Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano nhằm tăng sinh khả dụng của curcumin dùng theo đường uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ n c TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ượ c họ DƯƠNG THỊ HỒNG ÁNH sĩ D NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ tiế n HỆ TIỂU PHÂN NANO NHẰM TĂNG án SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN Lu ận DÙNG THEO ĐƯỜNG UỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯƠNG THỊ HỒNG ÁNH họ c NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ ượ c HỆ TIỂU PHÂN NANO NHẰM TĂNG sĩ D SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN tiế n DÙNG THEO ĐƯỜNG UỐNG án LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Lu ận CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 62720402 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trần Linh PGS.TS Nguyễn Văn Long HÀ NỘI, NĂM 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Lu ận án tiế n sĩ D ượ c họ c Dương Thị Hồng Ánh LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: TS Nguyễn Trần Linh PGS TS Nguyễn Văn Long Những người thầy nhiệt tình hướng dẫn hết lịng giúp đỡ tơi thời gian làm luận án vừa qua Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Võ Xuân Minh, PGS TS Nguyễn Đăng Hòa, PGS.TS Phạm Ngọc Bùng, PGS TS Phạm Thị Minh Huệ, PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến tồn thể thầy giáo, kỹ thuật viên Bộ môn c Bào chế Bộ môn Công nghiệp Dược nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi c Độ thầy cô giáo Bộ môn Dược lý họ cho tơi hồn thành luận án Tôi xin cảm ơn giúp đỡ KTV Đinh Đại ượ Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm tương đương sinh học-Viện kiểm nghiệm D thuốc trung ương, Khoa Hóa học-Trường Đại học khoa học tự nhiên-Đại học Quốc sĩ gia Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương nhiệt tình giúp đỡ tơi hồn thành tiế n nội dung thực nghiệm trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Nhà trường chuyên ận nghiên cứu án viên phòng Đào tạo Sau đại học quan tâm giúp đỡ q trình học tập Lu Cuối cùng, tơi xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè bên, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2017 Dương Thị Hồng Ánh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 CURCUMIN .2 1.1.1 Nguồn gốc c 1.1.2 Công thức họ 1.1.3 Tính chất lý hóa ượ c 1.1.4 Độ ổn định 1.1.5 Định tính định lượng .4 D 1.1.6 Tác dụng dược lý sĩ 1.1.7 Sinh khả dụng .4 tiế n 1.2 MỘT SỐ BIỆN PHÁP CẢI THIỆN SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG án 1.2.1 Biện pháp làm tăng độ tan tốc độ hòa tan curcumin .6 ận 1.2.2 Biện pháp làm giảm chuyển hóa thải trừ curcumin qua đường tiêu Lu hóa 15 1.2.3 Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng sinh khả dụng thương mại hóa 22 1.3 MỘT SỐ MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA CURCUMIN DÙNG ĐƯỜNG UỐNG 23 1.3.1 Nghiên cứu in vitro 23 1.3.2 Nghiên cứu ex vivo 26 1.3.3 Nghiên cứu in situ 27 1.3.4 Nghiên cứu in vivo 28 Chương NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 31 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 33 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng 34 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tiền công thức (Preformulation) 41 2.3.3 Bào chế hệ tiểu phân nano 46 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định 53 2.3.5 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo chuột thí nghiệm .54 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 c 3.1 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 56 họ 3.2 NGHIÊN CỨU TIỀN CÔNG THỨC .73 c 3.2.1 Kết nghiên cứu tính chất dược chất 74 ượ 3.2.2 Kết nghiên cứu độ ổn định hóa học dược chất trạng thái rắn 76 D 3.2.3 Kết nghiên cứu tương tác dược chất-tá dược 77 sĩ 3.3 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO 79 tiế n 3.3.1 Xây dựng công thức bào chế hỗn dịch nano curcumin 79 3.3.2 Xác định số thơng số quy trình bào chế hỗn dịch nano 84 án 3.3.3 Xác định số thông số quy trình bào chế bột phun sấy chứa nano ận 86 Lu 3.3.4 Đánh giá ảnh hưởng số yếu tố thuộc cơng thức thơng số quy trình bào chế đến đặc tính tiểu phân nano 86 3.3.5 Tối ưu hóa cơng thức số thơng số quy trình bào chế 92 3.4 NGHIÊN CỨU NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ VÀ DỰ KIẾN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG .94 3.4.1 Xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano curcumin quy mô gam/mẻ .94 3.4.2 Khảo sát thông số trọng yếu, giai đoạn trọng yếu quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô g/mẻ 96 3.4.3 Đánh giá số đặc tính hệ tiểu phân nano curcumin quy mô g/mẻ 102 3.4.4 Dự kiến tiêu chuẩn chất lượng .109 3.5 THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH 110 3.6 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG 114 3.6.1 So sánh sinh khả dụng hỗn dịch quy ước hỗn dịch nano curcumin 114 3.6.2 Xác định thông số dược động học chất gốc curcumin tetrahydrocurcumin chuột sau uống hỗn dịch nano curcumin 118 Chương BÀN LUẬN 122 4.1 VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CURCUMIN .122 c 4.2 VỀ BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN .122 họ 4.2.1 Yếu tố công thức 123 c 4.2.2 Phương pháp thiết bị bào chế 127 ượ 4.2.3 Quy trình bào chế 128 D 4.3 VỀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO 133 sĩ 4.4 VỀ ĐỘ ỔN ĐỊNH 140 tiế n 4.5 VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO CURCUMIN 141 án 4.5.1 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng 141 ận 4.5.2 Nghiên cứu đánh giá SKD in vivo 147 Lu 4.6 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .149 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 150 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ANOVA : Analysis of variance (Phân tích phương sai) AUC : The area under the curve (Diện tích đường cong) BCS : Biopharmaceutics Classification System (Hệ thống phân loại Sinh dược học) : Maximum concentration (Nồng độ thuốc tối đa) CMC : Carboxy methylcellulose Cre : Cremophor RH40 CUR : Curcumin DC : Dược chất EMA : European Medicines Agency họ c Cmax (Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu) : Food and Drug Administration ượ c FDA (Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm) : Glibenclamid GTTB : Giá trị trung bình HPLC : High Performance Liquid Chromatography tiế n sĩ D GBC (Sắc ký lỏng hiệu cao) : High quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) IS : Internal standard (Chất chuẩn nội) ận án HQC : Kích thước tiểu phân Lu KTTP KTTPTB : Kích thước tiểu phân trung bình kl/kl : Khối lượng/khối lượng kl/tt : Khối lượng/thể tích LC-MS : Liquid chromatography-Mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ) LCMS/MS : Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ/khối phổ) LLOQ : Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC : Low quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) LSD : Least Significant Difference Test (Kiểm định khác có ý nghĩa thống kê tối thiểu) : Matrix factor (Hệ số ảnh hưởng mẫu) MQC : Medium quality control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) MRT : Mean residence time (Thời gian lưu thuốc trung bình) Na CMC : Natri carboxy methylcellulose PDI : Polydispersity index (Chỉ số đa phân tán) PEG : Polyethylen glycol P-gp : P-glycoprotein PLGA : Poly (acid lactic co-glycolic) Pol : Poloxamer PVA : Alcol polyvinic PVP : Poly vinylpyrolidon RSD : Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SD : Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SE : Standard error (Sai số chuẩn) SEM : Scanning Electron Microscope D ượ c họ c MF sĩ (Kính hiển vi điện tử quét) : Sinh khả dụng SQC : Supplement quality control (Mẫu kiểm tra bổ sung) TBME : Tert-butyl methylether THC : Tetrahydrocurcumin án ận : Time of maximum plasma drug concentration Lu Tmax TPGS tiế n SKD (Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa) : D-alpha-tocopheryl poly (ethylen glycol) succinat 1000 tt/tt : Thể tích/thể tích t1/2 : Thời gian bán thải tR : Thời gian lưu Tw : Tween ULOQ : Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên) US-FDA : The United States-Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thực phẩm thuốc Mỹ) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Một số phương pháp bào chế nano tinh thể Bảng 1.2 So sánh ưu, nhược điểm nano tinh thể so với nhũ tương nano micel polyme 21 Bảng 1.3 So sánh ưu điểm số dạng trung gian chứa dược chất tan 22 Bảng 1.4 Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng SKD thương mại hóa 23 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng nghiên cứu .31 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 32 c Bảng 2.3 Điều kiện khối phổ phương pháp LC-MS/MS định lượng curcumin họ tetrahydrocurcumin huyết tương .37 c Bảng 2.4 Thành phần hỗn dịch nano curcumin mẻ gam .46 ượ Bảng 2.5 Các giai đoạn trọng yếu thông số trọng yếu giai đoạn D quy trình bào chế bột phun sấy chứa nano curcumin 48 sĩ Bảng 2.6 Kế hoạch lấy mẫu .49 tiế n Bảng 2.7 Điều kiện bảo quản thời điểm lấy mẫu nghiên cứu theo dõi độ ổn định 54 án Bảng 2.8 Thành phần hỗn dịch quy ước hỗn dịch nano chứa curcumin .54 ận Bảng 3.1 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống HPLC .57 Lu Bảng 3.2 Kết đánh giá độ phương pháp HPLC định lượng curcumin 59 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ xác phương pháp .59 Bảng 3.4 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống LC-MS/MS (n = 6) 60 Bảng 3.5 Kết đánh giá tính đặc hiệu-chọn lọc phương pháp LC-MS/MS (n = 6) 61 Bảng 3.6 Tương quan tỷ lệ diện tích pic CUR/IS nồng độ CUR huyết tương (n = 8) 62 Bảng 3.7 Tương quan tỷ lệ diện tích pic THC/IS nồng độ THC huyết tương (n = 8) 63 CHƯƠNG IV ĐẶC ĐIỂM TRANG THIẾT BỊ DÙNG TRONG SẢN XUẤT STT Tên máy móc Máy nghiền bi Retsch Nơi/hãng sản Model Đơn vị Số lượng MM200 Cái 01 Đức X1000 Cái 01 Mỹ B-191 Cái 01 Thụy Sỹ xuất Thiết bị đồng hóa nhờ lực phân cắt lớn Unidrive Máy phun sấy Buchi mini spray c c Cái 01 Anh Thiết bị xác định KTTP phân bố 3000E Cái 01 Anh Cái 01 ERWEKA Cái 01 Nhật Bản Cái 01 Nhật Bản tiế ZS90 sĩ KTTP Zetasizer Nano ượ KTTP phân bố n D Thiết bị xác định họ dryer hòa tan ận Thiết bị đánh giá độ Máy đo quang phổ SP-3000 UV/VIS nano Spectrophotometer (96W) Lu án KTTP Mastersizer Máy đo hàm ẩm Moisture analyzer MF50 CHƯƠNG V MÔ TẢ QUY TRÌNH SẢN XUẤT Q trình sản xuất chia làm giai đoạn: (1) Chuẩn bị nguyên phụ liệu, dụng cụ (2) Bào chế (3) Đóng gói Chuẩn bị nguyên phụ liệu dụng cụ  Kiểm tra nguyên phụ liệu Nguyên liệu kiểm tra chất lượng trước đưa vào sản xuất theo tiêu chuẩn ghi mục II c  Chuẩn bị dụng cụ họ Dụng cụ thủy tinh phải rửa nước tinh khiết, tráng nước cất, sấy ượ c tủ sấy cho khô  Các thiết bị: D Buồng nghiền, bi inox, bi zirconi oxyd rửa sạch, sấy khô Thiết bị phun n sĩ sấy phải vệ sinh lắp đặt sẵn tiế Bào chế: án 2.1 Cân, đong nguyên phụ liệu theo công thức sau: Lượng Curcumin 5,00 g Tween 80 0,60 g Polyvinyl pyrolidon K30 3,75 g Manitol 2,50 g Nước tinh khiết 125 ml Lu ận Nguyên liệu 2.2 Tiến hành 2.2.1 Bào chế hỗn dịch nano curcumin - Bước Nghiền khô Cho curcumin bi inox vào buồng nghiền Cân để hai buồng nghiền có khối lượng Lắp buồng nghiền vào thiết bị nghiền Cài đặt thông số: thời gian nghiền tần số 30 Hz Sau giờ, tiến hành đảo trộn curcumin buồng nghiền Sau giờ, bột curcumin lấy khỏi buồng nghiền - Bước Nghiền ướt Đong 10 ml nước tinh khiết Đun nóng khoảng 60oC Hịa tan PVP để tạo dung dịch PVP Để nguội Phối hợp Tween 80 vào dung dịch PVP Đưa vào buồng nghiền có g curcumin nghiền khô 25 g bi zircon oxyd, kích thước bi 0,8 mm Cài đặt thông số: thời gian nghiền giờ, tần số 30 Hz - Bước Pha loãng hỗn dịch Bước Đồng hóa họ - c Pha lỗng hỗn dịch đặc 100 ml nước tinh khiết Lọc loại bi qua rây 300 c Đồng hóa hỗn dịch sử dụng thiết bị đồng hóa nhờ lực phân cắt lớn ượ với tốc độ 18000 vòng/phút để tạo hỗn dịch nano, thời gian đồng 60 D phút, 15 phút lại cho máy nghỉ phút Bước Phun sấy sĩ - tiế n Hòa tan manitol vào 15 ml nước tinh khiết Phối hợp với hỗn dịch nano Cài đặt thiết bị phun sấy với thông số: nhiệt độ đầu vào 96oC, tốc độ cấp dịch án ml/phút tỷ lệ thơng gió 99% Hỗn dịch nano khuấy từ liên tục Bước Thu sản phẩm Lu - ận thời gian phun sấy Bột phun sấy thu hồi cyclon phận thu hồi sản phẩm phịng kín với độ ẩm khoảng 30-40% 2.3 Đóng gói: Trong lọ thủy tinh, nút kín Bảo quản: Nơi khơ mát, tránh ánh sáng CHƯƠNG VI PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT-KIỂM NGHIỆM Các giai đoạn cần KS-KN Nội dung KS-KN Định tính Kiểm tra Định lượng nguyên liệu Cân đong Phòng KN Đúng Người pha chế Khối lượng, thể tích Tần số nghiền Thời gian nghiền KTTP Tần số nghiền Thời gian nghiền KTTP c Tần số nghiền 30 Hz Thời gian nghiền Nghiền khô KTTP  m Tần số nghiền 30 Hz Thời gian nghiền Nghiền ướt KTTP  m Tốc độ khuấy 18000 Tốc độ khuấy vòng/phút Đồng Thời gian khuấy Thời gian khuấy 60 phút hóa KTTP KTTP < 500 nm PDI < 0,550 Tốc độ phun dịch Tốc độ phun dịch ml/phút Nhiệt độ khí vào 96oC Nhiệt độ khí vào Tỷ lệ thơng gió 99% Phun sấy Tỷ lệ thơng gió Hiệu suất phun Hiệu suất phun sấy  60% sấy Cảm quan Mất khối lượng làm khơ KN tiểu Định tính phân nano Đạt TCCS KTTPTB curcumin PDI Hàm lượng Độ hòa tan Người pha chế Người pha chế Người pha chế tiế Người pha chế Lu ận án n sĩ D Theo tiêu chuẩn ghi mục II c Người thực ượ Yêu cầu họ TT Đóng gói Số lượng Đúng Phịng kiểm nghiệm Kiểm sốt viên, người pha chế CHƯƠNG VII DƯ PHẨM, PHẾ PHẨM Nano phun sấy dư thừa thu hồi, xử lý Khơng có phế phẩm THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN CƠ SỞ (Dự thảo) TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HỆ TIỂU PHÂN HÀ NỘI NANO CURCUMIN Số TC: Có hiệu lực từ ngày ký Quyết định ban hành số:………… ngày ………… tháng …… năm … YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Công thức điều chế: cho mẻ Curcumin 5,00 g Tá dược vđ họ c (Tween 80, polyvinyl pyrolidon K30, manitol, nước tinh khiết) 1.2 Tiêu chuẩn nguyên phụ liệu Đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất Tween 80 Đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2010 Polyvinyl pyrolidon K30 Đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015 sĩ D ượ c Curcumin Đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2015 Đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV tiế Nước tinh khiết n Manitol án 1.3 Chất lượng thành phẩm 1.3.1 Hình thức: Bột kết tinh vơ định hình màu vàng ận 1.3.2 Kích thước tiểu phân trung bình hệ số đa phân tán: Lu KTTPTB nhỏ 500,0 nm PDI nhỏ 0,550 1.3.3 Mất khối lượng làm khô: không 12,0% 1.3.4 Khối lượng riêng biểu kiến: Ít 0,250 g/ml 1.3.5 Định tính: Sắc ký đồ có pic curcumin 1.3.6 Định lượng: Chế phẩm phải chứa từ 40,00-43,50% curcumin (C21H20O6) so với tổng khối lượng bột phun sấy 1.3.7 Độ hịa tan: Ít 95% curcumin hịa tan sau 60 phút PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Hình thức Phương pháp thử: thử cảm quan 2.2 Kích thước tiểu phân trung bình hệ số đa phân tán Phương pháp thử: phân tán tiểu phân nano curcumin nước tinh khiết, xác định thiết bị đo kích thước tiểu phân phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer ZS 90 Malvern 2.3 Mất khối lượng làm khô Phương pháp thử: phương pháp sấy đến khối lượng không đổi nhiệt độ cài họ định cân xác định khối lượng làm khô c đặt 100oC, phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam IV Lượng mẫu thử khoảng 1,00g, xác c 2.4 Khối lượng riêng biểu kiến ượ Phương pháp thử: Xác định máy đo thể tích biểu kiến hạt bột D Erweka SVM theo phương pháp gõ 30 lần Khối lượng bột phun sấy sử dụng cho sĩ lần đo g Khối lượng riêng biểu kiến tính theo cơng thức sau: tiế n dbk = án Trong dbk: khối lượng riêng biểu kiến bột (g/ml) m : khối lượng bột phun sấy ống đong (g) ận V : thể tích biểu kiến bột sau gõ (ml) Lu 2.5 Định tính: Phương pháp HPLC: Trên sắc ký đồ dung dịch thử (ở phần định lượng) phải có pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic curcumin dung dịch chuẩn 2.6 Định lượng: 2.6.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis Thuốc thử - Methanol - Tween 80 - Nước cất Cách tiến hành  Chuẩn bị dung dịch: - Dung môi pha loãng (dung dịch Tween 80 0,2%): cân 2,0 g Tween 80 vào cốc có mỏ, thêm nước cất đun nóng đến tan hồn tồn Để nguội thêm nước vừa đủ 1000 ml - Dung dịch chuẩn: cân xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn hịa tan 10 ml methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung mơi pha lỗng tới vạch, lắc kỹ dung dịch có nồng độ 100 g/ml Hút xác ml dung dịch vào bình định mức 50 ml, thêm dung mơi pha lỗng tới vạch lắc kỹ - Dung dịch thử: cân xác lượng bột phun sấy tương ứng với khoảng 10,0 c mg curcumin, hịa tan 10 ml methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml, họ thêm dung mơi pha lỗng tới vạch, lắc kỹ Hút xác ml dung dịch vào ượ c bình định mức 50 ml, thêm dung mơi pha lỗng tới vạch lắc kỹ Lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 m sĩ D  Đo độ hấp thụ mẫu chuẩn mẫu thử bước sóng 427 nm, mẫu trắng n dung mơi pha lỗng tiế  Tính kết % CUR = x x 100% ận án Hàm lượng curcumin tính theo cơng thức: Lu Trong DT, Dc: độ hấp thụ quang mẫu thử mẫu chuẩn mc : khối lượng curcumin chuẩn (mg) m : khối lượng bột phun sấy chứa nano curcumin (mg) Mỗi mẫu thử tiến hành lần lấy kết trung bình 2.6.2 Phương pháp HPLC Thuốc thử - Acid acetic băng loại dùng cho HPLC - Methanol loại dùng cho HPLC - Acetonitril loại dùng cho HPLC - Nước cất hai lần Tiến hành  Chuẩn bị dung dịch: - Dung mơi pha lỗng: hỗn hợp methanol : acid acetic băng (99:1, tt/tt) - Dung dịch chuẩn: cân xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn, hịa tan dung mơi pha lỗng, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung mơi pha lỗng tới vạch lắc kỹ Từ dung dịch trên, pha loãng thành dung dịch chuẩn có nồng độ curcumin từ 2,5 đến 15 µg/ml, lọc qua màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm - Dung dịch thử: cân xác lượng bột phun sấy tương ứng với 10,0 mg curcumin, hòa tan dung mơi pha lỗng, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung mơi pha lỗng tới vạch lắc kỹ Hút xác lượng dung dịch c trên, thêm dung mơi pha lỗng tạo thành dung dịch có nồng độ µg/ml, lọc qua họ màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm ượ c  Điều kiện sắc ký: - Pha tĩnh: Cột sắc kí AQ – C18 250 x 4,6 mm, hạt nhồi µm D - Pha động: acetonitril : dung dịch acid acetic 2% (kl/tt) (58:42), lọc qua sĩ màng lọc kích thước lỗ lọc 0,45 µm tiế n - Tốc độ dịng: 1,5 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl ận  Cách tiến hành án - Detector UV phát bước sóng 430 nm Lu Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành chạy sắc ký dung dịch curcumin chuẩn có nồng độ g/ml, độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic thu từ lần tiêm lặp lại không lớn 2,0% Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 2,5 đến 15 µg/ml dung dịch thử  Tính kết Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mơ tả mối tương quan diện tích pic nồng độ curcumin Tính kết theo phương trình hồi quy tuyến tính Mỗi mẫu thử tiến hành lần lấy kết trung bình 2.7 Độ hoà tan: 2.7.1 Thuốc thử -Tween 80 - Nước tinh khiết 2.7.2 Cách thử - Thiết bị: máy cánh khuấy - Mơi trường hịa tan: 900 ml nước chứa 0,2% Tween 80 - Tốc độ quay: 100 vòng/phút - Nhiệt độ mơi trường hịa tan: 37 ± 0,5oC - Cách tiến hành: Cho mẫu thử bột phun sấy chứa nano curcumin tương ứng với 5,0 mg curcumin vào cốc có mỏ chứa lượng mơi trường thử c độ hòa tan, siêu âm 3-4 giây chuyển vào cốc chứa mơi trường thử hịa họ tan Sau khoảng thời gian 10, 20, 30, 40, 50 60 phút, lấy khoảng 10 c ml dung dịch thử, ly tâm phút với tốc độ 12000 vòng/phút Phần dung ượ dịch đo quang phổ hấp thụ UV-Vis bước sóng 427 nm, sử dụng D mẫu trắng dung dịch Tween 80 0,2% Sau đo quang, rót tồn sĩ phần cắn phần dịch ly tâm vào cốc thử độ hòa tan n Chuẩn bị mẫu chuẩn tương tự phần định lượng Tính tốn kết tiế - án cách so sánh độ hấp thụ mẫu thử mẫu chuẩn: Cn = x Co Lu ận Trong Cn, Co: nồng độ dung dịch thử chuẩn (g/ml) Dn, Do: độ hấp thụ dung dịch thử chuẩn Phần trăm curcumin hịa tan thời điểm t tính theo công thức: % CUR = Cn x 900 x 100% m x 1000 Cn: nồng độ curcumin thời điểm t (µg/ml) m: lượng curcumin thử (mg) Mỗi mẫu thử tiến hành lần lấy kết trung bình - ĐĨNG GĨI - GHI NHÃN – BẢO QUẢN Đóng bao bì thủy tinh kín Bảo quản nơi khô mát, tránh ánh sáng Nhãn quy chế Hà Nội, ngày tháng năm 2017 ượ c họ c PHỤ LỤC MỘT SỐ KẾT QUẢ THEO DÕI ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA HỆ TIỂU PHÂN NANO D Phụ lục 7.1 Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau tháng điều Lu ận án tiế n sĩ kiện thực (mẻ 1) Phụ lục 7.2 Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau tháng điều kiện thực (mẻ 2) họ c hụ lục 7.5 Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau tháng điều kiện thực (mẻ 3) c Phụ lục 7.3 Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau tháng điều Lu ận án tiế n sĩ D ượ kiện thực (mẻ 3) Phụ lục 7.4 Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau tháng điều kiện lão hóa cấp tốc (mẻ 1) c họ c ượ Phụ lục 7.5 Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau tháng điều Lu ận án tiế n sĩ D kiện lão hóa cấp tốc (mẻ 2) Phụ lục 7.6 Sắc ký đồ mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sau tháng điều kiện lão hóa cấp tốc (mẻ 3) PHỤ LỤC MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA sĩ D ượ c họ c HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA CURCUMIN TRÊN CHUỘT THÍ NGHIỆM tiế n Phụ lục 8.1 Kết phân tích nồng độ curcumin huyết tương chuột Lu ận án sau uống hỗn dịch nano 10 phút (chuột số 69, nhóm 2) Phụ lục 8.2 Kết phân tích nồng độ curcumin huyết tương chuột sau uống hỗn dịch nano 10 phút (chuột số 70, nhóm 2) c họ c Phụ lục 8.3 Kết phân tích nồng độ curcumin huyết tương Lu ận án tiế n sĩ D ượ chuột sau uống hỗn dịch nano 20 phút (chuột số 57, nhóm 2) Phụ lục 8.4 Kết phân tích nồng độ curcumin huyết tương chuột sau uống hỗn dịch nano 20 phút (chuột số 58, nhóm 2) Phụ lục 8.5 Phương trình mơ tả ảnh hưởng hiệp biến khối lượng chuột đến số thơng số dược động học = × ×  = × ×  = × ×  Trong đó: V: Thể tích phân bố chuột (ml) họ c m: khối lượng chuột Ka: số tốc độ hấp thu chuột (phút-1) ượ c Ke: số tốc độ thải trừ chuột (phút-1) D V: thể tích phân bố chung quần thể sĩ Ka: Hằng số tốc độ hấp thu chung quần thể n Ke: Hằng số tốc độ thải trừ chung quần thể tiế dV: vi phân thể tích phân bố án dm: vi phân khối lượng chuột ận dKa: vi phân số tốc độ hấp thu Lu dKe: vi phân số tốc độ thải trừ V, Ka, Ke: giá trị eta