Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  BÙI THỊ THANH TỊNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E coli DH5α LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  HỒN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E coli DH5α Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN BÙI THỊ THANH TỊNH NIÊN KHÓA: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  COMPLETING PROTOCOL OF TRANSFORMATION DNA FRAGMENTS INTO E.coli DH5α BACTERIAL CELLS GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Dr LE ĐINH ĐON Student BUI THI THANH TINH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ Cha mẹ, anh chị ngƣời thân chỗ dựa vững tinh thần vật chất cho Em vô biết ơn thầy Lê Đình Đơn tận tình hƣớng dẫn truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập vừa qua Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh toàn thể anh chị Trung Tâm tạo điều kiện thuận lợi tối đa nhƣ tận tình giúp đỡ em thời gian thực tập tốt nghiệp Anh Nguyễn Văn Lẫm tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em suốt trình làm đề tài Các anh, chị bạn sinh viên thực tập phòng 105, 118 - khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ Và cuối bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập làm đề tài TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Bùi Thị Thanh Tịnh i TÓM TẮT BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, “Hồn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α”, đƣợc thƣc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đơn Đề tài đƣợc thực từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với nội dung: Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng hố chất Hồn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra Thiết lập phản ứng phủ đầu cho đoạn DNA từ phản ứng PCR plasmid sau cắt Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript Kết thu đƣợc nhƣ sau: Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hố chất, tế bào khả nạp giữ -70oC với glycerol thời gian tháng Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli DH5α Chiết tách plasmid khơng lẫn tạp theo quy trình Sambrook cộng có sửa đổi ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình vii Danh sách bảng ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung thực PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện tƣơng biến nạp vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu tƣợng biến nạp 2.1.2 Cơ sở sinh hóa tế bào học tƣợng biến nạp 2.1.3 Cơ chế tƣợng biến nạp 2.1.4 Vai trò tƣợng biến nạp 2.1.5 Ứng dụng tƣợng biến nạp 2.2 Các vector chủng chủ dùng biến nạp 2.2.1 Khái niệm chung vector 2.2.2 Plasmid 2.2.2.1 Cấu trúc 2.2.2.2 Tính chất plasmid 2.2.2.3 Phân loại plasmid 2.2.3 Phage 2.2.4 Chủng chủ E.coli 2.3 Các ezyme dùng biến nạp 10 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) 11 iii 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn 11 2.3.1.2 Tên gọi RE 11 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn 12 2.3.1.4 Các RE loại II 12 2.3.2 Các enzym thông dụng khác 15 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) 15 2.3.2.2 Taq polymerase 15 2.3.2.3 Terminal transferase 15 2.3.2.4 Các DNase 15 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa 16 2.3.3 Các enzym nối DNA 16 2.3.3.1 E.coli DNA ligase 16 2.3.3.2 T4 DNA ligase 16 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng biến nạp 17 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 17 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp 17 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp 18 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp plasmid tái tổ hợp 18 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid 19 Điện di (Electrophoresis) 19 2.6 Các nghiên cứu biến nạp nƣớc nƣớc 20 2.6.1 Ngoài nƣớc 20 2.6.2 Trong nƣớc 21 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm thực khoá luận tốt nghiệp 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu 22 3.2.1 Vi khuẩn E coli DH5α 22 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) 22 3.2.3 Đoạn DNA 23 3.3 Dụng cụ hóa chất 23 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 23 iv 3.3.2 Các thiết bị máy móc 23 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 23 3.3.4 Các loại hóa chất dùng thí nghiệm 24 3.3.5 Các loại enzym dùng thí nghiệm 24 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 25 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coli DH5α kiểm tra 26 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α môi trƣờng LB 27 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp 27 3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình Sambrook cộng sự, 1989 có sửa đổi) 27 3.4.6 Chiết tách plasmid sử dụng enzym cắt để kiểm tra 29 3.4.6.1 Chiết tách plasmid 29 3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn Samuel S.M.Sun, 1994) 32 3.4.6.3 Quy trình điện di gel agarose 32 3.4.7 Tinh plasmid đoạn DNA từ sản phẩm PCR 33 3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh DNA 33 3.4.7.2 Quy trình tinh DNA từ gel 33 3.4.7.3 Quy trình tinh trực tiếp sản phẩm PCR cột GFX 34 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR 35 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối plasmid đoạn DNA đầu (phản ứng nối blunt-end) 36 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α khả nạp (theo quy trình Sambrook cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) 37 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 38 4.2 Tách chiết DNA plasmid 40 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid 40 v 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid AurumTM Plasmid Mini Kit 42 4.3 Phản ứng cắt plasmid enzyme cắt giới hạn EcoRV 42 4.4 Tinh đoạn DNA plasmid sau cắt HindIII 44 4.4.1 Tinh đoạn DNA 44 4.4.2 Tinh plasmid 45 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp 46 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 49 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair CFU Colony Form Unit DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside MCS Multiple cloning Site OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RE Restriction Enzyme RNA Ribonucleic acid RFLP Restriction fragment length polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Kb kilobase dATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate Tris- HCL (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride UV Ultraviolet (light) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dglactopyranoside vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế tƣợng biến nạp Hình 2.2 Mơ hình plasmid sử dụng cho cloning Hình 2.3 Hình thái Escherichia coli 10 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn vi khuẩn 13 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu (blunt-end) cho đoạn DNA 35 Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn thể tích 10:1.5 38 Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn thể tích 3:0.5 39 Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid gel agarose 1% (lần 1) 41 Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid gel agarose 1% (lần 2) 41 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid Kit gel agarose 1% 42 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid EcoRV gel 1% (lần 1) 42 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm cắt gel agarose 1% (lần 2) 43 Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm cắt HindIII gel agarose 1% 43 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm cắt HindIII gel agarose 1% 43 Hình 4.10 Kết điện di sản phẩm tinh đoạn DNA phƣơng pháp cắt gel thu hồi lại cột GFX 45 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm tinh đoạn DNA phƣơng pháp cắt gel thu hồi lại cột GFX 45 Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm tinh gel agarose1% 46 Hình Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 55 Hình Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) 56 viii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS plasmid pBluescript II SK (+/-) 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E Coli 25 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E coli DH5α kiểm tra 26 ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày với phát triển nhƣ vũ bão khoa học công nghệ, đặc biệt cơng nghệ sinh học lĩnh vực đạt đƣợc thành quan trọng hứa hẹn đem lại lợi ích vơ to lớn tƣơng lai cho ngƣời Các nghiên cứu tập trung vào việc chuyển gen để tăng suất trồng, tạo giống có tính vƣợt trội Tuy nhiên, việc nghiên cứu phân tích mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn số lƣợng độ tinh DNA mẫu thí nghiệm Để giải vấn đề này, nghiên cứu trình tự đoạn DNA hoạt động gen, biểu protein cấu trúc protein, ngƣời ta trọng tới việc phân lập thu nhận đoạn DNA quan tâm tiến hành tạo với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu Mặc khác, gen sinh vật lớn phức tạp mà trình tự gen quan tâm thƣờng có hay hai tế bào Vì khơng thể sử dụng phƣơng pháp sinh hố thơng thƣờng để phân lập gen mục tiêu gen Những vấn đề đƣợc giải ta sử dụng cấu trúc DNA có khả tự chép tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng gen, biểu gen hay thao tác khác gen Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu gọi vector Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào thích hợp cho phép vector có khả tồn ổn định chép độc lập với gen tế bào Tế bào có khả tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi tế bào chủ Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc cải tạo để tạo thành chủng chủ có kiểu gen đặc tính thuận lợi cho thao tác gen Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi dòng tái tổ hợp Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp dùng cho thao tác gen Tồn q trình gọi tạo dịng DNA hay DNA cloning Mục đích tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn tinh khiết trình tự DNA hay thu nhận dịng tế bào có khả biểu gen mục tiêu Xuất phát từ khó khăn thực tế nghiên cứu tảng kiến thức kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trình học tập, tiến hành thực đề tài “ Hồn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α” Phạm Duy Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM thực 1.2 Mục tiêu đề tài Hoàn thiện quy trình chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào kí chủ E coli DH5α 1.3 Nội dung thực - Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E coli DH5α - Thiết lập qui trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất - Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α hóa chất sốc nhiệt - Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzyme giới hạn để kiểm tra - Chuẩn bị đoạn DNA để chèn - Cắt tinh vector - Phản ứng sữa chữa sai sót đoạn DNA từ sản phẩm PCR chèn, nhằm tạo đoạn DNA có đầu - Thiết lập phản ứng phủ đầu cho plasmid sau cắt enzyme giới hạn - Phản ứng nối vector DNA chèn - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào - Kiểm tra thể biến nạp mơi trƣờng có chứa Ampicillin, X-gal, IPTG 3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu tƣợng biến nạp Biến nạp phƣơng pháp đơn giản có để đƣa DNA tái tổ hợp vào tế bào Trong trƣờng hợp tế bào E coli biến nạp có nghĩa đƣa DNA plasmid vào tế bào Biến nạp đƣợc sử dụng với nghĩa rộng hơn, cụ thể đƣa DNA vào tế bào Lần biến nạp vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928 thí nghiệm tiếng ơng gọi “nguyên lí biến nạp” Trên thực tế phát minh sau chứng minh gen đƣợc cấu thành từ DNA Tuy nhiên tất vi khuẩn biến nạp cách dễ dàng Để cho biến nạp E coli có hiệu quả, tế bào cần trở nên khả biến (competent) Để đạt đƣợc điều này, ngƣời ta ngâm tế bào dung dịch calcium chloride lạnh đơng đá, tế bào trở nên khả biến theo cách mà chƣa rõ nguyên nhân Việc biến nạp tế bào khả biến đƣợc thực cách trộn DNA plasmid với tế bào, ủ đá 20 đến 30 phút, sau tạo sốc nhiệt ngắn (2 phút 420C), làm nhƣ DNA chui vào tế bào Các tế bào biến nạp thƣờng đƣợc ủ nƣớc thịt dinh dƣỡng 370C vòng 60 đến 90 phút để làm cho plasmid ổn định biểu tính trạng chúng kiểu hình Sau đó, tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng chọn lọc để nhân lên tế bào có plasmid (Lê Đình Lƣơng, 2001) 2.1.2 Cơ sở sinh hóa tế bào học tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi thể gen mã hóa cho thành phần mà DNA gắn vào, sau đƣợc hấp thụ Trong tự nhiên, nồng độ chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sống vi khuẩn, lúc tế bào bị thay đổi cấu trúc nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến hình thành kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA theo kênh vào nhờ việc tiếp xúc với màng nhận đƣợc hỗ trợ hệ thống vận chuyển bên tế bào Hệ thống vận chuyển đƣợc hình thành sở enzym gây biến tính số protein màng Enzym ComC có chất peptidase phân cắt protein ComG màng tế bào làm cho khơng cịn tính trọn vẹn protein màng, từ chúng đƣợc hoạt hố Có protein dạng với ComG, tất chúng tạo cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA ComEA thể nhận để DNA vào tế bào ComEC tạo kênh vận chuyển dạng dịch qua DNA vào tế bào (Leendert W.Hamoen cộng sự, 1998) ComFA dạng helycase có chức phối hợp với ComEA ComEC để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào Trong trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl ComEA đƣợc phân thành đoạn dƣới tác động endonuclease (hiện xác định NucA), phần đầu cuối đƣợc cắt đƣợc đƣa tới ComEC ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào Sự phiên mã gen “late competence” mã hoá cho máy gắn kết hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) nhƣ yếu tố cần cho tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi yếu tố có khả kích hoạt phiên mã ComK yếu tố hoạt hoá phiên mã ComK đƣợc điều chỉnh xác biểu Sự biểu ComK đƣợc quy định mạng lƣới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR MecAB Trong thí nghiệm thực năm 1998, Leendert W.Hamoen cộng ComK nhận biết vùng trình tự ngắn giàu A/T, đƣợc xếp khung đọc đặc trƣng linh động dọc theo sợi xoắn DNA Phân tích footfrinting gốc hydroxyl ComK bám vào addAB promoter cho phép họ kết luận ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T AAAAN5TTTT ComK đƣợc điều hoà âm bám vào AbrB CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng AbrB, sinR, DegU CodY GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào nhƣ thị dinh dƣỡng, điều hồ phiên mã phần đầu phare ổn định phiên mã gen quy định hình thành bào tử Từ đó, cho phép tế bào thích nghi với giới hạn dinh dƣỡng DegU giúp cho ComK bám chặt vào ComK promoter, điều đảm bảo phiên mã xác nồng độ ComK thấp 5 2.1.3 Cơ chế tƣợng biến nạp Tế bào vi khuẩn cho DNA xâm nhập vào tế bào đƣợc giai đoạn tăng trƣởng tế bào, bề mặt tế bào có diện điểm tiếp nhận đặc biệt gọi nhân tố dung nạp (competent factor) Nhân tố có khả tiếp nhận đoạn ngắn DNA từ mơi trƣờng bên ngồi để đƣa vào bên tế bào vi khuẩn, nhờ xảy tái tổ hợp Muốn thực biến nạp cần phải có điều kiện: (1) Phải có mơi trƣờng đoạn DNA, (2) Khả dung nạp DNA vi khuẩn nhận Không phải tất vi khuẩn nhận DNA vào nhƣ nhau, mà cần phải sử dụng số chất để tạo lỗ vách tế bào, giúp xâm nhập dễ dàng DNA nhƣ: CaCl2 50mmol, LiCl Quá trình biến nạp gồm giai đoạn: - Sự tiếp xúc DNA lạ với tế bào nhận - Sự xâm nhập DNA vào tế bào nhận - Sự liên kết DNA lạ với đoạn tƣơng đồng nhiễm sắc thể tế bào nhận - Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA tế bào nhận nhờ tái tổ hợp - Sự nhân lên nhiễm sắc thể có DNA biến nạp 2.1.4 Vai trò tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp giúp lồi vi khuẩn có thêm tính trạng dễ thích nghi với mơi trƣờng sống Đó sở tiến hóa đa dạng vi sinh vật 2.1.5 Ứng dụng tƣợng biến nạp Biến nạp DNA vào vi khuẩn bƣớc đầu kỹ thuật DNA tái tổ hợp Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển gen từ động vật, trồng vào vi khuẩn lƣợng lớn sản phẩm mong muốn gen đƣợc tạo ra, sau kết hợp với phƣơng pháp chiết xuất tinh để phục vụ cho mục đích ngƣời Biến nạp gen vào vi khuẩn giúp thực nghiên cứu khác nhƣ đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản ổn định đoạn gen đƣợc dễ dàng 6 Hình 2.1 Cơ chế tƣợng biến nạp 2.2 Các vector chủng chủ dùng biến nạp 2.2.1 Khái niệm chung vector Vector có chất DNA, thƣờng dạng vịng, mang nhiều đặc tính có khả xâm nhập vào tế bào vi khuẩn mƣợn máy tế bào vi khuẩn để tạo nhiều khác giống hệt vector ban đầu Một vector cần có đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau: - Có khả tự chép tế bào chủ, chép không phụ thuộc chép gen tế bào chủ - Có đặc tính cho phép phát dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa chúng Các đặc tính thƣờng đƣợc mã hố gen chọn lọc Thơng thƣờng gen kháng kháng sinh (ampicillin, tetracyline) Ngoài ra, gen chọn lọc gen mã hóa cho enzyme (ví dụ β-galactosidase, luciferase) chuyển hóa chất cho phép quan sát cách dễ dàng (tạo màu hay phát sáng theo thứ tự) 7 - Mang vị trí nhận biết số enzym giới hạn Các vị trí cắt giới hạn có tác dụng mở rộng khả xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu - Có kích thƣớc nhỏ tốt để thu nhận lƣợng DNA tối đa Hơn nữa, kích thƣớc vector nhỏ dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, đƣợc chép nhanh hiệu - Tồn đƣợc tế bào vi khuẩn qua nhiều hệ gây xáo trộn cho tế bào chủ - Các vector biểu cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc biểu gen sinh vật chủ Ngoài vector cần mang vector chọn lọc đặc biệt nhằm dễ dàng chọn lọc cá thể sinh vật chủ có mang vector tái tổ hợp Các vector thƣờng sử dụng biến nạp plasmid phage 2.2.2 Plasmid Plasmid phân tử DNA dạng vịng có kích thƣớc phân tử nhỏ, có vi khuẩn vi sinh vật khác, có khả nhân độc lập với chromosome tế bào ký chủ Chúng có khả mang nhiều gen, thƣờng gen mã hóa chất có ích cho vi khuẩn Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillin Chloramphenocol giúp vi khuẩn chủ kháng lại tồn mơi trƣờng có kháng sinh Tính kháng với loại kháng sinh đƣợc xem nhƣ dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để nhận diện quan trọng giúp khẳng định diện gen ngoại lai 2.2.2.1 Cấu trúc Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replication) giúp trình nhân nhanh số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể vi khuẩn chủ Những plasmid nhỏ sử dụng DNA tế bào kí chủ cho việc nhân nó, nhƣng plasmid lớn, chúng mang gen mã hóa chuyên biệt giúp cho q trình tái Tuy nhiên vài plasmid gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn số lƣợng plasmid đƣợc nhân lên với phân chia tế bào vi khuẩn Những plasmid hợp gọi episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kì phân chia tế bào, nhƣng giai đọan plasmid dạng tự 8 Vùng chèn DNA Hình 2.2 Mơ hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài liệu T.A Brown, 1997) 2.2.2.2 Tính chất plasmid - Plasmid có DNA chu trình kín độc lập với tế bào vi khuẩn - Plasmid mang gen hay nhiều gen - Plasmid có khả sống sót mơi trƣờng có nồng độ số chất hóa học ví dụ nhƣ ampicilin - Khi plasmid mang gen kháng, ngƣời ta dùng chất kháng nhƣ marker chọn lọc 2.2.2.3 Phân loại plasmid Phân loại plasmid đƣợc dựa vào đặc tính mã hóa gen Có loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau: Loại 1: F plasmid (Fertility) mang tra gen, có khả nạng chuyển vị tiếp hợp Ví dụ F plasmid E coli Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa hợp chất kháng lại chất kháng sinh giúp tế bào kí chủ tồn mơi trƣờng sống Ví dụ RP4 vi khuẩn Pseudomonas Loại 3: Col plasmid tạo colicin gây chết vi khuẩn khác Ví dụ ColE1 E coli Loại 4: Degradative plasmid giúp kí chủ tạo chất sinh học có tính chất đặc biệt điều kiện đó, nhƣ toluen, salycylyc xit Ví dụ TOL plasmid Pseudomonas putida 9 Loại 5: Virulence plasmid xác định khả gây bệnh vi khuẩn chủ Ví dụ Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens gây bệnh bƣớu hai mầm Trong thí nghiệm phân lập biến nạp gen thƣờng sử dụng plasmid có ba đặc tính sau: - Trọng lƣợng phân tử thấp - Khả thăm dị tính trạng chọn lọc tế bào chủ - Có cloning site đủ cho lƣợng lớn restriction enzyme 2.2.3 Phage Là vật liệu di truyền Bacteriophage, loại virus công vi khuẩn Khi công DNA phage đƣợc truyền vào ký chủ trải qua q trình nhân lên số lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính để thiết kế vector mang DNA vào tế bào Ngoài ra, cịn có vector lai plasmid phage mà chức phage đƣợc biểu sử dụng theo cách đó, gọi phasmid Các vector lai plasmid phage đƣợc hoàn thiện đƣợc sử dụng rộng rãi cho ứng dụng nhƣ giải trình tự DNA sản xuất mẫu dò để sử dụng nghiên cứu lai axit nucleic Các vector plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi đầu chép f1 phage M13, tiếp nhận đoạn DNA có kích thƣớc tới 10kb (pEMBL9, pBluescript) 2.2.4 Chủng chủ E coli E coli vi khuẩm Gram âm, hình que dài khoảng 2.5µm, có roi (flagella) gen gồm 4639221 cặp base mã hóa cho 4000 gen E coli loài đƣợc chọn phịng thí nghiệm sinh học phân tử dễ ni cấy, gen đơn giản đƣợc giải trình tự Giống nhƣ tất vi khuẩn Gram âm khác, E coli khơng có màng nhân nhiễm sắc thể phân tử sợi đơi dạng vịng lớn với vị trí gắn màng vị trí khởi đầu chép (origin of replication) Các tế bào E coli hỗ trợ chép plasmid DNA chọn lọc DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay phức hợp màu nhƣ Xgal-β galactosidase 10 Hình 2.3 Hình thái Escherichia coli Nhằm trì tồn vector bacteriophage tế bào chủ, thơng thƣờng E coli dùng để tạo dịng đƣợc cải tiến thành chủng theo hƣớng sau: - Loại bỏ hệ thống sửa đổi hạn chế (restriction modification) hệ thống can thiệp vào chép DNA lạ tế bào vi khuẩn nhờ vi khuẩn phân giải DNA lạ theo nhƣ cách DNA bacteriophage bị phân giải hệ thống phòng vệ tự nhiên Do chủng E coli dùng cho tạo dòng bị gây đột biến hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh (hsdR-) hay gây đột biến phức hợp mcrA/mcrB/mrr phức hợp phân giải DNA lạ không đƣợc methyl hóa cách xác - Hệ thống tái tổ hợp DNA đƣợc sữa đổi để ngăn chặn tái tổ hợp Gen recA E coli mã hóa cho DNA-dependent-ATPase cần thiết cho tái tổ hợp E coli Các chủng chủ E coli dùng để tạo dịng có đột biến recA- thƣờng khơng thực đƣợc tái tổ hợp - Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích lũy tế bào Thông thƣờng ngƣời ta gây đột biến gen endA (endA) gen mã hóa cho endonuclease I Việc endonuclease làm tăng sản lƣợng plasmid cải biến chất lƣợng DNA đƣợc chiết tách cách sử dụng phƣơng pháp sinh hóa chuẩn 2.3 Các ezyme dùng biến nạp Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp vector 11 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn sinh sôi nhờ máy sinh tổng hợp vi khuẩn Khi số lƣợng phage tăng lên đến hàng triệu sao, chúng phá vỡ tế bào vi khuẩn Nhƣng số trƣờng hợp, tế bào vi khuẩn nguyên vẹn mà phage khơng sinh sơi Hiện tƣợng hai nguyên nhân là: - DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không hoạt động thời gian dài hay ngắn - DNA phage bị hệ thống bảo vệ vi khuẩn tiêu diệt vừa xâm nhập, hệ thống bảo vệ enzym cắt giới hạn Đây tƣợng giới hạn Khi nghiên cứu DNA phage phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kích thƣớc ngun vẹn DNA phage trích từ vi khuẩn khơng bị phá vỡ lại bị cắt thành đọan nhỏ kích thƣớc xác định Tuy vậy, chủng kháng phage, có số vi khuẩn bị phân hủy Các phage số vi khuẩn phóng thích có khả phân hủy chủng vi khuẩn trƣớc kháng phage Tất tƣợng nêu kết hệ thống gồm hai enzym: Các enzym cắt giới hạn cắt DNA phage vị trí chun biệt, ln ln tạo thành đọan có kích thƣớc định Methylase enzym chịu trách nhiệm gắn nhóm methyl vào A hay C vị trí cắt enzym cắt giới hạn Khi A hay C đƣợc methyl hóa, enzym cắt giới hạn khơng cịn nhận biết đƣợc vị trí cắt DNA vi khuẩn khơng bị enzym cắt giới hạn chúng cắt nhờ chế Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ tế bào procaryote, chƣa có hệ thống tƣơng đƣơng đƣợc phát eucaryote 2.3.1.2 Tên gọi RE Tên gọi thống cho RE đƣợc qui định nhƣ sau: - Chữ đầu viết hoa chữ đầu tên giống vi khuẩn từ RE đƣợc li trích - Hai chữ kế khơng viết hoa tƣơng ứng với lồi vi khuẩn nói - Tiếp theo chữ số la mã thứ tự RE đƣợc phát (trong trƣờng hợp RE đƣợc tìm thấy loài vi khuẩn)