Dạng hỗ biến ceto-enol của curcumin

- Dung dịch curcumin có màu vàng tại pH 2,5 - 7 và màu đỏ ở pH > 7 [33]

Curcumin kém ổn định ở pH kiềm và phân hủy thành các sản phẩm chính bao gồm trans-6-(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexanal, feruloyl methan, acid ferulic và vanillin Ngược lại, trong môi trường acid, quá trình phân hủy của curcumin diễn ra chậm hơn, với khoảng dưới 20% curcumin phân hủy trong vòng 1 giờ.

Khi tiếp xúc với ánh sáng, curcumin bị phân hủy và thoái hóa thành anillin, acid vanillic, aldehyd ferulic và acid ferulic [89]

1.1.5 Định tính và định lượng

Theo chuyên luận "Curcuminoids" của Dược điển Mỹ USP 39, việc định tính curcuminoid có thể dựa vào vị trí và màu sắc của các vết curcumin, desmethoxycurcumin và bisdesmethoxycurcumin so với chuẩn trong phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc xác định vị trí của các pic sắc ký trong phương pháp HPLC Hàm lượng các thành phần curcumin, desmethoxycurcumin và bisdesmethoxycurcumin trong nguyên liệu curcuminoid và chế phẩm bào chế chứa curcuminoid có thể được xác định bằng phương pháp HPLC, giúp đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của sản phẩm.

Đối với curcumin, việc xác định hàm lượng curcumin trong các chế phẩm bào chế và môi trường thử độ hòa tan có thể được thực hiện thông qua phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis hoặc HPLC, giúp mang lại kết quả chính xác và đáng tin cậy.

Một số nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đã chỉ ra rằng curcumin sở hữu các tác dụng sinh học đa dạng, bao gồm chống oxy hóa, chống viêm và chống ung bướu Đặc biệt, curcumin còn có tiềm năng hỗ trợ điều trị hầu hết các bệnh mạn tính, bao gồm cả ung thư, bệnh thần kinh, tim mạch và bệnh phổi, nhờ vào khả năng chống oxy hóa và chống viêm mạnh mẽ của nó.

Một trong những khó khăn lớn nhất khi sử dụng curcumin trên lâm sàng là sinh khả dụng (SKD) thấp, điều này đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu về dược động học của curcumin, như báo cáo của Yang, nhằm tìm ra giải pháp cải thiện hiệu quả sử dụng của curcumin trong điều trị.

K và cộng sự cho thấy: nồng độ tối đa curcumin trong huyết tương chuột cống sau khi uống liều 500 mg/kg là 0,06 ± 0,01 g/ml, chứng tỏ SKD đường uống chỉ khoảng 1% [109] Tương tự, theo nghiên cứu của Shoba G và cộng sự, nồng độ curcumin cao nhất trong huyết tương là 1,35 ± 0,23 g/ml sau 1 giờ dùng đường

Nghiên cứu cho thấy curcumin có khả năng hấp thu kém qua hệ thống dạ dày-ruột Khi sử dụng liều 2 g/kg trên chuột cống, nồng độ curcumin trong huyết tương rất thấp, chỉ khoảng 0,006 ± 0,005 g/ml trong 1 giờ Tương tự, khi người tình nguyện khỏe mạnh uống liều đơn 2 g curcumin, nồng độ trong huyết tương cũng rất thấp Điều này cho thấy curcumin có tính thấm kém qua hệ thống dạ dày-ruột, dẫn đến việc hấp thu curcumin vào cơ thể không hiệu quả.

Sau khi hấp thu, curcumin trải qua quá trình chuyển hóa lần đầu tại gan, bao gồm liên hợp glucuronid, sulfat và quá trình khử thông qua alcol dehydrogenase, tạo ra nhiều chất chuyển hóa như dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, hexahydrocurcuminol, acid ferulic, acid dihydroferulic, curcumin glucuronid và curcumin sulfat Curcumin sau đó bị thải trừ nhanh chóng dưới dạng liên hợp với glucuronid và sulfat Khoảng 60-70% curcumin được sử dụng qua đường uống sẽ bị thải trừ qua phân.

Hình 1.3 Quá trình chuyển hóa của curcumin trong đường tiêu hóa [57]

Hấp thu curcumin từ ruột kém là do một số nguyên nhân, bao gồm độ tan thấp và tốc độ hòa tan chậm, khiến dược chất không hòa tan hoàn toàn Bên cạnh đó, curcumin còn bị phân hủy trong quá trình hấp thu, ảnh hưởng đến hiệu quả sinh học của nó.

Trong môi trường sinh lý của hệ thống dạ dày ruột, curcumin có tốc độ chuyển hóa và thải trừ nhanh chóng, dẫn đến sinh khả dụng (SKD) thấp Điều này hạn chế việc sử dụng curcumin trong điều trị, đòi hỏi cần có giải pháp cải thiện sinh khả dụng để phát huy tối đa tác dụng của nó.

MỘT SỐ BIỆN PHÁP CẢI THIỆN SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG

Các nghiên cứu về dược động học của curcumin đã chỉ ra rằng độ tan thấp, chuyển hóa mạnh và thải trừ nhanh là những nguyên nhân chính dẫn đến sinh khả dụng (SKD) thấp của curcumin Để cải thiện SKD của curcumin, các biện pháp tập trung vào việc tăng độ tan, mức độ hòa tan, giảm chuyển hóa và sử dụng chất ức chế quá trình chuyển hóa của curcumin, đồng thời giảm thải trừ và kéo dài thời gian lưu thông trong đường tiêu hóa của curcumin.

1.2.1 Biện pháp làm tăng độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin Để cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin, các công trình nghiên cứu đã đề cập đến các biện pháp làm thay đổi đặc tính vật lý của DC như giảm KTTP xuống kích cỡ nanomet (bào chế hệ nano tinh thể) và tạo dạng bào chế trung gian chứa curcumin như hệ phân tán rắn, hệ micel, vi nhũ tương, nhũ tương nano, hệ tự nhũ hóa hoặc dạng liên hợp

1.2.1.1 Bào chế hệ nano tinh thể

Nano tinh thể dược chất là tinh thể với kích thước dưới 1000 nm, mang cả đặc tính của tiểu phân nano và tinh thể [5], [43]

Tiểu phân nano tinh thể có thể cải thiện độ tan, độ hòa tan và tăng SKD của

DC do những đặc điểm nổi trội như sau:

Độ tan của dược chất phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của dược chất, môi trường hòa tan và nhiệt độ Tuy nhiên, đối với các tiểu phân dược chất có kích thước nhỏ hơn 1-2 micromet, độ tan lại phụ thuộc vào kích thước tiểu phân Cụ thể, khi kích thước tiểu phân giảm xuống dưới 1000 nm, độ tan của dược chất sẽ tăng lên, điều này có thể được giải thích thông qua phương trình Kelvin và Ostwald-Freundlich.

Phương trình Kelvin (1) biểu thị mối quan hệ giữa KTTP và áp suất hòa tan của tiểu phân:

Ở trạng thái hòa tan bão hòa, phân tử hòa tan và phân tử tái kết tinh cân bằng Tuy nhiên, khi giảm kích thước tiểu phân (KTTP), áp suất hòa tan tăng do ảnh hưởng của sức căng bề mặt, dẫn đến cân bằng chuyển dịch về phía hòa tan, kết quả là độ tan bão hòa tăng.

Phương trình Ostwald-Freundlich (2) biểu thị mối quan hệ giữa độ tan bão hòa và KTTP: log

Công thức tính độ tan bão hòa Cs của một chất dựa trên một số yếu tố quan trọng, bao gồm độ tan của tiểu phân lớn Cα, sức căng bề mặt σ, thể tích mol V, hằng số khí R, nhiệt độ tuyệt đối T, tỷ trọng tiểu phân ρ và bán kính tiểu phân r.

Theo phương trình trên, độ tan bão hòa của DC tăng khi giảm kích thước tiểu phân (KTTP) Tuy nhiên, mối quan hệ này chỉ đúng với các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 1-2 μm, đặc biệt là những tiểu phân có kích thước nano (nhỏ hơn 200 nm).

Việc bào chế hệ nano tinh thể có thể làm cho đặc tính kết tinh của tiểu phân

DC thay đổi trạng thái từ kết tinh sang vô định hình, giúp tăng cường khả năng tan của chúng Cụ thể, tinh thể nano ở trạng thái vô định hình có độ tan cao hơn so với tinh thể nano ở trạng thái tinh thể có kích thước tương đương Điều này làm cho tinh thể nano vô định hình trở thành sự kết hợp lý tưởng để tăng cường độ tan của DC.

 Cải thiện tốc độ hòa tan

Theo phương trình Noyes-Withney (3):

Tốc độ hòa tan của dược chất (DC) được xác định bởi phương trình dM/dt, trong đó D là hệ số khuếch tán, S là diện tích bề mặt tiểu phân, C s là độ tan bão hòa của DC, C là nồng độ DC xung quanh tiểu phân và h là bề dày lớp khuếch tán.

Tốc độ hòa tan của các tinh thể nano có thể tăng lên do một số yếu tố quan trọng Cụ thể, việc tăng diện tích bề mặt của các tinh thể nano cho phép chúng tiếp xúc với môi trường xung quanh nhiều hơn, từ đó làm tăng tốc độ hòa tan Bên cạnh đó, giảm bề dày lớp khuếch tán cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng tốc độ hòa tan của các tinh thể nano Cuối cùng, tăng độ tan của các tinh thể nano cũng là một yếu tố then chốt giúp tăng tốc độ hòa tan của chúng.

 Tăng khả năng kết dính vào bề mặt hoặc màng tế bào

DC nano tinh thể có đặc điểm nổi trội so với tiểu phân micro nhờ khả năng tăng cường kết dính vào bề mặt hoặc màng tế bào Sự tăng kết dính này là kết quả của việc tăng diện tích tiếp xúc của các tiểu phân kích thước nhỏ Cơ chế kết dính của nano tinh thể có thể được giải thích thông qua thuyết tĩnh điện và thuyết hấp thụ, bao gồm lực hút tĩnh điện, liên kết hydro và van der Waals giữa bề mặt tiểu phân và màng nhày.

 Cải thiện SKD đường uống

Nano tinh thể có thể cải thiện hấp thu của DC thông qua hai cơ chế chính Một mặt, dạng nano tinh thể giúp tăng độ tan và tốc độ hòa tan của DC, từ đó làm tăng chênh lệch nồng độ giữa nhung mao ruột và máu, dẫn đến việc DC được hấp thu hiệu quả hơn thông qua khuếch tán thụ động Mặt khác, các tiểu phân nano tinh thể có thể bám dính vào màng nhầy của hệ thống dạ dày ruột, giúp kéo dài thời gian lưu và thời gian tiếp xúc của DC trong hệ thống này, đồng thời tạo ra chênh lệch nồng độ cao hơn.

Phương pháp bào chế hệ nano tinh thể thường được thực hiện theo hai hướng chính: phương pháp "top-down" và phương pháp "bottom-up" Phương pháp "top-down" liên quan đến việc nghiền mịn các tiểu phân lớn để tạo ra tiểu phân nano, trong khi phương pháp "bottom-up" lại bắt đầu từ các phân tử nhỏ và kết tủa chúng thành các tiểu phân nano lớn hơn Các phương pháp bào chế nano tinh thể cụ thể được trình bày chi tiết trong bảng 1.1, cung cấp thông tin hữu ích về quy trình tạo ra hệ nano tinh thể.

Nghiên cứu của Onoue S và cộng sự đã bào chế thành công hệ nano tinh thể curcumin bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền ướt với bi polystyren, kết hợp với tá dược hydroxypropyl cellulose và natri lauryl sulfat Kết quả cho thấy hệ nano tinh thể curcumin thu được có kích thước tiểu phân khoảng 250 nm và hệ số đa phân tán 0,3-0,4, đồng thời vẫn giữ được trạng thái kết tinh Đặc biệt, độ hòa tan và sinh khả dụng đường uống của hệ nano tinh thể curcumin được cải thiện đáng kể so với tinh thể curcumin ban đầu, với giá trị C max và AUC cao gấp 3-5 lần.

Bảng 1.1 Một số phương pháp bào chế nano tinh thể

STT Phương pháp Nguyên tắc Ưu nhược điểm

Sử dụng lực phân chia là một phương pháp hiệu quả trong công nghệ nghiền, tận dụng lực va chạm, nén ép, mài mòn và lực ma sát giữa các tiểu phân và thành buồng nghiền, giữa các bi với nhau và giữa các tiểu phân Ưu điểm của phương pháp này là có thể áp dụng cho cả các dược chất có độ tan thấp hoặc không tan Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chi phí thiết bị cao, dễ nhiễm vi sinh vật và tạp chất từ thiết bị mài mòn, đồng thời cũng hạn chế về kích thước buồng nghiền.

Sự giảm kích thước tiểu phân trong quá trình nghiền khô thường xảy ra do các yếu tố như ma sát, sự cọ mòn, va chạm và đứt gãy của tương tác giữa các tiểu phân với nhau hoặc giữa tiểu phân với thiết bị.

MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG

Tiểu phân nano curcumin vi nang trong liposome phospholipid lecithin

Nhũ tương nano chứa curcumin

Tiểu phân nano polyme chứa curcumin

Tiểu phân nano lipid rắn

8 Curmin Lead Nafaco, Việt Nam

1.3 MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG Để đánh giá SKD của curcumin có thể sử dụng các mô hình nghiên cứu SKD như sau:

 Đánh giá giải phóng thuốc trực tiếp trong môi trường

Một số nghiên cứu đã sử dụng phương pháp in vitro để khảo sát sơ bộ xu hướng giải phóng curcumin từ hệ nano trước khi thử nghiệm in vivo Các môi trường thử nghiệm thường bao gồm dung dịch natri laurylsulfat 1% hoặc Tween 80 0,05%, được khuấy trộn bằng thiết bị cánh khuấy với tốc độ và thời gian thử thích hợp ở nhiệt độ 37 ± 0,5 o C.

Một nghiên cứu đã sử dụng nhiều môi trường thử độ hòa tan khác nhau, bao gồm môi trường acid hydrocloric 0,1 M (pH 1,0), đệm phosphat pH 4,0, 6,8 và 7,4 chứa 0,5% Tween 80 Mẫu thử được đưa trực tiếp vào môi trường hoặc đặt vào viên nang cứng gelatin trước khi thử độ hòa tan Sau đó, mẫu được lấy ra sau từng khoảng thời gian xác định, ly tâm 15000 vòng/phút và đánh giá lượng DC giải phóng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis, quang phổ huỳnh quang hoặc HPLC.

Một số nghiên cứu sử dụng thiết bị thử là các ống Eppendorf chứa môi trường thử và mẫu thử, được đặt vào thiết bị lắc và duy trì nhiệt độ 37 ± 0,5 o C với tốc độ phù hợp Sau đó, các ống được lấy ra và ly tâm tại từng khoảng thời gian xác định, rồi phân tán trở lại trong dung môi thích hợp để xác định lượng curcumin giải phóng bằng phương pháp HPLC.

Theo nghiên cứu của Xie X và cộng sự, hệ tiểu phân nano PLGA chứa curcumin đã được đánh giá khả năng giải phóng trong hai môi trường đệm phosphat pH 2,0 và 7,4, mô phỏng dịch dạ dày và ruột Kết quả cho thấy curcumin được giải phóng nhanh chóng trong 8 giờ đầu và tiếp tục giải phóng kéo dài Đặc biệt, tốc độ giải phóng của curcumin từ tiểu phân nano trong môi trường ruột cao hơn môi trường dạ dày nhân tạo, do quá trình hấp thu chủ yếu của curcumin xảy ra ở ruột Sự giải phóng in vitro chậm và kéo dài của curcumin dẫn đến hấp thu in vivo kéo dài, mang lại hiệu quả cao trong ứng dụng thực tế.

 Đánh giá giải phóng thuốc qua túi thẩm tích

Một số nghiên cứu sử dụng túi thẩm tích với kích thước lỗ xốp cho phép tiểu phân có khối lượng phân tử khoảng 3-14 kDa đi qua để đánh giá sự khuếch tán của curcumin Do curcumin có độ tan thấp trong nước, môi trường khuếch tán thường được sử dụng là ethanol, dịch dạ dày nhân tạo (pH 2,0) hoặc dịch ruột nhân tạo (pH 7,4) chứa 0,1% Tween 80, giúp tăng độ tan của curcumin và tránh bám dính vào thành ống Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng sử dụng dung dịch PEG 400 30% hoặc dung dịch natri laurylsulfat 20% làm môi trường khuếch tán Túi thẩm tích được đặt trong môi trường ở nhiệt độ 37 ± 0,5 o C và sử dụng khuấy từ để đảm bảo sự khuếch tán đều của curcumin.

Để đánh giá tốc độ giải phóng của dược chất (DC), người ta thường sử dụng các phương pháp như khuấy với tốc độ thích hợp hoặc đặt trong giỏ quay của thiết bị hòa tan, hoặc rung lắc theo chiều ngang bằng thiết bị rung Sau đó, định lượng DC giải phóng qua màng sẽ được thực hiện bằng phương pháp HPLC hoặc quang phổ UV-Vis ở bước sóng 423 nm, giúp đánh giá tốc độ giải phóng của dược chất sau từng khoảng thời gian.

Theo nghiên cứu của Ji H và cộng sự, quá trình giải phóng curcumin từ hệ tiểu phân nano lipid rắn đã được đánh giá trong môi trường dịch dạ dày nhân tạo (pH 1,2) và dịch ruột nhân tạo (pH 7,4) bằng phương pháp sử dụng túi thẩm tích Kết quả cho thấy tốc độ giải phóng curcumin diễn ra chậm trong cả hai môi trường, chứng tỏ rằng curcumin được nạp bên trong lõi lipid với tỷ lệ cao.

 Đánh giá tính thấm qua tế bào Caco-2

Nghiên cứu của Yu H và Huang Q đã sử dụng màng tế bào Caco-2 mô phỏng biểu mô ruột non để nghiên cứu cơ chế thấm của nhũ tương nano chứa curcumin Kết quả cho thấy nhũ tương nano có thể thấm qua màng tế bào theo hai cơ chế chính: hòa tan khuếch tán thụ động qua màng tế bào biểu mô sau khi bị tiêu hóa bởi lipase và hòa tan bởi acid béo-muối mật tạo micel, hoặc khuếch tán trực tiếp qua màng ruột do kích thước giọt nhỏ Tuy nhiên, kết quả đánh giá tính thấm qua màng tế bào Caco-2 chỉ ra rằng cơ chế thấm của nhũ tương nano chứa curcumin chủ yếu theo con đường khuếch tán-tiêu hóa.

Nghiên cứu in vitro là một công cụ hữu ích trong việc xây dựng công thức và kiểm soát chất lượng sản phẩm, với ưu điểm là đơn giản, ít tốn kém và dễ thiết lập Tuy nhiên, do curcumin có độ tan thấp và chuyển hóa nhanh trong cơ thể sống, việc sử dụng mô hình đánh giá in vitro để dự đoán kết quả in vivo thường khó chính xác Trong số các phương pháp đánh giá in vitro, phương pháp đánh giá giải phóng trực tiếp từ môi trường là mô hình phù hợp để đánh giá độ hòa tan của nano tinh thể, trong khi phương pháp giải phóng in vitro qua túi thẩm tích có thể tạo ra hàng rào đối với quá trình hòa tan, làm chậm tốc độ hòa tan.

Phương pháp đánh giá độ hòa tan không phù hợp với các tiểu phân nano kiểm soát giải phóng do hạn chế về khả năng hòa tan Thay vào đó, phương pháp này chỉ thích hợp với các ứng dụng kiểm soát giải phóng Ngoài ra, các nghiên cứu in vitro trên màng tế bào Caco-2 đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá tính thấm và cơ chế thấm của các tiểu phân nano này.

Đánh giá độ hòa tan của nano tinh thể bằng phương pháp thử giải phóng trực tiếp trong môi trường gặp phải một số khó khăn nhất định Curcumin là một dược chất sơ nước, khó phân tán vào môi trường nước và có thể bị kết tụ, bám dính vào cốc và cánh khuấy Khi chuyển sang dạng nano tinh thể, hiện tượng kết tụ vẫn có thể xảy ra do tác động của nhiều yếu tố trong quá trình phun sấy, dẫn đến tốc độ hòa tan ban đầu có thể chậm Để xác định chính xác phần trăm curcumin hòa tan, cần sử dụng biện pháp thích hợp để loại bỏ các tiểu phân nano chưa thấm và nổi trên bề mặt môi trường hòa tan.

DC kích cỡ nanomet không tan từ mẫu

Một số nghiên cứu về SKD của curcumin sử dụng phương pháp nghiên cứu ex vivo để đánh giá hấp thu của curcumin trên ruột cô lập

Mô hình túi ruột lộn ex vivo là một công cụ hữu ích để nghiên cứu cơ chế và động học của hấp thu thuốc, như đã được chứng minh bởi Kumar A và cộng sự Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã sử dụng chuột được cho nhịn đói 10-12 giờ và gây mê bằng ether để lấy phần ruột ra và đặt vào dung dịch Krebs Ringer (pH 7,4) với oxy cung cấp Phần tá tràng được sử dụng để nghiên cứu tính thấm, được thắt bằng chỉ nilon và lộn ra bằng que thủy tinh Dung dịch Krebs Ringer bên ngoài túi ruột được coi như dịch nhày, trong khi dung dịch bên trong được coi như dịch ruột Lượng curcumin thấm qua ruột sau từng khoảng thời gian xác định được xác định bằng phương pháp HPLC.

Nghiên cứu của Gupta N K và Dixit V K đã tiến hành đánh giá hấp thu ex vivo của nhũ tương nano chứa curcumin trên ruột dê, cho thấy kết quả đáng chú ý Cụ thể, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng hấp thu ex vivo của phức hợp curcumin và phospholipid cao hơn đáng kể so với curcumin tự do, chứng minh tiềm năng của phương pháp này trong việc tăng cường hấp thu curcumin.

Nghiên cứu ex vivo có ưu điểm đơn giản hơn so với nghiên cứu in vivo, cho phép nghiên cứu cơ chế và động học quá trình hấp thu của thuốc trước khi được phân bố và chuyển hóa trong cơ thể Tuy nhiên, đối với các dược chất (DC) chuyển hóa mạnh qua gan thành các chất có hoạt tính, mô hình nghiên cứu này vẫn còn hạn chế trong việc phản ánh đúng quá trình sinh dược học và dược động học của cơ thể sống.

Bên cạnh các mô hình nghiên cứu trên, nghiên cứu in situ được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá đặc tính hấp thu của curcumin

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Các nguyên liệu và hóa chất chính được được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Curcumin Ấn Độ Nhà sản xuất

2 Curcumin chuẩn (95,51%, số lô QT209031215) VKN thuốc TP HCM Chuẩn làm việc

4 Cremophor RH40 Trung Quốc USP 39

6 Polyvinyl pyrolidon K30 Trung Quốc BP 2015

7 Alcol polyvinic Trung Quốc BP 2015

11 Natri carboxy methylcellulose Trung Quốc USP 39

12 Carboxy methylcellulose Trung Quốc USP 39

13 Acetonitril J.T Baker Tinh khiết HPLC

14 Methanol J.T Baker Tinh khiết HPLC

15 Acid acetic băng Merck Tinh khiết HPLC

VKN thuốc Trung ương Dược điển VN IV

18 Tert-butyl methyl ether Merck Tinh khiết phân tích

19 Acid formic Fluka Tinh khiết LC-MS

20 Nước tinh khiết Việt Nam Dược điển VN IV

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Thiết bị Nước sản xuất Địa điểm nghiên cứu

Thiết bị dùng trong bào chế

Trường Đại học Dược Hà Nội hiện có các thiết bị hiện đại như máy nghiền bi Retsch MM200 của Đức, máy khuấy từ Ika RH B1, 415W của Đức và thiết bị đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn Unidrive X1000, giúp hỗ trợ nghiên cứu và thực hành hiệu quả.

Mỹ Trường ĐH Dược HN

Máy phun sấy Buchi mini spray dryer B-191

Thụy Sỹ Trường ĐH Dược HN

Thiết bị dùng để đánh giá

Kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi

Nhật Bản Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương Máy đo kích thước tiểu phân và xác định phân bố kích thước tiểu phân

Anh Trường ĐH Dược HN

Máy đo kích thước tiểu phân và khoảng phân bố kích thước tiểu phân

Anh Trường ĐH Dược HN

Thiết bị đánh giá diện tích bề mặt, thể tích lỗ xốp và đường kính lỗ xốp

Mỹ Trường ĐH Bách Khoa HN

Cân xác định mất khối lượng do làm khô Moisture analyzer MF50 AD

Nhật Trường ĐH Dược HN

Máy đo thể tích biểu kiến của hạt và bột Erweka SVM10 Đức Trường ĐH Dược HN

Thiết bị quét nhiệt vi sai DSC 131,

Pháp Trường ĐH Quốc gia HN

Thiết bị quét phổ nhiễu xạ tia X D8

Advance, Bruker axs Đức Trường ĐH Quốc gia HN Thiết bị đo phổ hồng ngoại Nhật Trường ĐH Quốc gia HN

Máy đo quang phổ UV/Vis

Nhật Trường ĐH Dược HN

Thiết bị thử độ hòa tan Erweka-DT Đức Trường ĐH Dược HN Máy ly tâm lạnh Universal 320 R Đức Trường ĐH Dược HN Máy siêu âm Ultrasonic Cleaner Set

Hàn Quốc Trường ĐH Dược HN

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mỹ Trường ĐH Dược HN

Thiết bị lắc xoáy Vortex ZX3, Velp

Mỹ Viện kiểm nghiệm thuốc

Trung ương Thiết bị lắc xoáy ngang

Reciprocating Shaking 3006, GFL Đức Viện kiểm nghiệm thuốc

Trung ương Thiết bị bốc hơi dung môi ở áp suất giảm Centrivap solvent system,

Máy sắc ký lỏng Acquity UPLC H-

Class, kết hợp khối phổ Xevo TQD,

Tủ lạnh sâu MDF 236, Sanyo Nhật Viện kiểm nghiệm thuốc

2.1.3 Động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm được lựa chọn là chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lượng khoảng 20-35 g, khoảng 7 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp từ Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột được cho thích nghi với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất một tuần và cho nhịn đói 12 giờ, chỉ uống nước trước khi tiến hành thí nghiệm.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

- Thẩm định phương pháp định lượng

- Nghiên cứu tiền công thức

- Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano curcumin

- Nghiên cứu ảnh hưởng khi nâng quy mô bào chế đến đặc tính của hệ tiểu phân nano curcumin

- Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở và theo dõi độ ổn định của hệ tiểu phân nano curcumin

- Đánh giá SKD của hệ tiểu phân nano curcumin trên chuột thí nghiệm.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng

2.3.1.1 Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis

Chuẩn bị các dung dịch:

Để tạo dung môi pha loãng, bạn cần cân 2,0 g Tween 80 vào cốc có mỏ, sau đó thêm nước cất và đun nóng cho đến khi Tween 80 tan hoàn toàn Sau khi để nguội, thêm nước vừa đủ để đạt được dung dịch có tổng thể tích là 1000 ml.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin và hòa tan trong 10 ml methanol, sau đó chuyển vào bình định mức 100 ml và thêm dung môi pha loãng tới vạch, lắc kỹ để tạo dung dịch A với nồng độ 100 g/ml Tiếp theo, hút chính xác 2 ml dung dịch A và chuyển sang bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha loãng tới vạch và lắc kỹ để tạo dung dịch có nồng độ 5 g/ml, sẵn sàng cho quá trình quét phổ trong khoảng bước sóng từ 200-800 nm.

200 đến 600 nm, lựa chọn bước sóng tại đó curcumin đạt cực đại hấp thụ Từ dung dịch A pha loãng thành các dung dịch curcumin chuẩn có nồng độ 1; 2; 2,5; 4; 4,5;

Để xây dựng đường chuẩn, chúng tôi đã chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ curcumin trong khoảng từ 5 đến 7,5 g/ml Tiếp theo, chúng tôi đo độ hấp thụ của các dung dịch này tại bước sóng đã chọn, sử dụng mẫu trắng là dung môi pha loãng Dữ liệu thu được sẽ được sử dụng để xây dựng đường chuẩn, thể hiện mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin.

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Chuẩn bị các dung dịch:

- Dung môi pha loãng: hỗn hợp methanol: acid acetic băng (99:1, tt/tt)

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn và hòa tan trong dung môi pha loãng Sau đó, chuyển dung dịch này vào bình định mức 100 ml và thêm dung môi pha loãng tới vạch, lắc kỹ để tạo thành dung dịch B Tiếp theo, hút chính xác một lượng dung dịch B và thêm dung môi pha loãng để tạo thành dung dịch có nồng độ 5 μg/ml Cuối cùng, lọc dung dịch này qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 μm để đạt được dung dịch chuẩn cần thiết.

Để chuẩn bị dung dịch thử, chúng tôi sử dụng phương pháp tương tự như chuẩn bị dung dịch chuẩn, nhưng thay thế curcumin chuẩn bằng một lượng bột phun sấy chứa nano curcumin tương ứng với 10,0 mg curcumin.

Dưới đây là các thông số kỹ thuật của hệ thống sắc ký Agilent Infinity 1260 được lựa chọn dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có và kết hợp với khảo sát sơ bộ: cột sắc ký AQ – C18 với kích thước 250 x 4,6 mm và hạt nhồi 5 μm; pha động là hỗn hợp acetonitril và dung dịch acid acetic 2% (kể với tỷ lệ 58:42) được lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 μm; tốc độ dòng chảy là 1,5 ml/phút; thể tích tiêm mẫu là 20 μl; và detector UV-Vis phát hiện ở bước sóng 430 nm.

 Thẩm định phương pháp định lượng dựa trên một số tiêu chí:

Để đảm bảo tính thích hợp của hệ thống sắc ký, cần thực hiện tiêm mẫu chuẩn có nồng độ 5 g/ml lặp lại 6 lần qua hệ thống theo chương trình đã chọn Kết quả yêu cầu đạt được là độ lặp lại về diện tích pic và thời gian lưu giữa mỗi lần tiêm có giá trị RSD không quá 2%, đồng thời hệ số bất đối xứng nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5.

- Tính chọn lọc - độ đặc hiệu: chuẩn bị mẫu trắng bằng cách hòa tan Tween

Để xác định curcumin trong mẫu nano curcumin, tiến hành sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với dung môi pha loãng chứa 80, PVP và manitol theo tỷ lệ quy định Sử dụng mẫu curcumin chuẩn (5 μg/ml) và mẫu thử chứa nano curcumin (5 μg/ml) để so sánh Hệ thống sắc ký sẽ ghi lại các sắc ký đồ và yêu cầu pic của curcumin phải được nhận diện rõ ràng trên cả mẫu chuẩn và mẫu thử, đồng thời không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của curcumin trên sắc ký đồ của mẫu trắng.

Để xây dựng khoảng tuyến tính, cần chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn với nồng độ từ 2,5 đến 15 µg/ml Sau đó, tiêm lần lượt các dung dịch này vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã định.

36 đã chọn Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin Khoảng tuyến tính phải có hệ số tương quan r  0,98

Để đánh giá độ đúng của phương pháp, các dung dịch chuẩn chứa nano curcumin được chuẩn bị ở 3 mức nồng độ khác nhau là 5, 10 và 15 µg/ml Tiếp theo, 10 ml dung dịch thử được thêm vào một lượng dung dịch chuẩn tương ứng khoảng 10, 20 và 30% so với lượng nano curcumin có sẵn trong mẫu thử Sau đó, dung dịch được pha loãng vừa đủ đến 20 ml và lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Kết quả yêu cầu phần trăm tìm lại của các mẫu ở 3 mức nồng độ phải nằm trong khoảng từ 98-102%.

- Độ chính xác: chuẩn bị 6 mẫu dung dịch thử chứa nano curcumin có nồng độ

Để xác định nồng độ curcumin, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký với dung dịch có nồng độ 5 àg/ml và chương trình đã được lựa chọn ở mục 2.3.1.2 Kết quả nồng độ được tính toán dựa trên phương trình hồi quy tuyến tính Đồng thời, yêu cầu về độ lặp lại của hàm lượng curcumin trong các mẫu phải đạt giá trị RSD không vượt quá 2%.

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột

Cân chính xác khoảng 5,0 mg curcumin (CUR), hòa tan trong bình định mức

Để tạo dung dịch chứa curcuminoid (CUR) và tetrahydrocurcumin (THC) trong huyết tương chuột, tiến hành các bước sau: Cân chính xác khoảng 10,0 mg tetrahydrocurcumin (THC) và hòa tan trong bình định mức 50 ml với dung môi methanol Tiếp theo, hút 1 ml dung dịch CUR và 0,5 ml dung dịch THC, pha loãng trong bình định mức 20 ml bằng dung môi methanol Sau đó, hút 1 ml dung dịch này, cô bốc hơi dung môi và hòa tan cắn trong 10 ml huyết tương chuột để tạo dung dịch chứa CUR và THC trong huyết tương có cùng nồng độ.

500 ng/ml Từ dung dịch này, pha loãng bằng huyết tương chuột thành các dung dịch có nồng độ thích hợp

Cân chính xác khoảng 25 mg glibenclamid (IS), hòa tan trong bình định mức

100 ml với dung môi methanol Hút 500 l dung dịch, pha loãng thành 25 ml với hỗn hợp dung môi methanol-nước (50:50)

Quy trình xử lý mẫu được tiến hành bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với dung môi chiết là tert-butyl methyl ether (TBME) [105] Cụ thể như sau:

Thêm 10 l dung dịch chuẩn nội vào ống nghiệm chứa 100 l huyết tương chuột Lắc xoáy 5 giây Thêm 3 ml dung môi tert-butyl methyl ether (TBME) Lắc cơ học ngang 5 phút Ly tâm 3000 vòng trong 5 phút Hút lấy 2,5 ml lớp dịch trong phía trên Cô bay hơi dung môi bằng thiết bị cô dung môi áp suất giảm ở nhiệt độ

40 o C Hòa tan cắn trong 100 l pha động bằng cách lắc xoáy 30 giây trên thiết bị lắc cơ học

Mẫu huyết tương sau khi xử lý được định lượng đồng thời CUR và THC bằng phương pháp LC-MS/MS với các điều kiện sắc ký được thiết lập dựa trên tham khảo tài liệu và khảo sát thực tế Cụ thể, cột sắc ký Kinetex C18 với kích thước 100 x 2,1 mm và kích thước hạt nhồi 1,7 m được sử dụng, cùng với nhiệt độ cột được điều chỉnh ở mức 40 o C Pha động được tạo thành từ hỗn hợp acetonitril và dung dịch acid formic 0,05% với tỷ lệ 60:40, và tốc độ dòng được thiết lập ở mức 0,3 ml/phút Thể tích mẫu tiêm là 10 l, và các điều kiện khối phổ được trình bày chi tiết ở bảng 2.3.

Bảng 2.3 Điều kiện khối phổ của phương pháp LC-MS/MS định lượng curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương

Thông số CUR THC IS

Chế độ ion hóa ESI (+) ESI (+) ESI (+) Điện thế đầu phun (kV) 3,0 3,0 3,0 Điện thế bộ phận thu mẫu (V) 36 18 28

Tốc độ khí bay hơi (lít/giờ) 800 800 800

Quy trình thẩm định phương pháp định lượng đồng thời CUR và THC trong huyết tương được thực hiện theo hướng dẫn của US-FDA và EMA, bao gồm các chỉ tiêu như ion ban đầu (ion mẹ) có khối lượng phân tử (m/z) là 369,03, 373,05 và 494,20, trong khi ion tạo thành (ion con) có khối lượng phân tử (m/z) là 176,98, 136,96 và 369,12.

 Tính thích hợp của hệ thống

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

Để tạo nền tảng cho nghiên cứu bào chế, đề tài đã thực hiện khảo sát và thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis và HPLC, đồng thời thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột bằng LC-MS/MS.

3.1.1 Kết quả khảo sát phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis

3.1.1.1 Phổ hấp thụ UV-Vis của curcumin

Quét phổ dung dịch curcumin chuẩn 5 g/ml trong dung môi nước chứa 0,2% Tween 80 cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại tại 427 nm Tại bước sóng này, độ hấp thụ của dung dịch chứa Tween 80, PVP và manitol là rất thấp, khoảng 0,004 ± 0,001 Do đó, bước sóng 427 nm được chọn để xác định hàm lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis.

Để xác định nồng độ curcumin, chúng tôi đã chuẩn bị dãy dung dịch curcumin chuẩn theo phương pháp đã được trình bày trước đó Tiếp theo, chúng tôi đo độ hấp thụ của các dung dịch này tại bước sóng 427 nm Kết quả thu được đã được trình bày chi tiết tại phụ lục 1.1 và minh họa bằng hình 3.1, cung cấp thông tin chính xác về nồng độ của các dung dịch curcumin.

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin Đ ộ h ấ p t h ụ

Kết quả thu được cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ curcumin trong khoảng nồng độ khảo sát, với hệ số tương quan r ≈ 1 Điều này chứng tỏ phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis có thể được sử dụng để định lượng curcumin trong nguyên liệu, chế phẩm bào chế hoặc xác định độ hòa tan của nó.

3.1.2 Kết quả khảo sát thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp HPLC mang lại độ tin cậy cao hơn so với phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis trong việc xác định chính xác nồng độ dược chất (DC) và phát hiện các tạp chất (nếu có) Để đảm bảo độ chính xác của phương pháp định lượng trong khoảng giới hạn nồng độ DC được khảo sát, quy trình thẩm định phương pháp cần được thực hiện dựa trên các chỉ tiêu cơ bản, bao gồm cả việc kiểm tra độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 5 g/ml và tiến hành đánh giá độ thích hợp theo phương pháp ghi ở mục 2.3.1.2 Kết quả xác định diện tích pic, thời gian lưu và hệ số bất đối xứng được trình bày ở bảng 3.1, cung cấp thông tin cần thiết để đánh giá hiệu suất của phương pháp phân tích.

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống HPLC

STT Thời gian lưu t R (phút)

Diện tích pic (mAU.giây) Hệ số bất đối xứng

Kết quả thu được từ bảng 3.1 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các giá trị thời gian lưu nhỏ hơn 1% và diện tích pic nhỏ hơn 2%, trong khi hệ số bất đối xứng nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5 Điều này cho thấy số đĩa lý thuyết trung bình khoảng 9635, chứng tỏ chương trình sắc ký đã chọn là phù hợp để định lượng curcumin trong các mẫu nghiên cứu.

3.1.2.2 Tính chọn lọc-độ đặc hiệu

Kết quả sắc ký đồ cho thấy mẫu dung dịch curcumin chuẩn và mẫu thử chứa nano curcumin đều có một pic tại thời gian lưu 6,27 phút trong khoảng thời gian 9 phút Ngược lại, sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của curcumin Điều này chứng tỏ pic trên sắc ký đồ là của curcumin, chứng minh phương pháp định lượng có độ đặc hiệu cao.

Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin trong mẫu, kết quả được thể hiện ở phụ lục 1.2 và biểu diễn ở hình 3.2

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin

Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ đã được khảo sát, với hệ số tương quan cao là 0,9989 Điều này cho thấy sự phụ thuộc chặt chẽ và tuyến tính giữa hai yếu tố này trong khoảng nồng độ đã nghiên cứu.

Để đánh giá độ đúng của phương pháp HPLC định lượng curcumin, chúng tôi đã chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử chứa nano curcumin Kết quả cho thấy phương pháp này đạt độ chính xác cao với phương trình hồi quy là y = 88,41x + 33,78 và hệ số xác định R² là 0,998, chứng tỏ mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ curcumin và diện tích pic.

Nồng độ curcumin (àg/ml)

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp HPLC định lượng curcumin

Nồng độ chuẩn thêm vào (g/ml)

Diện tích pic (mAU.giây)

Nồng độ tìm lại (g/ml)

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phương pháp phân tích có độ đúng cao, với phần trăm tìm lại của các mẫu nằm trong khoảng từ 98,0% đến 102,0%, đảm bảo phép phân tích chính xác khi xác định hàm lượng curcumin trong chế phẩm.

Pha 6 mẫu dung dịch thử chứa nano curcumin cú nồng độ 5 àg/ml Kết quả đánh giá độ chính xác theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.1.2 được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp

STT Khối lượng mẫu thử

Diện tích pic (mAU.giây)

Hàm lượng CUR (%) Độ đúng (%)

Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 cho thấy mẫu thử đạt hàm lượng trung bình là 42,0%, đồng thời độ chính xác của các dung dịch nằm trong khoảng từ 98,1% đến 101,1% với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 2%, chứng tỏ phương pháp này đáp ứng yêu cầu về độ chính xác.

Phương pháp HPLC đã chứng minh được hiệu quả và độ tin cậy trong thẩm định, từ đó có thể được ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích hàm lượng curcumin và đánh giá độ ổn định của các chế phẩm chứa curcumin.

3.1.3 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột

Sau khi được hấp thu qua đường uống, curcumin sẽ trải qua quá trình chuyển hóa mạnh tại gan, tạo ra một số sản phẩm chuyển hóa, bao gồm cả tetrahydrocurcumin Do đó, phương pháp phân tích cần được lựa chọn để có thể định lượng đồng thời cả curcumin (CUR) và tetrahydrocurcumin (THC) trong huyết tương với độ nhạy cao Phương pháp LC-MS/MS đã được chọn để đáp ứng yêu cầu này.

3.1.3.1 Tính thích hợp của hệ thống

NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC

Đánh giá các đặc tính vật lý, hóa học và cơ học của dược chất (DC) cùng với việc xem xét các tương tác dược chất-tá dược tiềm ẩn trong quá trình bào chế là bước đầu tiên quan trọng Đây là cơ sở để xây dựng công thức, lựa chọn tá dược phù hợp và quyết định phương pháp bào chế hiệu quả.

3.2.1 Kết quả nghiên cứu tính chất của dược chất

Trước tiên, DC curcumin được đánh giá một số tính chất như sau:

3.2.1.1 Hình thái học tiểu phân

Hình ảnh tiểu phân curcumin được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.1.a và được trình bày ở hình 3.3

Hình 3.3 Hình ảnh tiểu phân curcumin quan sát qua kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần

Về mặt hình thái học, tiểu phân curcumin có dạng hình kim với các cạnh sắc và rõ ràng Điều này cho phép tiểu phân dễ dàng bị phân chia thành các tiểu phân kích thước nhỏ hơn Mặc dù hình ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử quét không thể phản ánh kích thước của tiểu phân toàn bộ mẫu, nhưng kết quả này vẫn cung cấp thông tin dự đoán về kích thước và hình thái ban đầu của tiểu phân curcumin.

3.2.1.2 Phổ nhiễu xạ tia X và phổ hồng ngoại

Kết quả phân tích phổ nhiễu xạ tia X của curcumin được trình bày ở phụ lục 2.1 cho thấy nhiều pic có cường độ lớn, chứng tỏ curcumin chủ yếu tồn tại ở dạng kết tinh Để xác định các nhóm chức đặc trưng của chất, phổ hồng ngoại của curcumin cũng được chụp theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2.1.f, và hình ảnh phổ hồng ngoại được trình bày ở phụ lục 2.2.

3.2.1.3 Các đặc tính về kích thước tiểu phân, diện tích bề mặt và độ xốp, giản đồ nhiệt vi sai, hàm lượng và độ tan

Kết quả đánh giá một số tính chất lý hóa của curcumin theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2.1 được trình bày ở bảng 3.21

Bảng 3.21 Một số đặc tính của curcumin

Tính chất lý hóa Đặc điểm

Diện tích bề mặt và độ xốp

Diện tích bề mặt 1,348 m 2 /g, thể tích lỗ xốp trung bình 0,005 cm 3 /g, kích thước lỗ xốp trung bình 123,9 Å (phụ lục 2.4) Giản đồ nhiệt vi sai

Một pic thu nhiệt tương ứng với nhiệt độ nóng chảy 198,3 o C Enthalpy nóng chảy 126,9 J/g (phụ lục 2.5)

Hàm lượng CUR 95,1 ± 0,3% (phụ lục 2.6) Độ tan (25 ± 2 o C) 0,17 ± 0,04 g/ml

Hòa tan là bước quan trọng trong quá trình hấp thu của một số dược chất (DC) ít tan thuộc nhóm II và IV theo hệ thống phân loại sinh dược học Curcumin, một chất thuộc nhóm IV, thường khó phân tán và bị kết tụ trong nước Để cải thiện độ hòa tan, nghiên cứu đã sử dụng chất diện hoạt Tween 80 với nồng độ 0,2% trong môi trường thử Chất diện hoạt này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo điều kiện thuận lợi cho quá trình hòa tan của curcumin.

Chất diện hoạt giúp ngăn chặn sự bám dính của tiểu phân vào thành cốc và cánh khuấy, đồng thời giảm thiểu sai số do tiểu phân chưa phân tán vào môi trường hòa tan giữa các lần thử nghiệm Ngoài ra, chất diện hoạt còn gây thấm cho tiểu phân curcumin ở giai đoạn đầu của thử nghiệm hòa tan Kết quả độ hòa tan của curcumin trong môi trường dung dịch HCl 0,1 N, nước và đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80 được thể hiện rõ ràng, cho thấy hiệu quả của chất diện hoạt trong việc cải thiện độ hòa tan của curcumin.

Trong môi trường HCl 0,1 N chứa 0,2% Tween 80, curcumin có độ hòa tan thấp hơn so với trong môi trường nước và đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween

Môi trường HCl 0,1 N chứa 0,2% Tween 80

Môi trường nước chứa 0,2% Tween 80

Môi trường đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80

80 Dựa vào kết quả này, môi trường nước chứa 0,2% Tween 80 được chọn trong nghiên cứu thử độ hòa tan của curcumin

(các thời điểm 10 và 20 phút, phần trăm curcumin hòa tan không xác định được vì quá thấp)

Hình 3.4 Độ hòa tan của curcumin trong môi trường dung dịch HCl 0,1 N, nước và dung dịch đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80

Curcumin ban đầu có kích thước tiểu phân lớn và phân bố kích thước rộng, tồn tại ở trạng thái kết tinh và có độ tan trong nước kém Để cải thiện sinh khả dụng của curcumin, có thể áp dụng biện pháp cải thiện độ tan và độ hòa tan bằng cách bào chế hệ tiểu phân nano, giúp tăng khả năng hấp thụ và phát huy hiệu quả của curcumin.

3.2.2 Kết quả nghiên cứu độ ổn định hóa học của dược chất ở trạng thái rắn Độ ổn định của nguyên liệu sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định và tuổi thọ của dạng bào chế chứa DC đó Việc theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở trạng thái rắn có thể định hướng được tá dược sử dụng trong dạng bào chế, bao bì đóng gói cũng như điều kiện bảo quản Curcumin được theo dõi độ ổn định ở các điều kiện khắc nghiệt như trong mục 2.3.2.2 Đánh giá sự thay đổi hình thức bằng cảm quan, hàm lượng còn lại và tạp phân hủy bằng phương pháp HPLC, kết quả được trình bày ở bảng 3.22 và phụ lục 2.8

Bảng 3.22 Kết quả theo dõi độ ổn định của curcumin trong một số điều kiện khắc nghiệt (n = 3) Điều kiện khắc nghiệt Thay đổi hình thức

% curcumin so với ban đầu

Nhiệt khô, 60 o C trong 7 ngày, lọ kín - 108,1 ± 2,5 -

Tủ vi khí hậu, 40±2 o C, độ ẩm

Môi trường có độ ẩm 90% (dung dịch kali nitrat bão hòa), nhiệt độ phòng, 7 ngày

Kết quả thử nghiệm cho thấy curcumin có khả năng chịu được điều kiện nhiệt khô ở 60 độ C và tác động cơ học trong thời gian theo dõi mà không bị biến chất Tuy nhiên, trong môi trường có độ ẩm cao, curcumin dễ bị hút ẩm dẫn đến hiện tượng vón cục, mặc dù không có sự thay đổi về màu sắc Điều này có ý nghĩa quan trọng khi lựa chọn thông số trong quá trình bào chế, lựa chọn bao bì và điều kiện bảo quản chế phẩm để đảm bảo chất lượng của curcumin.

3.2.3 Kết quả nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược

Khi xây dựng công thức, curcumin được phối hợp với các tá dược thông qua quy trình bào chế thích hợp Để lựa chọn tá dược phù hợp, các nghiên cứu về tương tác giữa curcumin và tá dược đã được thực hiện, nhằm đánh giá sự thay đổi hình thức và hàm lượng còn lại sau thời gian bảo quản Kết quả cho thấy sự tương tác giữa curcumin và tá dược ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng sản phẩm sau khi bảo quản trong tủ vi khí hậu.

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá tương tác dược chất-tá dược sau 1 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc (n = 3)

Tỷ lệ dược chất-tá dược

Thay đổi hình thức Hàm lượng (%)

Chú thích: (-): không có; (+): có

Khả năng tương tác và tương kỵ của tá dược với hoạt chất curcumin có thể xảy ra ngay lập tức hoặc chậm hơn trong quá trình bảo quản Tuy nhiên, trong điều kiện khảo sát, curcumin không tương tác với các tá dược như Tween 80, Tween 60, Poloxame 188, CMC, manitol, Trehalose và lactose Đối với Cremophor RH40 và PVA, mặc dù có sự thay đổi về hình thức khi lọ mở nắp, nhưng khi lọ đóng nắp, kết quả định lượng không cho thấy sự thay đổi về hàm lượng curcumin và không xuất hiện tạp phân hủy Điều này cho thấy rằng trong điều kiện thực nghiệm, không có tương kỵ nào giữa curcumin và các tá dược được khảo sát.

Nghiên cứu này tập trung vào việc cải thiện sinh khả dụng (SKD) của curcumin thông qua việc tăng độ tan và tốc độ hòa tan của nó Để đạt được mục tiêu này, các nhà nghiên cứu đã lựa chọn một số nhóm tá dược và phương pháp bào chế để bào chế hệ tiểu phân nano, dựa trên cơ sở nghiên cứu tính chất của dược chất (DC) và tương tác dược chất-tá dược.

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO

3.3.1 Xây dựng công thức bào chế hỗn dịch nano curcumin

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế một số nhóm chất được lựa chọn để xây dựng công thức cơ bản như ở bảng 2.4

3.3.1.1 Lựa chọn loại chất diện hoạt

Chất diện hoạt đóng vai trò quan trọng trong việc định hướng trên bề mặt phân cách giữa hai pha rắn-lỏng, tạo thành một lớp đơn hoặc đa phân tử, bao gồm các ion xung quanh các tiểu phân DC rắn Quá trình này không chỉ làm giảm sức căng bề mặt mà còn cải thiện tính thấm của các tiểu phân DC rắn với môi trường phân tán, từ đó nâng cao hiệu quả của hệ thống.

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế sử dụng các chất diện hoạt khác nhau với thành phần theo bảng 3.24 bằng phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A)

Bảng 3.24 Thành phần các mẫu hỗn dịch nano sử dụng chất diện hoạt khác nhau

CUR (g) Tw80 (g) Tw60 (g) Cre (g) Pol (g) Nước (ml)

Kết quả xác định kích thước tiểu phân trung bình (KTTPTB) và hệ số đa phân tán (PDI) theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3.b được trình bày trong hình 3.5

Hình 3.5 KTTPTB và PDI của các mẫu hỗn dịch nano curcumin sử dụng chất diện hoạt khác nhau (n = 3)

Kết quả ở hình 3.5 chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa về kích thước tiểu phân trung bình (KTTPTB) giữa các mẫu sử dụng chất diện hoạt khác nhau, với giá trị p nhỏ hơn 0,05 Phân tích sâu hơn bằng kiểm định LSD cho thấy sự khác biệt đáng kể về KTTPTB giữa mẫu DH1 và các mẫu DH2, DH3, DH4, với giá trị p nhỏ hơn 0,05 Đặc biệt, hỗn dịch nano curcumin sử dụng chất diện hoạt Tween 80 có kích thước tiểu phân trung bình nhỏ nhất, do đó Tween 80 được lựa chọn để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.1.2 Lựa chọn tỷ lệ chất diện hoạt/curcumin

Các mẫu hỗn dịch nano curcumin được bào chế theo quy trình A, sử dụng chất diện hoạt Tween 80 với các tỷ lệ khối lượng khác nhau, cụ thể là 5%, 10%, 20% và 50% so với khối lượng curcumin Kết quả xác định kích thước tiểu phân (KTTP) và chỉ số phân tán (PDI) của các mẫu này cho thấy sự phụ thuộc vào tỷ lệ Tween 80, được trình bày chi tiết trong hình 3.6.

Hình 3.6 KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano curcumin sử dụng Tween 80 với các tỷ lệ khác nhau (n = 3)

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác biệt đáng kể về kích thước tiểu phân (KTTPTB) của mẫu hỗn dịch nano curcumin khi thay đổi tỷ lệ Tween 80/curcumin Cụ thể, khi tăng tỷ lệ từ 5% lên 10%, KTTPTB có xu hướng giảm, nhưng khi tiếp tục tăng từ 10% lên 20%, sự thay đổi này không có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, khi tỷ lệ Tween 80/curcumin đạt 50%, KTTPTB lại tăng, đồng thời hệ số đa phân tán PDI giảm, chứng tỏ sự ổn định của hệ thống.

Tỷ lệ Tween 80/curcumin được khảo sát trong khoảng từ 5-15% do tỷ lệ cao hơn 20% có thể gây khó khăn cho quá trình phun sấy và tạo ra nhiều bọt trong hỗn dịch, ảnh hưởng đến quá trình khuấy trộn ở tốc độ cao.

3.3.1.3 Lựa chọn loại polyme thân nước

Hỗn dịch nano thường kém ổn định về mặt nhiệt động học, dẫn đến hệ tiểu phân nano giảm năng lượng bề mặt bằng cách kết tụ hoặc hòa tan và kết tinh trở lại thành tiểu phân lớn hơn Tuy nhiên, việc sử dụng chất diện hoạt như Tween 80 chỉ tạo ra lớp hấp phụ mỏng trên bề mặt tiểu phân, dẫn đến sự ổn định không gian kém hiệu quả Để cải thiện điều này, các nghiên cứu đã phối hợp Tween 80 với các polyme thân nước, giúp giảm năng lượng bề mặt tiểu phân bằng cách hấp phụ trên bề mặt và tạo thành lớp áo thân nước ngăn chặn quá trình kết tụ Sự có mặt của các polyme này cũng có thể tạo sự cồng kềnh về mặt không gian và tích điện cho bề mặt tiểu phân, giúp tăng cường ổn định cho hỗn dịch nano.

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế theo công thức DH1 kết hợp với các polyme thân nước như PVP, Na CMC hoặc PVA Các thành phần của hỗn dịch nano được thể hiện chi tiết ở bảng 3.25, cung cấp thông tin cụ thể về tỷ lệ và thành phần của từng mẫu hỗn dịch.

Bảng 3.25 Thành phần các mẫu hỗn dịch nano sử dụng các polyme thân nước

CUR (g) Tw (g) PVP (g) Na CMC(g) PVA (g) Nước (ml)

Các mẫu hỗn dịch nano được đánh giá KTTPTB, PDI theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3.b và thế zeta theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3.c Kết

KTTPTB PDI quả đánh giá KTTPTB, PDI và thế zeta của các mẫu hỗn dịch nano được thể hiện ở hình 3.7 và bảng 3.26

Kết quả phân tích KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano sử dụng các polyme thân nước khác nhau được trình bày ở hình 3.7 Đồng thời, bảng 3.26 cho thấy giá trị thế zeta của các mẫu hỗn dịch nano sử dụng các polyme khác nhau, cung cấp thông tin về tính ổn định và đặc tính bề mặt của các hạt nano.

Giá trị thế zeta (mV) Trong môi trường nước Trong môi trường phân tán gốc

Kết quả nghiên cứu cho thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa giá trị thế zeta và kích thước tiểu phân nano (KTTPTB) của hỗn dịch nano curcumin Cụ thể, hỗn dịch nano sử dụng polyme ổn định Na CMC có giá trị thế zeta cao hơn đáng kể so với các mẫu sử dụng PVP hoặc PVA, ngay cả khi tỷ lệ sử dụng Na CMC thấp nhất (0,05%) Điều này dẫn đến KTTPTB cao hơn của hỗn dịch nano sử dụng Na CMC, có thể do khối lượng phân tử lớn của Na CMC giúp hình thành cầu nối polyme và tăng sự kết tụ tiểu phân.

Khi pha loãng trong môi trường phân tán gốc, giá trị thế zeta của hỗn dịch nano bào chế với polyme Na CMC lại tăng lên đáng kể Sự tăng thế zeta này của lớp bao phủ nano cho thấy sự ổn định và phân tán tốt hơn của hệ thống nano trong môi trường phân tán, giúp ngăn chặn sự kết tụ và tăng cường tính ổn định của sản phẩm.

Helmholtz tăng cường hấp phụ nhóm carboxylic tích điện âm (COO-) lên bề mặt tiểu phân nhiều hơn so với sự chuyển lớp hấp phụ của chuỗi polyme Điều này dẫn đến sự gia tăng điện thế Stern và thế zeta do nhóm tích điện âm của Na CMC phân bố ở cả trong và trên bề mặt polyme.

Giá trị thế zeta đóng vai trò quan trọng trong việc dự đoán độ ổn định vật lý của hỗn dịch, bởi điện tích bề mặt tiểu phân là yếu tố quyết định chính độ ổn định của hệ phân tán Kết quả xác định thế zeta cho thấy các polyme sử dụng đều có khả năng tăng độ ổn định của hỗn dịch nano curcumin, ngoại trừ Na CMC có thể gây mất ổn định do tương tác hình thành cầu nối polyme Dựa trên kết quả này, PVP được lựa chọn là chất ổn định phù hợp cho hỗn dịch nano curcumin.

3.3.1.4 Lựa chọn tỷ lệ polyme thân nước/curcumin

Hỗn dịch nano được bào chế theo công thức DH1 kết hợp với polyme PVP với tỷ lệ khối lượng PVP/curcumin được thay đổi linh hoạt Quá trình phun sấy hỗn dịch nano được thực hiện theo phương pháp quy định tại mục 2.3.3.1 (quy trình A), trong đó các thông số nhiệt độ khí vào đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra hỗn dịch nano chất lượng cao.

Kết quả đánh giá KTTPTB và PDI của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin với tỷ lệ PVP khác nhau được trình bày ở bảng 3.27 và 3.28, cho thấy ảnh hưởng của tỷ lệ PVP đến kích thước và phân bố kích thước của hạt nano curcumin Quá trình phun sấy được thực hiện ở nhiệt độ 85 o C và tốc độ phun dịch 5 ml/phút.

Bảng 3.27 KTTPTB và PDI của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệ PVP/curcumin khác nhau

Mẫu Tỷ lệ PVP/CUR KTTPTB (nm) PDI

Bảng 3.28 Độ hòa tan của các mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệ PVP/curcumin khác nhau

PS 1 PS 2 PS 3 PS 4 PS5

Kết quả thu được từ bảng 3.27 và 3.28 cho thấy tỷ lệ PVP/curcumin có ảnh hưởng đáng kể đến độ hòa tan của curcumin trong bột phun sấy, nhưng không ảnh hưởng đáng kể đến KTTPTB và PDI của tiểu phân nano curcumin Tỷ lệ PVP/curcumin càng cao thì tốc độ hòa tan curcumin từ bột phun sấy càng nhanh Tuy nhiên, cần lưu ý rằng tỷ lệ PVP/curcumin quá cao có thể ảnh hưởng đến thể chất của khối bột trong quá trình bảo quản do đặc tính dễ hút ẩm của PVP Do đó, tỷ lệ PVP/curcumin được lựa chọn trong khoảng từ 10% đến 100% để đảm bảo độ hòa tan và tính ổn định của sản phẩm.

3.3.2 Xác định một số thông số trong quy trình bào chế hỗn dịch nano

3.3.2.1 Lựa chọn tốc độ đồng nhất hóa

NGHIÊN CỨU NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ VÀ DỰ KIẾN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG

Để nâng cấp quy mô bào chế và tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa tiểu phân nano vào các dạng bào chế thích hợp, hệ tiểu phân nano curcumin được nghiên cứu bào chế ở quy mô 5 g/mẻ Tuy nhiên, quá trình này gặp phải một số khó khăn, bao gồm thể tích buồng nghiền hạn chế và lựa chọn thiết bị nghiền ướt phù hợp Để giải quyết vấn đề này, mỗi mẻ nghiền khô chỉ được tiến hành ở quy mô tối đa 5 g/mẻ, và thiết bị nghiền bi với buồng nghiền chứa bi zirconi oxyd được lựa chọn trong giai đoạn nghiền ướt để đảm bảo tiểu phân nano thu được có kích thước tiểu phân phù hợp và khoảng phân bố kích thước tiểu phân hẹp.

Khi nâng cấp quy mô bào chế từ 1 g lên 5 g/mẻ, cần xem xét lại các thành phần, tỷ lệ các thành phần trong công thức và một số thông số trong quy trình bào chế để điều chỉnh cho phù hợp, đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng.

3.4.1 Xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano curcumin ở quy mô 5 gam/mẻ

Hỗn dịch nano được bào chế với các thành phần và tỷ lệ tương tự như trước, nhưng khi chuyển sang dạng bột phun sấy, bột thu được có hàm ẩm cao và hiệu suất thấp do bám dính vào cyclon Để cải thiện hiệu suất, có thể thay đổi polyme thân nước hoặc kết hợp thêm các chất mang Bảng 3.34 trình bày thành phần hệ tiểu phân nano curcumin ở quy mô 5 g/mẻ, cung cấp thông tin chi tiết về công thức và tỷ lệ các thành phần.

Bảng 3.34 Thành phần của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng các chất mang khác nhau

Kết quả xác định KTTPTB, PDI và mất khối lượng do làm khô theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.3 được trình bày ở bảng 3.35

Bảng 3.35 Kết quả đánh giá KTTPTB, PDI và mất khối lượng do làm khô của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng các chất mang khác nhau (n = 3)

CT KTTPTB (nm) PDI Mất khối lượng do làm khô (%)

Khi tăng quy mô bào chế từ 1 lên 5 g/mẻ, kích thước trung bình tiểu phân (KTTPTB) và chỉ số phân tán (PDI) của hệ nano tăng Tuy nhiên, đối với mẻ 5 g, việc thay đổi polyme thân nước hoặc thêm chất mang thân nước không ảnh hưởng đến KTTPTB và PDI của hệ tiểu phân nano Trong khi đó, khi kết hợp với các chất mang như manitol, Trehalose hoặc lactose, hàm ẩm và hiệu suất của khối bột sau phun sấy tăng lên, đặc biệt là mẫu chứa manitol có khối bột tơi xốp, thuận lợi cho việc bảo quản và nghiên cứu chuyển dược chất vào các dạng bào chế thích hợp.

3.4.2 Khảo sát các thông số trọng yếu, giai đoạn trọng yếu trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 g/mẻ

Khi nâng cấp quy mô bào chế từ nhỏ lên lớn hơn, cần khảo sát các giai đoạn trọng yếu và thông số kỹ thuật quan trọng trong từng giai đoạn, như đã trình bày ở mục 2.3.3.2, để đảm bảo quá trình sản xuất được tối ưu và hiệu quả.

3.4.2.1 Giai đoạn nghiền khô Ở quy mô bào chế nhỏ, curcumin được nghiền khô trong buồng nghiền với bi inox kích thước 20 mm Khi nâng cấp lên quy mô bào chế lớn hơn, thiết bị này vẫn được lựa chọn trong quá trình nghiền khô Tuy nhiên, các thông số của thiết bị bao gồm thời gian và tần số nghiền khô cần được khảo sát cụ thể

 Ảnh hưởng của thời gian nghiền khô

Các mẫu curcumin đã được nghiên cứu về ảnh hưởng của thời gian nghiền khô ở tần số 30Hz tại các thời điểm khác nhau, bao gồm 1, 2, 3, 4, 5 và 6 giờ Kết quả phân tích kích thước và phân bố kích thước tiểu phân của các mẫu này đã được đánh giá bằng thiết bị Mastersizer 3000E và trình bày chi tiết trong hình 3.15.

Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của curcumin mẻ 5 gam nghiền khô với tần số 30Hz trong thời gian khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về KTTPTB giữa các mẫu nghiền khô với thời gian khác nhau Cụ thể, sau 6 giờ nghiền, KTTPTB có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với các mẫu nghiền khô ở các thời điểm trước 4 giờ Kết quả này chứng tỏ rằng quá trình nghiền khô có ảnh hưởng đáng kể đến kích thước tiểu phân của curcumin.

 Ảnh hưởng của tần số nghiền

Tần số nghiền là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân sau khi nghiền Để đánh giá tác động của tần số nghiền, quá trình nghiền khô curcumin bằng bi inox đã được thực hiện trong 6 giờ ở hai tần số khác nhau là 15 và 30 Hz Kết quả đánh giá KTTPTB sau quá trình nghiền được trình bày chi tiết, cung cấp thông tin quý giá về hiệu suất nghiền ở các tần số khác nhau.

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của mẫu nghiền khô mẻ 5 gam ở hai tần số 30 và 15 Hz trong 6 giờ (n = 3)

Kết quả ở hình 3.16 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về kích thước tiểu phân trung bình (KTTPTB) của curcumin giữa hai tần số nghiền 15Hz và 30Hz, với giá trị p nhỏ hơn 0,05 Cụ thể, sau 6 giờ nghiền với tần số 30Hz, kích thước tiểu phân trung bình của curcumin đạt khoảng 8,79 ± 0,22 μm và chỉ số phân bố kích thước Span là 2,6 ± 0,2.

Việc nghiền khô mẫu trong 6 giờ ở tần số 30 Hz với bi inox giúp giảm kích thước tiểu phân, từ đó làm tăng diện tích bề mặt đáng kể Để xác định diện tích bề mặt sau quá trình nghiền, mẫu được phân tích theo phương pháp quy định tại mục 2.3.3.3.d Kết quả thu được đã được trình bày chi tiết trong bảng 3.36 và phụ lục 4.3.

Bảng 3.36 Kết quả xác định diện tích bề mặt của mẫu nguyên liệu và mẫu curcumin 5 gam sau nghiền khô 6 giờ

Mẫu Diện tích bề mặt

Thể tích lỗ xốp (cm 3 /g) Đường kính trung bình của lỗ xốp (Å)

Sau 6 giờ nghiền khô, diện tích bề mặt của DC tăng gấp khoảng 5 lần (diện tích bề mặt mẫu nguyên liệu và mẫu sau nghiền khô lần lượt là 1,348 và 6,570 m 2 /g, còn kích thước lỗ xốp tăng khoảng 3 lần Do vậy, sau khi nghiền, kích thước tiểu phân giảm, diện tích bề mặt và độ xốp tăng

Dựa trên cơ sở đó, nghiên cứu được tiến hành với tần số của thiết bị nghiền bi là 30Hz và thời gian nghiền 6 giờ

Sau khi nghiền khô trong 6 giờ trên thiết bị nghiền bi inox, curcumin được tiếp tục nghiền ướt với khối lượng bi cố định 25g mỗi buồng nghiền theo phương pháp quy định Trong giai đoạn này, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nghiền như kích thước bi, tần số nghiền và thời gian nghiền được khảo sát kỹ lưỡng để đánh giá hiệu suất nghiền.

 Ảnh hưởng của kích thước bi

Kết quả khảo sát giai đoạn nghiền ướt trong 4 giờ ở tần số 30Hz với hai loại bi kích thước 0,65 và 0,8 mm cho thấy sự thay đổi đáng kể về kích thước và phân bố kích thước hạt Các mẫu nghiền ướt được đánh giá về kích thước trung bình theo trọng lượng (KTTPTB) và khoảng phân bố kích thước hạt (KTTP) bằng thiết bị Mastersizer 3000E Sau đó, hỗn dịch được pha loãng và đồng nhất hóa với tốc độ 18000 vòng/phút trong 60 phút, và đánh giá lại về KTTPTB và chỉ số phân tán (PDI) bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90 Malvern, với kết quả được trình bày chi tiết ở bảng 3.37.

Bảng 3.37 Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân curcumin ở giai đoạn nghiền ướt mẻ 5 gam với bi zirconi oxyd 0,8 và 0,65 mm (n = 3)

Kích thước bi Nghiền ướt Đồng nhất hóa

KTTPTB (àm) Span KTTPTB (nm) PDI

Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về kích thước tiểu phân trung bình (KTTPTB) giữa hai mẫu nghiền ướt với kích thước bi khác nhau (p > 0,05) Sau quá trình đồng nhất hóa, cả hai mẫu đều đạt KTTPTB nhỏ hơn 500 nm và chỉ số phân tán poly (PDI) nhỏ hơn 0,55 Điều này cho thấy sự khác biệt về kích thước bi không ảnh hưởng đáng kể đến KTTPTB của các mẫu nghiền ướt.

 Ảnh hưởng của quá trình nghiền khô và thời gian nghiền ướt

THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH

Độ ổn định của hệ tiểu phân nano được nghiên cứu ở hai điều kiện đã mô tả ở mục 2.3.4

3.5.1 Độ ổn định cấu trúc hệ tiểu phân

Sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc, hệ tiểu phân nano curcumin được chụp hình ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét Kết quả thể hiện ở hình 3.24

Hình ảnh chụp SEM của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin và nano curcumin sau quá trình rửa loại tá dược cho thấy sự ổn định của nano curcumin trong các điều kiện khác nhau Cụ thể, sau 9 tháng ở điều kiện thực, bột phun sấy chứa nano curcumin vẫn giữ được cấu trúc ổn định, tương tự như sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc Điều này chứng tỏ nano curcumin có khả năng chống oxy hóa và ổn định trong môi trường thực tế cũng như trong điều kiện lão hóa cấp tốc.

Kết quả ở hình 3.24 cho thấy: hệ tiểu phân nano vẫn tồn tại ở dạng cấu trúc và hình thái như ban đầu sau thời gian theo dõi độ ổn định

3.5.2 Độ ổn định kích thước tiểu phân và khoảng phân bố kích thước tiểu phân

Sau mỗi 3 tháng, phân tán hệ nano phun sấy vào nước và xác định KTTP bằng phương pháp ghi ở mục 2.3.3.3.b Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.46 và 3.47

Bảng 3.46 Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện thực (n = 3)

Mẻ Chỉ tiêu Thời gian (tháng)

Bảng 3.47 Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện lão hóa cấp tốc (n = 3)

Mẻ Chỉ tiêu Thời gian (tháng)

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác biệt về kích thước tiểu phân nano sau quá trình phun sấy và sau 3, 6 và 9 tháng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Phân tích sâu hơn bằng kiểm định LSD cho thấy kích thước trung bình của mẻ 2 và 3 có sự thay đổi đáng kể trong 9 tháng ở điều kiện thực tế so với ban đầu (p < 0,05), trong khi đó kích thước trung bình của mẻ 1 cũng có sự thay đổi.

Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về kích thước tiểu phân nano (KTTPTB) sau quá trình phun sấy và theo dõi trong 3 tháng và 6 tháng (p > 0,05) Tuy nhiên, ở điều kiện lão hóa cấp tốc, sự khác biệt về KTTPTB sau 3 tháng và 6 tháng là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Đặc biệt, sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc, KTTPTB của mẫu nano có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ban đầu (p < 0,05), mặc dù vẫn nằm trong giới hạn cho phép.

3.5.3 Độ ổn định đặc tính kết tinh của hệ tiểu phân Đặc tính kết tinh của hệ tiểu phân nano sau thời gian theo dõi ở hai điều kiện được đánh giá bằng phổ nhiễu xạ tia X Kết quả được trình bày ở hình 3.25

Hình 3.25 Phổ nhiễu xạ tia X của bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc

Kết quả ở hình 3.25 cho thấy: đặc tính kết tinh của hệ tiểu phân nano sau thời gian theo dõi hầu như không thay đổi

3.5.4 Mất khối lượng do làm khô

Sau thời gian bảo quản 9 tháng trong điều kiện thực tế, kết quả kiểm tra cho thấy mức độ mất khối lượng do làm khô của cả 3 mẻ sản phẩm lần lượt là 9,63%, 9,04% và 9,74%, vẫn nằm trong giới hạn cho phép Tương tự, sau 6 tháng bảo quản, kết quả kiểm tra cũng cho thấy mức độ mất khối lượng do làm khô vẫn đảm bảo an toàn và đạt tiêu chuẩn chất lượng.

Kết quả thử nghiệm cho thấy 113 điều kiện lão hóa cấp tốc vẫn nằm trong giới hạn cho phép, chứng tỏ bao bì vỉ nhôm-nhôm đã hạn chế hiệu quả sự thấm của hơi ẩm vào bên trong chế phẩm, đảm bảo chất lượng sản phẩm.

3.5.5 Độ ổn định về hàm lượng

Kết quả theo dõi hàm lượng curcumin trong bột phun sấy được trình bày ở bảng 3.48 Các sắc ký đồ được trình bày ở phụ lục 7

Bảng 3.48 Phần trăm curcumin trong bột phun sấy bảo quản ở điều kiện thực và lão hóa cấp tốc so với ban đầu (n = 3) Điều kiện

% hàm lượng so với ban đầu

Sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện thực tế và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc, hàm lượng curcumin trong bột phun sấy đóng trong viên nang vẫn giữ được chất lượng, đạt yêu cầu ban đầu với mức độ ổn định cao.

3.5.6 Độ ổn định về tốc độ hòa tan Đánh giá độ hòa tan của hệ tiểu phân nano sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3.i Kết quả được trình bày ở bảng 3.49

Kết quả cho thấy các hệ số f2 so với ban đầu lớn hơn 50, chứng tỏ độ hòa tan của các mẫu bảo quản ở điều kiện thực sau 9 tháng và lão hóa cấp tốc sau 6 tháng không có sự thay đổi đáng kể so với thời điểm ban đầu Điều này cho phép chúng ta sơ bộ kết luận rằng hệ tiểu phân nano đạt được chỉ tiêu về độ hòa tan trong thời gian theo dõi, đảm bảo tính ổn định và hiệu quả của sản phẩm.

Sau 9 tháng ở điều kiện thực tế và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc, bảng 3.49 cho thấy độ hòa tan của 3 mẫu bột phun sấy chứa tiểu phân nano Kết quả này cho phép đánh giá sự ổn định và khả năng giữ nguyên đặc tính của các mẫu bột trong thời gian dài.

60 100,1 ± 1,0 99,8 ± 1,3 100,2 ± 1,1 Giá trị f 2 so với ban đầu 70,1 74,6 70,9

60 98,3 ± 1, 6 98,3 ± 0,9 99,8 ± 0,7 Giá trị f 2 so với ban đầu 61,9 68,5 70,0

KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG

3.6.1 So sánh sinh khả dụng của hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano curcumin

Sinh khả dụng của hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano được đánh giá trên hai nhóm chuột, với các mẫu huyết tương thu được sau khi cho uống hỗn dịch chứa curcumin Các mẫu này được xử lý và định lượng theo phương pháp cụ thể, giúp xác định nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch quy ước, kết quả được trình bày chi tiết ở bảng 3.50.

Bảng 3.50 Nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch quy ước chứa curcumin

(phút) Nồng độ CUR trong huyết tương (ng/ml) GTTB ± SD

Chú thích: (*): nồng độ dưới LLOQ; (**): nồng độ cao bất thường

Kết quả phân tích nồng độ curcumin trong huyết tương chuột cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước và nhóm chuột uống hỗn dịch nano Đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước, nồng độ curcumin trong huyết tương thường thấp, thậm chí thấp hơn giới hạn định lượng dưới của phương pháp định lượng tại một số thời điểm Trong khi đó, nhóm chuột uống hỗn dịch nano có nồng độ curcumin trong huyết tương cao hơn đáng kể tại tất cả các thời điểm khảo sát, không có trường hợp nồng độ curcumin dưới giới hạn định lượng dưới Tuy nhiên, một số điểm dữ liệu bất thường đã bị loại bỏ khi xử lý thống kê và tính toán các thông số dược động học của curcumin trên cả hai nhóm chuột.

Hỗn dịch quy ước Hỗn dịch nano

Bảng 3.51 Nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano chứa curcumin

(phút) Nồng độ CUR trong huyết tương (ng/ml) GTTB ± SD

Để minh họa rõ hơn sự khác biệt về nồng độ curcumin trong huyết tương giữa hai nhóm chuột, các số liệu được biểu diễn dưới dạng đường cong nồng độ curcumin trung bình theo thời gian, giúp thể hiện kết quả một cách trực quan và dễ hiểu hơn.

Hình 3.26 Đường cong nồng độ curcumin-thời gian của hai nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano

Kết quả ở hình 3.26 cho thấy đường cong nồng độ curcumin-thời gian có sai số lớn, đặc biệt ở những thời điểm trước 60 phút Điều này là do các giá trị nồng độ tại mỗi thời điểm được thu thập từ nhiều cá thể, dẫn đến sự biến động đáng kể Tuy nhiên, tại các thời điểm 60, 120, 240 và 480 phút, đường cong nồng độ curcumin-thời gian có xu hướng ổn định hơn.

420 phút, nồng độ curcumin trong huyết tương ổn định và sai số thấp hơn giữa các cá thể

Kết quả tính toán các thông số hấp thu thuốc qua đường uống trên nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano được trình bày ở bảng 3.52, dựa trên phương pháp không dựa trên mô hình ngăn và lấy mẫu "rải rác" (sparse sampling).

Bảng 3.52 Một số thông số dược động học của curcumin trên chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nano tính toán không dựa trên mô hình ngăn

Thông số Hỗn dịch quy ước Hỗn dịch nano

AUC0240 phút (ng/ml.phút)

- Do việc lấy mẫu máu chuột là “rải rác” (sparse sampling) nên giá trị SE không được tính toán với một số thông số DĐH

- Chỉ xác định AUC 0240 phút do tại thời điểm 360 phút đối với hỗn dịch quy ước, nồng độ CUR trong huyết tương rất thấp

Kết quả nghiên cứu cho thấy hỗn dịch nano chứa curcumin có khả năng hấp thu nhanh hơn so với hỗn dịch quy ước, đạt C max sau khoảng 20 phút so với 25 phút của hỗn dịch quy ước Nồng độ thuốc cực đại trong huyết tương của hỗn dịch nano cao gấp 14,5 lần và giá trị AUC0240 phút cao gấp 8,8 lần so với hỗn dịch quy ước Điều này chứng tỏ hỗn dịch nano có khả năng cải thiện sinh khả dụng (SKD) của curcumin so với hỗn dịch quy ước, tương tự kết quả nghiên cứu của Gao Y và cộng sự.

118 tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột tại thời điểm 10 và 20 phút được trình bày ở phụ lục 8.1, 8.2, 8.3 và 8.4

3.6.2 Xác định các thông số dược động học của chất gốc curcumin và tetrahydrocurcumin trên chuột sau khi uống hỗn dịch nano curcumin Đối với nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước, nồng độ chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin (THC) rất thấp và hầu hết đều dưới nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml) Riêng đối với nhóm chuột uống hỗn dịch nano, nồng độ chất chuyển hóa THC trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano được trình bày ở bảng 3.53 Kết quả cho thấy: nồng độ chất chuyển hóa THC trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano không cao Tại một số thời điểm, nồng độ THC ở dưới giới hạn định lượng dưới

Bảng 3.53 Nồng độ chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin sau khi uống hỗn dịch nano curcumin

(phút) Nồng độ THC trong huyết tương (ng/ml)

Chú thích: (**): các chuột bị loại ở bảng 3.51

Kết quả tính toán và xử lý thống kê các thông số dược động học của CUR và chất chuyển hóa THC trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano cho thấy mô hình dược động học quần thể một ngăn có chuyển hóa là phù hợp Tuy nhiên, do sự khác nhau về khối lượng của chuột trong nhóm, một số thông số dược động học có thể bị ảnh hưởng Sử dụng phần mềm để chạy các kịch bản hiệp biến khác nhau cho thấy rằng mô hình một ngăn có chuyển hóa với hiệp biến khối lượng chuột có tác động đến thể tích phân bố, hằng số tốc độ hấp thu và hằng số tốc độ thải.

Mô hình 119 được xác định là mô hình phù hợp nhất dựa trên giá trị -2 log-likelihood và AIC nhỏ nhất Do đó, mô hình này được lựa chọn để tính toán các thông số dược động học, đảm bảo độ chính xác và tin cậy cao trong phân tích dữ liệu.

Nồng độ CUR và THC trên nhóm chuột uống hỗn dịch nano được thể hiện qua các đồ thị 3.27, 3.28, 3.29 và 3.30, cho thấy kết quả của mô hình một ngăn có chuyển hóa Các đồ thị này cung cấp thông tin chi tiết về sự thay đổi nồng độ CUR và THC trong cơ thể chuột sau khi uống hỗn dịch nano.

Hình 3.27 Đồ thị biểu diễn nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

Hình 3.28 Đồ thị dạng logarit biểu diễn nồng độ curcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

Nồng độ CUR trong huyết tương (ng/ml)

Hình 3.29 Đồ thị biểu diễn nồng độ tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

Hình 3.30 Đồ thị dạng logarit biểu diễn nồng độ tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột sau khi uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

Kết quả tính toán các thông số dược động học dựa trên mô hình đã nêu được thể hiện ở bảng 3.54

Nồng độ THC trong huyết tương (ng/ml) N ồ n g đ ộ T H C ( n g /m l)

Bảng 3.54 Báo cáo  một số thông số dược động học của curcumin và tetrahydrocurcumin trên chuột uống hỗn dịch nano dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa

Thông số DĐH Đơn vị Giá trị trung bình

Hằng số tốc độ hấp thu của chất gốc (Ka) phút -1 65,2

Thể tích phân bố của chất gốc (V) ml 49885,4 Hằng số tốc độ chuyển hóa từ chất gốc sang chất chuyển hóa (K m ) phút -1 0,00007

Hằng số tốc độ thải trừ của chất gốc (K e ) phút -1 0,003

Thể tích phân bố của chất chuyển hóa (V m ) ml 42,3

Hằng số tốc độ thải trừ của chất chuyển hóa (K em ) phút -1 36,3

Kết quả ở bảng 3.54 cho thấy quá trình chuyển hóa Curcumin (CUR) thành Tetrahydrocurcumin (THC) diễn ra thuận lợi với hằng số tốc độ chuyển hóa là 0,00007 phút-1 Quá trình chuyển hóa này dẫn đến nồng độ Curcumin trong huyết tương rất thấp, gây ra sinh khả dụng (SKD) thấp.

Mặc dù nghiên cứu còn một số hạn chế do cỡ mẫu nhỏ và sai số giữa các cá thể khác nhau, kết quả thu được đã cho thấy SKD của hỗn dịch nano bào chế cao hơn so với hỗn dịch quy ước Đồng thời, mô hình nghiên cứu cũng giúp xác định hằng số tốc độ chuyển hóa từ chất gốc curcumin sang chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin, cung cấp những thông tin ban đầu quan trọng cho lĩnh vực nghiên cứu dược học.

BÀN LUẬN

VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CURCUMIN

Curcumin là một dược chất ít tan thuộc nhóm IV trong hệ thống phân loại sinh dược học Do tính chất này, dạng thuốc dùng đường uống chứa curcumin thường gặp vấn đề về sinh khả dụng (SKD) do bị chuyển hóa và thải trừ nhanh Để cải thiện SKD của curcumin, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào hai hướng: tăng độ tan và tốc độ hòa tan, cũng như giảm chuyển hóa và thải trừ Trong đó, hướng nghiên cứu tăng độ tan và tốc độ hòa tan được áp dụng phổ biến hơn, thông qua các biện pháp như bào chế dưới dạng hệ phân tán rắn, hệ nano tinh thể, micel chất diện hoạt, hệ tự nhũ hóa, vi nhũ tương, nhũ tương nano Đặc biệt, hệ tiểu phân nano tinh thể nổi bật với nhiều ưu điểm và dễ dàng ứng dụng vào các dạng thuốc rắn dùng đường uống.

Hệ tiểu phân nano được bào chế bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân, kết hợp kỹ thuật nghiền bi siêu mịn và đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn, mang lại khả năng ứng dụng thực tế trong sản xuất Quá trình nghiền giúp phân chia tiểu phân dược chất thành các tiểu phân kích thước nhỏ hơn, tiếp xúc với môi trường nước chứa chất diện hoạt và polyme thân nước, từ đó có thể xảy ra hiện tượng hòa tan từ bề mặt tiểu phân tạo dung dịch bão hòa Đồng thời, quá trình tái kết tinh dược chất cũng có thể xảy ra, giúp hệ tiểu phân nano thu được tồn tại một phần ở trạng thái kết tinh với kích thước tiểu phân (KTTP) giảm xuống dưới 500 nm Nhờ đó, hệ tiểu phân nano có thể cải thiện đáng kể độ tan và độ hòa tan của curcumin.

VỀ BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN

Công nghệ nano đã được nghiên cứu hơn 50 năm qua với hàng loạt công trình nghiên cứu được công bố trên toàn cầu, nhưng số lượng sản phẩm bào chế bằng công nghệ nano được ứng dụng trên lâm sàng vẫn còn hạn chế Nguyên nhân của tình trạng này có thể đa dạng, nhưng yếu tố quan trọng nhất là mỗi dược chất (DC) sở hữu những đặc tính và khả năng ứng dụng vào dạng thuốc nano riêng biệt.

Quy trình nghiên cứu bào chế dạng nano đối với một dược chất (DC) bất kỳ thường phụ thuộc vào nhiều yếu tố đa dạng, bao gồm công thức và kỹ thuật bào chế Các yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định thành công của quá trình bào chế nano, đòi hỏi sự tính toán và tối ưu hóa cẩn thận để đạt được kết quả mong muốn.

Trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano, chất diện hoạt được nghiền ướt trực tiếp cùng với curcumin (DC), giúp tập trung chất diện hoạt ở bề mặt phân cách pha cao Sự có mặt của chất diện hoạt làm giảm đáng kể kích thước tiểu phân (KTTP) bằng cách giảm sức căng bề mặt phân cách pha rắn-lỏng và giảm tính sơ nước của curcumin, từ đó giúp curcumin dễ dàng phân tán vào môi trường lỏng Đồng thời, chất diện hoạt cũng có thể tạo micel, làm tăng độ tan của curcumin trong môi trường lỏng.

Sự có mặt của chất diện hoạt trong dạng thuốc dùng đường uống giúp tăng tính thấm qua đường tiêu hóa Chất diện hoạt kết hợp vào lớp lipid kép của màng tế bào, làm thay đổi tính phân cực của màng tế bào, giảm sức căng bề mặt và tăng khả năng thấm của dược chất qua màng tế bào biểu mô Ngoài ra, chất diện hoạt còn tác động làm tăng thấm qua đường kẽ tế bào và ức chế trung gian P-gp, từ đó tăng hấp thu dược chất Trong nghiên cứu này, sự có mặt của chất diện hoạt Tween 80 đã giúp hỗn dịch nano bào chế từ hệ tiểu phân nano có khả năng thấm qua màng sinh học cao hơn so với hỗn dịch quy ước.

Nghiên cứu này đã khảo sát ảnh hưởng của một số chất diện hoạt đến đặc tính tiểu phân nano Kết quả cho thấy chỉ có Poloxame 188 có nhiệt độ nóng chảy cao, trong khi các chất diện hoạt còn lại có nhiệt độ nóng chảy thấp Điều này gây khó khăn cho quá trình làm khô bằng phương pháp phun sấy, vì thể chất lỏng của chất diện hoạt có thể ảnh hưởng đến thể chất bột phun sấy, đồng thời hạn chế việc sử dụng chất diện hoạt trong quá trình này.

Nồng độ chất diện hoạt quá cao có thể tạo ra các micel, đóng vai trò như chất kết dính giữa tiểu phân và thúc đẩy hình thành kết tụ trong hỗn dịch Do đó, tỷ lệ chất diện hoạt cần được nghiên cứu khảo sát cẩn thận để đảm bảo đủ để bào chế hệ tiểu phân nano có kích thước tiểu phân (KTTP) đạt yêu cầu mà không ảnh hưởng đến thể chất khối bột Trong nghiên cứu này, Tween 80 được lựa chọn là chất diện hoạt với phần đuôi kỵ nước dài chứa các liên kết chưa bão hòa, giúp hấp phụ lên bề mặt tiểu phân.

DC và phần đầu lớn tạo ra hàng rào năng lượng không gian ngăn cản hiện tượng kết tụ Tuy nhiên, Tween 80 có nhược điểm là tạo ra lớp hấp phụ mỏng trên bề mặt tiểu phân, dẫn đến sự ổn định không gian giữa các tiểu phân kém hiệu quả hơn so với các polyme khối lượng phân tử lớn Để giải quyết hạn chế này, nghiên cứu này đã phối hợp Tween 80 với một polyme thân nước để cải thiện hiệu quả ổn định.

Quá trình bào chế dạng hỗn dịch nano tạo ra diện tích bề mặt lớn, dẫn đến diện tích liên bề mặt lớn, làm thay đổi năng lượng tự do Gibbs Điều này khiến hỗn dịch nano kém ổn định về mặt nhiệt động học và có xu hướng giảm tổng năng lượng bằng cách kết tụ trở lại Quá trình kết tụ phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa, và năng lượng này bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của polyme ổn định, quyết định sự ổn định của hỗn dịch nano.

Các polyme đóng vai trò quan trọng trong việc giảm kết tụ tiểu phân bằng cách tạo ra sự cồng kềnh về không gian và tích điện bề mặt tiểu phân, giúp ổn định hỗn dịch nano Việc kết hợp chất diện hoạt với polyme có thể hỗ trợ hiệu quả khả năng ổn định hỗn dịch nano, mang lại hiệu quả cao trong ứng dụng thực tế.

Mặc dù có nhiều công trình nghiên cứu về dạng bào chế hỗn dịch nano, việc đánh giá và so sánh khả năng của các polyme trong việc ổn định hỗn dịch nano vẫn còn hạn chế Theo thuyết DLVO, sự kết hợp của polyme thân nước và chất diện hoạt tạo ra hàng rào năng lượng, ngăn chặn quá trình kết tụ Ostwald và tăng độ ổn định cho hỗn dịch nano Ngoài ra, sự có mặt của các polyme còn làm tăng độ nhớt và năng lượng biến dạng cần thiết để phá vỡ tiểu phân, từ đó góp phần ổn định hệ thống.

Nghiên cứu của luận án đã tập trung khảo sát ảnh hưởng của một số polyme phổ biến như PVP, PVA và Na CMC đến quá trình hình thành và độ ổn định của hỗn dịch nano, nhằm tìm ra giải pháp tối ưu cho việc tạo ra hỗn dịch nano có tính ổn định cao.

Kết quả đánh giá KTTPTB, PVP và PVA không ảnh hưởng đến KTTPTB của nano curcumin, trong khi đó Na CMC lại làm tăng KTTPTB Sự hiện diện của Na CMC, một polyme có khối lượng phân tử lớn khoảng 90 kDa và tích điện âm, có thể ổn định nano curcumin thông qua cơ chế kết hợp cả ổn định không gian và ổn định điện tích Tuy nhiên, Na CMC lại tạo cầu nối polyme, dẫn đến xu hướng hình thành tiểu phân kết tụ lớn, do đó không phải là lựa chọn thích hợp cho nano curcumin.

Trong nghiên cứu này, PVP đã được lựa chọn để kết hợp với Tween 80 nhằm ổn định hỗn dịch nano Mặc dù PVP K30 có chiều dài chuỗi ngắn hơn so với các polyme khác, nhưng nó vẫn được sử dụng do khả năng tạo ra hệ tiểu phân nano ổn định Tuy nhiên, PVP có nhược điểm là hút ẩm mạnh, ảnh hưởng đến độ ổn định của hệ tiểu phân nano Để khắc phục điều này, nghiên cứu đã xác định tỷ lệ PVP tối thiểu cần thiết để đạt được mục tiêu tăng tốc độ và mức độ hòa tan curcumin.

Khi sử dụng buồng nghiền với bi zirconi oxyd, tiểu phân DC có thể được nghiền đồng thời với dung dịch chất ổn định Tuy nhiên, một số tác giả cho rằng việc thêm chất diện hoạt và polyme vào giai đoạn đầu của quá trình nghiền ướt sẽ dẫn đến độ nhớt của hỗn dịch lỏng tăng, tốn năng lượng để nghiền ướt trong giai đoạn đầu.

Khi đưa vào giai đoạn nghiền ướt, việc thêm dung dịch chất diện hoạt và polyme ngay từ đầu đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định kích thước tiểu phân và hạn chế hiện tượng kết tụ Sự hấp phụ của chất diện hoạt và polyme lên bề mặt tiểu phân cần thời gian đủ để đảm bảo hầu hết bề mặt được bao bọc, giúp hình thành tiểu phân nano curcumin hiệu quả Việc thêm chất diện hoạt và polyme vào giai đoạn đầu là bước quan trọng trong quá trình tạo ra tiểu phân nano curcumin chất lượng cao.

VỀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO

4.3.1 Cấu trúc của hệ tiểu phân nano

Hệ tiểu phân nano sau khi bào chế có cấu trúc gần hình cầu, với curcumin được phân tán vào bên trong cấu trúc của polyme thân nước PVP Quá trình tạo cấu trúc này bao gồm việc PVP nóng chảy, gel hóa và đông tụ lại, "nhốt" tiểu phân curcumin vào trong Do sự tạo phức với PVP, một phần hệ tiểu phân chuyển sang dạng vô định hình, khiến việc xác định kích thước tiểu phân theo thuyết BET trở nên không khả thi Cấu trúc này tương tự như cấu trúc của tiểu phân nano raloxifen trong các nghiên cứu trước đây.

So sánh với hệ tiểu phân nano curcumin bào chế bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao của Rachmawati H và cộng sự, nghiên cứu này cho thấy sự khác biệt về hình dạng và kích thước của tiểu phân nano curcumin Nguyên liệu curcumin ban đầu ở dạng tinh thể hình kim với kích thước lớn, sau khi bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano, các tinh thể hình kim biến mất và chỉ còn lại các tiểu phân gần hình cầu Tuy nhiên, có khả năng tiểu phân nano curcumin bị kết tinh trở lại sau khi rửa loại tá dược bằng nước, làm tăng kích thước tiểu phân nano so với trước khi rửa.

4.3.2 Kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán

Kích thước tiểu phân là một trong những đặc điểm quan trọng của tiểu phân nano, ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất và ứng dụng của chúng Kích thước tiểu phân của hỗn dịch nano có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau, giúp đánh giá chính xác tính chất và hiệu suất của tiểu phân nano.

134 kỹ thuật phân tích khác nhau như nhiễu xạ laze, phổ tương quan photon (tán xạ laze), đếm tiểu phân và kính hiển vi điện tử quét

Kích thước tiểu phân trung bình (KTTP) của hỗn dịch nano thu được bằng phương pháp nhiễu xạ laze và phổ tương quan photon có sự khác biệt do cách thức đo lường khác nhau Phương pháp nhiễu xạ laze dựa trên thể tích và đường kính trung bình, trong khi phổ tương quan photon biểu diễn kích thước theo cường độ ánh sáng Kết quả cho thấy kích thước tiểu phân đo bằng phương pháp nhiễu xạ laze thường cao hơn so với phương pháp tương quan photon, thậm chí cao gấp đôi như nhận định của Sepassi S và cộng sự Tuy nhiên, mỗi phương pháp có ưu điểm riêng, phương pháp đếm tiểu phân cho số lượng chính xác tiểu phân trên một đơn vị thể tích, còn phương pháp nhiễu xạ laze xác định khoảng KTTP rộng với giá trị trung bình trong khoảng nano, thao tác nhanh và chính xác.

Nghiên cứu này lựa chọn phương pháp xác định kích thước tiểu phân (KTTP) bằng nhiễu xạ laze cho giai đoạn nghiền khô và nghiền ướt, và phương pháp tán xạ laze cho giai đoạn đồng nhất hóa Để chuẩn bị mẫu, cần phân tán mẫu thử trong môi trường đến mức độ che mờ chấp nhận được cho phương pháp nhiễu xạ laze, và pha loãng mẫu thử đến tốc độ đếm tiểu phân nằm trong khoảng 150-250 kcps cho phương pháp tán xạ laze Việc phân tán mẫu thử trong nước chứa Tween 80 với nồng độ thấp 0,1% giúp tránh kết tụ tiểu phân trong quá trình nghiền khô.

Các nghiên cứu về nano curcumin sau phun sấy cho thấy chất này phân tán nhanh và không bị kết tụ trong môi trường nước Do đó, để chuẩn bị mẫu thử, người ta thường pha loãng hỗn dịch hoặc phân tán bột phun sấy chứa nano curcumin trong môi trường nước Một số nghiên cứu còn tiến hành pha loãng mẫu thử trong môi trường bão hòa hoàn toàn hoặc bão hòa một phần để xác định khả năng tương thích của nano curcumin.

Tuy nhiên, nghiên cứu này cho thấy khả năng tương thích sinh học (KTTP) của nano curcumin không bị ảnh hưởng bởi môi trường pha loãng, do đó nước được lựa chọn làm môi trường phân tán để đảm bảo tính ổn định và hiệu quả của nano curcumin.

Kết quả xác định kích thước tiểu phân (KTTP) có thể được biểu diễn dưới dạng phân bố KTTP theo thể tích hoặc theo khối lượng Trung bình momen thể tích là thông số được lựa chọn ưu tiên do đặc tính nhạy cảm cao với sự có mặt của các tiểu phân kích thước lớn trong mẫu Điều này cho phép xác định sự tồn tại của các tiểu phân kích thước lớn trong hỗn dịch nano, ngay cả khi số lượng tiểu phân nhỏ nhưng khối lượng của chúng tương đối lớn.

Việc so sánh kích thước tiểu phân trung bình (KTTP) giữa các nghiên cứu khác nhau phụ thuộc vào phương pháp xác định và thông số quang học lựa chọn Sự thay đổi thông số quang học ảnh hưởng đến KTTP và chỉ số phân tán (PDI) Hơn nữa, sự hiện diện của tiểu phân kích thước nhỏ và lớn trong mẫu cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả đo, đặc biệt khi kỹ thuật phân tích chỉ phù hợp với tiểu phân kích thước nhỏ Do đó, sự khác biệt về KTTP và PDI giữa các nghiên cứu hoặc các lần thực nghiệm khác nhau có thể do nhiều yếu tố chưa rõ ràng.

Kết quả nghiên cứu của luận án chỉ ra rằng hệ tiểu phân nano được bào chế với quy mô 5 gam/mẻ sở hữu các đặc tính về kích thước tiểu phân (KTTPTB) và chỉ số phân bố kích thước (PDI) nằm trong khoảng 300-500 nm và 0,30-0,55 trước và sau quá trình phân tán, cao hơn so với các mẫu bào chế ở quy mô nhỏ hơn.

Kích thước tiểu phân nano curcumin trong nghiên cứu này là khoảng 1 gam/mẻ, nhỏ hơn so với kết quả nghiên cứu của Rachmawati H và cộng sự, với kích thước tiểu phân nano curcumin khoảng 500-700 nm, nhưng lớn hơn so với kết quả nghiên cứu của Gao Y và cộng sự, với kích thước tiểu phân nano khoảng 210,2 nm.

Một số nghiên cứu khác đã báo cáo các giá trị KTTPTB khác nhau cho nano curcumin, chẳng hạn như nghiên cứu của Shaikh J và cộng sự với giá trị KTTPTB khoảng 334 nm và chỉ số phân bố kích thước (PDI) là 0,25, trong khi một nghiên cứu khác có thông số quang học khác với giá trị hệ số phản xạ là 1,5.

Phân tích trên cho thấy phương pháp tán xạ laze không phù hợp khi phân tích mẫu chứa cả tiểu phân kích thước lớn và nhỏ Để xác định kích thước tiểu phân (KTTP) của mẫu chứa tiểu phân kích thước lớn hơn ở giới hạn micro, có thể sử dụng thiết bị Mastersizer 3000E hoặc kỹ thuật SEM Thực tế, các tiểu phân có kích thước tương đối lớn hơn thường được quan sát bằng kỹ thuật SEM Do đó, KTTP thường được phân tích kết hợp bằng cả hai kỹ thuật tán xạ laze và chụp SEM để đảm bảo độ chính xác.

Khi đánh giá giá trị kích thước tiểu phân (KTTP), hệ số đa phân tán (PDI) là một thông số quan trọng không thể bỏ qua Giá trị PDI càng thấp cho thấy độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano càng cao, đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, các tiểu phân nano được bào chế có kích thước phân bố khá lớn, đây cũng là một hạn chế của phương pháp phân chia tiểu phân từ kích thước lớn xuống kích thước nano.

4.3.3 Phổ nhiễu xạ tia X và giản đồ nhiệt vi sai của hệ tiểu phân nano Đối với một số DC, quá trình chuyển sang dạng tiểu phân kích thước nano có thể làm thay đổi trạng thái kết tinh hoặc tạo dạng đa hình Kết quả của nghiên cứu ở mục 3.4.3.4 cho thấy: khi chuyển sang dạng nano, curcumin vẫn tồn tại ở trạng thái kết tinh nhưng tỷ lệ kết tinh đã giảm đi so với ban đầu

VỀ ĐỘ ỔN ĐỊNH

Việc bào chế hệ tiểu phân nano với các đặc tính mong muốn đã là một thách thức, nhưng việc giữ được ổn định những đặc tính ấy trong thời gian bảo quản lại càng khó khăn hơn nhiều Trong nghiên cứu của luận án, độ ổn định của hỗn dịch nano chỉ được theo dõi sau khi bào chế, do đó việc đánh giá và duy trì độ ổn định của hệ tiểu phân nano trong thời gian dài là vô cùng quan trọng.

Sau 24 giờ bào chế, hỗn dịch được chuyển sang dạng bột phun sấy, do đó nghiên cứu tập trung vào đánh giá độ ổn định của bột phun sấy chứa tiểu phân nano dưới tác động của các yếu tố môi trường như nhiệt độ và độ ẩm, cũng như các yếu tố thuộc về chế phẩm thuốc như tính chất hóa lý của dược chất và tá dược, dạng bào chế, thành phần, quy trình bào chế, mức độ kín và bản chất của bao bì đóng gói trực tiếp.

Hệ tiểu phân nano được đóng gói trong vỏ nang cứng, ép vỉ nhôm-nhôm và đựng trong hộp giấy để đánh giá độ ổn định dưới tác động của các yếu tố môi trường Tuy nhiên, nếu muốn duy trì độ ổn định cao, lựa chọn lọ thủy tinh kín và tránh ánh sáng là phương án tốt nhất Kết quả cho thấy hệ tiểu phân nano được theo dõi trong hai điều kiện lão hóa cấp tốc và điều kiện thực trong khoảng thời gian từ 6 đến 9 tháng.

Về hàm lượng curcumin, mỗi viên nang chứa khoảng 40 mg curcumin, tương ứng với khối lượng bột phun sấy chứa hệ tiểu phân nano curcumin khoảng 94,8 mg

So với các chế phẩm chứa nano curcumin trên thị trường, nghiên cứu này đã tạo ra chế phẩm có hàm lượng curcumin cao hơn trong mỗi viên nang Cụ thể, chế phẩm Curma Gold chứa 150 mg nano curcuminoid, nhưng chỉ có khoảng 20% là curcuminoid, tương đương khoảng 23 mg curcumin thực tế Trong khi đó, nghiên cứu đã chứng minh rằng bột phun sấy chứa tiểu phân nano curcumin ổn định về hình thái, kích thước, đặc tính kết tinh, mất khối lượng và độ hòa tan trong thời gian dài Điều này cho phép bột phun sấy chứa tiểu phân nano curcumin có thể được đóng trong viên nang cứng và bảo quản trong bao bì vỉ nhôm-nhôm và hộp giấy.

VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO

4.5.1 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng

4.5.1.1 Đối tượng thử, mô hình dược động học và liều dùng

Một số nghiên cứu SKD đường uống của curcumin được tiến hành trên chuột cống [39], [42], [55], [87] hoặc chuột nhắt [30], [32], [76], [111]

Chuột cống thí nghiệm tại Việt Nam thường có sự khác biệt lớn về khối lượng, chế độ nuôi dưỡng, tình trạng sức khỏe và tuổi, dẫn đến kết quả khảo sát nồng độ curcumin sau khi uống không đồng nhất giữa các cá thể và lần thử nghiệm Ngược lại, chuột nhắt là đối tượng có sự đồng nhất cao về tuổi, chế độ nuôi dưỡng và tình trạng sức khỏe, đồng thời có khối lượng cơ thể nhỏ hơn nhiều so với chuột cống Do đó, chuột nhắt được lựa chọn làm đối tượng thử nghiệm trong điều kiện thực nghiệm.

Về thời điểm lấy mẫu, nghiên cứu của luận đã khảo sát các thời điểm lấy mẫu thích hợp tại 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 120, 240 và 360 (hoặc 420 phút)

Do chuột nhắt khá nhỏ nên không thể lấy máu nhiều lần trên cùng một cá thể Đồng

142 thời, sau khi lấy máu, sức khỏe chuột không còn tốt Do đó, mỗi chuột được lấy máu một lần tại một thời điểm

Về mô hình ngăn, một số nghiên cứu dược động học của curcumin không dựa trên mô hình ngăn tiến hành trên chuột cống [46], [52], [91] hoặc chuột nhắt [30],

[76], hoặc dựa trên mô hình một ngăn trên chuột cống [110] hoặc chuột nhắt [32],

Nghiên cứu này sử dụng mô hình một ngăn có chuyển hóa trên quần thể để tính toán các thông số dược động học liên quan đến chuyển hóa của hỗn dịch nano và hỗn dịch quy ước Mô hình này có ưu điểm nổi trội so với mô hình cá thể, nhưng cũng đòi hỏi số lượng lớn cá thể để phân tích thống kê dược động học phức tạp Tuy nhiên, do số lượng cá thể trong mỗi nhóm tương đối ít, nghiên cứu chỉ xác định các thông số dược động học dựa trên mô hình một ngăn có chuyển hóa Đối với dược chất ít tan, trạng thái no hoặc đói có thể ảnh hưởng đến sinh khả dụng (SKD) của thuốc, nhưng khi thiết kế dưới dạng hệ phân tán đồng nhất của các tiểu phân kích thước nano, sự sai khác về SKD do trạng thái no hoặc đói có thể được giảm đến mức tối thiểu.

[17] Vì vậy, nghiên cứu này tiến hành thử trên chuột ở trạng thái đói

Về liều dùng, trong nghiên cứu về SKD của hỗn dịch nano curcumin của Gao

Y và cộng sự, liều dùng trên chuột nhắt khoảng 250 mg/kg cân nặng [30] Trong nghiên cứu của Zhongfa L và cộng sự, nhũ tương nano curcumin được đánh giá

SKD trên chuột nhắt với liều khá cao 1,8 g/kg [115] Trong nghiên cứu của luận án, mức liều được lựa chọn là 500 mg/kg

Vị trí lấy máu trên chuột có thể ở tĩnh mạch đuôi, hốc mắt hoặc tĩnh mạch cổ Tuy nhiên, lấy máu tại tĩnh mạch đuôi thường không đủ để xử lý mẫu, trong khi lấy máu tại hốc mắt có ưu điểm hơn vì dễ thực hiện và có thể lấy được thể tích máu lớn trong thời gian ngắn Phương pháp lấy máu tại hốc mắt phù hợp với các thời điểm lấy mẫu của nghiên cứu, nhưng cần tránh lấy máu trên cùng cá thể nhiều lần để đảm bảo đánh giá được xu hướng hấp thu của DC và sức khỏe của chuột Do đó, trong nghiên cứu, máu được lấy tại chỉ một thời điểm trên mỗi chuột để đảm bảo kết quả chính xác và sức khỏe của chuột.

4.5.1.3 Phương pháp xử lý mẫu

Quá trình chiết DC từ dịch sinh học có thể được thực hiện bằng các phương pháp khác nhau, bao gồm chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn hoặc tủa protein trong huyết tương Tuy nhiên, phương pháp chiết pha rắn đòi hỏi các cột chứa chất mang tương đối đắt tiền, trong khi thể tích huyết tương mỗi lần phân tích khá nhỏ (100 l) và hàm lượng curcumin và chất chuyển hóa THC thấp Do đó, việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác của quá trình chiết DC.

DC làm giảm nồng độ DC trong mẫu Đồng thời, nếu tủa protein, nền mẫu còn chứa

Quá trình phân tích mẫu huyết tương có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều tác nhân gây hiệu ứng nền khi đồng rửa giải, làm cản trở khả năng ion hóa của chất cần phân tích ở nguồn ion hóa Để giải quyết vấn đề này, phương pháp chiết lỏng-lỏng được áp dụng để xử lý mẫu huyết tương, với lựa chọn dung môi chiết phù hợp để đạt hiệu suất cao nhất So với kỹ thuật chiết pha rắn, kỹ thuật chiết lỏng-lỏng bằng dung môi hữu cơ đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt và dễ dàng triển khai tại nhiều phòng thí nghiệm Ngoài ra, việc sử dụng dung môi tert-butyl methyl ether cho nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi chất cần phân tích cao và ổn định, giúp tăng nồng độ chất cần phân tích trong mẫu định lượng và thuận lợi cho việc phân tích.

Khi được hấp thu qua đường uống, curcumin sẽ bị chuyển hóa mạnh qua gan ở cả người tình nguyện và chuột thí nghiệm, tạo ra nhiều sản phẩm chuyển hóa quan trọng như tetrahydrocurcumin, curcumin glucuronid và tetrahydrocurcumin glucuronid Việc xác định nồng độ của các chất chuyển hóa này có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả điều trị của curcumin trên lâm sàng.

Phần lớn các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) của curcumin trên thế giới chỉ tập trung vào việc định lượng curcumin trong huyết tương Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã tiến hành định lượng cả curcumin và các chất chuyển hóa của nó trong huyết tương Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất chuyển hóa chính của curcumin, bao gồm curcumin-O-glucuronid, THC và curcumin-O-sulfat, có thể được phát hiện trong huyết tương sau khi uống liều curcumin Để định lượng các sản phẩm chuyển hóa dạng liên hợp, cần phải có chất chuẩn hoặc sử dụng enzym β-glucuronidase và sulfatase để chuyển dạng liên hợp về dạng tự do.

Phản ứng thủy phân trước khi phân tích có thể gây phức tạp và tốn thời gian, đồng thời ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp phân tích do hiệu suất phản ứng phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong nghiên cứu này, việc định lượng đồng thời curcumin và sản phẩm chuyển hóa THC đã được thực hiện, nhưng vẫn chưa thể định lượng được một số dạng liên hợp của curcumin trong huyết tương, dẫn đến kết quả định lượng curcumin trong huyết tương khá thấp.

4.5.1.5 Phương pháp phân tích curcumin trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS

Curcumin có đặc tính sinh khả dụng (SKD) thấp và bị chuyển hóa mạnh thành tetrahydrocurcumin (THC), khiến việc phân tích và định lượng curcumin và THC trong huyết tương chuột trở nên khó khăn hơn so với phân tích trong chế phẩm thuốc Tuy nhiên, phương pháp LC-MS/MS được áp dụng trong luận án đã chứng minh khả năng phân tích đồng thời curcumin và THC trong huyết tương ở nồng độ rất thấp (tới 0,5 ng/ml) với độ đúng và độ chính xác cao Phương pháp này có ưu điểm phát hiện đồng thời curcumin và THC mà không cần yêu cầu tách riêng hai chất này So với các phương pháp HPLC và LC-MS/MS khác, phương pháp này có giới hạn định lượng dưới thấp hơn nhiều, cho phép xác định nồng độ curcumin và THC trong các mẫu huyết tương chuột ở xa thời điểm dùng thuốc, ứng dụng phù hợp trong các nghiên cứu SKD.

Việc sử dụng chuẩn nội không chỉ mang lại lợi ích về mặt hiệu quả và tiết kiệm thời gian, mà còn giúp giảm thiểu sai số trong quá trình phân tích, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy cao hơn.

Quá trình xác định 146 tích DC trong dịch sinh học không thể thực hiện trực tiếp mà đòi hỏi phải xử lý mẫu và chiết tách DC khỏi mẫu Độ thu hồi DC phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong quá trình chiết tách phức tạp này Vì vậy, việc sử dụng chuẩn nội trong phương pháp phân tích là cần thiết để đảm bảo độ chính xác Chuẩn nội được pha loãng trong hỗn hợp dung môi methanol và nước theo tỷ lệ 1:1 để giảm tỷ lệ methanol và tránh làm kết tủa huyết tương khi phối hợp.

Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp phân tích CUR và THC trong huyết tương đáp ứng các yêu cầu chung của FDA về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học, với tính thích hợp, tính đặc hiệu, độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày, cũng như độ ổn định cao.

Các chế phẩm "nano curcumin" hiện có trên thị trường thường chứa hỗn hợp curcuminoid kết hợp với piperin, trong đó curcumin chiếm khoảng 77% Sự kết hợp này giúp cải thiện sinh khả dụng (SKD) của sản phẩm Tuy nhiên, điều này cũng khiến các chế phẩm này không thể sử dụng làm chế phẩm đối chiếu Một số sản phẩm bột phun sấy nano curcumin có curcumin làm thành phần chính, nhưng khi đánh giá kích thước và hình thái trên thiết bị đo Zetasizer Nano ZS90 Malvern và ảnh chụp SEM, kích thước tiểu phân của các mẫu này khá lớn, trên 100nm.

1000 nm) Vì vậy, trong nghiên cứu này, hỗn dịch quy ước bào chế từ nguyên liệu curcumin ban đầu được lựa chọn là chế phẩm đối chiếu

Curcumin là một dược chất ít tan trong nước, khiến việc hấp thụ trở nên khó khăn khi sử dụng đường uống Do đó, curcumin cần được phân tán đồng đều trong môi trường phân tán để đảm bảo hiệu quả Trong nghiên cứu này, curcumin được tạo hỗn dịch quy ước trong môi trường phân tán chứa CMC 0,2% và được khuấy từ liên tục trong thời gian cho chuột uống, giúp các tiểu phân được gây thấm và phân tán đồng đều.

4.5.2 Nghiên cứu đánh giá SKD in vivo

Nghiên cứu SKD của hỗn dịch nano curcumin đã được tiến hành trên chuột nhắt bởi Gao Y và cộng sự dựa trên hai nhóm chuột, mỗi nhóm gồm 27 chuột [30]

Nghiên cứu này có số lượng chuột, số thời điểm lấy mẫu và số mẫu lấy tại một thời điểm nhiều hơn so với nghiên cứu của Gao Y và cộng sự, giúp tăng độ chính xác và đáng tin cậy của kết quả thu được.

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin thông qua phương pháp giảm kích thước tiểu phân bằng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn Phương pháp bào chế này không chỉ đơn giản mà còn dễ dàng áp dụng, giúp nó có thể được ứng dụng rộng rãi trong điều kiện thực tiễn ở Việt Nam, mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe mới.

Nghiên cứu đã xây dựng thành công mô hình đánh giá sinh khả dụng (SKD) của bột phun sấy chứa hệ tiểu phân nano curcumin dùng đường uống trên chuột thí nghiệm, một phương pháp khả thi và có thể áp dụng cho các nghiên cứu đánh giá SKD đường uống của hệ tiểu phân nano khác Phương pháp đánh giá SKD dựa trên việc định lượng đồng thời chất gốc curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột bằng kỹ thuật LC-MS/MS đã được xây dựng và thẩm định tại Việt Nam, cho phép xác định nồng độ các chất trong dịch sinh học với độ nhạy và đặc hiệu cao Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ tiểu phân nano đã cải thiện sinh khả dụng đường uống của curcumin bằng cách tăng độ tan, tốc độ hòa tan và tính thấm của curcumin Đồng thời, nghiên cứu cũng xác định được hằng số tốc độ chuyển hóa của chất gốc curcumin sang chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trên chuột thí nghiệm, tạo tiền đề cho các nghiên cứu dược động học của curcumin trên người.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

1 Về xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin

Trong nội dung thực nghiệm của đề tài, nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc bào chế hệ tiểu phân nano curcumin với liều lượng 5g/mẻ thông qua công thức bào chế tối ưu bao gồm: curcumin 5,00g, Tween 80 0,60g, PVP K30 3,75g, manitol 2,50g và 125ml nước tinh khiết.

Hỗn dịch nano được bào chế thông qua phương pháp giảm kích thước tiểu phân bằng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa Quá trình này được thực hiện với các thông số cụ thể, bao gồm thời gian nghiền khô 6 giờ và tần số 30 Hz trong buồng nghiền bi inox, tiếp theo là thời gian nghiền ướt 4 giờ và tần số 30 Hz trong buồng nghiền bi zirconi oxyd với kích thước bi 0,8 mm Sau đó, hỗn dịch được đồng nhất hóa ở tốc độ 18000 vòng/phút trong 60 phút Cuối cùng, hỗn dịch nano được tạo ra thông qua quá trình phun sấy với nhiệt độ khí vào là 96 độ C và tốc độ phun dịch 2 ml/phút.

Hệ tiểu phân nano curcumin được duy trì ở dạng bột phun sấy với kích thước trung bình khoảng 336,7 ± 18,6 nm và hệ số phân tán 0,387 ± 0,032 Curcumin được phân tán trong chất mang PVP, giúp cải thiện đáng kể tốc độ hòa tan so với nguyên liệu ban đầu Dạng bột phun sấy này có tỷ lệ mất khối lượng do làm khô khoảng 9,35% và khối lượng riêng biểu kiến khoảng 0,329 ± 0,024 g/ml Đặc biệt, hệ tiểu phân nano này ổn định về hình thái, kích thước, đặc tính kết tinh, mất khối lượng do làm khô, hàm lượng curcumin và độ hòa tan curcumin trong thời gian dài, cụ thể là 9 tháng ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc.

2 Về đánh giá sinh khả dụng của hệ tiểu phân nano

Việc đánh giá sinh khả dụng (SKD) của thuốc nghiên cứu trên chuột thí nghiệm đã chứng tỏ hệ tiểu phân nano có khả năng cải thiện đáng kể SKD của curcumin Kết quả nghiên cứu bước đầu này cũng chứng minh được sự chuyển hóa từ chất gốc curcumin sang chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trên chuột dùng đường uống, cho thấy tiềm năng ứng dụng của hệ tiểu phân nano trong việc tăng cường hiệu quả của curcumin.

Hoàn thiện quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin là một bước tiến quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng của nguyên liệu này Việc nâng quy mô lô mẻ sẽ giúp tăng cường khả năng sản xuất và cung cấp nano curcumin cho các dạng bào chế khác nhau Đây là hướng đi quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm ứng dụng nano curcumin, mang lại lợi ích cho sức khỏe con người và đóng góp vào sự phát triển của ngành công nghiệp dược phẩm.

- Đánh giá độ ổn định dài hạn của hệ tiểu phân nano curcumin.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Dương Thị Hồng Ánh, Nguyễn Đình Hà, Nguyễn Trần Linh (2015), “Tối ưu hóa công thức và một số thông số trong quy trình bào chế tiểu phân nano curcumin”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 6, số 2, trang 2-

2 Dương Thị Hồng Ánh, Thái Thị Hồng Anh, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Trần Linh (2016), “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5 gam/mẻ”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 7, số 6, trang 28-

3 Dương Thị Hồng Ánh, Hoàng Văn Đức, Lê Thị Thu Huyền, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Trần Linh (2017), “Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời curcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột”, Tạp chí Dược học, tập 57, số

Tiêu đề	Nghiên Cứu Bào Chế Hệ Tiểu Phân Nano Nhằm Tăng Sinh Khả Dụng Của Curcumin Dùng Theo Đường Uống
Tác giả	Dương Thị Hồng Ánh
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Trần Linh, PGS.TS. Nguyễn Văn Long
Trường học	Trường Đại Học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Công Nghệ Dược Phẩm Và Bào Chế Thuốc
Thể loại	luận án
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	236
Dung lượng	10,6 MB