Chuẩn bị dụng cụ, môi trường và hóa chất để nuôi cấy tế bào
Giúp sinh viên biết được cách chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, môi trường trong nuôi cấy tế bào.
Te bào động vật trong nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng chậm hon rất nhiều so với vi sinh vật
Để nuôi cấy tế bào động vật hiệu quả, tất cả dụng cụ, môi trường, hóa chất và thiết bị liên quan, cũng như phòng nuôi cấy, cần phải được đảm bảo vô trùng thông qua nhiều phương pháp tiệt trùng khác nhau.
Tiệt trùng là quá trình quan trọng nhằm tiêu diệt các tác nhân xâm nhiễm như vi khuẩn, virus, nấm và bào tử có trên bề mặt, trong môi trường, hóa chất, cũng như dụng cụ và thiết bị trong nuôi cấy tế bào Quá trình này được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm nhiệt độ cao, hóa chất, lọc, chiếu xạ hoặc sự kết hợp của các phương pháp này.
Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt độ cao hiệu quả trong việc biến tính protein, đứt gãy DNA và phá vỡ màng tế bào vi sinh vật Tiệt trùng có thể thực hiện bằng lửa từ đèn cồn hoặc khí để đốt cháy dụng cụ kim loại như dao, kéo, kẹp, hoặc sử dụng nhiệt khô trong tủ sấy với thời gian 2 giờ ở 160°C hoặc 30 phút ở 180°C Ngoài ra, autoclave cũng là một phương pháp hữu hiệu để tiêu diệt các nội bào kháng nhiệt của dụng cụ và thiết bị bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao.
Nhiều loại hóa chất được dùng để tiệt trùng như cồn 70° (dạng lỏng) hay Ethylene Oxyde
Khí EO (ethylene oxide) kết hợp với cồn 70° có khả năng biến tính protein của vi sinh vật, giúp tiêu diệt vi khuẩn và nấm, nhưng không ảnh hưởng đến bào tử Đây là một phương pháp tiệt trùng hiệu quả cho các bề mặt và dụng cụ thiết bị, tiêu diệt toàn bộ vi khuẩn, virus, nấm và bào tử Khí EO có khả năng xuyên qua nhiều loại vật liệu như giấy, vải và nhựa, phù hợp với hầu hết các vật liệu, kể cả những vật liệu được sử dụng nhiều lần.
Phương pháp tiệt trùng bằng chiếu xạ, bao gồm tia tử ngoại (UV) và tia gamma, có khả năng tiệt trùng hiệu quả Tia UV đặc biệt hiệu quả trong việc tiệt trùng bề mặt trong các không gian nhỏ và vừa, phù hợp cho việc tiệt trùng phòng nuôi cấy, tủ thao tác và các dụng cụ, thiết bị Trong khi đó, tia gamma có khả năng xuyên thấu, thường được sử dụng để tiệt trùng bên trong các dụng cụ, thiết bị và vật liệu.
Phương pháp tiệt trùng bằng lọc là kỹ thuật hiệu quả để loại bỏ vi sinh vật dựa trên kích thước lỗ của màng lọc Phương pháp này thường được áp dụng cho các dung dịch hoặc môi trường không chịu nhiệt Màng lọc sẽ giữ lại các vi sinh vật có kích thước lớn hơn kích thước lỗ của nó, đảm bảo an toàn cho sản phẩm.
Để nuôi cấy tế bào hiệu quả, việc chuẩn bị dụng cụ là rất quan trọng Các bước cần thực hiện bao gồm: rửa sạch, sấy khô, gói, tiệt trùng và bảo quản trong điều kiện thích hợp cho đến khi sử dụng.
Các dụng cụ bên dưới là các dụng cụ thường được dùng trong thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật
- Kéo, kẹp, cán dao mô
Để rửa sạch các dụng cụ trong nuôi cấy tế bào, có thể sử dụng các dung dịch rửa thông thường Ngâm dụng cụ trong dung dịch này từ 15-20 phút, sau đó rửa lại dưới vòi nước hoặc dùng máy rửa dụng cụ để đảm bảo sạch sẽ.
Thông thường các dụng cụ thường được gói bằng giấy hoặc giấy nhôm aluminum trước khi tiệt trùng bằng nhiệt ẩm.
Để tiệt trùng dụng cụ hiệu quả, cần áp dụng các phương pháp phù hợp như nhiệt độ cao, hóa chất hoặc chiếu xạ Dụng cụ bằng kim loại, thủy tinh và một số loại nhựa chịu nhiệt có thể được tiệt trùng bằng nhiệt độ cao, trong khi những dụng cụ nhựa không chịu nhiệt nên sử dụng phương pháp chiếu xạ để đảm bảo an toàn và hiệu quả.
3.2 Chuẩn bị môi trường, hóa chấtsửdụngtrong nuôi cấy tế bào
Các môi trường, hóa chất bên dưới thường được dùng trong thu nhận và nuôi cấy tế bào:
Dung dịch đệm phosphate (PBS) là một dung dịch quan trọng trong nghiên cứu sinh học, được pha chế với pH 7,4 Công thức pha 1 lít dung dịch PBS bao gồm 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 và 0,245 g KH2PO4 Để đảm bảo tính vô trùng, dung dịch này cần được tiệt trùng bằng phương pháp lọc hoặc nhiệt.
- Huyết thanh thai bò (Fetal bovine serum - FBS) có thể được tiệt trùng bằng phương pháp lọc.
- Môi trường nuôi cấy cơ bản có 10% FBS, 1% kháng sinh Penicillin/Streptomycin.
Chuẩn bị 100 ml môi trường nuôi cấy tế bào DMEM với 10% FBS và 1% kháng sinh bằng cách pha trộn 10 ml FBS, 1 ml kháng sinh và thêm môi trường DMEM lỏng cho đến đủ 100 ml Sau đó, tiến hành tiệt trùng môi trường này bằng phương pháp lọc.
- Môi trường đông lạnh có 10% DMSO: Pha 100 ml môi trường đông lạnh có 10% DMSO
(10 ml DMSO, 90 ml môi trường nuôi cấy tế bào DMEM 10% huyết thanh, 1% kháng sinh), được tiệt trùng bằng phương pháp lọc.
- Trypan blue 0,5%: Pha 10 ml thuốc nhuộm Trypan blue 0,5% (0,05 g Trypan blue trong dung dịch đệm PBS)
- Sinh viên trình bày được cách chuẩn bị các dụng cụ thường được dùng trong nuôi cấy tế bào động vật: rửa, sấy, gói, tiệt trùng, bảo quản.
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
- Sinh viên biết cách chuẩn bị các hóa chất, môi trường để dùng trong nuôi cấy tế bào động vật: pha, tiệt trùng, bảo quản.
- Nêu các phương pháp tiệt trùng môi trường nuôi cấy tế bào, thiết bị, dụng cụ, hóa chất? Giải thích.
- Tại sao cần phải bổ sung FBS cũng như kháng sinh vào môi trường nuôi cấy tế bào động vật?
BAI 2 THU TE BAO DON TU MO D(>NG V �T
Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra phôi, tùy thuộc vào từng loại tế bào trứng Quy trình xác định chất lượng tế bào trứng là rất quan trọng trước khi tiến hành nuôi cấy phôi.
Kỹ thuật thu nhận và nuôi cấy tế bào động vật đang ngày càng được quan tâm vì khả năng giúp hiểu rõ các chức năng của tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật là quá trình tách tế bào động vật ra khỏi mô và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện nhân tạo Qua quá trình nuôi cấy tế bào động vật, những dòng tế bào thu được sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm quan trọng sau đó.
C6 có nhiều phương pháp thu nhận tế bào đơn như phương pháp nuôi cấy tế bào mạnh mẽ, phương pháp cấy ghép hay phương pháp sử dụng enzyme Mỗi phương pháp phụ thuộc vào loại mô và số lượng mẫu mô Đối với phương pháp nuôi cấy mạnh mẽ, có thể thu nhận tế bào đơn một cách hiệu quả; trong khi đó, phương pháp cấy ghép hay sử dụng enzyme sẽ thu được một dịch huyền phù tế bào, sau đó dịch huyền phù được pha loãng và nuôi cấy tiếp Thu nhận tế bào bằng phương pháp sử dụng enzyme có thể thu được một lượng lớn tế bào đơn và nhiều tế bào có khả năng sống trong một thời gian ngắn Do đó, việc nuôi cấy tế bào bằng phương pháp sử dụng enzyme cho kết quả tốt hơn, thời gian thu nhận ngắn hơn so với phương pháp thu nhận tế bào đơn bằng phương pháp cấy ghép.
Nhiều loại enzyme được sử dụng để thu nhấn tế bào đơn như collagenase, pronase, hyaluronidase, elastase, nhưng enzyme trypsin được sử dụng rộng rãi vì hiệu quả thu nhấn tế bào đơn cao và giá thành hợp lý Trypsin có khả năng phân tách tế bào bằng cách thủy phân các protein liên kết giữa các tế bào Trong quá trình sử dụng trypsin, cần chú ý đến khả năng tách tế bào và trypsin có thể làm tổn thương màng tế bào, do đó cần xác định nồng độ enzyme và thời gian tách tế bào tối ưu cho từng loại mô khác nhau Vì vậy, trong quá trình thu nhấn tế bào, enzyme trypsin nên được sử dụng ở nhiệt độ 36,5 °C (trypsin hoạt động) và thu nhận tế bào đơn mỗi 30 phút một lần Cuối cùng, trypsin sẽ được loại bỏ bằng cách thêm huyết thanh vào môi trường để inactivate trypsin hoặc ly tâm.
Nuôi cấy sơ cấp nguyên bào sợi
Bài thực hành này giúp sinh viên thu nhận và nuôi cấy nguyên bào sợi từ mô động vật thí nghiệm, đồng thời quan sát sự sinh trưởng của tế bào trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp.
Nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn đầu tiên trong quá trình nuôi cấy tế bào, nơi các tế bào hoặc mảnh mô được tách ra từ mô hay cơ quan nhằm tạo ra tế bào cho nuôi cấy thứ cấp và tạo dòng tế bào Tế bào thu được trong giai đoạn này được gọi là tế bào sơ cấp, có nguồn gốc từ mô sống và được nuôi cấy trong điều kiện in vitro, mang đặc điểm gần giống với trạng thái sinh lý của mô gốc Mặc dù tế bào sơ cấp thường không thuần nhất và chứa nhiều loại tế bào khác nhau, nhưng chúng vẫn được sử dụng rộng rãi trong các mô hình nghiên cứu sinh học Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy, tế bào sơ cấp có xu hướng thoái hóa và cần được thiết lập lại thường xuyên để duy trì chất lượng.
Nguyên bào sợi (fibroblast) là tế bào chính trong mô liên kết, có khả năng tăng trưởng mạnh mẽ và đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc của mô Chúng thường được chọn để nuôi cấy và nghiên cứu, bên cạnh các tế bào khác như tế bào biểu mô, tế bào nội mô, và các tế bào miễn dịch như lympho B, lympho T, tế bào tua và đại thực bào Mô phôi được ưa chuộng nhất cho việc nuôi cấy sơ cấp nguyên bào sợi do khả năng sống sót cao của tế bào thu được Ngoài ra, mô từ chuột nhắt trắng cũng thường được sử dụng để khai thác và nuôi cấy tế bào nguyên bào sợi.
- Trứng gà có phôi đã ấp 10 ngày
- Môi trường DMEM chứa 10% huyết thanh, 1% kháng sinh
Kính hiển vi quang học
Roux 25 cm2/đĩapetri 35 mm Ống ly tâm 15ml
Cá khuấy từ Kẹp cong Kéo thẳng, kéo cong Cán dao, lưỡi dao Lamelle Đầu tip 100- 1000 pl Đầu tip 10 - 100 |11 Bông gòn Đĩa petri thủy tinh Găng tay
3.2.1 Thu nhận mô từ phôi gà a Kỹ thuật lẩy phôi gà
- ủ trứng gà ở 38,5°c và hằng ngày đảo trứng (xoay trứng 180°) Sử dụng trứng 8-10 ngày để nuôi cấy tế bào.
- Dùng bông gòn thấm cồn 70° để lau trứng Đặt trứng vào becher nhỏ sao cho đầu to của trứng quay lên trên.
- Dùng kẹp vô trùng làm rạn đỉnh của vỏ và bóc dần vỏ đến rìa của buồng khí.
Tiệt trùng kẹp bằng cách nhúng vào cồn và hơ qua đèn cồn trước khi làm nguội trong PBS Sử dụng kẹp để bóc bỏ màng trắng của vỏ, lộ ra màng đệm và các mạch máu bên dưới Dùng kẹp cong vô trùng để chọc thủng màng đệm, nhẹ nhàng kẹp phần dưới đầu phôi để nhấc phôi ra, lưu ý không siết kẹp quá chặt để tránh cắt đứt cổ phôi.
- Chuyển phôi vào đĩa petri b Kỹ thuật tách mô cơ ở phôi gà
Lưu ý: ở 10 ngày tuổi, khối lượng mô cơ của phôi gà chiếm tỷ lệ cao.
- Dùng kẹp cong kẹp vùng ngay dưới đầu của phôi và lấy ra khỏi vỏ trứng.
- Chuyển phôi vào đĩa petri chứa sẵn PBS.
- Cắt bỏ đầu và các chi.
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tể bào động vật
- Dùng kéo nhỏ mở lồng ngực và loại bỏ nội quan.
- Lột bỏ phần da để loại bỏ lông.
- Chuyển sang đĩa petri khác đã chứa sẵn PBS.
- Cắt thành những khối nhỏ Tìm các mô cần chọn.
Hình 5.Thu nhận phôi từ trứng và cắt các mảnh mồ. c Xử lí mẫu và nuôi cấy sơ cấp
Trong bài thực hành này, chúng ta sử dụng quy trình trypsin ấm.
- Chuyển mô vào đĩa petri có chứa PBS vô trùng và rửa.
- Chuyển sang đĩa thứ 2, cắt bỏ những phần mô không cần thiết Sau đó dùng dao mổ cắt thành những khối khoảng 3 mm3.
- Dùng kẹp chuyển mô vào erlen loại 50 ml đã chứa sẵn PBS
- Rửa lại các mảnh mô trong PBS để mô được ồn định, sau đó loại bỏ phần dịch trong bên trên Lặp lại quá trình rửa mô này 2-3 lần.
- Sau khi rửa sạch mẫu (loại bỏ phần PBS rửa mẫu lần cuối), thêm trypsin 0,25% (1ml trypsin 0,25% cho mỗi 100 mg mô) vào erlen.
- Khuấy từ gia nhiệt: 200 vòng/phút, trong 30 phút, ở 36,5°c.
Ly tâm phần dịch nổi với tốc độ khoảng 1000 vòng/phút trong 10 phút Sau khi ly tâm, loại bỏ dịch ở phía trên và hòa trộn các tế bào (phần cặn sau ly tâm) với môi trường lml.
- Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, xác định mật độ tế bào.
- Chuyển tế bào vào đĩa nuôi với mật độ là 106 tế bào/ml, bổ sung môi trường.
- ủ ở 36,5°c, sau 24 giờ quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược, ghi nhận kết quả.
3.2.2 Thu nhận mô thận, phổi, xương đuôi của chuột nhắt a Thu mẫu mô thận và phổi:
Sử dụng gòn thấm cồn 70° để lau sạch vùng da chuột, sau đó tiến hành giải phẫu để thu thập thận và phổi, giữ mẫu riêng biệt trong PBS Rửa sạch mẫu nhiều lần với PBS nhằm loại bỏ máu và mô thừa Nghiền nhỏ mô bằng cách ép giữa hai lame kính sạch, sau đó tách tế bào đơn bằng 0,5 ml Trypsin EDTA 0,25% trong 5-10 phút và ủ mẫu trong tủ nuôi cấy ở 37°C với 5% CO2 Sử dụng 0,5 ml môi trường bất hoạt Trypsin để thu tế bào vào eppendorf 1.5 ml, ly tâm với tốc độ 5200 vòng/phút trong 5 phút ở 25°C, và thu tế bào với 1 ml môi trường nuôi cấy DMEM/10% FBS/1% kháng sinh Cuối cùng, nuôi mẫu trong tủ nuôi cấy ở 37°C với 5% CO2.
Sử dụng bông gòn thấm cồn 70° để vệ sinh vùng da chuột đã hi sinh, sau đó tiến hành giải phẫu để thu nhận xương đuôi và bảo quản trong PBS Tiến hành loại bỏ da đuôi và thu thập phần xương bên trong, cắt nhỏ mẫu thành các đoạn 2-3 mm Rửa sạch nhiều lần với PBS, sau đó chuyển xương vào đĩa nuôi cấy Sử dụng miếng kính để cố định xương theo phương pháp cố định mẫu, bổ sung 1,5ml môi trường nuôi cấy DMEM/10% FBS và 1% kháng sinh penicillin và streptomycin Cuối cùng, ủ mẫu trong tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2.
3.2.3 Duy trì tế bào nuôi cấy
Để nuôi cấy tế bào hiệu quả, cần thực hiện ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 Tùy thuộc vào tình trạng của đĩa nuôi cấy, có thể thêm hoặc thay đổi môi trường Khi cần thay môi trường, trước tiên phải loại bỏ môi trường cũ, sau đó rửa đĩa bằng dung dịch PBS và tiếp tục đổ bỏ PBS Cuối cùng, thêm môi trường mới vào bình nuôi cấy.
- Xác định được mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu và điều chỉnh mật độ tế bào về mật độ tế bào thích hợp để nuôi cấy.
- Nuôi cấy sơ cấp được tế bào nguyên bào sợi từ phôi gà/từ mô thận, phổi, xương đuôi chuột nhắt trắng.
Quan sát và ghi nhận sự phát triển của tế bào thu từ phôi gà hoặc mô chuột nhắt trắng trong quá trình nuôi cấy in vitro theo thời gian, bao gồm các yếu tố như tình trạng bám dính hoặc lơ lửng, hình dạng tế bào, mức độ khỏe mạnh hoặc yếu, phần trăm hợp dòng, và tình trạng nhiễm hoặc không nhiễm.
- Trình bày ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật.
- Tại sao các phòng thí nghiệm thường chọn nguyên bào sợi để nuôi cấy?
- Cho biết hiện tượng đĩa nuôi cấy bị nhiễm vi sinh vật?
- Nêu các dấu hiệu nhận biết tế bào nguyên bào sợi sống khỏe mạnh trong nuôi cấy tế bào.
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Nuôi cấy thứ cấp tế bào động vật
Bài thực hành này giúp sình viên có khả năng nuôi cấy và thu nhận một số lượng lớn tế bào dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nuôi cấy thứ cấp tế bào bắt đầu từ lần cấy chuyền đầu tiên của tế bào nuôi cấy sơ cấp, là kỹ thuật quan trọng trong nuôi cấy tế bào động vật Cấy chuyền cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cần thiết cho sự phát triển liên tục của các dòng tế bào Tần suất cấy chuyền và tỷ lệ pha loãng, tức nồng độ tế bào, phụ thuộc vào đặc tính riêng của từng dòng tế bào Tỷ lệ pha loãng được xác định bằng cách chia đều lượng tế bào từ một giếng ban đầu cho các giếng mới, ví dụ, nếu chia cho bốn giếng, tỷ lệ pha loãng sẽ là 1/4.
Cấy chuyền bao gồm các thao tác sau:
- Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ.
- Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám).
- Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi.
- Pha loãng các tế bào bàng môi trường mới.
Việc loại bỏ môi trường cũ có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau Đối với tế bào nuôi trong Roux hoặc đĩa nuôi đơn giếng, chỉ cần đổ bỏ môi trường cũ Nếu tế bào nuôi trong các đĩa đa giếng, cần sử dụng micropipette với đầu tip vô trùng để hút hết môi trường và rửa tế bào bằng PBS Tế bào thường được tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy bằng enzyme trypsin, và để loại bỏ enzyme này sau khi tách tế bào, có thể tiến hành ly tâm hoặc sử dụng huyết thanh để ức chế hoạt động của trypsin Một số tế bào bám không chặt có thể được tách ra chỉ bằng cách sử dụng pipette hút và huyền phù Đối với môi trường nuôi không có huyết thanh, cần phải trung hòa enzyme bằng chất ức chế protease.
Cấy chuyền tế bào bám dính yêu cầu nguyên vật liệu bao gồm tế bào nuôi cấy sơ cấp hoặc dòng tế bào Môi trường sử dụng là DMEM kết hợp với 10% FBS và 1% kháng sinh, cùng với DPBS không chứa Ca2+ và Mg2+, và Trypsin/EDTA 0,25% Quy trình cấy được thực hiện trên đĩa nuôi 35 mm hoặc Roux 25 cm2, sử dụng buồng đếm hồng cầu, MTT và Trypan blue để theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Tách bỏ môi trường khỏi bình nuôi.
- Rửa dụng cụ nuôi với PBS (5 ml/ Roux 25 cm2).
- Bổ sung dung dịch trypsin (2-3 ml/ Roux 25 cm2).
Trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C, sau 2-3 phút, cần lấy dụng cụ nuôi ra ngoài và quan sát dưới kính hiển vi Nếu các tế bào có hình cầu, điều đó cho thấy chúng đã tách ra khỏi bề mặt giá thể nuôi.
Khi các tế bào có hình cầu và nổi lên trên bề mặt dung dịch, tiến hành huyền phù với môi trường bổ sung huyết thanh (5 ml/Roux 25 cm2) và rửa tế bào bằng cách ly tâm ở tốc độ 800 vòng/phút trong 5-10 phút Sau đó, tái huyền phù tế bào bằng môi trường nuôi (5 ml/Roux 25 cm2).
Tỷ lệ pha loãng được đề nghị là 1:4.
3.2 Cấy chuyền tế bào huyền phù
- Chia dịch huyền phù ra các bình nuôi mới.
Để tách rời các cụm tế bào lớn trong bình nuôi, thêm Trypsin/EDTA 0,25% vào huyền phù Sau đó, bổ sung chất ức chế protease và ủ ở 37°C trong 2-3 phút Tiến hành ly tâm ở 800 vòng/phút trong 5-10 phút, sau đó tái huyền phù bằng môi trường nuôi với tỷ lệ 1:4 (5 ml/Roux 25 cm2).
Khi nuôi cấy mảnh mô, tế bào sẽ phát triển từ rìa của mảnh mô Quá trình nuôi cấy tiếp tục cho đến khi có các đám tế bào xung quanh rìa, sau đó tiến hành cấy chuyền Mô được chuyển từ bình nuôi cấy cũ sang bình mới để tiếp tục thu nhận tế bào Tế bào từ mảnh mô trong bình cũ vẫn được duy trì cho đến khi đạt đến trạng thái hợp dòng, lúc này sẽ áp dụng phương pháp cấy chuyền tế bào.
- Cấy chuyền được tế bào trong các dụng cụ nuôi cấy.
- Đánh giá được mức độ sống của tế bào sau cấy chuyền.
- Tại sao số lần cấy chuyền của mỗi loại tế bào khác nhau và có giới hạn?
- Ý nghĩa của kỹ thuật cấy chuyền?
- Trình bày các hiện tượng nhiễm vi sinh vật có thể xảy ra qua các lần cấy chuyền.
- Cho biết các tình trạng có thể có của tế bào sau khi cấy chuyền.
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Đông lạnh và giải đông tế bào
Bài thực hành này giúp sinh viên nắm vững kỹ thuật đông lạnh và giải đông tế bào, từ đó làm chủ việc lưu giữ và triển khai nuôi cấy tế bào khi cần thiết.
Trong quá trình nuôi cấy tế bào liên tục, các dòng tế bào có thể gặp phải biến đổi di truyền, lão hóa và nhiễm vi sinh vật Do việc thiết lập một dòng tế bào yêu cầu nhiều kinh phí, công sức và thời gian, việc đông lạnh và bảo quản tế bào đúng cách là cần thiết để lưu trữ lâu dài nguồn tế bào trong nghiên cứu và ứng dụng.
Phương pháp đông lạnh tế bào bám dính và huyền phù tương tự nhau, nhưng tế bào bám dính cần được tách ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy trước khi đông lạnh Để bảo quản tế bào nuôi cấy hiệu quả, nên sử dụng nitơ lỏng (-196°C) kết hợp với môi trường có bổ sung FBS và các tác nhân đông lạnh như glycerol hoặc dimethyl sulfoxide (DMSO) Những tác nhân này giúp giảm điểm đóng băng của môi trường, cho phép quá trình làm lạnh diễn ra chậm hơn và hạn chế sự hình thành tinh thể nước đá, từ đó bảo vệ tế bào khỏi hư hỏng và chết.
Để giảm thiểu sự hình thành các tinh thể gây hư hại tế bào, việc giải đông nhanh chóng là rất quan trọng, trái ngược với quá trình đông lạnh chậm.
- Môi trường đông lạnh (90% môi trường phát triển bình thường, 10% glycerol hay 10% dimethyl sulfoxide dùng như chất bảo vệ lạnh)
- PBS (Phosphate buffer salin) pH 7,4
- Ống đông lạnh 2 ml hay 5 ml
Để tiến hành đông lạnh, chỉ nên chọn các tế bào khỏe mạnh và không bị nhiễm Mật độ tế bào lý tưởng cho quá trình đông lạnh là từ 2-5.1 x 10^6 tế bào trong 2 ml, được chứa trong một ống đông lạnh.
- Tách các tế bào bám dính bằng trypsin hay bất kỳ các tác nhân tách tế bào khác.
- Rửa tế bào một lần trong mồi trường mới bàng cách ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.
- Đem mật độ tế bào, đánh giá phần trăm tế bào sống/chết.
- Tái huyền phù vào môi trường đông lạnh ở mật độ mong muốn.
- Cho huyền phù tế bào trong môi trường đông lạnh vào các ống đông lạnh.
- Ghi chú tên dòng tế bào, số tế bào, ngày và người thực hiện đông lạnh tế bào.
- Nên thực hiện đông lạnh chậm các tế bào.
Các ống đông lạnh chứa tế bào cần được đặt thẳng đứng Sau đó, hãy để chúng trong tủ lạnh ngăn mát trong 30 phút trước khi chuyển vào tủ đông ở -80°C Nên duy trì nhiệt độ này ít nhất một thời gian nhất định để đảm bảo chất lượng tế bào.
60 phút nhưng không để qua đêm Cuối cùng, chuyển các ống đông lạnh sang bình nitơ lỏng hoặc tủ đông âm sâu -150°C.
Các tế bào có thể được lưu trữ trong thời gian ngắn ở nhiệt độ -80°C trong vài tuần, nhưng nếu để lâu hơn, chúng sẽ nhanh chóng bị hư hại Ngược lại, khi được bảo quản ở -150°C hoặc trong nitơ lỏng, tế bào có thể được giữ trong nhiều năm.
Quy trình giải đông tế bào gồm các bước sau:
- Các ống đông lạnh tế bào được lấy ra khỏi bình nitơ lỏng/tủ -80°C/tủ -150°C.
- Đặt ống đông lạnh vào bể ổn nhiệt 37°c, lắc nhẹ đến khi tan gần hết đá.
- Dịch huyền phù trong ống đông lạnh được chuyển sang các ống ly tâm.
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
- Thu cặn tế bào và đếm mật độ tế bào, đánh giá phần trăm tế bào sống/chết.
- Thêm môi trường mới để huyền phù tế bào.
- Cho dịch huyền phù tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường nuôi cấy tế bào thích hợp, mật độ tế bào từ 2-3.1 o4tế bào/cm2.
- Đặt vào tủ ấm ở 37°c, 5% CƠ2.
- Đánh giá được khả năng sống của tế bào trước khi đông lạnh;
- Đông lạnh được tế bào để bảo quản;
- Giải đông được tế bào trong ống đông lạnh;
- Đếm được mật độ tế bào sống, chết sau giải đông;
- Nuôi cấy được tế bào sau giải đông tế bào.
- Cho biết cách đánh giá khả năng sống của tế bào trước khi đông lạnh và sau khi giải đông tế bào.
- Tại sao khi đông lạnh thì phải đông lạnh chậm qua các mức nhiệt độ giảm dần?
- Vai trò của DMSO/glycerol trong môi trường đông lạnh.
- Tại sao khi giải đông tế bào thì cần thao tác nhanh?
Tạo dòng tế bào
Tạo được các dòng tế bào để sử dụrig trong nhiều mục đích khác nhau như sản xuất protein tái tổ hợp, thử thuốc
Kỹ thuật tạo dòng tế bào là phương pháp thu nhận một colony tế bào từ một tế bào duy nhất trong môi trường nuôi cấy Colony, được hình thành từ một tế bào gốc, được nuôi cấy trong các dụng cụ như đĩa petri, đĩa nhiều giếng hoặc Roux, với sự hỗ trợ của kính hiển vi đảo ngược để xác định nguồn gốc Sau khi nuôi cấy, các colony này sẽ phát triển thành các dòng tế bào (cell strain) Đối với tế bào nuôi cấy ở dạng huyền phù, việc tạo dòng được thực hiện bằng cách cấy tế bào vào gel (như agar hoặc agarose) hoặc dung dịch nhầy (Methocel), với lớp thạch hoặc agarose bên dưới, giúp duy trì tính ổn định và ngăn tế bào tách rời khỏi colony.
3.1 Tạo dòng bằng phương pháp pha loãng
Kỹ thuật tạo dòng bằng phương pháp pha loãng là phương pháp phổ biến nhất, dựa trên nguyên tắc rằng khi các tế bào được pha loãng với mật độ thấp trong một thể tích dung dịch nhất định, có thể chỉ có một tế bào duy nhất trong mỗi thể tích đó Các tế bào đơn lẻ này sẽ được nuôi cấy trong các vi giếng, dẫn đến sự hình thành các colony Để kiểm tra hiệu quả bám dính và phân tích khả năng sống, tế bào sẽ được nhuộm, hoặc có thể tiến hành phân lập và tăng sinh thành một dòng tế bào (cell strain) cho dòng tế bào quan tâm.
Phương pháp này có thể được sử dụng cho các tế bào huyền phù hay tế bào bám dính. a Nguyên vật liệu
Tế bào nuôi cấy CH0-K1 được thực hiện trên các đĩa 96 giếng, 24 giếng, 35 mm và 100 mm, cùng với Roux 25 cm² Môi trường nuôi cấy sử dụng là Ham’s F12 với 10% FBS Quy trình bao gồm việc sử dụng buồng đếm hồng cầu và dung dịch trypsin/EDTA 0,25% Các pipette có kích thước 1,5 ml, 10 ml và 25 ml được sử dụng để hỗ trợ trong quá trình này.
- Tách tế bào trong các đĩa nuôi bằng trypsin để thu được dịch huyền phù tế bào đơn.
- Ly tâm 2 lần ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tế bào
Điều chỉnh môi trường nuôi cấy là cần thiết để đạt được mật độ tế bào từ 10-100 tế bào/ml Mật độ tế bào phù hợp sẽ phụ thuộc vào hiệu quả bám trải của các tế bào trong quá trình tạo dòng.
Cho 100 µl dịch huyền phù vào từng giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 1 tế bào Sau 12-24 giờ, kiểm tra các dòng đã trải, đánh dấu và chỉ chọn các đĩa có 1 tế bào Giữ nguyên môi trường nuôi cấy trong 1 tuần để các colony hình thành.
Nếu sau ba tuần nuôi cấy tế bào động vật mà không thấy xuất hiện colony nào, hãy thay môi trường và tiếp tục nuôi cấy thêm một tuần Trong tuần thứ ba, bổ sung môi trường vào các đĩa nuôi cấy Nếu vẫn không có colony xuất hiện, cần tiến hành làm lại thí nghiệm.
Khi tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào, việc tách tế bào bằng trypsin là cần thiết để chuyển chúng vào các đĩa 24 giếng, 35 mm, 100 mm hoặc Roux 25 cm² Quá trình này giúp thu nhận các dòng tế bào đơn (cell strain) hiệu quả.
3.2 Tạo dòng các tế bào ở dạng lơ lửng/huyền phù
Các tế bào nuôi cấy lơ lửng như tế bào gốc tạo máu và nguyên bào sợi đã được biến đổi gen có thể được tạo dòng trong trạng thái huyền phù Để ngăn chặn sự trộn lẫn giữa các colony, các tế bào này được huyền phù trong agar hoặc Methocel và được đặt trên lớp agar lót bên dưới.
Agar là một chất lỏng ở nhiệt độ cao nhưng sẽ tạo thành gel khi đạt 37°C Các tế bào được huyền phù trong môi trường agar ấm và sau khi ủ trong gel agar, chúng có khả năng hình thành các colony rời rạc, dễ dàng phân lập.
Trong bài thí nghiệm riày sẽ mô tả phương pháp tạo dòng tế bào trong agar a Nguyên vật liệu
Tế bào nuôi cấy thứ cấp được hình thành từ huyền phù tế bào sơ cấp, có nguồn gốc từ tủy xương hoặc khối u Quá trình nuôi cấy diễn ra trong đĩa petri với các môi trường như Dulbecco’s MEM, Ham’s F-12, CMRL 1066 và RPMI 1640 Để thực hiện, cần sử dụng buồng đếm hồng cầu, dung dịch trypsin/EDTA, agar và nước cất vô trùng.
- Pha loãng môi trường nuôi cấy 2x từ môi trường lOx, bổ sung 40% FBS và giữ ở 37°c.
Để pha 100 ml dung dịch agar 1,2%, bạn cần cân 1,2 g agar và cho vào cốc chứa 50 ml nước cất Khuấy đều cho agar tan hoàn toàn, sau đó đổ dung dịch vào bình định mức 100 ml Cuối cùng, thêm nước cất cho đến khi đạt vạch định mức.
- Tiệt trùng dung dịch trên bằng phương pháp nhiệt ẩm.
- Chuyển agar 1,2% đã tiệt trùng và chai nước cất vô trùng sang bể ổn nhiệt ở 55°C.
Chuẩn bị lớp lót agar 0,6% bằng cách kết hợp môi trường 2x và agar 1,2% theo tỉ lệ 1:1 Giữ lớp lót ở nhiệt độ 37°C và thêm các yếu tố tăng trưởng, hormone hoặc chất bổ sung cần thiết vào môi trường lót tại thời điểm này.
- Thêm 1 ml môi trường agar 0,6% vào các đĩa, tráng đều và đảm bảo rằng môi trường bao phủ đáy đĩa Đẻ các đĩa ở nhiệt độ phòng.
- Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào và đếm tế bào.
Chuẩn bị môi trường agar 0,3% bằng cách pha loãng môi trường 2x ở nhiệt độ 37°C với agar 1,2% và nước cất vô trùng, cả hai đều ở 55°C, theo tỷ lệ 2:1:1 Sau khi chuẩn bị, để môi trường ở nhiệt độ 37°C.
Chuẩn bị các dịch huyền phù tế bào với các nồng độ khác nhau như sau: đầu tiên, pha chế dịch huyền phù có nồng độ 1 X 10^5/ml Tiếp theo, tiến hành pha loãng 1/3 dịch huyền phù này để đạt được nồng độ 3,3 X 10^4/ml Sau đó, tiếp tục pha loãng 1/3 dịch huyền phù 3,3 X 10^4/ml để có nồng độ 1,1 X 10^4/ml Cuối cùng, pha loãng 1/3 dịch huyền phù 1,1 X 10^4/ml để thu được nồng độ 3,7 X 10^3/ml.
Hút 40 µl dịch tế bào của mỗi độ pha loãng vào các bình chứa tương ứng, sau đó thêm 4 ml môi trường thạch 0,3% ở 37°C vào mỗi bình Trộn đều và dùng pipet lấy 1 ml từ mỗi bình cho vào ba đĩa Petri Nồng độ cuối cùng của các đĩa là: a 1 x 10^3/ml mỗi đĩa; b 330/ml mỗi đĩa; c 110/ml mỗi đĩa; d 37/ml mỗi đĩa.
Ghi chú: Luôn đảm bảo rằng môi trường agar của lớp trên cùng đã có đủ thời gian để nguội đến 37°c trước khi thêm các tế bào vào đó.
- Để dung dịch trong đĩa petri đồng lại ở nhiệt độ phòng.
- Đặt các đĩa petri vào hộp nhựa trong suốt có nắp đậy và đặt ở 37°c trong tủ ấm trong 10 ngày.
- Quan sát và thu nhận các dòng tế bào từ các colony được hình thành.
3.4 Phân tách dòng tế bào
3.4.1 Phăn tách dòng tế bào bám dính bằng sử dụng vòng tạo dòng (cloning ring)
Các phương pháp kiểm tra độc tính trên tế bào động vật
Sinh viên nghiên cứu có thể áp dụng phương pháp giới thiệu để đánh giá khả năng gây độc tế bào của các đối tượng như chiết xuất thực vật, thuốc và vật liệu nano.
Độc tính tế bào là khả năng của một chất gây hại cho tế bào, dẫn đến tổn thương hoặc cái chết của chúng Các tế bào có thể trải qua các quá trình như hoại tử, chết theo lập trình (apoptosis) hoặc tự thực (autophagy) khi tiếp xúc với các hợp chất độc hại Nếu không chết, tế bào sẽ ngừng phát triển và phân chia để hạn chế sự tăng sinh.
Các xét nghiệm kiểm tra độc tính tế bào là công cụ quan trọng để đánh giá khả năng gây độc hại của các hợp chất, làm tổn thương hoặc tiêu diệt tế bào Phương pháp này hiện được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu cơ bản và phát triển thuốc mới, giúp sàng lọc các hợp chất độc hại Trong quá trình phát triển thuốc, độc tính tế bào là yếu tố quyết định cần được kiểm tra song song với hiệu quả của hợp chất, nhằm xác định liệu hợp chất có tiếp tục được sử dụng hay không Nếu hợp chất gây phản ứng độc hại với tế bào, nó sẽ bị loại khỏi các vòng sàng lọc tiếp theo trong đánh giá các liệu pháp điều trị tiềm năng Ngoài ra, các hợp chất tác động vào quá trình phân chia tế bào nhanh chóng có thể trở thành ứng viên cho việc điều trị ung thư.
Có nhiều phương pháp kiểm tra độc tính tế bào, bao gồm xét nghiệm khả năng sống của tế bào, độc tính qua enzyme, tế bào chết theo lập trình, tự thực, sự tăng sinh tế bào và độc tính lipid Kết quả từ các xét nghiệm này giúp xác định liệu hợp chất kiểm nghiệm có ảnh hưởng đến tế bào hay không, và nếu có, mức độ ảnh hưởng là bao nhiêu.
Trong bài thực hành này, chúng tôi giới thiệu và hướng dẫn sinh viên thực hiện xét nghiệm khả năng sống và tăng sinh của tế bào bằng muối tetrazolium (MTT) Phương pháp này dựa trên hoạt động trao đổi chất của tế bào, trong đó các tế bào sống chứa enzyme NAD(P)H-dependent oxidoreductase Khi enzyme này tương tác với MTT, nó sẽ khử muối tetrazolium màu vàng, tạo ra tinh thể formazan màu tím.
Hình 7 Cấu trúc hóa học của muối MTT yà formazan
Các tinh thể formazan hòa tan trong dung dịch sẽ tạo ra một dung dịch có màu, cho phép xác định giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng 500-600 nm Màu sắc của dung dịch tỷ lệ thuận với số lượng tế bào hoạt động trao đổi chất, cho thấy số lượng tế bào sống và/hoặc đang tăng sinh Phương pháp MTT không chỉ được áp dụng trong các xét nghiệm độc tính tế bào mà còn để định lượng sự phát triển và khả năng sống của tế bào, nghiên cứu kích hoạt tế bào, và đo lường khả năng tăng sinh của tế bào khi tiếp xúc với các yếu tố kích thích sinh trưởng, chất dinh dưỡng và cytokines.
- MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (lx), được pha với nồng độ 5 mg/ml trong phosphate buffered saline (PBS).
- Dung dịch hòa tan tinh thể formazan sodium dodecyl sulfate (SDS).
- Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM hoặc RPMI có bổ sung 10% huyết thanh thai bê (FCS), 1% kháng sinh gồm penicillin và streptomycin/gentamycin.
- Chất cần xét nghiệm có khả năng gây độc tế bào hay không (gọi chung là chat X).
- Đĩa 96 giếng có đáy giếng phẳng.
- Tế bào dòng ung thư.
- Tế bào dòng nguyên bào sợi.
- Nuôi cấy trong môi trường DMEM hoặc RPMI có bổ sung 10% huyết thanh thai bê và 1% kháng sinh ở 37°c, 5% CƠ2.
- Đưa tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 5 X 104 tế bào/giếng trong 100 pl môi trường DMEM hoặc RPMI có bồ sung 10% FCS và 1% kháng sinh (penicillin + streptomycin/gentamycin)
- Nuôi cấy tế bào trong tủ ấm 37°c, 5% CO2 trong 24 giờ.
- Tiếp tục bổ sung 10 ỊLil dung dịch MTT đã được pha với nồng độ 0,5 mg/ml vào từng giếng.
- Để đĩa vào tủ 37°c, 5% CO2 trong 4 giờ.
- Bồ sung 100 Ị11 dung dịch hòa tan tinh thể SDS vào mỗi giếng.
- Để đĩa qua đêm trong tủ 37°c, 5% CO2.
Trước khi đo OD bằng máy đọc ELISA, cần kiểm tra xem các tinh thể màu tím đã hòa tan hoàn toàn hay chưa Thực hiện đo ở bước sóng từ 550-600 nm, thường sử dụng 570 nm, với bước sóng tham khảo là 650 nm.
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
- Thiết kế được thí nghiệm thử độc tính tế bào với các nồng độ chất thử trên tế bào ung thư và tế bào thường.
- Phân tích kết quả và vẽ được biểu đồ tỷ lệ tế bào sống, tế bào chết.
- Phân biệt tế bào chết do hoại tử (necrosis), chết theo lập trình (apoptosis) hoặc chết theo kiểu tự thực (autophagy).
- Nguyên lý của phương pháp sử dụng MTT trong việc xác định khả năng sống và tăng sinh của tế bào.
- Trình bày các ứng dụng của xét nghiệm độc tính trên tế bào.
- Trình bày các phương pháp khác xác định khả năng sống và tăng sinh của tế bào.
Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật
Bài thực hành này trang bị cho sinh viên kiến thức và kỹ năng cần thiết để tiến hành nghiên cứu chuyên sâu hơn trong lĩnh vực liên quan, giúp họ có thể tham khảo và áp dụng hiệu quả.
Chuyển gen vào tế bào động vật là kỹ thuật đưa vật chất di truyền ngoại lai vào tế bào để thay đổi biểu hiện protein Vật chất di truyền thường là DNA, nhưng cũng có thể là RNA Phương pháp chuyển gen có thể được thực hiện qua virus (phương pháp virus) hoặc không qua trung gian virus (phương pháp không virus).
Các phưong pháp chuyển gen chủ yếu bao gồm:
- Phưong pháp qua trung gian virus hoặc phưong pháp sinh học
Hình 8 Chuyển gen vào tế bào động vật
1 Chuyến gen qua trung gian virus
Common viruses utilized in gene transfer techniques into animal cells include adenoviruses, retroviruses, adeno-associated viruses, herpes simplex viruses, and poxviruses.
Các bước trong kỹ thuật chuyển gen qua trung gian virus bao gồm:
- Tạo virus tái tổ hợp chứa gen chuyển
- Tinh sạch các hạt virus
- Gây nhiễm cho các loại tế bào cụ thể
- Tích hợp gen chuyển vào bộ gen tế bào chủ
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Hình 9 Chuyển gen qua trung gian virus
1 Phương pháp chuyển gen vậtlý
- Điện di/xung điện (Electroporation)
- Súng chuyển gen (Gene gun or biolistic gene transfer)
2 Phương pháp chuyển gen hóa học
- Phưong pháp sử dụng DEAE (Diethylaminoethyl)-dextran
- Phương pháp chuyển gen Canxi Phosphate
- Phương pháp chuyển gen qua trung gian lipid
- Phương pháp chuyển gen sử dụng từ trường (Magnetofection)
Bài thực hành này hướng dẫn sinh viên phương pháp chuyển gen vào tế bào bằng kỹ thuật Canxi phosphate, một phương pháp hóa học hiệu quả trong việc chuyển DNA vào tế bào nhân thực Phương pháp này thường được kết hợp với các kỹ thuật protein như Immunoprecipitation (IP) và Western Blot để xác nhận sự thay đổi biểu hiện tế bào Kỹ thuật Canxi phosphate cho phép thu được sự chuyển gen ổn định hoặc tạm thời cho nhiều loại tế bào khác nhau Khi DNA được đưa vào tế bào, nó có thể được giữ tạm thời dưới dạng plasmid hoặc tích hợp vĩnh viễn vào bộ gen của tế bào, và trong trường hợp sau, DNA sẽ được truyền cho các tế bào con trong quá trình phân chia.
Trước khi DNA được đưa vào tế bào nhân chuẩn, cần phải trung hòa điện tích của nó, vì bề mặt tế bào mang điện tích âm Nếu không thực hiện quy trình này, DNA sẽ bị đẩy ra ngoài bề mặt tế bào Hơn nữa, ngay cả khi DNA đã vào trong tế bào, màng nhân vẫn không thể tiếp nhận DNA do vấn đề liên quan đến điện tích.
Kỹ thuật thường dùng để trung hòa điện tích DNA là Canxi Phosphate Các bước chuyển gen với Canxi phosphate khá đơn giản như sau:
- Trộn canxi phosphate với DNA và tạo kết tủa hạt nano
- Chọn các tế bào biểu hiện DNA quan tâm
Hạt nano canxi phosphate có khả năng được tế bào thực bào và có thể xâm nhập vào nhân tế bào nếu điều kiện thuận lợi Phương pháp chuyển gen bằng canxi phosphate dễ dàng thực hiện nhờ vào tính ổn định do các ion Ca2+ mang lại.
Quy trình chuyển gen dựa trên việc pha trộn từ từ dung dịch muối đệm HEPES chứa Natri phosphate với dung dịch CaCl2 chứa DNA Kết tủa DNA-canxi phosphate bám vào bề mặt tế bào và được tế bào hấp thụ qua cơ chế nhập nội bào Sử dụng sốc Glycerol có thể nâng cao khả năng tiếp nhận DNA của một số loại tế bào.
- Phin lọc vô trùng 0,2pM.
- Đĩa 3.5 cm, hoặc đĩa 6-12 giếng.
- Nước dành cho sinh học phân tử (25 ml).
- Muối đệm Hepes 2x, pH 7,05 gồm: 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPƠ4. Các loại dung dịch bảo quản ở -20°C và đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Tế bào dòng CHO (Chinese hamster ovary cells), HELA là những dòng tế bào thường được sử dụng trong việc chuyền gen.
Plasmid là công cụ quan trọng trong việc chuyển gen cho các thí nghiệm khác nhau, chẳng hạn như plasmid pSV40-CAT Để đạt được hiệu quả tối ưu trong sinh học phân tử, DNA plasmid cần phải có chất lượng cao, có khả năng kết tủa trong ethanol và tạo huyền phù trong nước, với nồng độ pha chế là 1 pg/ml.
Tế bào thường được nuôi trong môi trường có hoặc không có huyết thanh, tùy thuộc vào loại tế bào cụ thể Cần lưu ý rằng không nên bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy.
- Môi trường DMEM có bổ sung FCS (hoặc không bổ sung FCS).
- DNA (10-50 ug/một lần chuyển gen).
Dung dịch muối đệm Hepes (2x) (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES, 1.5 mM NaHPO, PBS có pH 7,05).
Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
- Đĩa nuôi cấy tế bào.
- Tách các tế bào sao cho có khoảng cách giữa các tế bào.
Làm sạch DNA bằng cách bả sung ethanol có nồng độ 100% để kết tủa.
Làm khô DNA sau khi hút dịch nổi từ ethanol Sử dụng khí để làm khô hoàn toàn. Hòa tan DNA trong 450 pl H2O với 50 pl 2.5 M đệm CaCh.
- Đưa 500 pl dung dịch muối đệm Hepes 2x vào ống falcon 15 ml.
- Thêm từng giọt DNA/CaCh vào ống trên trong khi khuấy bằng thanh khuấy.
- Để kết tủa ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.
Trải kết tủa lên tế bào trong môi trường Lắc nhẹ để kết tủa được trải đều.
- Nuôi trong tủ ấm 37°c với 5% CƠ2 trong 16 giờ.
- Loại bỏ môi trường, rửa 2 lần với PBS và nuôi tế bào trong môi trường có bo sung FCS. Đưa tế bào vào môi trường chọn lọc.
Kiểm tra kết quả chuyển gen.
- Thao tác được các bước trong quy trình chuyển gen.
Quan sát được tế bào sau chuyển gen trước và sau khi đưa vào môi trường chọn lọc.
- Nêu ứng dụng của kỹ thuật chuyển gen.
Nhận biết được tế bào đã chuyển gen thành công.
- Nêu nguyên lý của phương pháp chuyển gen bằng Canxi phosphate.