Thực hành kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật iuh

TS NGUYEN THJ KIM ANH (Chu bien) - ThS LE TRAM NGHiA THU THUC HANH KY THUAT NUOI • • CAY TE BAO DONG VAT • • NHA XUAT BAN D�I HQC CONG NGHitP THANH PHO HO CHI MINH Giảo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật LỜI MỞ ĐÀU Tài liệu học tập cung cấp thực hành với hướng dẫn cụ thể, dễ thực giúp người học thực kỹ thuật liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật Tài liệu biên soạn nhằm phục vụ cho việc giảng dạy học tập sinh viên đại học chuyên ngành Sinh học, Công nghệ sinh học chuyên ngành liên quan Học viên cao học người nghiên cứu khoa học có sử dụng kỹ thuật liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật tham khảo tài liệu hướng dẫn kỹ thuật Nhóm tác giả Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tể bào động vật Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật MỤC LỤC Quy tắc làm việc phịng thí nghiệm cơng nghệ tế bào động vật Giới thiệu thiết bị, môi trường nuôi cấy tế bào động vật Nội dung thực hành 13 Bài Chuẩn bị dụng cụ, môi trường hóa chất để ni cấy tế bào 14 Bài Thu tế bào đon từ mô động vật 17 Bài Nuôi cấy sơ cấp nguyên bào sợi 22 Bài Nuôi cấy thứ cấp tế bào động vật 26 Bài Đông lạnh giải đông tế bào 28 Bài Tạo dòng tế bào 31 Bài Các phương pháp kiểm tra độc tính tế bào động vật 36 Bài Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 39 Tài liệu tham khảo 43 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ DMEM Dulberco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide ETDA Ethylenediaminetetraacetic acid FBS Fetal Bovine Serum MEM Minium Essential Media MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, PBS Phosphate Buffer Saline RPMĨ Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium ưv Ultraviolet Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Khi làm việc phịng thí nghiệm, sinh viên phải thực nghiêm túc quy tắc sau để đảm bảo hiệu an tồn: I NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM Điều 1: Sinh viên phải tham dự đầy đủ buổi thực hành, chuẩn bị trước bước vào phịng thực hành Điều 2: Sinh viên vào phịng thí nghiệm phải có cho phép giáo viên phụ trách rời phòng Điều 3: Sinh viên khơng nói chuyện, khơng làm việc riêng, khơng hút thuốc, khơng ăn, uống phịng thí nghiệm Điểu 4: Sinh viên cần làm theo dẫn giáo viên phụ trách sử dụng dụng cụ đắt tiền, dễ vỡ, hóa chất dễ cháy, nổ Điều 5: Sinh viên cần sử dụng hóa chất tiết kiệm, cẩn thận để khơng làm đồ hóa chất, vỡ dụng cụ Khi dụng cụ bị vỡ, sinh viên cần báo cáo với giáo viên phụ trách bồi thường hóa chất, dụng cụ làm đổ, vỡ Điểu 6: Sinh viên khơng tự ý di chuyển hóa chất khỏi nơi qui định Điểu 7: Sinh viên cần lau nắp cổ chai hóa chất trước mở nắp Điều 8: Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải rửa sau dùng xong Không sử dụng dụng cụ lấy hóa chất để lấy loại hóa chất khác dụng cụ chưa rửa Điều 9: Sinh viên thực thí nghiệm cần cẩn thận, nghiêm túc báo cáo kết trung thực Điều 10: Sinh viên rửa sạch, làm khô dụng cụ vệ sinh vị trí làm việc Quét, lau phịng thí nghiệm trước Điều 11: Thực nghiêm túc qui định phòng cháy chữa cháy Điều 12: Kiểm tra hệ thống điện, nước trước rời khỏi phịng thí nghiệm, phải tắt quạt, tắt đèn, khóa vịi nước ngắt cầu dao điện II QUY TẮC LÀM VIỆC VỚI HÓA CHÁT Độc, DẺ CHÁY, DẺ NỔ Khi sử dụng hóa chất cần đọc thơng tin nhãn chai Chú ý ký hiệu cảnh báo dễ cháy, nổ, độc hại Thực nghiêm túc yêu cầu phòng chống độc, phòng chống cháy nổ làm việc với hóa chất Khi pha hóa chất, hóa chất phải chứa dụng cụ chứa có nắp, ghi nhãn tên hóa chất, nồng độ, tên người pha, ngày pha cần bê phần đáy chai cầm chai hóa chất lên Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tể bào động vật Đeo mặt nạ, kính bảo vệ mắt sử dụng axit đậm đặc dung môi dễ bay Các thao tác sử dụng hóa chất phải thực tủ hút tắt tủ hút chất độc hết Khi pha loãng axit H2SO4 phải chọn bình chứa chịu nhiệt rót cẩn thận axit qua phễu vào bình chứa nước tủ hút Lưu ý muốn pha axit hay bazơ phải đổ acid/bazơ vào nước tránh làm ngược lại Không hút acid/bazơ miệng lọ cịn hóa chất khơng hút pipet Khơng đun nóng trực tiếp lửa sử dụng chất dễ cháy aceton, benzen, eter, cacbondisunfua, etylacetate mà nên đun bếp cách thủy II QUY TẤC LÀM VIỆC VỚI CÁC DỊNG TÉ BÀO Việc thao tác dịng tế bào nên tiến hành tủ an toàn sinh học cấp 2 Khi làm việc dịng tế bào phải đeo số đồ bảo hộ trang, găng tay để tránh bị nhiễm mycoplasma Đối với dòng tế bào, đặc biệt dịng tế bào chuyển gen, khơng thải bỏ trực tiếp nguồn nước thải mà phải hấp tiệt trùng trước Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tể bào động vật GIỚI THIỆU CÁC THIẾT BỊ, MÔI TRƯỜNG TRONG NUÔI CẤY TẾ BAO Động Vật Thiết bị I ỉ Tủ an toàn sinh học Tủ an toàn sinh học thiết bị cần có phịng ni cấy tế bào động vật tủ thường dùng tủ an toàn sinh học cấp (Class II) Thiết bị bảo vệ người thao tác khỏi tác nhân lây nhiễm, bảo vệ mẫu vật thao tác, bảo vệ môi trường bên tủ trước tác nhân lây nhiễm sinh học 1.2 Tủ nuôi tế bào (Tủ ấm co2) Tủ ấm CO2 thiết bị cần phải có phịng thí nghiệm ni cấy tế bào động vật người Thiết bị tạo môi trường nuôi cấy phù hợp cho tế bào sinh trưởng giữ cho môi trường nuôi cấy tránh khỏi vi sinh vật tạp nhiễm Tủ trì nhiệt độ ổn định 37°c, 85-90% RH (độ ẩm tương đối), 5% CO2 Hình Tủ an tồn sinh học cấp II (bên trái) tủ ấm CO2 (bên phải) 1.3 Kinh hiển vi đảo ngược Kính hiển vi đảo ngược/soi ngược kính có hệ thống bàn để vật kính, vật kính hướng lên trên, cịn bàn đặt mẫu, nguồn cung cấp ánh sáng tụ quang bên Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật Hình Kính hiển vi đảo ngược Kính hiển vi đảo ngược thường sử dụng thao tác tế bào tinh trùng hay trứng, để quan sát, theo dõi tế bào bình/đĩa ni cấy hay loại sinh vật đáy bình ni 1.4 Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) Nồi hấp tiệt trùng thiết bị phổ biến dùng để tiệt trùng nhiều loại vật dụng khác thiết bị, dụng cụ sử dụng y tế hay dụng cụ phịng thí nghiệm nhiệt độ 121 °C, latm, thời gian từ 15 - 20 phút Hấp tiệt trùng nồi hấp tiệt trùng tiêu diệt hết vi sinh vật, bào tử vật dụng cần tiệt trùng 7.5 Máy ly tâm Máy ly tâm sử dụng quy trình ni cấy tế bào để ly tâm dịch huyền phù tế bào nhằm tăng nồng độ tế bào (cell concentration) quy trình xác định nồng độ tế bào, loại enzyme sử dụng phân tách tế bào (ví dụ trypsin) hay loại bỏ mơi trường ni cấy quy trình ni cấy tế bào dạng lơ lửng/huyền phù Hình Máy ly tâm (bên trái) nồi hấp tiệt trùng (bên phải) 1.6 Micropipette Micropipette (pippetman) dụng cụ sử dụng nhiều phịng thí nghiệm để đo xác lượng thể tích nhỏ Micropipette thường gắn với đầu tip tương ứng tiệt trùng để hút dung dịch, hóa chất dịch huyền phù tế bào 10 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Mỗi micropipette có giới hạn sử dụng riêng biệt nên tùy theo thể tích dung dịch cần hút mà lựa chọn loại micropipette phù hợp Có số loại micropipette 0,5-lOgl, 0,2-2pl, 20-200pl, ỈOO-lOOOpl, 1000 ul-5000ul 1.7 Buồng đếm Neubauer Mảy đếm tế bào tự động Buồng đếm máy đếm tế bào tự động sử dụng để đếm số lượng tế bào dịch huyền phù tế bào nhằm điều chỉnh số tế bào thích hợp cho ni cấy cho biết tỉ lệ tế bào sống chết dịch huyền phù Phương pháp sử dụng buồng đếm phương pháp đếm số lượng tế bào đcm giản theo cách trực tiếp Phương pháp rẻ cho phép xác định khả sống tế bào việc nhuộm tế bào với loại thuốc nhuộm Máy đếm tế bào tự động lựa chọn hữu hiệu nhằm thay việc đếm tế bào dựa buồng đếm hồng cầu thủ cơng khả lặp lại, độ xác cao giảm thời gian thao tác; làm giảm đáng kể sai số người sử dụng sai số nồng độ tế bào tạo 1.8 Tủ lạnh âm sâu Tủ lạnh âm sâu thiết bị làm lạnh sử dụng phòng thí nghiệm nghiên cứu nhằm bảo quản giống, mẫu sinh phẩm, tế bào dải nhiệt độ -40°C, -86°c, -140°C khoảng thời gian khác Hệ thống tủ lạnh âm sâu có kết hợp nhiều hệ thống lạnh Khi sử dụng tủ âm sâu để bảo quản tế bào động vật sử dụng thêm chất bảo quản đông lạnh DMSO Glycerol để giúp tế bào không bị hư hỏng hay chết thời gian lưu trữ, bảo quản để ni cấy sau rã đơng tế bào 1.9 Bình đựng ni tơ lỏng Bình đựng ni tơ lỏng sử dụng để bảo quản tế bào nhiệt độ lạnh sâu (-196°C) thời gian dài Ngồi ra, bình ni tơ lỏng cịn sử dụng trường hợp vận chuyển mẫu Môi trường nuôi cấy tế bào Môi trường nuôi cấy tế bào cung cấp lượng, dinh dưỡng chất điều hịa sinh trưởng Mơi trường ni cấy cung cấp thành phần amino acid, vitamin, glucose, muối vô Huyết thêm vào môi trường nuôi cấy nguồn cung cấp các yếu tố bám dính, hormone yếu tố sinh trưởng Ngoài việc bổ sung chất dinh dưỡng, mơi trường ni cấy tế bào cịn chứa hệ đệm vô hữu giúp môi trường ln trì pH áp suất thẩm thấu Môi trường nuôi cấy tế bào động vật phân thành hai loại mơi trường tự nhiên môi trường tổng hợp 2.1 Môi trường tự nhiên Môi trường tự nhiên dịch sinh học tự nhiên huyết thanh, huyết tương, dịch chiết mô Môi trường phù hợp cho nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật khác Nhược điểm lớn mơi trường tự nhiên khơng biết xác tất thành phần nên khả lặp lại thí nghiệm khơng cao 11 Giảo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật - Ống đông lạnh ml hay ml - Bình chứa nitơ lỏng - TÙ-8O°C - Tủ lạnh - Tủ ni - Tủ thao tác - Bình ni tế bào - Eppendorf - Ống ly tâm 15 ml Tiến hành 3.2.1 Đông lạnh tế bào Chỉ nên chọn tế bào khỏe mạnh, không bị nhiễm để tiến hành đơng lạnh Mật độ tế bào thích hợp để đông lạnh 2- 5.1 o6 tế bào/2 ml chứa ống đông lạnh Tiến hành - Tách tế bào bám dính trypsin hay tác nhân tách tế bào khác - Rửa tế bào lần mồi trường bàng cách ly tâm 1000 vòng/phút phút - Đem mật độ tế bào, đánh giá phần trăm tế bào sống/chết - Tái huyền phù vào môi trường đông lạnh mật độ mong muốn - Cho huyền phù tế bào môi trường đông lạnh vào ống đông lạnh - Ghi tên dòng tế bào, số tế bào, ngày người thực đông lạnh tế bào - Nên thực đông lạnh chậm tế bào Các ống đông lạnh chứa tế bào nên đặt tư đứng thẳng Sau đó, đặt vào tủ lạnh ngăn mát 30 phút chuyển vào tủ đông -80°C Nên giữ giá ống nhiệt độ 60 phút không để qua đêm Cuối cùng, chuyển ống đơng lạnh sang bình nitơ lỏng tủ đơng âm sâu -150°C Các tế bào lưu trữ thời gian ngắn (vài tuần) -80°C, tiếp tục giữ nhiệt độ lâu hơn, tế bào nhanh chóng bị hư Khi tế bào bảo quản -150°C hay nitơ lỏng giữ tế bào nhiều năm 3.2.2 Giải đơng tế bào Quy trình giải đơng tế bào gồm bước sau: - Các ống đông lạnh tế bào lấy khỏi bình nitơ lỏng/tủ -80°C/tủ -150°C - Đặt ống đông lạnh vào bể ổn nhiệt 37°c, lắc nhẹ đến tan gần hết đá - Dịch huyền phù ống đông lạnh chuyển sang ống ly tâm - Ly tâm thời gian 3-5 phút với tốc độ 1000 vịng/phút 29 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật - Thu cặn tế bào đếm mật độ tế bào, đánh giá phần trăm tế bào sống/chết - Thêm môi trường để huyền phù tế bào - Cho dịch huyền phù tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường ni cấy tế bào thích hợp, mật độ tế bào từ 2-3.1 o4tế bào/cm2 - Đặt vào tủ ấm 37°c, 5% CƠ2 YÊU CẦU - Đánh giá khả sống tế bào trước đông lạnh; - Đông lạnh tế bào để bảo quản; - Giải đông tế bào ống đông lạnh; - Đếm mật độ tế bào sống, chết sau giải đông; - Nuôi cấy tế bào sau giải đông tế bào CÂU HỎI - Cho biết cách đánh giá khả sống tế bào trước đông lạnh sau giải đông tế bào - Tại đơng lạnh phải đơng lạnh chậm qua mức nhiệt độ giảm dần? 30 - Vai trị DMSO/glycerol mơi trường đơng lạnh - Tại giải đơng tế bào cần thao tác nhanh? Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tể bào động vật BÀI TẠO DÒNG TÉ BÀO MỤC TIÊU Tạo dòng tế bào để sử dụrig nhiều mục đích khác sản xuất protein tái tổ hợp, thử thuốc Cơ SỞ LÝ THUYẾT Tạo dòng tế bào kỹ thuật nhằm thu nhận colony dụng cụ nuôi cấy có nhiều dạng tế bào khác Colony cụm tế bào bắt nguồn từ tế bào Kỹ thuật tạo dịng tế bào bám dính thực đĩa petri, đĩa nhiều giếng Roux sử dụng kính hiển vi đảo ngược để xác định chác chắn ban đầu dụng cụ nuôi có tế bào nhằm đảm bảo colony hình thành có nguồn gốc từ tế bào Các colony nuôi cấy tăng sinh tiếp tục thu dòng tế bào (cell strain) Đối với tế bào ni cấy dạng huyền phù tạo dòng cách cấy tế bào vào gel (agar agarose) dung dịch nhầy (Methocel) với lớp thạch agarose bên Tính ổn định gel độ nhớt Methocel đảm bảo tế bào không tách khỏi colony VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 3.1 Tạo dịng phương pháp pha lỗng Tạo dịng phương pháp pha loãng kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất, dựa quan sát tế bào pha loãng với mật độ thấp thể tích dung dịch định chứa tế bào Các tế bào đơn ni cấy vi giếng hình thành colony Nhuộm tế bào (để kiểm tra hiệu bám dính phân tích khả sống) hay phân lập tăng sinh thành dòng tế bào (cell strain) dòng tế bào quan tâm Phương pháp sử dụng cho tế bào huyền phù hay tế bào bám dính a Nguyên vật liệu Tế bào nuôi cấy CH0-K1, đĩa 96 giếng, đĩa 24 giếng, đĩa 35 mm, đĩa 100 mm, Roux 25 cm2, môi trường nuôi cấy Ham’s F12 10% FBS, buồng đếm hồng cầu, dung dịch trypsin/ EDTA 0,25%, pipette 1,5, 10, and 25 ml b Tiến hành - Tách tế bào đĩa nuôi trypsin để thu dịch huyền phù tế bào đơn - Ly tâm lần tốc độ 1000 vòng/phút phút để thu nhận tế bào - Điều chỉnh môi trường nuôi cấy để thu mật độ 10-100 tế bào/ml Mật độ sử dụng phụ thuộc vào hiệu bám trải tế bào thực tạo dòng - Cho 100 ul dịch huyền phù vào giếng đĩa 96 giếng với giếng có tế bào o Từ 12-24 kiểm tra dòng sau trải, đánh dấu chọn đĩa có tế bào Để nguyên môi trường nuôi cấy tuần để colony hình thành 31 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào.động vật không nhìn thấy colony thay mơi trường tiếp tục nuôi cấy thêm tuần Bổ sung môi trường vào đĩa nuôi cấy tuần thứ ba can Neu khơng có colony xuất sau tuần cần tiến hành làm lại thí nghiệm o Nếu - Khi tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào, thực tách tế bào trypsin để đưa vào đĩa 24 giếng, 35 mm 100 mm Roux 25 cm2 để thu nhận dòng tế bào đơn (cell strain) 3.2 Tạo dòng tế bào dạng lơ lửng/huyền phù Những tế bào nuôi cấy dạng lơ lửng/huyền phù tế bào gốc tạo máu nguyên bào sợi bị biến đổi gen tạo dòng hạng thái huyền phù Để giữ colony không trộn lẫn với nhau, tế bào huyền phù frong agar Methocel đặt lớp agar lót bên Agar chất lỏng nhiệt độ cao, tạo gel 37°c Các tế bào huyền phù vào môi trường agar ấm sau ủ gel agar tế bào tạo thành colony rời rạc phân lập dễ dàng 3.3 Tạo dòng tế bào agar Trong thí nghiệm riày mơ tả phương pháp tạo dòng tế bào agar a Nguyên vật liệu Tế bào nuôi cấy thứ cấp hay huyền phù tế bào sơ cấp từ tủy xương hay khối u, đĩa petri, môi trường nuôi cấy lOx (Dulbecco’s MEM, Ham’s Fl 2, CMRL 1066, RPMI 1640), buồng đếm hồng cầu, dung dịch trypsin/ EDTA, agar, nước cất vô trùng b Tiến hành - Pha lỗng mơi trường ni cấy 2x từ môi trường lOx, bổ sung 40% FBS giữ 37°c - Pha 100 ml agar 1,2%: cân 1,2 g agar cho vào cốc chứa 50 ml nước cất, khuấy tan agar Sau đó, đổ dung dịch vào bình định mức 100 ml Thêm nước cất vạch bình định mức - Tiệt trùng dung dịch phương pháp nhiệt ẩm - Chuyển agar 1,2% tiệt trùng chai nước cất vô trùng sang bể ổn nhiệt 55°C - Chuẩn bị lớp lót (underlay) agar 0,6% cách kết hợp mơi trường 2x agar 1,2% với tỉ lệ 1:1 Giữ lớp lót nhiệt độ 37°c Thêm vào mơi trường lót yếu tố tăng trưởng, hormone chất bổ sung (nếu cần) thời điểm - Thêm ml môi trường agar 0,6% vào đĩa, tráng đảm bảo môi trường bao phủ đáy đĩa Đẻ đĩa nhiệt độ phòng - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào đếm tế bào - Chuẩn bị môi trường agar 0,3% để nhiệt độ 37°c Mơi trường chuẩn bị cách pha lỗng mơi trường 2x 37°c với agar 1,2% 55°C nước cất vô trùng 55°C theo tỷ lệ tương ứng 2:1:1 - Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào sau: a X 105/ml b Pha loãng 1/3 dịch huyền phù X 105/ml để có 3,3 X 104/ml 32 Giảo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật c Pha loãng 1/3 dịch huyền phù 3,3 X 104/ml để có 1,1 X 104/ml d Pha lỗng 1/3 dịch huyền phù 1,1 X 104/ml để thu 3,7 X 103/ml - Hút 40 Ị11 dịch tế bào độ pha lỗng vào bình chứa tương ứng Thêm ml môi trường thạch 0,3% 37°c vào bình, trộn dùng pipet lấy ml từ bình cho vào ba đĩa Petri Nồng độ cuối đĩa sau: a X 103/ml đĩa; b 330/ml đĩa; c 110/ml đĩa; d 37/ml đĩa Ghi chú: Luôn đảm bảo môi trường agar lớp có đủ thời gian để nguội đến 37°c trước thêm tế bào vào - Để dung dịch đĩa petri đồng lại nhiệt độ phòng - Đặt đĩa petri vào hộp nhựa suốt có nắp đậy đặt 37°c tủ ấm 10 ngày - Quan sát thu nhận dòng tế bào từ colony hình thành 3.4 Phân tách dịng tế bào 3.4.1 Phăn tách dịng tế bào bám dính sử dụng vòng tạo dòng (cloning ring) Nếu tế bào ni cấy bám dính tạo dịng trực tiếp vào đĩa nhiều giếng dịng (colony) tách cách sử dụng trypsin để thu tế bào giếng riêng lẻ Nếu tạo dòng thực đĩa petri khơng có rào cản vật lý colony Rào cản phải tạo cách loại bỏ môi trường đặt vịng thép khơng gỉ gốm xung quanh colony cần phân lập Cũng sử dụng thủy tinh có thành dày (Fisher Bellco) nhựa (được cắt từ ống có thành dày nylon, silicone Teflon) Dù vật liệu gì, đế phải nhẵn để dán mỡ silicon vào đĩa petri đường kính phải vừa đủ rộng để bao quanh tồn colony, đường kính ngồi khơng chồng lên colony bên cạnh Hình Cloning rings 33 Giảo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật a Nguyên vật liệu Tế bào nuôi cấy, đĩa 24 giếng hay Roux 25 cm2, môi trường nuôi cấy, buồng đếm hồng cầu, cloning rings, pipette 100 pl đầu tip vô trùng, mỡ silicon cloning ring tiệt trùng nhiệt khô (160°C giờ) hấp tiệt trùng 121 °C 15 phút đĩa Petri thủy tinh b Tiến hành - Kiểm tra dòng tế bào đánh dấu dòng mà bạn muốn phân lập bút đánh dấu mặt đĩa - Lấy môi trường khỏi đĩa rửa nhẹ nhàng dòng tế bào PBS - Sử dụng kẹp vô trùng, lấy cloning ring nhúng vào silicon ấn xuống đĩa với mỡ silicon, để phết mỡ xung quanh đế cloning ring - Đặt vòng xung quanh colony mong muốn - Lặp lại hai bước cho hai ba colony khác đĩa - Thêm lượng trypsin 0,25% vừa đủ để lấp đầy lỗ vòng (0,1-0,4 ml, tùy thuộc vào đường kính vịng) - Đe trypsin 20 giây lấy - Đậy đĩa ủ 15 phút 37°c - Thêm 0,1-0,4 ml mơi trường vào vịng - Lần lượt lấy dịng tế bào, dùng pipet hút mơi trường lên xuống để phân tán tế bào chuyển môi trường vào phiến đĩa 24 giếng vào Roux 25 cm2 dựng đứng Sử dụng pipet riêng đầu pipet riêng cho dòng tế bào - Rửa vịng 0,1-0,4 ml mơi trường chuyển môi trường vào giếng Roux Ghi chú: Đĩa bị khô để mở lâu Hoặc giới hạn số lượng dòng tế bào phân lập dòng tế bào bị phủ lên đĩa nuôi cấy - Cho môi trường giếng đến ml đóng đĩa ủ Neu sử dụng Roux, thêm ml môi trường vào Roux ủ Roux dựng đứng - Khi dòng tế bào phát triển Ịấp đầy giếng, cấy truyền sang Roux 25 cm2, ủ với ml môi trường Tiếp tục ni cấy 3.4.2 Phân tách dịng tễ bào huyền phù Hút colony vào pipet pipet Pasteur chuyển colony vào bình tam giác giếng đĩa nhiều giếng a Nguyên liệu - Môi trường nuôi cấy - Đĩa giếng, Roux 25 cm2, đầu tip màu vàng pipet Pasteur - Kính hiển vi soi độ phóng đại 20 - 50 lần, micropipette 10-100 pl, 100-1000 pl 34 Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật b Tiến hành - Kiểm tra đĩa kính hiển vi đảo ngược đánh dấu colony; - Dùng pipet hút ml môi trường vào giếng đĩa 24 giếng; - Chọn colony kính hiển vi soi nổi; - Sử dụng micropipette/pipet Pasteur để thu nhận colony; - Chỉnh micropipette thành 100 pl, hút khoảng 50 pl môi trường, sau hút colony cần phân lập; - Chuyển colony môi trường vừa hút sang giếng đĩa 24 giếng hút nhả môi trường để tách tế bào đon từ colony Neu môi trường làm từ agar, dùng micropipette hút lên nhả xuống vài lần giếng để phân tán agar Các dòng tế bào gieo trực tiếp vào Roux 25 cm2 dựng đứng YÊU CẦU - Tạo colony từ tế bào giếng; - Tạo dịng tế bào bám dính/tế bào huyền phù; - Thu nhận dòng tế bào tạo CÂU HỎI - Ý nghĩa việc tạo dòng - Các lưu ý tạo dịng phương pháp pha lỗng - Tại phải cho tế bào vào giếng tạo dòng tế bào phương pháp pha lỗng? 35 Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật BÀI CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA Độc TÍNH TRÊN TẾ BÀO ĐỘNG VẬT MỤC TIÊU Sinh viên thực nghiên cứu sử dụng phương pháp giới thiệu để kiểm tra khả gây độc tế bào số đối tượng nghiên cứu chiết xuất thực vật, thuốc, vật liệu nano Cơ SỞ LÝ THUYẾT Độc tính tế bào mức độ chất gây hại cho tế bào Một chất trình gây tổn thương giết chết tế bào gọi gây độc tế bào Khi tiếp xúc với hợp chất có khả gây độc tế bào tế bào bị hoại tử (necrosis), chết theo lập trình (apoptosis) chết theo kiểu tự thực (autophagy) Trường hợp khơng chết tế bào trạng thái ngừng phát triển ngừng phân chia để giảm tăng sinh tế bào Các xét nghiệm kiểm tra độc tính tế bào sử dụng để kiểm tra khả hợp chất gây độc tế bào, làm tổn thương giết chết tế bào Ngày nay, phương pháp xét nghiệm độc tính tế bào sử dụng phổ biến nghiên cứu nghiên cứu phát triển thuốc Xét nghiệm giúp sàng lọc hợp chất độc hại Trong nghiên cứu phát triển thuốc, độc tính tế bào điểm quan trọng cuối cần kiểm tra song song với thí nghiệm đánh giá tác dụng hợp chất định hợp chất có tiếp tục sử dụng hay khơng Neu hợp chất gây phản ứng độc tế bào bị loại bỏ khỏi vịng sàng lọc đánh giá phương pháp điều trị sử dụng dược phẩm tiềm Bên cạnh đó, hợp chất tác động nhắm đích vào q trình phân chia tế bào cách nhanh chóng ứng cử viên sử dụng làm thuốc điều trị ung thư Có nhiều phương pháp kiểm tra độc tính tế bào xét nghiệm khả sống tế bào, xét nghiệm độc tính tế bào thông qua enzyme, xét nghiệm tế bào chết theo lập trình, xét nghiệm tề bào tự thực, xét nghiệm tăng sinh tế bào, xét nghiệm độc tính lipid Thông qua kết tế bào sống tăng sinh kết luận hợp chất kiểm nghiệm có gây ảnh hưởng (gây độc) tới tế bào hay không có mức độ Trong thực hành này, xét nghiệm khả sống tăng sinh tế bào sử dụng muối tetrazolium (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide or MTT) giới thiệu hướng dẫn sinh viên thực Nguyên lý phương pháp dựa hoạt động trao đổi chất tế bào Các tế bào sống có chứa enzyme NAD(P)H-dependent oxidoreductase enzyme kết hợp với MTT khử muối tetrazolium màu vàng tạo thành tinh thể formazan màu tím MTĨ salt Hình Cấu trúc hóa học muối MTT yà formazan 36 Giảo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật Các tinh thể formazan hòa tan dung dịch hịa tan dung dịch có màu xác định giá trị mật độ quang (OD) bước sóng 500-600 nm Dung dịch sẫm màu số lượng tế bào hoạt động trao đổi chất nhiều, hay nói cách khác tế bào cịn sống và/hoặc tăng sinh nhiều Ngồi việc sử dụng xét nghiệm độc tính tế bào, phương pháp sử dụng MTT sử dụng để định lượng phát triển khả sống tế bào, nghiên cứu kích hoạt tế bào, đo lường khả tăng sinh tế bào để đáp ứng với yếu tố kích thích sinh trưởng, chất dinh dưỡng cytokines VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 3.1 Hóa chất, môỉ trường - MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (lx), pha với nồng độ mg/ml phosphate buffered saline (PBS) Dung dịch hòa tan tinh thể formazan sodium dodecyl sulfate (SDS) - - Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM RPMI có bổ sung 10% huyết thai bê (FCS), 1% kháng sinh gồm penicillin streptomycin/gentamycin Chất cần xét nghiệm có khả gây độc tế bào hay không (gọi chung chat X) - 3.2 Dụng cụ - Đĩa 96 giếng có đáy giếng phẳng - Micropipette - Đầu tip 3.3 Tế bào - Tế bào dòng ung thư - Tế bào dòng nguyên bào sợi 3.4 Quy trình thực - Ni cấy mơi trường DMEM RPMI có bổ sung 10% huyết thai bê 1% kháng sinh 37°c, 5% CƠ2 - Đưa tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ X 104 tế bào/giếng 100 pl môi trường DMEM RPMI có bồ sung 10% FCS 1% kháng sinh (penicillin + streptomycin/gentamycin) - Nuôi cấy tế bào tủ ấm 37°c, 5% CO2 24 - Tiếp tục bổ sung 10 ỊLil dung dịch MTT pha với nồng độ 0,5 mg/ml vào giến - Để đĩa vào tủ 37°c, 5% CO2 - Bồ sung 100 Ị11 dung dịch hòa tan tinh thể SDS vào giếng - Để đĩa qua đêm tủ 37°c, 5% CO2 - Kiểm tra tinh thể màu tím hịa tan hồn tồn trước đo OD máy đọc EL1SA, bước sóng từ 550-600 nm (thơng thường sử dụng 570 nm) Bước sóng tham khảo 650 nm 37 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật YÊƯ CÀU - Thiết kế thí nghiệm thử độc tính tế bào với nồng độ chất thử tế bào ung thư tế bào thường - Phân tích kết vẽ biểu đồ tỷ lệ tế bào sống, tế bào chết CÂU HỎI - Phân biệt tế bào chết hoại tử (necrosis), chết theo lập trình (apoptosis) chết theo kiểu tự thực (autophagy) - Nguyên lý phương pháp sử dụng MTT việc xác định khả sống tăng sinh tế bào 38 - Trình bày ứng dụng xét nghiệm độc tính tế bào - Trình bày phương pháp khác xác định khả sống tăng sinh tế bào Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật BÀI KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO ĐỘNG VẬT MỤC TIÊU Bài thực hành cung cấp thông tin kỹ nâng cao cho sinh viên thực nghiên cứu chuyên sâu hon lĩnh vực liên quan tham khảo Cơ SỞ LÝ THUYẾT Chuyển gen vào tế bào động vật kỹ thuật đưa vật chất di truyền ngoại lai vào bên tế bào, từ thay đổi biểu protein tế bào Vật chất di truyền thường DNA, RNA Phưong pháp chuyển gen thơng qua virus (viral method) khơng thơng qua trung gian virus (non-viral method) Các phưong pháp chuyển gen chủ yếu bao gồm: - Phưong pháp qua trung gian virus phưong pháp sinh học - Phưcmg pháp hóa học - Phương pháp vật lý Hình Chuyển gen vào tế bào động vật Chuyến gen qua trung gian virus Các virus thường sử dụng kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật bao gồm: adenovirus, retrovirus, virus có liên quan đến Adeno (Adeno associated viruses), virus herpes đơn giản (Herpes simplex viruses), virus đậu mùa Các bước kỹ thuật chuyển gen qua trung gian virus bao gồm: - Tạo virus tái tổ hợp chứa gen chuyển - Khuếch đại hạt virus - Tinh hạt virus - Gây nhiễm cho loại tế bào cụ thể - Tích hợp gen chuyển vào gen tế bào chủ 39 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Hình Chuyển gen qua trung gian virus Phương pháp chuyển gen vật lý - Điện di/xung điện (Electroporation) - Vi tiêm (Microinjection) - Súng chuyển gen (Gene gun or biolistic gene transfer) - Siêu âm (Sonoporation) - Chiếu tia laser (Optoporation) Phương pháp chuyển gen hóa học - Phưong pháp sử dụng DEAE (Diethylaminoethyl)-dextran - Phương pháp chuyển gen Canxi Phosphate - Phương pháp chuyển gen qua trung gian lipid - Phương pháp chuyển gen sử dụng từ trường (Magnetofection) VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Bài thực hành hướng dẫn sinh viên phương pháp chuyển gen vào tế bào sử dụng phương pháp Canxi phosphate, phương pháp hóa học thường sử dụng việc chuyển DNA vào tế bào nhân thực Phương pháp phổ biến có tính hiệu cao Thực tế nghiên cứu nhà nghiên cứu thường kết hợp kỹ thuật Canxi phosphate với số kỹ thuật protein để thay đổi biểu tế bào xác nhận thay đổi có hiệu Các kỹ thuật kết hợp gồm Immunoprecipia (IP) Western Blot Kỹ thuật chuyển gen Canxi phosphate sử dụng với mục đích thu chuyển gen (biến nạp) ổn định tạm thời nhiều loại tế bào khác Khi đưa DNA vào tế bào tế bào giữ DNA tạm thời vĩnh viễn Trường hợp tạm thời, tể bào giữ DNA dạng plasmid đóng gói biểu DNA tế bào phân chia Còn tế bào giữ DNA vĩnh viễn DNA tích hợp vào gen tế bào DNA chuyền cho tế bào tế bào phân chia Trước đưa vào tế bào nhân chuẩn, DNA cần trung hòa điện tích Bề mặt tế bào tích điện âm khơng xử lý DNA bị đẩy khỏi bề mặt tế bào Ngay DNA đưa vào tế bào màng nhân khơng tiếp nhận DNA vấn đề điện tích 40 Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tể bào động vật Kỹ thuật thường dùng để trung hịa điện tích DNA Canxi Phosphate Các bước chuyển gen với Canxi phosphate đơn giản sau: - Tạo chuỗi DNA - Trộn canxi phosphate với DNA tạo kết tủa hạt nano - Ù với tế bào - Chọn tế bào biểu DNA quan tâm Các hạt nano canxi phosphate tế bào thực bào thuận lợi hạt nano vào nhân tế bào Chuyển gen phương pháp canxi phosphate dễ thực tính ổn định tạo nhờ ion Ca2+ Nguyên lý: quy trình chuyển gen dựa việc pha trộn cách từ từ dung dịch muối đệm HEPES có chứa Natri phosphate với dung dịch CaCh có chứa DNA Kết tủa DNA-canxi phosphate bám vào bề mặt tế bào tế bào hấp thụ theo kiểu nhập nội bào Gây sốc Glycerol tăng khả tiếp nhận DNA số loại tế bào 3.1 Vật liệu - Phin lọc vô trùng 0,2pM - Đĩa 3.5 cm, đĩa 6-12 giếng - CaCh2.5M(l ống) - Nước dành cho sinh học phân tử (25 ml) - Muối đệm Hepes 2x, pH 7,05 gồm: 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPƠ4 Các loại dung dịch bảo quản -20°C đưa nhiệt độ phòng trước sử dụng 3.2 Tế bào plasmid - Tế bào dòng CHO (Chinese hamster ovary cells), HELA dòng tế bào thường sử dụng việc chuyền gen - Plasmid thường sử dụng để chuyển gen tùy vào mục đích thí nghiệm (ví dụ: pSV40-CAT plasmid) DNA plasmid phải có chất lượng cao, kết tủa ethanol, tạo huyền phù nước dành cho sinh học phân tử để pha thành nồng độ pg/ml 3.3 Nguyên liệu, môi trường Te bào thường nuôi môi trường có huyết khơng có huyết tùy theo loại tế bào Lưu ý không bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy - Tế bào HeLa - Mơi trường DMEM có bổ sung FCS (hoặc khơng bổ sung FCS) - DNA (10-50 ug/một lần chuyển gen) - 2.5 M CaCb Dung dịch muối đệm Hepes (2x) (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES, 1.5 mM NaHPO, PBS có pH 7,05) 41 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật - Đĩa nuôi cấy tế bào 3.4 Quy trình thực - Tách tế bào cho có khoảng cách tế bào Làm DNA cách bả sung ethanol có nồng độ 100% để kết tủa Làm khô DNA sau hút dịch từ ethanol Sử dụng khí để làm khơ hồn tồn Hịa tan DNA 450 pl H2O với 50 pl 2.5 M đệm CaCh - Đưa 500 pl dung dịch muối đệm Hepes 2x vào ống falcon 15 ml - Thêm giọt DNA/CaCh vào ống khuấy khuấy - Để kết tủa nhiệt độ phòng 20 phút Trải kết tủa lên tế bào môi trường Lắc nhẹ để kết tủa trải - Nuôi tủ ấm 37°c với 5% CƠ2 16 - Loại bỏ môi trường, rửa lần với PBS nuôi tế bào mơi trường có bo sung FCS Đưa tế bào vào môi trường chọn lọc Kiểm tra kết chuyển gen YÊU CẦU - Thao tác bước quy trình chuyển gen Quan sát tế bào sau chuyển gen trước sau đưa vào môi trường chọn lọc CÂU HỎI - Nêu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen Nhận biết tế bào chuyển gen thành công - 42 Nêu nguyên lý phương pháp chuyển gen Canxi phosphate Giáo trình thực hành Kỹ thuật ni cấy tế bào động vật TÀI LIỆU THAM KHẢO Amanda Cape-Davis, R Ian Freshney Freshney's Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 8th Edition, Wiley-Blackwell, 2021 ISBN: 978-1-119-51304-9 Agnieszka Fus-Kujawa, Pawel Prus, Karolina Bajdak-Rusinek, Paulina Teper, Katarzyna Gawron, Agnieszka Kowalczuk, Aleksander L Sieron An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro Fron Bioeng Biotechnol, 2021, vol 9, http://doi.Org/l 0.2289/fbioe.2021701031 Anju Verma, Megha Verma, andAnchal Singh’ Animal tissue culture principles and applications, Animal Biotechnology, 2020 : 269-293 doi: 10.1016/B978-0-12-8117101.00012-4 Berridge M, Tan A Characterization of the Cellular Reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): Subcellular Localization, Substrate Dependence, and Involvement of Mitochondrial Electron Transport in MTT Reduction Archives of Biochemistry and Biophysics, 1993, 303(2):474482 https://doi.org/10.1006/abbi.1993.1311 Debra F Saxe, Kristin M May, Jean H Priest General cell culture principles and fibroblast culture Book Editor(s): Marilyn s Arsham, Margaret J Barch M.S., CG(ASCP)CM, Helen J Lawce B.S., CG(ASCP)CM, 2017, https://doi.org/10.1002/9781119061199.ch4 Floch et al Cationic phosphonolipids as non-viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells Blood Cells Molec.& Diseases, 1997,23:69-87 Guillaume-Gable et al Cationic phosphonolipids as nonviral gene transfer agents in the lung of mice Hum Gene Ther 1998, 9:2309-2319 Karthik Raman Calcium phosphate transient transfection protocol and guides, 2016, https://scigine.com/blog/calcium-phosphate-transient-transfection Varsha Gupta, Manjistha Sengupta, Jaya Prakash, Baishnab Charan Tripathy, Basic and Applied Aspects of Biotechnology, Spinger, 2016, ISBN-13 : 978-9811008733 Vistica VT, Skehan p, Scudiero D, Monks A, Pittman A, Boyd MR Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production Cancer Res., 1991, 51(10):2515-20 https://www.abcam.com https://www.sigmaaldrich.com https://www.thermofisher.com 43